Giáo trình Công nghệ tế bào

PHẦN VI CƠNG NGHỆ TẾ BÀO THỰC VẬT Phần VI: CƠNG NGHỆ TẾ BÀO THỰC VẬT 415 SỰ PHÁT SINH CƠ QUAN TỪ LỚP MỎNG TẾ B ÀO CỦA GIỐNG ĐIỀU (Anacardium occidentale L.) CAO SẢN BO1 NI CẤY in vitro Huỳnh Hữu Đức, Nguyễn Đình Sỹ, Nguyễn Thị Quỳnh Phòng Cơng nghệ tế bào thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới MỞ ĐẦU Cây điều (Anacardium occidentale L.) cơng nghi ệp đem lại hiệu kinh tế cao số nước thuộc vùng nhiệt đới Châu Á Châu Phi nhân h ạt điều có giá trị cao xuất Thơng th ường nhân giống từ hạt, phương pháp đem l ại tính khơng đồng di truyền (Philip v Unni, 1994) Các phương pháp nhân gi ống vơ tính truyền thống nh giâm cành, ghép thường sử dụng để nhân d òng điều có suất cao, nhi ên hệ số nhân giống khơng đáp ứng nhu cầu Do ph ương pháp nhân gi ống in vitro sử dụng thành cơng nhi ều lồi ăn trái gần với điều (Barghchi & Alderson, 1983; Litz cộng sự, 1984) nên nhân giống in vitro điều có tính khả thi (Vũ Ngọc Phượng cs, 2003) Ni cấy lớp mỏng tế b phương pháp cho nhi ều ưu so với phương pháp nhân gi ống in vitro truyền thống khác v ứng dụng thành cơng nhiều lồi khác (Dương T ấn Nhựt cs, 2003) Tuy nhiên, vi ệc ứng dụng phương pháp ni cấy lớp mỏng tế bào thân gỗ chưa cơng bố nhiều Trong chúng tơi trình bày m ột số kết nghi ên cứu ni cấy lớp mỏng tế bào từ đốt thân mầm v đốt tử diệp điều VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Mẫu ni cấy hạt trưởng thành giống điều cao sản BO1 thu đ ược từ vườn đầu dòng Trung tâm H ưng Lộc (Viện Khoa học Kỹ thuật Nơng nghiệp Miền Nam), Đồng Nai Hạt điều có lớp vỏ, vỏ cứng b ên ngồi vỏ lụa bên Hạt khử trùng dung dịch NaOCl (C sở Vân Phương, Quận 11, Tp Hồ Chí Minh) với nồng độ 1% (w/v) 24 giờ, sau rửa lại n ước cất vơ trùng lần Cây mầm phát triển từ hạt ni cấy tr ên mơi trường khống MS khơng có đ ường vitamin sau tu ần dùng làm ngun li ệu cho thí nghiệm Lớp mỏng cắt 416 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ 2007 ngang từ loại vật liệu l đốt tử diệp đốt thân mầm (có bề dày khoảng 0,3-0,5mm) cấy đĩa petri (Ф = 10cm) chứa 20ml mơi trường Mơi trường ni cấy l mơi trường MS (Murashige v Skoog, 1962) có b ổ sung nước dừa 10% (v/v), adenine su lphate (Sigma Chemical Co.,USA) 40 mg/L, saccharose (Cty Đường Biên Hồ, Đồng Nai) 20g/L, maltose (Sigma Chemical Co., Missouri, USA) 10 g/L, agar (Cty C ổ phần Đồ hộp Hạ Long, Quản g Ninh) 9g/L, than hoạt tính 3g/L Mơi trường bổ sung chất điều ho sinh trưởng thực vật 6-benzyladenine (BA), kinetin (KN) naphthalene -1-acetic acid (NAA) nồng độ khác pH mơi tr ường trước khử trùng 5,9 Mơi trường khử trùng 121 oC, atm 20 phút Phòng ni có nhi ệt độ 25 ± oC, độ ẩm 60 ± 5% Đĩa petri đựng mẫu đ ược che tối ng ày đầu, sau đặt cường độ ánh sáng 40 -50 µ mol m -2 s -1 với thời gian chiếu sáng 12 giờ/ngày Mỗi đĩa petri có 24 mẫu cấy loại vật liệu (đốt thân mầm đốt tử diệp) Thí nghiệm có yếu tố chất điều hồ tăng trưởng thực vật, yếu tố có hai mức độ (Bảng 1) Thí nghiệm đ ược bố trí hồn tồn ngẫu nhiên nghiệm thức gồm đĩa petri lập lại lần Số liệu đ ược phân tích thống k ê phần mềm MSTATC (Đại học Michigan, M ichigan, USA) Thí nghi ệm theo dõi 28 ngày Bảng 1: Mơ tả thí nghiệm (chung cho loại vật liệu) Nghiệm thức BA (mg/L) KN (mg/L) NAA (mg/L) 1 0,5 5 0,5 10 1 10 0,5 10 10 0,5 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Kết thí nghiệm sau 28 ng ày ni cấy cho thấy lát mỏng v ùng đốt thân cho chồi vùng đốt tử diệp cho nhiều chồi Điều cho thấy vùng sinh mơ ch diện chung quanh đốt tử diệp dễ bị kích hoạt tác động ch ất điều hồ sinh trưởng thực vật (K Trần Thanh Vân, 2003) (Hình 1) 417 Phần VI: CƠNG NGHỆ TẾ BÀO THỰC VẬT đốt thân mầm đốt tử diệp Hình Chồi hình thành từ lớp mỏng đốt thân mầm v đốt tử diệp sau 28 ng ày Số chồi cao (5, chồi) từ lớp mỏng đốt tử diệp th uộc nghiệm thức có bổ sung 10mg/l BA, 1mg/l KN 0,5mg/l NAA Lớp mỏng tạo chồi thấp (3 chồi) ni mơi trường có bổ sung 5mg/l BA v 0,5mg/l NAA Số chồi/mẫu Ảnh hưởng BA KN lên tạo chồi lớp mỏng v ùng đốt tử diệp thấy rõ nồng độ BA 10mg/L KN 1mg/L, ảnh hưởng NAA khơng thấy rõ thí nghiệm Đối với đốt thân mầm, nồng độ chất điều ho sinh trưởng thực vật sử dụng thí nghiệm n ày khơng đem lại khác biệt số chồi hình thành nghiệm thức (Hình 2) 1 Nghiệm thức Đố t thâ n Đố t tử diệ p Hình Số chồi tạo thành từ lát mỏng đốt thân mầm v đốt tử diệp ngày thứ 28 418 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ 2007 Các chồi hình thành từ lớp mỏng tiếp tục cấy chuyền sang mơi tr ường MS có bổ sung 1mg/l BA 1mg/l KN để phát triển thành với số lần cấy chuyền l tuần/lần Chiều cao trung bình đạt 3-4cm sau tháng cấy chuyền (Hình 3) Hình Cụm chồi điều phát triển sau tháng cấy chuyền KẾT LUẬN Phương pháp ni cấy lớp mỏng tế bào sử dụng để tạo chồi trực tiếp từ trục thượng diệp hạt điều nảy mầm Số chồi đ ược tạo trực tiếp từ lớp mỏng đốt tử diệp cao mơi trường có bổ sung 10mg/l BA, 1mg/l KN v 0,5mg/l NAA Đối với ni cấy lớp mỏng đốt thân mầm th ì chồi phát triển mơi trường có BA 5mg/L có khơng có kinetin v NAA Cần tiếp tục nghiên cứu để tìm mơi trường thích hợp cho phát triển chồi từ ni cấy lớp mỏng đốt thân mầm TÀI LIỆU THAM KHẢO Barghchi M, Alderson PG (1983) In vitro production of Pistacia species Acta Hort 131, 49-60 Dương Tấn Nhựt, Da Silva JAT, B ùi Văn Lệ, Kiêm Trần Thanh Vân (2003) Thin cell layer (TCL) morphogenesis as a powerful tool in woody plant and fruit crop mircopropagation and biotechnology, floral genetics andgenetic transformation In: Jain SM & Ishii K (eds.) Micropropagation of woody trees and fruits, pp 783-814, Kluwer Academic Publishers, Dordretch, The Netherlands Litz RE, Knight Jr RJ, Gazit S (1984) In vitro somatic embryogenesis from Mangifera indica L callus Sci Hort 22, 233 -240 419 Phần VI: CƠNG NGHỆ TẾ BÀO THỰC VẬT Philip VJ & Unni PN (1984) In vitro propagation of cashew for crop improvement In: Bhaskara Rao EVV & Khan HH (eds.) Cashew Research and Development, pp.77-82, CPCRI, Kasargod, India Trần Thanh Vân K (2003) Thin cell layer concept In: Duong Tan Nhut, Van Le Bui, Tran Thanh Van K, Thorpe T (eds.) Thin cell layer culture systerm: regeneration and transformation applications pp.1 -16, Kluwer Academic Publishers, Dordretch, The Netherlan ds SUMMARY The organogenesis via thin cell layers cashew (Anacardium occidentale L.) of the cultivar BO1 cultured in vitro Huynh Huu Duc, Nguyen Dình Sy, Nguyen Thi Quynh Institute of Tropical Biology Cashew (Anacardium occidentale L.) is a profi table cash crop of several tropical countries due to the export value of kernels A study on the in vitro organogenesis via thin cell layer (TCL) culture of the cultivar BO1 was carried out for an appropriate approach to produce cashew transplants on a lar ge scale Mature seeds of the cultivar BO1 were surface sterilized with NaOCl 1% (w/v) on the MS sugar -free medium Epicotyls of seedlings were used as explants for TCL culture and put on a modified MS medium (Murashige and Skoog, 1962) supplemented with B A, KN and NAA at different concentrations, 20g/L sucrose and 10 g/L maltose The TCL positions on the explants affected the direct shoot induction and number of shoots Shoot formation from TCLs derived from the cotyledonary nodal position was greater than that from other nodal positions of epicotyls Concentrations of BA, KN and NAA of 10, 1, and 0.5 mg/L, respectively, were the best for the direct shoot formation of the cultivar BO1 420 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ 2007 ẢNH HƯỞNG CỦA ÁNH SÁNG TỰ NHI ÊN TRONG Q TRÌNH NHÂN GIỐNG in vitro LÊN SỰ TĂNG TRƯỞNG CỦA CÂY LAN GIỐNG TRONG GIAI ĐOẠN VƯỜN ƯƠM Lưu Việt Dũng, Vũ Ngọc Phượng, Thái Xn Du Phòng Cơng nghệ tế bào thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới MỞ ĐẦU Trong năm gần đây, nhu cầu trồng phong lan phát triển TP Hồ Chí Minh Tuy nhiên, việc cung cấp số l ượng lớn giống khỏe mạnh, có tỷ lệ sống trồng cao thời gian qua c òn gặp nhiều khó khăn khơng có đ ơn vị có khả cung cấp Nhu cầu trồng lan từ giống cách ni cấy in vitro ng ày lớn giai đoạn Chính v ì việc nhân nhanh v đưa thị trường số lượng lớn giống khoẻ mạnh l nhu cầu thực tế Để tạo khỏe mạnh, giá th ành thấp, bên cạnh thành cơng ni cấy in vitro, giai đoạn v ườn ươm vấn đề quan trọng L àm để cấy mơ trồng v ườn ươm có tỷ lệ sống cao, phát triển tốt chuyển từ mơi trường nhân tạo ổn định b ình cấy mơ mơi trường biến động gần với tự nhiên vườn ươm Nối tiếp kết nghi ên cứu ni cấy mơ điều kiện ánh sáng tự nhi ên, việc khảo sát: “Ảnh h ưởng ánh sáng tự nhi ên q trình nhân gi ống in vitro lên tăng trưởng lan giống giai đoạn v ườn ươm” bước thu hẹp khoảng cách từ kết nghi ên cứu khoa học đến tay nhà vườn ứng dụng vào thực tiễn, góp phần đ ưa khoa học kỹ thuật phục vụ sản xuất nơng nghiệp cơng nghệ cao VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Cây lan cấy mơ nhân giống điều kiện ánh sáng tự nhi ên điều kiện ánh đèn huỳnh quang lựa chọn kích cỡ để trồng vườn ươm 421 Phần VI: CƠNG NGHỆ TẾ BÀO THỰC VẬT Hình Cây lan Dendrobium c mơ trước trồng vườn ươm Hình Cây lan Catleya c mơ trước trồng vườn ưom Thí nghiệm tiến hành giống Dendrobium, Catleya Phalaenopsis Số lượng thí nghiệm: 150/giống/nghiệm thức x ba lần lặp lại Giá thể l xơ dừa dớn đen (là rễ dương xỉ) Sau lấy khỏi b ình cấy mơ rửa ngâm 10 phút dung d ịch Dithan M-45 5gr/lít Các tiêu khảo sát gồm: ♦ Số chết tính theo % ♦ Số tính theo trung bình cộng ♦ Tỷ lệ số tính theo % ♦ Chiều cao cây: đo từ cổ rễ l ên hết thân + cao ♦ Chiều rộng lá: đo chiều rộng lớn nhất, tính trung bình cộng ♦ Số nhánh bụi tính theo trung b ình cộng ♦ Số rễ hình thành tính theo trung bình cộng ♦ Số cho rễ tính theo % ♦ Chiều dài rễ tính theo trung bình cộng Thí nghiệm tiến hành vườn ươm Thủ Đức Tp HCM, thuộc Ph òng Cơng nghệ Tế bào, Viện Sinh học Nhiệt đới, Viện Khoa học v Cơng nghệ Việt Nam Hình 3: Cây lan Phalaenopsis c mơ trước trồng vườn ươm 422 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ 2007 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Một u cầu trồng lan phải thích nghi sống Nhờ tơi luyện trước điều kiện ánh sáng v nhiệt độ gần giống vườn ươm nên cấy mơ điều kiện ánh sáng tự nhi ên tỏ thích nghi tốt Các kết Dendrobium trình bày bảng đây: Bảng So sánh tăng tr ưởng lan Dendrobium trồng vườn ươm nguồn gốc ánh sáng đ èn ngày đo 10 30 60 90 nguồn gốc ánh sáng tự nhi ên 10 30 60 90 số chết % 4,7 10,9 14,4 14,8 3,0 5,2 5,6 5,9 số (trung bình) 3,4 3,4 3,7 4,5 5,3 3,6 3,6 3,8 4,7 5,4 số (%) 15 52 100 40 89 100 cao (cm) 5,2 5,2 6,6 10,1 12,9 5,0 5,0 6,4 10,8 14,6 số nhánh bụi 2,0 2,0 2,8 3,4 3,6 2,0 2,0 2,4 3,1 3,8 số rễ 1,8 3,9 5,4 12,6 2,4 4,6 6,8 15,7 số rễ (%) 14,8 42,7 87,4 100 28,6 82,1 100 100 Dài rễ (cm) 8,2 8,3 11,4 16,7 19,8 8,4 8,5 12,6 18,4 24,4 A Hình Cây dendrobium ngu ồn gốc ánh sáng tự nhiên 60 ngày tuổi B Hình 5: A- gốc ánh sáng tự nhiên B- gốc ánh sáng đèn Cây giống sản xuất điều kiện ánh sáng tự nhiên có sức sống tốt hơn, biểu số chết giảm, mau mới, lớn nhanh n ên có chiều cao số nhánh số rễ phát sinh tính tr ên bụi cao đối chứng giống bình thường sản xuất phòng máy lạnh chiếu sáng đèn Các kết giống lan dendrobium khích lệ nghiên cứu Catleya Kết nghiên cứu trình bày bảng sau đây: 423 Phần VI: CƠNG NGHỆ TẾ BÀO THỰC VẬT Bảng So sánh tăng tr ưởng lan Catleya trồng v ườn ưom nguồn gốc ánh sáng đèn nguồn gốc ánh sáng tự nhi ên ngày đo 10 30 60 90 10 30 60 90 số chết % 12,2 14,6 17,5 19,4 3,0 4,8 5,2 6,8 số (%) 11,3 44,6 78,5 100 23,4 64,8 98,1 100 Dài lá=cao cm 6,5 6,7 7,1 8,1 10,8 6,5 6,6 7,2 8,4 11,3 số nhánh bụi 2,0 2,0 2,2 2,8 3,3 2,0 2,0 2,4 2,8 4,4 số rễ 1,6 2,8 3,9 5,8 2,3 3,4 4,8 6,9 số rễ (%) 5,8 28,9 76,8 100 15,1 40,9 89,5 100 Dài rễ cm 5,2 7,4 8,7 10,5 13,4 5,2 8,6 9,4 12,6 14,8 Sự khác biệt biểu t 10 ngày Trong gần phần tư lan Catleya bung cơng thức nguồn ánh sáng từ nhi ên mười phần trăm số lan cơng thức đối chứng có thở bung non Đây l việc quan trọng Catleya vốn giống lan lớn chậm Số nhánh mới, chiều cao thân nh số rễ phát sinh vượt trội so với đối chứng Hinh Lan Catleya 90 tu ổi gốc ánh sáng tự nhiên Hinh Lan Catleya 90 tu ổi gốc ánh sáng đèn Trên giống lan Phalaenopsis ghi nhận kết tương tự, xem bảng đây: Bảng So sánh tăng tr ưởng lan Phalaenopsis trồng v ườn ưom nguồn gốc ánh sáng đ èn nguồn gốc ánh sáng tự nhi ên ngày đo 10 30 60 90 10 30 60 90 số chết % 2,1 5,6 10,5 16,4 2,0 3,4 5,8 6,9 số (%) 2,8 38,4 56,8 100 3,0 4,1 76,2 100 rộng cm 1,8 1,8 2,2 2,6 3,0 1,8 1,9 2,4 2,9 3,5 Dài lá=cao cm 5,1 5,2 5,9 6,8 7,9 5,2 6,2 7,6 8,4 số rễ 0,6 1,8 3,1 3,9 1,1 2,4 3,8 4,5 số rễ (%) 4,0 12,6 76,8 100 11,2 54,6 98,8 100 Dài rễ cm 4,6 4,7 5,6 6,4 10,3 4,5 4,8 6,2 8,6 11,4 Phần VI: CƠNG NGHỆ TẾ BÀO THỰC VẬT 555 Điều kiện ni cấy: mơi trường vơ trùng 121oC 1at 25 phút Nhiệt độ phòng ni cấy 28±2oC Cường độ chiếu sáng 34,2 µmol/m2/s Thời gian chiếu sáng 8giờ/ngày Mơi trường ni cấy: Mơi trường khống MS (Murashige-Skoog, 1962), LV (Phillips-Collins, 1979) có bổ sung đường sucrose, chất điều hồ sinh trưởng như: BA (6-benzyladenine), Kinetin (6-furfurylaminopurine), NAA ( -naphthalene acetic acid ), 2.4D (2.4-dichlorophenoxy acetic acid) Phương pháp Thí nghiệm bố trí theo CBD (1 yếu tố), lần lặp lại, lần lặp lại nu cấy bình tam giác 300ml, bình tam giác chứa 65ml mơi trường thí nghiệm cấy mẫu Số liệu thu thập phân tích thống kê phần mềm MSTATC (P=0.05) sinh khối tế bào sau ni cấy (g), chiều cao chồi (mm) KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Chọn lựa khảo sát sinh trưởng phát triển mơi trường ni cấy MS LV: Để xác định mơi trường khống thích hợp ni cấy hao invitro Các chồi non thực sinh bầu đất vơ trùng hypochlorite-Na (5%) 10 phút Ch ồi non vơ trùng đưa vào ni cấy hai mơi trường khống MS LV Theo dõi đánh giá khả tạo chồi sau 30 ng ày ni cấy Kết nghiên cứu cho thấy: Mơi trường khống MS LV khơng có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng có khả phát sinh chồi hao Tuy nhi ên mơi trường LV thích hợp với mọc to hơn, vươn thẳng, xanh tốt Chọn dòng hao: Trong thí nghiệm quan sát thấy có hai dòng hao khác Một dòng cao, thân chắc, vươn thẳng; dòng thân thấp Theo nhiều tài liệu ghi nhận dòng thân cao cho hàm lượng artemisinin cao hơn, chúng tơi chọn làm vật liệu cho thí nghiệm D òng hao thân cao ni cấy nhân giống in vitro tr ên mơi trường LV + BA (0-0,1-0,3-0,5-0,7mg/l) Chúng tơi nhận thấy với nồng độ BA thấp (0,3mg/l) chồi phát triển chiều cao v số lượng Chồi xanh tốt, thân chồi vươn thẳng, to Trong đó, mơi tr ường có BA (0.5mg/l) BA (0,7mg/l), chồi phát triển khơng bình thường, xoăn, thân mọng nước Do mơi trường có bổ sung BA (0,3mg/l) thích hợp cho nhân chồi Ảnh hưởng BA, NAA 2,4 D đến khả ni cấy phát sinh tế b soma: Mơi trường ni cấy LV có bổ sung BA, NAA, v 2.4D riêng rẽ với nồng độ sử dụng cho loại chất 0-0,1-0,5-0,7-1mg/l Kết nghiên cứu cho thấy, BA, NAA v 2.4D riêng rẽ khơng kích thích phát sinh tế b soma bổ sung NAA 2.4D riêng rẽ cho thấy kích thích tạo rễ (bảng 3) Ảnh hưởng phối hợp BA NAA đến khả ni cấy phát sinh tế b soma: Mơi trường khống LV có bổ su ng BA (0,1-0,5-0,7-1,1,5-2,-2,5mg/l) NAA (0,1-0,30,5-0,7-1-1,5-2mg/l) sử dụng nghi ên cứu ni cấy phát sinh tế b soma thân rễ in vitro đưa vào ni cấy Trong nghiệm thức LV + BA (0,5mg/l) + NAA (0,5mg/l) cho phát sinh t ế bào soma đồng Với mẫu ni cấy từ mảnh lá, tế bào soma có màu trắng xanh, mịn, xốp Với mẫu ni cấy từ thân, tế bào soma có màu trắng xanh Với mẫu ni cấy từ rễ, tế b soma có màu vàng trắng, xốp 556 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ 2007 Ảnh hưởng BA, NAA 2.4D đến khả ni cấy tăng sinh tế bào soma: Mơi trường khống LV có bổ sung ri êng rẽ BA (0,1-2,5mg/l), NAA (0,1-2,5mg/l) 2.4D (0,1-2,5mg/l) nghiên cứu ni cấy tăng sinh tế b soma Kết nghiên cứu cho thấy, mơi trường khống LV có bổ sung BA (1mg/l) hay NAA (1mg/l ) hay 2.4D (1mg/l) cho khả tăng sinh tế bào 10.670mg/cụm, 10.500mg/cụm, 10.830mg/cụm Điều cho phép nhận xét BA, NAA v 2.4D có tác động kích thích tăng sinh tế bào soma Ảnh hưởng phối hợp BA NAA đến khả ni cấy tăng sin h tế bào soma: Mơi trường khống ni cấy LV có bổ sung BA (0,1 -2,5mg/l) kết hợp với NAA (0,12,5mg/l) sử dụng nghiên cứu ni cấy tăng sinh tế b soma Kết nghiên cứu cho thấy mơi trường thích hợp cho ni cấy tăng sinh l LV + BA (0,5mg/l) + NAA (0,5mg/l) Trên mơi trường ni cấy này, tế bào soma có nguồn gốc từ hay thân, sau tiếp tục cấy truyền m àu xanh diệp lục, chuyển sang màu vàng tơi xốp Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng đến q trình ni cấy tế bào soma: Các mẫu ni cấy tế bào soma đặt điều kiện mơi tr ường: (a) mơi trường che tối (b) mơi trường đặt điều kiện chiếu sáng/ngày, nhiệt độ 26-28oC Xác định điều kiện ni cấy thích hợp cho ni cấy tế b soma Kết nghiên cứu cho thấy: Trong điều kiện chiếu sáng, cụm tế b soma chuyển dần sang màu vàng đậm, tế bào rắn lại, vón cục, chuyển sang màu nâu sau tuần ni cấy Ngược lại, đặt điều kiện tối, cụm tế b soma có màu vàng trắng, tơi, xốp Nhưng khơng cấy truyền sau tháng th ì cụm tế bào soma chuyển sang màu vàng đậm hóa nâu Khả tạo artemisinin: Trong q trình ni cấy phát sinh tế bào soma từ hao in vitro mơi trư ờng MS + BA (0,5mg/l) + NAA (0,5m g/l) xuất dạng tế bào soma sau tuần ni cấy: (a) tế bào soma có màu trắng vàng nhạt xốp (b) tế bào soma có màu xanh diệp lục cứng (c) tế bào soma có màu nâu nhạt Kiểm tra artemisinin kỹ thuật chạy điện di lớp mỏng (TLC - thin layer chromatography) cho thấy có diện Khảo sát tăng sinh tế b phân tích artemisinin b ằng kỹ thuật HPLC cho thấy h àm lượng artemisinin tế bào soma màu xanh diệp lục > màu trắng vàng nhạt > màu nâu Kết cho thấy cần thiết ni cấ y tế bào soma điều kiện có chiếu sáng điều kiện bán rắn v lỏng Qua nghiên cứu đường cong sinh trưởng tế bào soma ni cấy lỏng cho thấy từ tuần thứ -3 tế bào tăng sinh mạnh mẽ, từ tuần thứ trở tăng sinh khối bắt đầu v giai đoạn ổn định (stationary phase) l giai đoạn sinh tổng hợp artemisinin Phân tích h àm lượng artemisinin giai đo ạn ni cấy tăng sinh mạnh mẽ cho thấy h àm lượng tăng theo thời gian từ 3-6-9-18 ngày sau ni cấy Điều cho thấy hàm lượng artemisinin tổng hợp xuất giai đoạn ni cấy tăng sinh KẾT LUẬN Với việc chọn dòng hao invitro, v ới việc ni cấy tế bào soma từ phận (lá, thân, rễ), hy vọng mở h ướng việc nghi ên cứu sản xuất artemisinin kỹ thuật ni cấy tế bào nhằm gúp phần phòng chống bệnh sốt rét 557 Phần VI: CƠNG NGHỆ TẾ BÀO THỰC VẬT TÀI LIỆU THAM KHẢO Hara Y., Y Yukimune, J Hiratsuka, T Nakano, K H T Chris & L K Chan (1998) Studies in tissue and cell culture of medicinal plants In: JBA & NEDO (eds) Proceedings of the Tokyo international forum on conservation and sustainable use of tropical bioresources Pp236-238 Tokyo, Japan Chan L K & S Nalammai (2001) Preparation of cell suspension of Artemisia annua In: Proceedings of the seminar on me dicinal plants - Towards of modernization of rsearch and technology in herbal industries Pp277-281 Kepong Selangor, Malaysia Nalammai S & L K Chan (2004) Effect of type of callus, MS -sugar and pH on cell suspension of Artemisia annua, an antimalarial plant In: Chang YS, M Mastura & MY Nurhanan (eds) Proceedings of the seminar on Tongkat ali, Kacip fatima and Pagaga new dimension in complimentary health care Pp109-113 FRIM, Kuala Lumpur, Malaysia Murashige T & R Skoog (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures Physiol Plant 15: 431-497 SUMMARY In vitro cloning of Artemisia annua for bioactive compounds production Pham The Anh, Le Thi Hien, Bui Thi Tuong Thu, Tran Van Minh National Key Lab of Plant Ce ll Biotechnology, Institute of Tropical Biology Artemisinin is effective against both chloroquine resistant and sensitive strains of P falciparum Yield of artemisinin in plant is low, while demand is increasing and extremely difficult synthesis in labo ratory So that we select invitro Artemisia annua L plant, make somatic cell from parts of artemisia annua (roots, stems, leaves) to provide material for producing artemisinin LV basic medium supplemented with BA (0.3mg/l) was chosen for using micropropa gation with good healthy plant Using BA, NAA and 2.4D separately was not stimulated somatic cell induction The combination of plant hormone LV + BA (0.5mg/l) + NAA (0.5mg/l) was favoured for somatic cell mass proliferation Somatic cells were cultured in the conditions of in darkness and under fluorescent light, the somatic cells was to change green color under light effected with high artemisinin content analysed by TLC and HPLC 558 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ 2007 NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT NI CẤY ĐỈNH SINH TRƯỞNG TRONG PHỤC TRÁNG V À DỊNG HỐ CÂY THƠNG BA LÁ (Pinus kesiya Royle ex Gordon) Bùi Thị Tường Thu, Trần Văn Minh PTNTĐ phía Nam CNTBTV, Viện Sinh học Nhiệt đới MỞ ĐẦU Cây thơng ba lồi thơng đư ợc trồng diện rộng Đà Lạt Được du nhập trồng từ thời Pháp thuộc L lồi đuợc sử dụng nhiều cơng nghiệp v xây dựng Hiện nay, thơng ba có t ượng thối hóa giống nh sinh trưởng chậm, bị nhiều lo ài nấm bệnh gây hại Phục tráng v dòng hóa nhu c ầu cấp thiết để phát triển rừng thơng tr ên quy mơ cơng ng hiệp Hiện cơng tác giống thơng ba lá, tr ồng rừng từ hạt thực sinh đ ược sử dụng phổ biến Ch ưa có hệ thống giống hiệu cho ng ành trồng thòng (Minh & Loan, 2003) Có nhiều báo cáo giới nghiên cứu dòng hóa thò ng, chủ yếu qua ni cấy phát sinh phơi soma (Gladfelter & Phillips, 1987), báo cáo ni cấy đỉnh sinh trưởng tư liệu nói đến Nhằm mục ti nghiên cứu áp dụng kỹ thuật ni cấy đỉnh sinh trưởng để phục tráng v dòng hóa thơng ba xây d ựng vườn giống đầu nguồn sản xuất giống phát triển v ùng trồng thơng chun canh, nghiên cứu áp dụng vào bảo tồn thơng năm hai d ẹt VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu Mẫu ni cấy: thơng ba giâm cành tro ng bầu đất (được thu thập từ thơng ba chọn dòng) Mẫu ni cấy chồi đỉnh non Điều kiện ni cấy: mơi trường vơ trùng 121oC 1at 25 phút Nhi ệt độ phòng ni cấy 28+2oC Cường độ chiếu sáng 34,2 mol/m2/s Thời gian chiếu sáng 8giờ/ngày Mơi trường ni cấy: mơi trường dinh dưỡng khống MS (MurashigeSkoog, 1962), WPM (Lloyd and McCown, 1981), LV (Litvay etal., 1985), đư ợc bổ sung BA (6-benzyl aminopurine), IAA (-indol acetic acid), IBA (-indol butyric acid), NAA (-naphthalene acetic acid), Rib (rhizopon), tyrosin, adenin, glycin, vitamin B1 nước dừa (CW) Phần VI: CƠNG NGHỆ TẾ BÀO THỰC VẬT 559 Phương pháp Thí nghiệm bố trí theo CBD đơn yếu tố, lần lặp lại, lần lặp lại ni cấy bình tam giác 300ml, bình tam giác chứa 65ml mơi trường thí nghiệm cấy mẫu Số liệu thu thập phân tích thống kê phần mềm MSTATC (P=0.05) Tỷ lệ mẫu ni cấy phát sinh chồi (%), số chồi / mẫu (chồi), chiều cao chồi (mm) KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Vơ trùng mẫu ni cấy: Mẫu ni cấy chồi đỉnh bầu đất giâm cành 12 tháng tuổi Cây mẹ thơng ba đầu d òng chọn lấy mẫu giâm hom Mơi tr ường ni cấy WPM + BA (1mg/l) Mẫu chồi đỉnh đ ược vơ trùng hypochlorite natrium (10%) 10 phút đạt mức độ vơ trùng 82,2% Ảnh hưởng mơi trường khống đến ni cấy phát sinh chồi in vitro : Chồi đỉnh sau vơ trùng ni cấy mơi trường phát sinh chồi Mơi tr ường sử dụng ni cấy l MS, WPM LV Kết nghiên cứu cho thấy mơi trường khống WPM thích hợp cho ni cấy thơng ba in vitro có tỷ lệ phát sinh chồi cao (100%), số chồi / mẫu nhiều (4.2 chồi / mẫu) v chiều cao tương đối (6,1mm) Ảnh hưởng BA đến ni cấy phát sinh chồi in vitro : Chồi in vitro ni cấy mơi trường phát sinh cụm chồi WPM có bổ sung BA Kết nghi ên cứu cho thấy mơi trường nghiệm thức B1: WPM + BA (0,5mg/ l) + NAA (0,1mg/l) cho tỷ lệ phát sinh chồi cao, số chồi / mẫu nhiều (5,2 chồi / mẫu) Ảnh hưởng BA đến nhân nhanh thơng ba in vitro : Chồi non phát sinh ni cấy mơi trường ni cấy có nồng độ BA (0,5 -1-2 mg/l) thay đổi, nhằm xác định nồng độ BA thích hợp cho vi nhân giống Kết nghi ên cứu cho thấy WPM + BA (1mg/l) thích hợp cho vi nhân giống, có tỷ lệ phát sinh cao (88,9%) v cho nhiều chồi / mẫu ni cấy (6,4 chồi ) Ảnh hưởng BA-IAA, BA-IBA đến nhân nhanh thơng ba in vitro : Trên mơi trường ni cấy bản, có bổ sung kết hợp BA -IAA, BA-IBA BA-NAA Kết nghiên cứu cho thấy mơi trường nghiệm thức C4 C5: WPM + BA (1mg/l) + IBA (0,1mg/l) thích hợp cho vi nhân giống, so với nghiệm thức B1 Ảnh hưởng tyrosine, adenine, tyrosin/adenine đến nhân nhanh thơng ba in vitro: Trên mơi trường ni cấy vi nhân giống WPM + BA (1mg/l) + IBA (0,1mg/l) bổ sung tyrosin (10mg/l), adenine (10mg/l) tyrosin (10mg/l) + adenine (10mg/l) K ết nghiên cứu cho thấy số chồi ph át sinh / cụm khơng sai khác có ý nghĩa so với nghiệm thức C5 (bảng 3) Ảnh hưởng thơng khí cường độ chiếu sáng đến đến nhân nhanh thơng ba in vitro: Trên mơi trường ni cấy vi nhân giống WPM + BA (1mg/l) + IBA (0,1mg/l) xử lý có thơng khí (nắp giấy) kín (nắp cao su) đặt cường độ chiếu sáng 11,4-22,8-34,2 mol/m2/s Kết nghiên cứu cho thấy, với cường độ chiếu sáng 22,8 mol/m2/s điều kiện ni cấy kín (nắp cao su) số chồi phát sinh 560 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ 2007 đạt cao (6,2 chồi) Trong ni cấy có thơng khí (nắp giấy), thơng ba in vitro dễ bị héo nước Ni cấy phát sinh rễ in vitro: Cây thơng ba ni cấy mơi trường phát sinh rễ WPM có bổ sung NAA v Rhizopon Kết nghiên cứu cho thấy, rễ phát sinh sau 45 ngày ni cấy mơi trường nghiệm thức E2 Sự phát sinh rễ cao (88,9%), nhiều rễ (8 rễ) rễ dài (11,1mm) KẾT LUẬN Mẫu chồi đỉnh vơ trùng hypochlorite natrium (10%) 10 phút đ ạt mức độ vơ rùng 82,2% Mơi trường khống WPM thích hợp cho ni cấy thơng ba in vitro có t ỷ lệ phát sinh chồi cao (100%), số chồi / mẫu nhiều (4.2 chồi / mẫu) chiều cao tương đối (6,1mm) Tạo cụm chồi dùng cho vi nhân giống thích hợp với mơi trường WPM + BA (0,5mg/l) cho tỷ lệ phát sinh chồi cao, số chồi / mẫu nhiều (5,2 chồi / mẫu) Thể chồi vi nhân giống hiệu tr ên mơi trường WPM + BA (1mg/l) có tỷ lệ phát sinh cao (88,9%) v cho nhiều chồi / mẫu ni cấy (6,4 chồi) mơi trường nhân chồi hiệu WPM + BA (1mg/l) + IBA (0,1mg/l) Với c ường độ chiếu sáng 22,8mol/m2/s điều kiện ni cấy kín (nắp cao su) cho số chồi phát sinh đạt cao (6,2 chồi) so với ni cấy có thơng khí, thơng ba in vitro dễ bị héo nước Ni cấy phát sinh rễ sau 45 ng ày ni cấy mơi trường WPM + rhizopon (50mg/l) cho phát sinh r ễ cao (88,9%), nhiều rễ (8 rễ) v rễ dài (11,1 mm) TÀI LIỆU THAM KHẢO Gladfelter H J & G C Phillips (1987) De novo organogenesis of Pinus eldarica in vitro I Reproducible regeneration from long -term callus cultures Plant Cell Rep (6) 163-166 Litvay J D., D C Verma & M A Johnson (1985) Effect of abscisic acid, osmoticum, and desiccation on synthesis of storag e proteins during the development of white spruce somatic embryos Ann Bot (71) 11-22 Lloyd G & B McCown (1980) Commercially feasible micropropagation of laurel, Kalmia latifolia, by use of shoot tip culture Comb Proc Int Plant Crop Soc (30) 421-427 Murashige T & R Skoog (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures Physiol Plant (15) 431-497 Trần Văn Minh, Hà Thị Loan (2003) Ứng dụng cơng nghệ tế bào thực vật phát triển ngun liệu giấy thơng Caribeae Kỷ yếu Hội nghị NCCB 2003 , Huế, pp372-376 561 Phần VI: CƠNG NGHỆ TẾ BÀO THỰC VẬT SUMMARY Application of shoot-tip culture techniques in degeneration and cloning of thong ba la ( Pinus kesiya Royle ex Gordon) Bui Thi Tuong Thu, Tran Van Minh National Key Lab of Plant Cell Biotechnol ogy, Institute of Tropical Biology Young shoots from cutting pot were used as explants in cultivation Young shoots were cultured for initiation, mass propgation on medium WPM + BA (1mg/l) + IBA (0,1mg/l) The planlets were cultured for root initiation o n medium WPM + Rhizopon (50mg/l) Plantlets were acclamitization in nursery bed A system of pine tree degeneration and cloning was established 562 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ 2007 NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT TÁI SINH PHƠI soma CÂY TIÊU (Piper nigrum L.) Bùi Thị Tường Thu, Trần Văn Minh PTNTĐ phía Nam CNTBTV, Viện Sinh học Nhiệt đới MỞ ĐẦU Tiêu đen (Piper nigrum L.) vua loại gia vị loại gia vị cổ xưa phổ biến tồn cầu Một số loại gia vị v dược phẩm sản xuất từ hạt biết đến sử dụng ngày hơm Cây tiêu chủ yếu nhân giống số ph ương pháp truyền thống như: gieo hạt, giâm cành, chiết cành Chồi đỉnh sử dụng ni cấy câ y tiêu (Philip etal, 1992; Sarma & Kalloo, 2004) Cơng ngh ệ phơi soma nghiên cứu nhiều đối tượng lâm nghiệp, cơng nghiệp, lo ài thân thảo đặc biệt tiêu (Josep etal, 1996; Ramakrishnan & Gupta, 2006) Nâng cao su ất đồng vườn tiêu trồng thâm canh thơng qua kỹ thuật tái sinh phơi soma hướng nghiên cứu khả thi VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu Mẫu ni cấy: tiêu giâm cành b ầu đất 12 tháng tuổi Điều kiện ni cấy: Mơi trường vơ trùng 121oC, 18 phút, nhiệt độ phòng ni cấy 28±2 oC, cường độ chiếu sáng 34,2mol/m2/s, thời gian chiếu sáng giờ/ngày Mơi trường ni cấy: mơi trường dinh dưỡng khống SH (Schenk Hildebrandt, 1972), MS (Murashige & Skoog, 1962) có b ổ sung 2.4D (2.4-dichlorophenoxy acetic acid), BA (6-benzyl aminopurine), NAA (-naphthalene acetic acid), Kinetin (6 furfuryl-aminopurine), nước dừa, đường sucrose Phương pháp Thí nghiệm bố trí theo CBD (đơn yếu tố) lần lặp lại, lần b ình tam giác 250ml, bình có chứa 50ml mơi trường Số liệu thu thập phân tích theo phần mềm MSTATC (P=0.05) khả tạo tế b soma, khả tăng sinh tế bào soma, số chồi tạo thành/mẫu KẾT QUẢVÀ THẢO LUẬN Vơ trùng mẫu ni cấy: Mẫu ni cấy lấy từ mẹ bầu đất 12 tháng tuổi, giống Ấn Độ Chồi đỉnh sử dụng làm mẫu ni cấy Chồi non vơ trùng Hypochorite-Na (10%) thời gian 10 phút HgCl2 (0,05%) thời gian phút Phần VI: CƠNG NGHỆ TẾ BÀO THỰC VẬT 563 cho thấy khả nhiễm thấp, chấp nhận Chồi non vơ trùng đưa vào ni cấy tạo thể chồi invitro Ảnh hưởng nồng độ đường 2.4D đến khả phát sinh tế b soma: Đọt thân (dài 1cm) tiêu in vitro chẻ dọc theo chiều d ài thân ni cấy mơi trường khống SH có bổ sung đường sucrose (15-30-45g/l) 2.4D (0,5-1-2 mg/l) Kết nghiên cứu cho thấy nghiệm thức SH + sucrose (30g/l) + 2.4D (1mg/l) cho kết phát sinh tế bào soma cao mẫu ni cấy Ảnh hưởng khối lượng tế bào đưa vào ni cấy ban đầu đến khả tăng sinh tế bào soma: Mơi trường thích hợp cho ni cấy phát sinh tế bào soma SH + sucrose (30g/l) + 2.4D (1mg/l) đư ợc dùng để ni cấy khảo sát tăng sinh tế b ào; Và ni cấy hai điều kiện: dạng bán rắn v dạng lỏng Khối lượng ban đầu tế bào soma đưa vào ni cấy ba mức 300mg, 500mg, 1000mg Kết sau tuần ni cấy cho thấy với khối l ượng ni cấy ban đầu 500mg tế b soma tăng sinh mơi trường bán rắn cho kết cao l 8811,75mg; Và sau tu ần ni cấy mơi trường lỏng, máy lắc (110rpm), nhiệt độ 24 oC, với khối lượng ban đầu ni cấy 300mg cho tế bào soma tăng sinh cao nh ất 29,37 lần Dịch huyền phù tế bào soma ni cấy trải mơi trường bán rắn SH + BA (1mg/l) + Sucrose (45g/l) cho phát sinh phơi soma đ ồng với hiệu suất cao sau 60 ng ày ni cấy Ảnh hưởng Kinetin, NAA, BA đến khả tái sinh phơi soma : Mơi trường MS có bổ sung Kin (3mg/l), NAA (0,5mg/l), BA (0 -1-3-5-7mg/l) cho nghiên cứu tái sinh phơi soma Kết cho thấy nghiệm thức MS + BA ( 5mg/l) + Kin (3mg/l) + NAA (0,5mg/l) cho kết tái sinh cao Vươn thân nhân giống phơi invitro: Cây tiêu in vitro tái sinh t tế bào phơi soma cấy chuyển vào mơi trường vươn thân nhân giống phương thức cụm chồi MS + BA (0,5mg/l) + CW (10%) Ni cấy phát sinh rễ tiêu in vitro: Cây phơi sau đủ lớn cấy chuyển qua mơi trường kích thích phát sinh rễ sau 34 ng ày ni cấy MS + NAA (0,1mg/l) KẾT LUẬN Trên đường tìm kiếm mơ hình nhân giống thích hợp cơng nghiệp, có đặc điểm giống l khả tạo hợp phần phenol lớn chiết mơi trường ni cấy làm hạn chế khả nhân giống Cây ti qua ni cấy phát sinh tế bào soma [SH + sucrose (30g/l) + 2.4D (1mg/l)], phát sinh phơi soma [SH + BA (1mg/l) + Sucrose (45g/l)], tái sinh phơi soma [MS + B A (5mg/l) + Kin (3mg/l) + NAA (0,5 mg/l)], nhân nhanh th ể chồi [MS + BA (0,5mg/l) + CW (10%)], ni cấy phát sinh rễ [MS + NAA (0,1mg/l)] cho thấy l hệ thống nhân nhanh cơng nghiệp hiệu TÀI LIỆU THAM KHẢO Joshep B., D Joseph & V J Philip (1996) Plant regeneration from somatic embryos in Black pepper Plant cell, tissues and organ culture (47) 87-90 564 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ 2007 Murashige T & R Skoog (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures Physiol Plant (15) 431-497 Nair R R & S D Gupta (2003) Somatic embryogenesis a nd plant regeneration in black pepper (Peper nigrum L.): I Direct somatic embryogenesis from tissues fo germinating seeds and ontogeny of somatic embryos The journal of Horticulture Science and Biotechnology (3) 416- 421 Nair R R & S D Gupta (2006) High -frenquency plant regeneration through cyclic secondary somatic embryogenesis in black pepper ( Piper nigrum L.) Plant cell Rep (24) 699-707 Philip V J., D Joseph, G S Triggs & N M Dickinson (1992) Micropropagation of black piper (piper nigrum L) through shoot tip cultures Plant cell reports (12) 41-44 Sarma Y R & G Kalloo (2004) Status of current research towards increased production and productivity in black piper in India Focus on Piper (1) 69-86 Schenk R U & A C Hildebrandt (1972) Medium and techniques for induction and growth of monocotyledonous and dicotyledonous plant cell cultures Can J Bot (50) 199-204 SUMMARY Study of regeneration culture techniques of black pepper (Piper Nigrum L.) somatic embryos Bui Thi Tuong Thu, Tran Van Minh National Key Lab of Plant Cell Biotechnology, Institute of Tropical Biology Black pepper, the king of spices, is one of the oldest and the most popular spice in the world Some hotly pungent sp ice and medical products which made from its berries are some of the earliest products to be known and are probably the most widely used in the world today Black pepper is maily cultured by seedlings, stem cuttings, marcottings In order to increase the y ield and resistant capability to some of popular deseases Study of somatic embryogenesis and manipulation is realizable direction for those purposes: somatic cell induction [SH + sucrose (30g/l) + 2.4D (1mg/l)], embryogenesis [SH + BA (1mg/l) + Sucrose (4 5g/l)], embryogenic cell regeneration [MS + BA (5mg/l) + Kin (3mg/l) + NAA (0,5 mg/l)], elongation and micropropagation [MS + BA (0,5mg/l) + CW (10%)], and rooting culture [MS + NAA (0,1mg/l)] proved that there was an efficient system for black piper in vit ro propagation through embryogenesis culture established Phần VI: CƠNG NGHỆ TẾ BÀO THỰC VẬT 565 NGHIÊN CỨU NI CẤY PHÁT SINH V À TÁI SINH PHƠI soma THƠNG ĐỎ (Taxus wallichiana Zucc) in vitro Bùi Thị Tường Thu, Trần Văn Minh PTNTĐ phía Nam CNTBTV, Viện Sinh học Nhiệt đới MỞ ĐẦU Cây thơng đỏ dòng Taxus sp var wallichiana (Zucc.) Hook lồi b ản địa Việt Nam, sót lại khơng q 16 Cao ngun lâm viên Liang Biang, có đư ờng kính thân 75cm, lồi sinh trư ởng chậm Bảo tồn phát triển thơng đỏ Đà Lạt u cầu cấp thiết lồi q có giá trị chiết xuất taxol phòng chống bệnh ung thư Phương thức nhân giống truyền thống l gieo hạt giâm cành ghép cành (Ho, 1998) Tuy nhiên, h ạt mau sức nẩy mầm số lượng hạt cho mùa trái thấp; giâm cành thường có tượng sinh trưởng chậm ngã nghiêng (plagiotropically) khơng thẳng đứng (Chang etal, 2001) Ni cấy vi nhân giống thơng đỏ dòng Taxus media Taxus mairei ghi nhận năm gần (Cerdeira, 1994; Chang etal, 1998), nhiên in vitro sinh trư ởng chậm bảo lưu cục tính ngả nghiêng Ni cấy phơi soma kỹ thuật ni cấy in vitro để vượt qua khả nẩy mầm hạt giống v hạn chế vấn đề sinh trưởng chậm in vitro thân gỗ kim (Gupta & Durzan, 1987) Kết hợp kỹ thuật ni cấy phát sinh, tái sinh phơi soma dòng hóa in vitro hạn chế mức thấp tính bảo l ưu ngả nghiêng cục kỹ thuật vi nhân giống nâng cao hiệu suất nhân nhanh thơng đỏ in vitro (Amos & McCown, 1981; Chee, 1995) VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu Vật liệu đưa vào ni cấy phát sinh tế bào soma thân thơng đ ỏ dòng hóa in vitro Tế bào soma thu nhận qua ni cấy từ thân đưa vào nghiên cứu ni cấy tăng sinh mơi trường agar lỏng Dịch huyền phù thu nhận sau tuần ni cấy đ ược xác định mật độ sử dụng ni cấy phát sinh tái sinh phơi soma Mật độ tế bào: đếm buồng đếm hồng cầ u (có cấu tạo khung đếm Thoma, bao gồm 25 lớn lớn có 16 nhỏ, diện tích nhỏ l 1/400mm 2, chiều cao 0,1mm) giọt dung dịch, sau đ ược tính 1ml dung dịch với nồng độ pha lo ãng 10 -1 với cơng thức tính: Số tế bào / ml mẫu = [ a x 4000 x 1000 ] / H 566 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ 2007 Với: a: số tế bào trung bình có diện tích vi trường (ơ nhỏ) 4000: số quy đổi 1/400mm2 thành 1mm 1000: số quy đổi từ 1mm thành 1ml H: hệ số pha lỗng Mơi trường ni cấy nghiên cứu phát sinh tăng sinh t ế bào soma agar lỏng, phát sinh tái sinh phơi: WPM + Cw (10%) + vitaminB (5mg/l) + Glycin (5mg/l) + sucrose (30g/l) Điều kiện ni cấy: mơi trường vơ trùng 121oC, 1at, 25 phút Nhi ệt độ phòng 28+2oC, cường độ chiếu sáng 33,4μmol/m 2/s, thời gian chiếu sáng giờ/ng ày Hạt nhân tạo: Phơi soma trộn vào hỗn hợp: dung dịch alginate(3 o/oo) + mơi trường ni cấy WPM, hỗn hợp nhỏ giọt vào dung dịch CaCl 2(2%) Hạt nhân tạo chứa phơi tồn trữ phytotron nhiệt độ 15 oC, thời gian chiếu sáng 8giờ/ngày, cường độ chiếu sáng 11,1µmol/m 2/s Phương pháp: Thí nghiệm bố trí theo CBD yếu tố, nghiệm thức có lần lặp lại Mỗi lần lặp lại ni cấy bình tam giác 300ml Mỗi bình tam giác ni cấy mẫu Số liệu xử lý phần mềm thống k ê MSTATC KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Ni cấy phát sinh tế bào soma Mục tiêu thí nghiệm tìm mơi trường thích hợp cho ni cấy phát sinh tế bào soma khả tăng sinh khối Mẫu ni cấy ban đầu thân in vitro, với trọng lượng lượng mẫu ban đầu đ ưa vào ni cấy 0,5g Trọng lượng tươi tăng lên tính cách lấy trọng lượng tươi tuần sau ni cấy trừ cho trọng lượng ban đầu Ni cấy phát sinh tế bào soma điều kiện che tối hồn tồn: mơi trường ni cấy bản: WPM + Cw (10%) + vitaminB (5mg/l) + Glycin (5mg/l) + sucrose (30g/l) + BA (0,1mg/l) + NAA (0 -1-3-5-7mg/l) Tỷ lệ phát sinh phơi soma cao 93.33% (với mẫu ni cấy thân) 96.67% (với mẫu ni cấy lá) nồng độ NAA (3mg/l), kết tương tự 90% (mẫu thân) 93.33% (mẫu lá) ghi nhận với nồng độ NAA (5mg/l) Trọng lượng tươi tế bào soma tăng lên cao nh ất 2.10g (với mẫu ni cấy l thân) 2.23g (với mẫu ni cấy lá) nồng độ NAA (3mg/l), kết ghi nhận thấp 1.57g (mẫu thân) 1.67g (mẫu lá) nồng độ NAA (5mg/l) Vậy với mơi trường ban đầu, có bổ sung nồng độ NAA biến thi ên khác (0-7mg/l), cho thấy mẫu thân hay có khả phát sinh tế b soma cao (90-96.67%) nồng độ NAA (3-5mg/l); trọng lượng tươi tăng lên sau tuần ni cấy ghi nhận mức 2.10-1.57g (mẫu thân) 2.23-1.67g (mẫu lá) với nồng độ NAA (3 -5mg/l) Ni cấy phát sinh tế bào soma điều kiện có chiếu sáng (22,2μmol/m2/s): mơi trường ni cấy bản: WPM + Cw (10%) + vitaminB (5mg/l) + Glycin (5mg/l) + sucrose Phần VI: CƠNG NGHỆ TẾ BÀO THỰC VẬT 567 (30g/l) + BA (0,1mg/l) + NAA (0-1-3-5-7mg/l) Tỷ lệ phát sinh phơi soma cao 86.67% (với mẫu ni cấy thân) 90% (với mẫu ni cấy ) nồng độ NAA (3mg/l), kết tương tự 73.33% (mẫu thân) 76.67% (mẫu lá) ghi nhận với nồng độ NAA (5mg/l) Trọng lượng tươi tế bào soma tăng lên cao 1.53g (với mẫu ni cấy thân) 1.90g (với mẫu ni cấy lá) nồng độ NAA (3mg/l), kết ghi nhận thấp 1.27g (mẫu thân) 1.60g (mẫu lá) nồng độ NAA (5mg/l) Vậy với mơi tr ường ban đầu, có bổ sung nồng độ NAA biến thi ên khác (0-7mg/l), cho thấy mẫu thân hay có khả phát sinh tế bào soma cao (73.33-90%) nồng độ NAA (3-5mg/l); trọng lượng tươi tăng lên sau tuần ni cấy ghi nhận mức 1.53-1.27g (mẫu thân) 1.90-1.60g (mẫu lá) với nồng độ NAA (3-5mg/l) Kết luận: với mơi trường ni cấy ban đầu có thay đổi nồng độ NAA (0 7mg/l) bổ sung, kết cho thấy mẫu thân đưa vào ni cấy có khả phát sinh tăng sinh kh ối tế bào soma; với mẫu ni cấy cho tỷ lệ phát sinh tế bào soma khả tăng sinh khối cao nồng độ NAA (3 -5mg/l) hai điều kiện ni cấy tối hồn tồn có chiếu sáng 2000lux Và mơi trường ban đầu sử dụng cho nghi ên cứu tiếp sau Nhân sinh khối tế bào soma mơi trường Agar Mẫu ni cấy ban đầu tế bào soma sau ni cấy tuần từ thí nghiệm đ ã loại bỏ phận thân chưa phát sinh, với trọng lượng tươi ni cấy ban đầu 1g ni cấy tuần Trọng l ượng tươi tăng sinh tính cách lấy trọng l ượng tươi sau tuần ni cấy trừ cho trọng l ượng tươi ban đầu Mơi trường ni cấy bản: WPM + Cw (10%) + vitaminB1 (5mg/l) + Glycin (5mg/l) + sucrose (30g/l) + TDZ (0-0.1-0.5-1-3mg/l) hay + BA (0.5-1-2-4mg/l) Kết nghiên cứu cho thấy: bổ sung TDZ (0 -3mg/l), khả tăng sinh khối tế bào soma cao (5.07g) nồng độ TDZ (0.5mg/l) v giảm dần tăng dần nồng độ TDZ Tế bào soma tăng sinh có d ạng xốp Màu sắc thay đổi từ vàng (TDZ=00.1mg/l), vàng đậm (TDZ=1mg/l), vàng nâu (TDZ=3mg/l) đ ến vàng xanh (TDZ=0.5mg/l) Khi bổ sung BA (0-4mg/l), khả tăng sinh khối tế b soma cao (3.67g) nồng độ BA (2mg/l) giảm tăng dần nồng độ BA Tế b soma tăng sinh có dạng mơ cứng Màu sắc thay đổi từ vàng trắng (BA=0-0.5mg/l), vàng (BA=1mg/l), đến vàng xanh (BA=2-4mg/l) Kết luận: ni cấy tế bào soma mơi trư ờng có bổ sung TDZ cho thấy khả tăng sinh khối cao (5.07g), tế b soma xuất có dạng xốp, l loại tế bào cho ni cấy tăng sinh nhanh cấy truyền; ng ược lại bổ sung BA, tế bào xuất có dạng tế b chặt, loại tế bào cho khả tăng sinh chậm cấy truyền TDZ thích hợp cho ni cấy tăng sinh khối v BA thích hợp cho ni cấy phát sinh phơi Nhân sinh khối tế bào soma mơi trường lỏng Mẫu ni cấy ban đầu tế bào soma từ thí nghiệm 1, trọng lượng ban đầu 1g ni cấy máy lắc với nhiệt độ ổn định l 14oC thời gian 30 ngày Mơi 568 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ 2007 trường ni cấy bản: WPM + Cw (10%) + vitaminB1 (5mg/l) + Glycin (5mg/l) + sucrose (30g/l) + TDZ (0.1-0.5-1mg/l) hay + BA (1-2mg/l) Kết nghiên cứu cho thấy: mơi trường ni cấy có bổ sung TDZ (1mg/l) cho khả tăng sinh cao với mật độ tế b 1410x10 tế bào /ml; tương tự với BA (2mg/l) cho khả tăng sinh với mật độ 1023x10 tế bào /ml Kết ni cấy mơi trường lỏng cho thấy TDZ l chất điều hòa sinh trưởng thích hợp cho ni cấy tăng sinh tế bào so với BA Tái sinh tế bào phơi soma Mẫu ni cấy tế bào soma thu nhận qua ni cấy lỏng tr ên mơi trường ni cấy có bổ sung TDZ (1mg/l) Dịch huyền ph ù tế bào trải mơi trường phát sinh tái sinh phơi soma trực tiếp Mơi trường ni cấy bản: WPM + Cw (10%) + vitaminB1 (5mg/l) + Glycin (5mg/l) + sucrose (30g/l) b ổ sung tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng TDZ (0-0.1-0.5-1-3mg/l) + ABA (0.5mg/l) hay TDZ (0.1 -0.51-3mg/l) + BA (2mg/l) hay TDZ (0.1-0.5-1-3mg/l) + kinetin (2mg/l) Kết nghiên cứu cho thấy, dịch huyền phù tế bào soma biệt hóa phơi soma sau tuần (2 tháng) ni cấy chuyển qua q trình tái sinh sau tháng ni cấy Mơi trường ni cấy có bổ sung tổ hợp TDZ+ABA, TDZ+BA hay TDZ+kinetin đ ều cho phát sinh phơi sau tháng ni cấy Khi bổ sung Ki BA vào mơi trường ni cấy tế bào soma có dạng xanh chặt; đồng thời kéo dài thời gian ni cấy phần mơ bên tiếp xúc với mặt thạch bi đen, mặ t tạo nên lớp mơ trắng rời rạc Trên mơi trường có bổ sung ABA mơ có dạng m àu xanh vàng xốp, đỉnh phơi xuất nhiều Khi ni cấy kéo dài mơ trở nên xanh hơn, mơi trường bị hóa nâu hơn, tế bào bị chết Riêng mơi trường ni cấy có bổ sung tổ hợp chất điều h òa sinh trưởng TDZ (1mg/l) + ABA (0.5mg/l) xuất chồi tái sinh sau tháng ni cấy Cây từ phơi ni cấy mơi trường phát sinh rễ WPM + NAA (3mg/l) + Rhizopon (50mg/l) Riêng mơi trường ni cấy có bổ sung tổ hợp chất điều h òa sinh trưởng TDZ (1mg/l) + ABA (0.5mg/l) xuất chồi tái sinh sau tháng ni cấy Bảo tồn tế bào phơi soma Bảo tồn tế bào phơi thơng đỏ in vitro: Phơi soma chuyển qua giai đoạn phát sinh chồi (sau tháng ni cấy mơi trường phát sinh phơi), phơi có đỉnh chồi nhọn, đ ược tách cụm 3-5 phơi, trộn vào hỗn hợp alginate nhỏ giọt vào dung dịch CaCl2 (2%) tạo hạt Hạt tồn trữ phytotron Hạt phơi nhân tạo đ ược đưa vào ni cấy tái sinh phát sinh chồi sau tháng ni cấy mơi trường có bổ sung TDZ (1mg/l) + ABA (0.5mg/l) KẾT LUẬN Mơi trường ni cấy có bổ sung TDZ thích hợp cho ni cấy tăng sinh tế bào soma mơi trư ờng agar mơi trường lỏng; tổ hợp chất điều h òa sinh trưởng TDZ+ABA bổ sung vào mơi trường ni cấy thích hợp cho phát sinh v tái sinh phơi soma 569 Phần VI: CƠNG NGHỆ TẾ BÀO THỰC VẬT TÀI LIỆU THAM KHẢO Amos R R & B McCown (1981) Micropropagation of members of the Coniferae Hortic Sci (16): 453 Cerdeira R M., J D McChesney & C Jr Burandt (1994) Microcuttings of Taxus media cv Hicksii In Vitro Cell Dev Biol Anim (30A): 59 Chang S H., C K Ho, Z Z Chen & J Y Tsay (2001) Micropropagation of Taxus mairei from mature trees Plant Cell Report (20): 496-502 Chee P P (1995) Organogenesis in Taxus brevifolia tissue cultures Plant Cell Report (14):753-757 Gupta P K & D J Durzan (1987) Micropropagation and phase specificity in mature elite Douglas fir J Am Soc Hortic Sci (112):969-971 Ho C K., S H Chang & J Y Tsai (1998) Selection breeding, propagation and cultivation of Taxus mairei in Taiwan Halb Taiwan For Res Inst (88): 65-82 Lloyd G & B McCown, 1981 Commercially feasible micropropagation of mountain laurel, Kalmia latifolia, by use of shoot-tip culture In: Comb Proc Intl Plant Prop Soc., (30): 421-426 Murashige T & F Skoog (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures Physiol Plant 15: 473-479 SUMMARY Study of somatic cell induction and regeneration of embryogenic cell of taxus trees (Taxus wallichiana Zucc) in vitro Bui Thi Tuong Thu, Tran Van Minh National Key Lab of Plant Cell Biotechnology, Institute of Tropical Biology The basic medium WPM was used for somatic cells induction WPM medium was supplemented with BA+NAA favoured for somatic cells induction via in vitro stems or leaves cultured in the conditions of darkness or fluorescence The composition of medium was determined WPM + Cw (10%) + vitaminB1 (5mg/l) + Glycin (5mg/l) + sucros (30g/l) + BA (0,1mg/l) + NAA (0-1-3-5-7mg/l) The basic medium WPM supplemented with TDZ was favoured to enhance the somatic cell biomass on semi -solid cultivation in the composition of WPM + Cw (10%) + vitaminB1 (5mg/l) + Glycin (5mg/l) + sucrose (30g/l) + TDZ (0 -0.1-0.51-3mg/l) /or + BA (0.5-1-2-4mg/l) and liquid cultivation in the composition of WPM + Cw (10%) + vitaminB1 (5mg/l) + Glycin (5mg/l) + sucrose (30g/l) + TDZ (0.1 -0.5-1mg/l) /or + BA (1-2mg/l) The composition of plant growth regulators supplemented TDZ+ABA to m edium was favoured for embryogenic induction and regeneration cultured such as WPM + Cw (10%) + vitaminB1 (5mg/l) + Glycin (5mg/l) + sucrose (30g/l) + TDZ (1mg/l) + ABA (0.5mg/l) Embryogenic cells was immobilized by alginate-Na solution (2o/oo) for conservation under temperature of 15oC and light intensity of 11.1 µmol/m2/s in phytotron conditions [...]... vườn ươm 440 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007 NHIÊN CỨU SỰ KHỬ TRÙNG, TẠO CHỒI VÀ TẠO RỄ in vitro TRÊN GIỐNG ĐIỀU CAO SẢN (Anacardium occidentale L.) Nguyễn Đình Sỹ, Huỳnh Hữu Đức, Nguyễn Thị Quỳnh Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới MỞ ĐẦU Cây điều, Anacardium occidentale L., thuộc họ Anacardiaceae, l à cây công nghiệp có tằm quan trọng về kinh tế ở một số n ước vùng nhiệt đới... mg/L) Shoots were rooted on 1/2 MS medium and in vitro culture plant conditions was described 430 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007 SỬ DỤNG TINH BỘT TRONG NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH PHONG LAN BẰNG NUÔI CẤY MÔ Ở ĐIỀU KIỆN ÁNH SÁNG TỰ NHIÊN Vũ Ngọc Phượng, Thái Xuân Du Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới MỞ ĐẦU Hiện nay chi phí điện cho máy lạnh v à đèn chiếu sáng chiếm một tỷ trọng cao... late period of cultivation The same results obtained for Dendrobium, Doritanopsis and Catleya multiplicated in vitro 436 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007 NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH CÂY vani BẰNG NUÔI CẤY MÔ Vũ Ngọc Phượng, Lê Hoàn Hảo, Thái Xuân Du Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới MỞ ĐẦU Vani có nguồn gốc từ vùng Mexicô, vùng Caribbean thu ộc châu Mỹ nhiệt đới Sản xuất vani năm 2001... but also created a way somehow to “harden” orchids for better adaptable plantlets to greenhouse conditions 426 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007 NHÂN in vitro GIỐNG TIÊU GỐC GHÉP (Piper columbrium Link.) Đỗ Đăng Giáp, Đoàn Thị Ái Thuyền Thái Xuân Du Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới MỞ ĐẦU Hồ tiêu (Piper) là một chi lớn, gồm khoảng 1.200 lo ài, phân bố chủ yếu ở các khu vực... Plant., 15, 473 -479 445 Phần VI: CÔNG NGHỆ TẾ BÀO THỰC VẬT 5 Philip VJ (1984) In vitro organogenesis and plantlet formation in cashew (Anacardium occidentale L.) Ann Bot (54): 149-152 6 Vũ Ngọc Phượng, Nguyễn Thị Quỳnh, Nguyễn Minh Tuấn, Thái Xuân Du (2003) Bước đầu nghiên cứu nhân giống in viro cây điều ( Anacardium occidentale L.) Tuyển tập của Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc lần thứ 2, tổ... s were pretreated with IBA (100 mg/L) for 1 h compared with that in the same concentration of NAA 446 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007 NHÂN GIỐNG in vitro MỘT SỐ GIỐNG HỒ TI ÊU (Piper nigrum L.) SẠCH virus Đoàn Thị Ái Thuyền, Đỗ Đăng Giáp, Thái Xuân Du Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới MỞ ĐẦU Trong những năm gần đây việc tăng diện tích trồng ti êu ồ ạt đã dẫn tới tình trạng... nồng độ đường và điều kiện ánh sáng lên sự tăng trưởng của lan Dendrobium nuôi cấy in vitro Tạp chí Khoa học v à Công nghệ 44 (3), 100-106 2 Vũ Ngọc Phượng , Đ T A Thuyền, L V Dũng, T X Du & N V Uyển (2001) Quy trình ươm cây hồng (Paulownia fortunei) giai đoạn sau ống nghiệm Trong cuốn: Công nghệ Sinh học v à Nông nghiệp Sinh thái Bền vững Viện Sinh học Nhiệt đới NXB Nông nghiệp 69 -75 3 Vũ Ngọc Phượng... nồng độ theo bảng 1 Bảng 1 Mô tả thí nghiệm Nghiệm thức Nồng độ % (W/V) Thời gian (phút) J1 J2 J3 0,6 1,0 1,4 20 20 20 441 Phần VI: CÔNG NGHỆ TẾ BÀO THỰC VẬT Sau khi được khử trùng, hạt được cấy trên môi trường khoáng MS (Murasighe v à Skoog, 1962) có bổ sung agar 9g/L (Công ty Cổ phần Đồ hộp Hạ Long, Quảng Ninh), than hoạt tính 3g/L Mỗi nghiệm thức gồm 10 b ình, mỗi bình cấy 2 nhân hạt điều Mỗi nghiệm... con ra vườn ươm 449 Phần VI: CÔNG NGHỆ TẾ BÀO THỰC VẬT KẾT LUẬN 1 2 3 4 5 Sử dụng chất kháng sinh x êfotaxin (0,5%) kết hợp với các phương pháp khử trùng bề mặt, không những loại bỏ đ ược các nguồn lây nhiễm b ên ngoài mà còn có tác dụng diệt được các mầm bệnh nội sinh b ên trong mẫu hồ tiêu Môi trường MS có bổ sung BA = 2,0mg/l, IBA = 0,5mg/l thích hợp nhất cho quá trình tạo chồi từ đốt ở cây hồ... (0,5mg/l) để tạo chồi Tạo cụm chồi từ đốt trên môi trường MS có bổ sung BA (0 -5mg/l), indole-3-butyric acid IBA (0,5mg/l) Các chồi dài 2-3 cm, được nuôi cấy trên môi trường trên MS để tạo cây Phần VI: CÔNG NGHỆ TẾ BÀO THỰC VẬT 427 con hoàn chỉnh Ươm cây nhân giống in vitro ngoài vườn ươm Cây tiêu gốc ghép được kiểm tra virút bằng kỹ thuật ELISA, tr ước, trong và sau khi nuôi cấy in vitro đối với các loại ... VI: CƠNG NGHỆ TẾ BÀO THỰC VẬT KHẢO SÁT SỰ TĂNG TRƯỞNG in vitro CỦA CÂY KHOAI LANG Ipomoea batatas L TRONG ĐIỀU KIỆN CHIẾU SÁNG TỰ NHIÊN Nguyễn Mỹ Un, Đỗ Đăng Giáp Phòng Cơng nghệ tế bào thực... thuộc Ph òng Cơng nghệ Tế bào, Viện Sinh học Nhiệt đới, Viện Khoa học v Cơng nghệ Việt Nam Hình 3: Cây lan Phalaenopsis c mơ trước trồng vườn ươm 422 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ 2007 KẾT QUẢ... nhiên, vi ệc ứng dụng phương pháp ni cấy lớp mỏng tế bào thân gỗ chưa cơng bố nhiều Trong chúng tơi trình bày m ột số kết nghi ên cứu ni cấy lớp mỏng tế bào từ đốt thân mầm v đốt tử diệp điều VẬT LIỆU