Chiết xuất và phân lập isoflavonoid hạt đậu tương ( glycine max l )merr , fabaceae) Chiết xuất và phân lập isoflavonoid hạt đậu tương ( glycine max l )merr , fabaceae) Chiết xuất và phân lập isoflavonoid hạt đậu tương ( glycine max l )merr , fabaceae) Chiết xuất và phân lập isoflavonoid hạt đậu tương ( glycine max l )merr , fabaceae) Chiết xuất và phân lập isoflavonoid hạt đậu tương ( glycine max l )merr , fabaceae) Chiết xuất và phân lập isoflavonoid hạt đậu tương ( glycine max l )merr , fabaceae) Chiết xuất và phân lập isoflavonoid hạt đậu tương ( glycine max l )merr , fabaceae) Chiết xuất và phân lập isoflavonoid hạt đậu tương ( glycine max l )merr , fabaceae) Chiết xuất và phân lập isoflavonoid hạt đậu tương ( glycine max l )merr , fabaceae) Chiết xuất và phân lập isoflavonoid hạt đậu tương ( glycine max l )merr , fabaceae) Chiết xuất và phân lập isoflavonoid hạt đậu tương ( glycine max l )merr , fabaceae) Chiết xuất và phân lập isoflavonoid hạt đậu tương ( glycine max l )merr , fabaceae) Chiết xuất và phân lập isoflavonoid hạt đậu tương ( glycine max l )merr , fabaceae) Chiết xuất và phân lập isoflavonoid hạt đậu tương ( glycine max l )merr , fabaceae) Chiết xuất và phân lập isoflavonoid hạt đậu tương ( glycine max l )merr , fabaceae) Chiết xuất và phân lập isoflavonoid hạt đậu tương ( glycine max l )merr , fabaceae) Chiết xuất và phân lập isoflavonoid hạt đậu tương ( glycine max l )merr , fabaceae) Chiết xuất và phân lập isoflavonoid hạt đậu tương ( glycine max l )merr , fabaceae) Chiết xuất và phân lập isoflavonoid hạt đậu tương ( glycine max l )merr , fabaceae) Chiết xuất và phân lập isoflavonoid hạt đậu tương ( glycine max l )merr , fabaceae) Chiết xuất và phân lập isoflavonoid hạt đậu tương ( glycine max l )merr , fabaceae) Chiết xuất và phân lập isoflavonoid hạt đậu tương ( glycine max l )merr , fabaceae) Chiết xuất và phân lập isoflavonoid hạt đậu tương ( glycine max l )merr , fabaceae)
Trang 1BO Y TE
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
HOÀNG THỊ MAI ANH
CHIET XUAT VA PHAN LAP
ISOFLAVONOID TU HAT DAU TUONG ( Glycine max(L.) Merr.,Fabaceae)
KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP DƯỢC SỸ
Hướng dẫn khoa học: TS Đỗ Quyên
Trang 2Loicam on
Em xin chân thành cảm ơn TS Đỗ Quyên, Bộ môn Dược liệu - Trường Đại học Dược Hà Nội, cô đã nhiệt tình truyền đạt cho em những kinh
nghiệm và kỹ thuật làm thực nghiệm nghiên cứu khá học, đề em có thê hoàn thành khoá luận tốt nghiệp này
Em xin chán thành cảm ơn các thay, các cô, các anh chị kỹ thuật viên trong Bộ môn Dược liệu đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện cho em hoàn thành khóa luận đúng thời hạn
Va cudi cùng em gửi lời cám ơn tới bô mẹ, các anh chỉ, các bạn đã luôn
ở bên cạnh động viên em trong suốt thời gian qua Cám ơn nhóm làm thực
nghiệm tại bộ môn Dược liệu đã cùng nhau vượt qua những thời điểm khó
khăn nhất đề hoàn thành đề tài
Hà Nôi, ngày l7 tháng 5Š năm 2010
Sinh viên
Trang 3MUC LUC
PAT VAT DE sscscxcvcercvvevacevaereveonnneepnenunnannacerexesauncorceasesnsunmenncnsaneucaencansesens 1
CHƯỜNGH, TỎNG QUẦN ga hao di th hh toa 3i 8d ál0kãd038340 3
1 PÔNH ND: Về GGHWHHI ca cosacianoianiiigttinbdooDtgV G3004 30 :0nigsgnt2e 3
1.1.1 Cấu tạo hóa học của Isoflavonoid -.-‹¿ - 55ses+szzss+zxsss2 3
1.1.2 Tác dụng sinh học của i$oflaVOHƠIỦ.: / ‹.¿2 220/202 00 222226 6 1.2 Tổng quan về đậu tương Glycine max (L.) Merr -. 10
1.2.1 Đặc điểm thực vật, sự phn b6 ccccccccescesesesseseesesessesesseeeeeeens 10
1.2.2 Thành phan héa hoe ctia Glycine max (L.) Merr 11 1.3.3 Tác dụng dược lý của G80 tW0nG sisisiicscaccsssicisccisciinicsssacsees 14
CHƯƠNG 2 ĐÔI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16
DL Ney ny NOU occccsiccsersssvocsonxeserosvenrseseonescnceensesernnsaneestsvennessqusereseyseeeresys 16 22 PROG tibn TEHIEN CON iiiiccninicinnimncnmancannanannamcan 16 2.2.1 Thuốc thử, dung môi, hOa chat .c.cccccccccccessesesssseseeeseesesseeeeveee l6 ee LUST ORL tran rrgannneeernartniovokeriiftesreii934314000095266204205040y258/2e2x00ø3i0t 17 2.3 Phương DpRảD ng DỮU sa cccvcueobiotoyciioiiskisiv0141614162141450063646060154 17
2.3.1 Chiết xuất Isoflavonoid từ hạt đậu tương - ssszs+2 17
2.3.2 Phân lập Isoflavonoid từ hạt Đậu tương cv 18 2.3.3 Xác định cấu trúc các hợp chất isoflavonid phân lập được 18
CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KÉT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 19
3.1 Định tính 4 nhóm chất chính: chất béo, đường, acid amin và
isoflavonoid của dịch chiết hạt đậu tương .- -‹-¿ 5¿- 5+2 19
re _ŠŠ—-—+-——-ĂẰẰ 19
3.12 Đình thih ACIS OMAN aengavseaddgddoGododriddddidi66ias404a06 20
3:1:3 90W tHN GHẤ ĐỀU ucannuingicngoggoagghogghghNg 2k4432bg00430001868380 20
Trang 43.2 Chiét xuat Isoflavonoid DWDiDE0G000060//0177060000700900000901001006/200510/000194//0u100 21
3.2.1 Quy trình chiết xuất isoflavonoid - + + ss©c<csczssscs<e 21 3.2.2 Định tính 4 nhóm chất chính trong địch chiết EtOH70° và 96° 22
3.2.3 Quy trình loại tạp địch chiết đậu tương EtOH70? và 96° 22 3.3 Phân lập và nhận dạng Isoflavonoid ‹- - 5 << 5<<x<<+2 24
3.3.1 Định tính Isoflavonoid bằng sắc ký lớp mỏng 24
3.3.2 Phần lập To fllaYDHO co eeeeiiiaidrieeseee a5
13134 NE NI d0 00 GHẾ HN ca cccuaoaeciesvsxiissacbi0saooescea 27
GIÁ, HẦU I cca cecevscannunssennaeonniancunieaecanianwaeianaaeivis Kholivkoic)999090000/0808001400006 27
Trang 5DANH MUC CAC BANG STT | Ky hiéu Tén bang bang
| | Bang 1.1 Cac phan nhom isoflavonoid
2 | Bang 1.2 Cấu trúc hóa học của các Isoflavonoid trong Đậu
tương
3 | Bang 13 Hàm lượng các Isoflavonoid trong một số cây họ Đậu và thực phẩm làm từ Đậu tương
4 | Bảng 3.1 | Kết quả định tính 4 nhóm chất chính của 2 dịch chiết EtOH 707 và 96” từ hạt đậu tương
5 | Bang 3.2 | Ket qua dinh tính 4 nhóm chất chính của 2 dịch chiết EtOH 70° va 96” từ hạt đậu tương sau khi đã loại tạp
6 | Bảng3.3| Bảng giá trị Rf của các vết trên sắc ký đồ hình 3.2
Trang 6DANH MUC CAC HINH STT | Ky hiéu Tên hình hình
1 Hinh 1.1 Cấu trúc hóa học của Oestradiol, điethylstilbenstrol
va 2 hormon thuc vat genistein va daidzein
2 | Hinh 1.2 Cấu trúc hóa học của các Isoflavonoid trong Đậu
tương
3 Hình 2.1 Hạt và quả đậu tương
4 | Hình3.2 Sắc kí đô dịch chiết EtOH96” quan sát ở UV 254 nm 5 |Hình33 Công thức cầu tạo của Daidzin (Daidzein glucosid)
Trang 8DAT VAN DE
Một trong những vấn đề về sức khỏe đáng lo ngại ở phụ nữ tuổi tiền
mãn kinh là việc thiếu hụt hormon sinh dục (oestrogen) Điều này gây ra một
số triệu chứng như rỗi loạn vận mạch, các bệnh tim mạch, tăng hàm lượng
lipid máu, loãng xương, ung thư vú Để phòng tránh các rối loạn trên, ở nhiều nước trên thế giới, phụ nữ tuổi tiền mãn kinh thường được sử dụng liệu pháp điều trị thay thế hormon Tuy nhiên, việc sử dụng liệu pháp điều trị thay thế hormon bằng việc đưa oestrogen có nguồn gốc tông hợp hay chiết xuất từ động vật có vú vào cơ thê lại không an toàn vì có thể gây thừa oestrogen Đó lại là nguyên nhân gây ung thư vú và ung thư buông trứng [21], [22]
Ở Pháp, có khoảng 30% phụ nữ tuổi tiền mãn kinh sử dụng liệu pháp
điều trị thay thế hormon oestrogen thực vật (phytoestrogen) Các oestrogen
thực vật là các isoflavonoid, stilben, lignan và coumestan Chúng có cấu trúc
không giống các hormon steroid nhưng có tác dụng sinh học giống oestrogen
Việc sử dụng liệu pháp điều trị thay thế hormon bằng các phytoestrogen theo thống kê đem lại kết quả tốt và có độ an toàn cao [21], [22]
Từ lâu, Đậu tương đã được xem như một loại thực pham rất tốt cho phụ
nữ, nhất là phụ nữ trong độ tuổi tiền mãn kinh Lí do là trong đậu tương có
hoạt chất nhóm isoflavonoid [13], [16] [18] Nhiều loại thực phẩm có nguồn
gốc từ thực vật đã được xác định là có chứa isoflavonoid như bột lúa mach
(Hordeum sp.), hạt hướng dương (Helianthus annuus), hat cay co ba la
(Trifolium uniflorum), hat cay carum (Cuminum cymicum), hat lac (Arachis
hypogaea), dau do (Phaseolus vulgaris), dau xanh (Cicer arietinum), dau Ha Lan (Pisum sativum), cay dau lang (Lens culinaris), co linh lang (Medicago
Trang 9ra mói liên hệ giữa việc cung cấp thường xuyên các phytoestrogen trong khâu
phần ăn hàng ngày có tỷ lệ mắc thấp các bệnh như ung thư vú, ung thư tử cung [22] Tuy nhiên, hàm lượng các phytoestrogen trong thực phẩm được sử dụng hàng ngày thường là rất thấp Do vậy, trong liệu pháp điều trị thay thế hormon bằng các oestrogen thực vật, người ta thường phải bổ sung thêm dưới dạng thuốc uống hay thực phẩm giàu các chất này
Vì lí do trên, chúng tôi đề xuất nghiên cứu “Chiết xuất và phân lập
Isoflavonoid tir hat Dau twong (Glycine max (L.) Merr.)” voi 2 ndi dung nghiên cứu chính sau:
- Chiét xuat Isoflavonoid
Trang 10CHUONG |
TONG QUAN
1.1 TONG QUAN VE ISOFLAVONOID
1.1.1 Cấu tạo hóa học của Isoflavonoid
Các flavonoid là một nhóm hợp chât lớn thường gặp trong thực vật Xét
về cấu trúc hóa học thì các flavonoid có cấu trúc theo kiều Có6-C3-C6 tức là
khung cơ bản gồm 2 vòng benzen nối với nhau qua một mạch 3 carbon [1] Isoflavonoid là một phân nhóm đặc biệt và khá lớn của flavonoid, nhóm chất này có khung cấu trúc là 3-phenylchroman được sinh tổng hợp từ dan chat 2-phenylchroman bằng phản ứng dịch chuyển 1,2-aryl Sự phân bố
Isoflavonoid trong hệ thực vật bậc cao là hạn chế nhưng sự đa dạng về cầu
trúc của isoflavonoid lại rất lớn Sự đa dạng này không chỉ liên quan đến khung cấu trúc 3-phenylchroman mà còn liên quan đến mức độ oxi hóa của khung cấu trúc này cũng như sự có mặt của dị vòng Phân loại nhóm
isoflavonoid cũng dựa trên hai tiêu chuẩn trên đê phân loại Isoflavonoid được
chia làm các nhóm nhỏ theo mức độ oxy hóa của dị vòng C, tạo thành các
nhóm isoflavone, isoflavanone, rotenoid, pterocarpan, isoflavan, isoflavanon,
3-arylcoumarin, coumestan [22] Bang 1.1 trinh bay tom tắt các phân nhóm của isoflavonoid [1], [22] Bang 1.1 Cac phan nhom isoflavonoid Phân nhóm - Cấu | 2 $ STT Một số đặc điêm trúc hóa học
Isoflavon là phân nhóm lớn nhât của nhóm
Isoflavonoid tự nhiên Cho đến nay đã phát
] ISOFLAVON :
hiện 364 aglycon, trong vòng 10 năm qua đã
có 130 cấu trúc mới được phát hiện
Trang 11
Isoflavanon được xem là phân nhóm hiểm
hơn so với Isoflavon Isoflavanon được sinh
tông hợp từ isofavon và pterocarpan
Thường gặp ở họ Đậu
Rotenoid là 1 isoflavonoid có thêm | dị vòng
chứa oxi Rotenoid được sinh tông hợp từ 2- methoxyisoflavon ° Í SS ⁄ ) 0 vĩ ISOFLAVANON ROTENOID cy a O C ^ Sy PTEROCARPAN Ệ ( J
Pterocarpan là nhóm chât lớn thứ 2 sau Isoflavon Pterocarpan có 4 vòng, có nhân cơ
bản của isoflavonoid và có liên kết ether giữa
Carbon số 4 và 2 Được chia làm 3 nhóm nhỏ: pterocarpan, hydroxypterocarpan và pterocarpen ISOFLAVAN P
Rất nhiều isoflavan đóng vai trò như các chất
bảo vệ thực vật như phytoalexin trong các
cay ho Dau (vi dy nhu Millettia dielsiana,
Phaseolus coccineus),
ISOFLAVANOL Phan nhém isoflavanol 1a tién chat cua
isoflav-3-en khi có phản ứng loại nước và
Trang 12
2
OH
cing 1a tién chat cla pterocarpan khi dong vong voi su tham gia cua nhom OH ở vị trí số 4 Isoflavanol được tìm thấy ở một vài loài như G glabla, G inflata
ISOFLAV-3-EN
oO
À
Được tìm thấy ở các loai Glycyrrhiza nhu G
glabla hay G inflata
3-ARYLCOUMARIN 3- arylcoumarn là một nhóm nhỏ của
isoflavonoid Đến năm 1985 mới chỉ phát hiện được 6 chất Đến nay có thêm 3 chất mới được phát hiện Tắt cả các chất này đều
được tìm thấy từ rễ các loài thuộc chỉ Glyeyrrhiza
COUMESTAN
Coumestan được xem như là dẫn chất của
pterocarpan đã được oxi hóa hoàn toàn Các loài thuộc chỉ Œjyeyrrhiza được xem như là nguồn chính chứa coumestan Ngoài ra coumestan còn có ở nhiều loài quen thuộc như (Ơjeime max, Phaseolus lunadfs, Pueraria lobata lIWedelia calendulacea, Eclinta alba 10 COUMARONCHROMON oO É ì SS ZO 1 )
0 Sl Đây là một phân nhóm tự nhiên rât nhỏ trong
nhóm isoflavonoid Ban đầu chỉ có một chất
duy nhất được phân lập là listein được phân lập từ loài Piscidia erythrina Cho đến nay số chất trong phân nhóm này đã tăng lên 13
Trang 131]
COUMARONCHROMEN O
SX X1
Cho đến nay phân nhóm mới chỉ có một chất
là pachyrrhisomen, được phân lập từ hạt của
loài Pachyrhizus erosus
a-METHYLDEOXYBENZOIN
(O)
Angolenin cùng với một vài methyl ether va cadinyl ether được phân lập từ một vài loài 12 Pterocarpus spp rt
2-ARYLBENZOFURAN | Các chất trong nhóm này chủ yếu được phân
Cc) Ọ lập từ các loài Glycyrrhiza uralensis,
13
oO @ Dalbergia odorifera
Nhóm chat nay ban dau chi có 4 chất được phân lập Đến nay, nhóm chất này đã tăng lên đáng kề, không chỉ có isoflavan dimer mà ISOFLAVONOID si xi vo : 14 còn có isoflavonoid-isoflavonoid, OLIGOMER isoflavonoid-stilben, isoflavonoid- phenylpropanoid liên kết với nhau qua dây nồi ether
1.1.2 Tác dụng sinh học của isoflavonoid
Vào những năm 1940, lần đầu tiên người ta phát hiện ra rằng một vài
hợp chất có nguồn gốc từ thực vật có thể gây ra tác dụng tương tự hoạt tính
Trang 14nhiều dấu hiệu phát dục sớm, những con cừu cái không thể mang thai hoặc những con đang mang thai thì lại thường bị sảy thai Về sau người ta tìm ra
nguyên nhân là do cây cỏ ba lá (7rj/olium unjflorưm) mọc với số lượng lớn
trên những cánh đồng cỏ này chứa một hàm lượng lớn các isoflavonoid là formononetin và biochanin A Đây cũng là những phytoestrogen đầu tiên được phát hiện [22]
Trong những năm gần đây mối quan tâm của các nhà khoa học đối với các hormon thực vật đã tăng lên nhanh chóng khi các nhà khoa học thấy liệu pháp điều trị thay thế hormon cho phụ nữ tuổi tiền mãn kinh không an toàn và hiệu quả như mong muốn Sự phỏ biến của các hormon thực vật trong chế độ ăn uống và tác dụng sinh học của chúng đang rất được các nhà khoa học quan tâm [22]
Nghiên cứu dịch tế một số bệnh ung thư phụ thuộc oestrogen như ung
thư vú, ung thư tử cung, ung thư tuyến tiền liệt cho thấy lượng phytoestrogen
trong khâu phần ăn của người châu Á cao hơn trong khẩu phần ăn của người
châu Âu và Mỹ cùng với tỷ lệ mắc bệnh thấp hơn người châu Âu và Mỹ
Nhóm người châu Á di cư sang Mỹ có tỷ lệ bệnh cao hơn nhóm người sống tại chính nước họ [22]
Các nhà khoa học đã so sánh về mặt cấu trúc của 17-estradiol,
diethylstilbenstrol với genistein và đaidzein thấy có sự tương đồng về mặt cấu trúc trong không gian Điều này có thé giải thích một phân tại sao genistein có thể găn vào các thụ thể oestrogen Người ta đã biết đến hai loại thụ thể của
oestrogen là ERơ va ERB Mac dui ca hai loai thu thé này có mặt trong cùng một tế bào nhưng nồng độ của chúng thay đổi theo từng loại mô và hiệu lực
Trang 15tại các tế bào vú, buông trứng, tuyến tiền liệt, màng trong tử cung, mạch máu
và các mô xương [19], [22] Hình 1.1 trình bày sự tương đồng về mặt cấu trúc hóa học giữa genistein, daidzein với I7B-estradiol _ on 9 2S | cử I7B-Oestradiol Genistein | | a 4 = : SI _ 22% | HO FA | Diethylstilbenstrol Daidzein |
Hình 1.1: Cầu trúc hóa học của Oestradiol, diethylstilbenstrol và 2
hormon thực vật genistein và daidzein
Theo nhiều kết quả nghiên cứu, cac isoflavonoid: - C6 hoat tinh oestrogen
Như đã trình bày ở trên, một số isoflavon (genistein, daidzein) có cấu trúc hóa học tương tự như các oestrogen nội sinh và gây ra tác dụng đối kháng hay chủ vận với oestrogen Tác dụng đối kháng hay chủ vận này phụ thuộc vào nòng độ của chúng hoặc các mô đích mà chúng tác dụng Trong các
isoflavon thi genistein 14 chat cé hoat tinh oestrogen manh nhat [19], [22]
Trang 16chế quá trình xốp xương, giảm tỷ lệ hay gặp các cơn bốc hỏa, mất ngủ, hay cáu giận, hay quên và khó tập trung Rất nhiều phụ nữ ở tuổi mãn kinh cảm thấy rằng khả năng nhận thức của họ giảm di rõ rệt trong giai đoạn này Điều
này gây nhiều khó khăn trong cuộc sông sinh hoạt của họ Nhiều nghiên cứu
đã chỉ ra rằng những người có chế độ ăn chứa genistein và các phytoestrgen với nồng độ cao (100mg/ngày) sau thời gian nghiên cứu khoảng 10 tuần đã có
những cải thiện đáng kể về trí nhở, khả năng nhận thức và khả năng phản xạ
Đối với những người mà chế độ ăn không có hoặc có chứa Phytoestrogen với
nòng độ thắp thì không thấy những cải thiện này hoặc những cải thiện không
thực sự rõ rệt [22]
- Tác dụng trên hệ thống tìm mạch
Genistein là một isoflavon có khả năng chống oxy hóa mạnh Nó loại bỏ các gốc tự do và giảm sự peroxyd hóa lipid Ngăn cản quá trình oxy hóa LDL- Cholesterol, làm giảm Cholesterol toàn phần trong đó làm giảm LDL- Cholesterol và làm tăng HDL-Cholesterol do vậy làm giảm nguy cơ xơ cứng
động mạch Genistein còn có khả năng ngăn chặn sự hình thành các cơn đau
tìm và đột quy khi hoạt động như một tác nhân chống lại việc hình thành các cục máu đông Genistein còn làm tăng hoạt tính của các enzym chống oxy hóa khác như glutathione peroxidase, superoxide dismutase va glutathione reductase [15], [20], [22] Isoflavonoid nhu puerarin, daidzein lai co tac dung hạ huyết áp, chống loạn nhịp tim Trên tuân hoàn não, chúng làm giảm trợ lực mạch máu vỏ não, tăng lưu lượng máu qua não [7]
- Chống ung thư
Ung thư là căn bệnh làm chết người nhiều hàng thứ nhì tại Hoa Kỳ mà đa số đều có liên hệ mật thiết với thực phẩm chúng ta ăn Các con SỐ thống kê
Trang 17vú gia tăng đều đặn hằng năm Tính chung trên toàn thế giới, ung thư vú ở
phái nữ được xếp vào hạng nguy cơ hàng đầu
Một số isoflavonoid (genistein) có khả năng ức chế sự phát triển của một số dòng tế bào gây ung thư như dòng tế bào DU145 (gây ung thư tuyến tiền liệt), MCF-7 (gây ung thư vú), HL-60 (ung thư tủy sống), MOLT-4 (ung thư tế bào lympho) Các nghiên cứu dịch tễ học chỉ ra rằng việc dùng các Isoflavon làm giảm tỷ lệ mắc ung thư vú và ung thư tiền liệt tuyến Chế độ ăn
uống dùng nhiều các sản phẩm từ đậu tương có mối liên hệ với tỷ lệ thấp
những người mắc các bệnh ung thư này Các kết quả nghiên cứu cho thấy
rằng người Hoa Kỳ bị ung thư nhiều gấp bốn lần người Nhật Bản Khi họ nghiên cứu những người Nhật đã đi cư qua Hoa Kỳ thì lại thấy rằng những
người Mỹ gốc Nhật này cũng bị bệnh ung thư cao như người Hoa Kỳ, do đó họ kết luận rằng sự khác biệt do dân Nhật Bản trước đây có truyền thống ăn ít
thịt động vật và ăn nhiều thực phâm làm từ hạt đậu tương [15], [22] - Cac tac dụng khác
Các isoflavonoid có tác dụng chống viêm giống như nhóm flavanon, 4- arylcoumarin, dihydroflavonon, anthocyanin, flavan-3-ol, chalcon,biflavon, 4- arylcoumarin, 4-arylchroman Tac dung này được chứng minh bằng thực nghiệm trên mô hình ức chế sinh tổng hợp prostagladin [10] Một số isoflavonoid như genistein có khả năng hạn chế các ảnh hưởng do thiếu hụt hormon insulin và do vậy Đậu tương là thực phẩm có lợi cho những người bị
bệnh tiêu đường [22]
1.2 TONG QUAN VE CÂY DAU TUONG Glycine max (L.) Merr 1.2.1 Đặc điểm thực vật, sự phân bố
Theo hệ thống phân loại mới của Takhtajan thì loài Œjycine max (L.)
Trang 1811
(Fabales), phân lớp Hoa Hồng (Rosidae), lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida), nganh Ngoc Lan (Magnoliophyta) [7], [11], [23]
Đậu tương là cây thảo đứng, sống hàng năm, cao từ 40 - 80cm Thân
cành mảnh, có lông màu trắng Lá kép mọc so le, gồm 3 lá chét hình bầu dục
hoặc trái xoan, gốc tròn, đầu nhọn, đài tứ 3 - 12cm, rộng 2 - 8em, lá chét bên
lệch Hoa dây, trắng hay tím, xếp thành chùm ở gốc Quả đậu, có lông mềm màu vàng, mọc thõng xuống, dài 3 — 4em, hơi thắt lại ở giữa các hạt Hạt 2, 3, Š thận dài, màu trắng vàng Việt Nam phân biệt rõ ràng đậu nành hay đậu
tương (hạt màu vàng nhạt) với hạt đậu đen, đậu đỏ nhưng trong các tài liệu nước ngoài với tên khoa hoc Glycine soja hay Glycine max hay Soja hispida người ta dùng chỉ nhiều loại đậu với màu vàng nhạt, màu nâu, màu đen [3],
[H]
Theo các nguồn tài liệu, Đậu nành xuất hiện đầu tiên tại Trung Quốc khoảng 5000 năm trước đây nhưng mãi đến năm 300 trước Thiên Chúa giáng
sinh mới được ghi vào cô thư là một nông phẩm chính của miền Bắc Trung
Quốc Từ đây, đậu nành được lan truyền qua Triều Tiên, Nhật Bản, xuống
miền Nam Trung Quốc và các nước Đông Nam châu Á Đến Nhật Bản vào
thế kỷ thứ 8 sau Công nguyên và khoảng một ngàn năm sau đó đến Châu Âu Đâu nành được du nhập vào lục địa Hoa Kỳ năm 1765 nhưng chỉ được xem là một loại hạt đậu mới mà thôi cho đến khi Dr John Harvey Kellog làm cuộc
cách mạng thức ăn sáng của người Hoa Kỳ bằng sữa đậu nành, ngũ cốc và các
thức ăn biến chế từ protein đậu nành vào những năm 1920
1.2.2 Thanh phần héa hoe ciia Glycine max (L.) Merr
Toàn cây chứa nước 12%, glucid 16%, Protein 14-15%, muối khoáng
6% và một số chất khác không có Nitơ [11] Hạt: 100g hạt chứa :
Trang 1912 - Chấtvôcơ: 4-5g bao gồm: K 2g P 0,65g Na 0,38¢ Mg 0,24g Ca 0,23g; S 0,46g - Glucid: 15-25¢ - Chat béo: 15-20g Các acid amin: 35-40g bao gồm: Glycin 0,97g Phenylalanin 3,86g Valin 0,63g A aspartic 3,89g Leucin §,45g A Glutamic 19 46g Prolin 3,780 Tyrosin 1 86g Phenylalanin 3,86g Arginin 7-82 A aspartic 3,89g Histidin I,39g A.Glutamc 19 46g Lysin 2,96g Glycin 0,97g Tryptophan 1,25g Valin 0,632 Cystin 1,18g Leucin 8,45g Prolin 3,782
- Ngoai ra, còn một số các chất khác như:
- Sắc tố vàng: Carotenoid và các dẫn chất isoflavonoid (genistein,
daidzein và glycitein)
- Sac té anthoxyan trong cac loai đậu tím, đen
- - Vitamin: tan trong nước (BI, B2, PP), tan trong dầu (A, D, E, K, I)
- Cac enzym: Amylase, Lipaseidin, Protease, Urease
Dau tuong va San day cé ham luong isoflavonoid cao nhat trong cac
Trang 2013
tương chỉ chứa rất ít các chất này [12] Hình 1.2 trình bày cấu trúc hóa học của các isoflavonoid đã được tìm thấy trong Đậu tương [13] | R! Rí Genistein OHH _ H H Genisin 0H H61 7H Daidzein H H H H Dadmn H H Glu ‘H - Glycitein | H OCH; 9H |H
Glycitin 9H | OCH; | Glu H
Hình 1.2: Cấu trúc hóa học của các Isoflavonoid trong Đậu tương Hàm lượng isoflavonoid trong một số cây họ Đậu và thực phẩm làm từ
Đậu tương được t rình bày trong bảng I.1 [22]
Trang 21
Đậu xanh 0,07 - 0,2 0,01 - 0,2
Lo 1 | — 11-36
1.2.3 Tác dụng dược lý của đậu tương [3]
* Tác dụng bảo vệ gan: Tác dụng của các soyasaponin L, H, II, IV (saponin triterpenoid) đã được thử theo nghiệm pháp nuôi cấy tế bào gan Hoạt tính bảo vệ gan giảm dẫn theo thứ tự soyasaponin III > IV > I> II Kết quả cho thấy các soyasaponin III, IV chỉ có 2 đơn vị đường có tác dụng mạnh hon soyasaponin Ï, II có 3 đơn vị đường Tác dụng bảo vệ gan là do một phân
tử đường liên kết với aglycon ở C3, và do soyasaponin II mạnh hơn
soyasaponin IV có lẽ do sự hiện diện của một đơn vị galactosyl mang nhóm hydroxymethyl
* Tác dụng ức chế monoaminoxydase A4 (MAO): Nghiên cứu hoạt tính
của MAO dùng serotonin làm cơ chất cho thay flavonoid của đậu tương có tác
dụng ức chế MAO
* Tác dụng chồng oxy hóa (antixydan): Sự peroxy hóa lipid được tiến
hành trên microsom tim và gan của chuột công trắng và dùng adriamycin 1a chất sinh ra các gốc tự do, kết quả cho thấy dịch chiết đậu tương có tác dụng
làm tăng sự oxy hóa lipid Tác dụng chống oxy hóa của isoflavonoid chiết xuất từ đậu tương được nghiên cứu so sánh với a-tocopherol Két qua cho thay isoflavonoid cé tac dung manh hon a-tocopherol tir 80 — 100 lần
* Tac dung lam giảm cholesterol máu: Đã tiễn hành thử nghiệm lâm
sàng trên 38 người, dùng protein đậu tương thay cho protein động vật Kết quả cho thấy: ở nhóm có cholesterol cao và vừa phải, sự giảm cholesterol toàn phần là 93% (23,2mg/100ml mau), cholesterol tỉ trọng thấp (LDL-
cholesterol) là cholesterol xấu, giảm 12,9% (21,7mg/100ml mau) va
triglycerid giam 10,5% (13,3mg/l00ml máu); ở nhóm người có mức cholesterol máu bình thường, ăn đậu tương thay thịt, cholesterol chỉ giảm rất ít (3,3%), trong khi những người có cholesterol máu rất cao (335mg/100ml
" |
Trang 2215
máu), mức độ giảm đến 19,6% Với LDL-cholesterol ciing vay, ngudi cé LDL cholesterol thấp, đậu tương chỉ làm giám 7,7%, trong khi người có mức LDL-cholesterol cao sẽ giam toi 24%
Thí nghiệm trên những người có mức cholesterol tương tự nhau, thấy càng ăn nhiều protein đậu tương, mức giảm cholesterol càng nhiều Cục quản
lý Thuốc và thực phẩm Hoa kỳ (FDA) đã chấp nhận cho ghi vào nhãn thực
phẩm có đậu tương là “có lợi cho sức khỏe và giảm nguy cơ bệnh mạch vành tìm” Theo cơ quan này, thực phẩm có đậu tương chứa ít lipid bão hòa, ít cholesterol toàn phần trong máu, giảm hàm lượng LDL-cholesterol, do đó glảm nguy cơ tim mạch
* Tác dụng kiểu Estrogen: thừ nghiệm trên nhóm phụ nữ ở tuổi mãn
kinh, khi nồng độ oestrogen giảm, thường xuất hiện những cơn bốc hỏa người
rạo rực, khó chịu Dùng đậu tương 25g (2 cốc sữa đậu nành hay | bìa đậu
phụ) sẽ giảm các biểu hiện trên
* Tác dụng dinh dưỡng: Đậu tương có một tỉ lệ các chất đạm, chất béo,
chất đường, chất khoáng và các nguyên tố vi lượng Đặc biệt là chất béo trong
đậu tương có tỉ lệ acid béo thiết yếu tới 50% 1a acid linoleic, 6,5% linolenic Các acid béo này là thành phần rất quan trọng của tế bào, màng các bào quan
trong tế bào và vỏ bọc myelin của các tế bào thần kinh, vì vậy chúng có vai
trò rất quan trọng cho sự phát triển kể cả hệ thần kinh và quá trình tái tạo lại
Trang 2316 CHUONG 2 ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu Đậu tương được thu hái vào tháng 6/2009 tại Dương Quang, Gia Lâm, Hà Nội
Đặc điểm: Hạt có thể chất cứng, hình cầu hoặc hình xoan tròn, kích
thước 2 - 5 mm, có màu vàng nhạt, hạt có rốn trắng nôi rõ Xử lý nguyên liệu:
- Chọn những hạt đậu tương tốt, có màu vàng nhạt, không mốc mọt
-_ Hạt được sấy khô ở nhiệt độ 50°C, xay vỡ, cho vào túi PE đóng kín,
đề nơi khô ráo là thí nghiệm
Hình 2.1: Hạt và quả đậu tương 2.2 Phương tiện nghiên cứu
2.2.1 Thuốc thứ, dung môi, hóa chất
Hóa chất sử dụng trong thực nghiệm là các hóa chất thí nghiệm thông
thường:
- Methanol: xi nghiép H6a duge Quang Đông - Trung Quốc - Chloroform: xi nghiép Héa duge Quảng Déng - Trung Quéc
- Ethanol 90%: céng ty Héa chat Dite Giang - Viét Nam
Trang 2417
Natri Hydroxyd, Amoni Hydroxyd: xí nghiệp Hóa dược Quảng
Đông - Trung Quốc
Dicloromethan: xí nghiệp Hóa dược Quảng Đông - Trung Quốc
Silicagel sắc ký cột (Silicagel, Merck, d=60-200 jum)
Ban sac ky lép mong trang san (Silicagel GF2s4 — Merck) 2.2.2 Dung cu * Các dụng cụ thí nghiệm được sử dụng ở bộ môn Dược liệu, Đại học Dược Hà Nội, gôm có: Bình thủy tinh có nắp đậy, Cột sắc ký thủy tỉnh các loại,
Máy cất quay BUCHI waterbath B480- Đức,
Bộ chiết hỏi lưu dung môi: Bình cầu 500ml và sinh hàn ruột gà,
Tu say Memmert,
Binh gan thuy tinh 250ml, 500ml, 1000ml, 2000ml, Cân phân tích Presica XB-220,
Máy xác định độ am Precisa PH60,
Đèn tử ngoại,
May anh Sony Cybershoot 2.3 Phuong phap nghién ciru
2.3.1 Chiết xuất Isoflavonoid từ hạt đậu tương
Trong khóa luận tốt nghiệp của Bùi Thị Hồng Vân [12] và Phạm Thị
Ngọc Lan [9], đã khảo sát chiết xuất isoflavonoid từ hạt đậu tương bằng 2
phương pháp chiết nóng và ngâm lạnh, đã khảo sát chiết xuất isoflavonoid với các dung môi có độ phân cực khá cao như EtOAc, EtOH, MeOH Kết quả cho
thấy, chiết xuất bằng dung môi ethanol tốt, dễ mua và giá rẻ nên chúng tôi lựa chọn EtOH làm dung môi chiết xuất theo phương pháp ngâm lạnh
Trang 2518
Đề khảo sát lượng cắn chiết xuất được trong các điều kiện khác nhau, chúng
tôi tính lượng cắn thu được bằng phương pháp cân, theo công thức dưới đây:
%X=——”—x100% ax(100—-”)
Trong đó:
- _ X là tỉ lệ % khối lượng cắn ( % )
- _ a là khối lượng dược liệu ban đầu ( g )
- _m là khối lượng cắn khô thu được ( g ) - _ h là hàm âm dược liệu ( % )
2.3.2 Phân lập Isoflavonoid từ hạt Đậu tương
Chúng tôi tiến hành phân lập Isoflavonoid trong dược liệu bằng phương
pháp sắc ký cột, sử dụng pha tĩnh 1a Silicagel 60 Merck Dé lyra chon hé dung
môi rửa giải hợp lý, chúng tôi tiến hành định tính dich chiét isoflavonoid toàn phần bằng sắc ký lớp mỏng
Dé phan lap isoflavonoid ching tôi chọn hệ dung môi rửa giải CH;C]; - MeOH
2.3.3 Xác định cấu trúc các hợp chất isoflavonid phân lập được
- Dùng phương pháp sắc ký lớp mỏng để kiểm tra các phân đoạn và đánh
giá mức độ tinh khiết của chất phân lập được Sắc ký đồ được quan sát dưới
ánh sáng thường, ánh sảng tử ngoại UV 254nm, 365nm Với nhiều hệ dung
môi, nếu chất phân lập được chỉ cho vết duy nhất trên sắc ký đồ thì có thể sơ
bộ kết luận chất đó là tỉnh khiết
Trang 2619
CHUONG 3
THUC NGHIEM, KET QUA VA BAN LUAN
3.1 Định tính 4 nhóm chất chính: chất béo, đường, acid amin va isoflavonoid của dịch chiết hạt đậu tương
Theo các tài liệu nghiên cứu trước đây, hạt đậu tương chứa rất nhiều
chất béo, đường, acid amin, thành phần isoflavonoid chiếm một lượng nhỏ
Mặt khác, khi sử dụng dung môi chiết xuất là ethanol, là một dung môi chiết xuất đa năng nên nhiều nhóm chất có thê tan được trong dung môi này Chính vì lý do đó, đê khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất chọn
lọc isoflavonoid, chúng tôi kiêm tra thường xuyên các phân đoạn dịch chiết bằng các phản ứng hóa học 4 nhóm chất trên để thu được các phân đoạn chỉ
còn chủ yếu là nhóm chất isoflavonoid
Đối với nhóm chất isoflavonoid, không có phản ứng đặc hiệu riêng cho nhóm này, do vậy chúng tôi thử các phản ứng hóa học chung của nhóm flavonoid Riêng phản ứng cyanidin, chúng tôi đã thử làm nhiều lần nhưng phản ứng dương tính không rõ vì các isoflavonoid không dương tính rõ với
phản ứng này (về mặt cấu trúc hóa học, nếu các isoflavonoid có vòng C là
vòng y-pyron thì cho kết quả đương tính với phản ứng cyanidin), nên chúng
tôi không dùng phản ứng này đẻ định tính nhóm chất flavonoid
Chuẩn bị dịch chiết: lấy 5 g bột đậu tương, ngâm lạnh với 20 ml EtOH 90° trong 2h, lọc lây dịch chiết để làm phản ứng
3.1.1 Định tính đường
Lấy 1 ml dịch chiết EtOH, sau đó thêm 5 giọt Fehling A và 5 giọt Fehling B, đun cách thủy khoảng 5 phút Kết quả cho thấy, có kết tủa đỏ gạch năm dưới đáy 2 ống nghiệm: Phản ứng dương tính rõ (+++)
Trang 2720
3.1.2 Dinh tinh acid amin
Lay 1 ml dịch chiết EtOH, rồi thêm 5 — 6 giot TT Ninhydrin 0,1%, dun nong | phut Két qua cho thay, mau dich chiét chuyén thanh màu xanh tím: Phản ứng dương tính rõ (++t) Kết luận: Trong dịch chiết đậu tương có acid amin 3.1.3 Định tính chất béo Lấy 1 ml dịch chiết EtOH nhỏ lên 1 tờ giấy lọc khổ 5 x 10, nhỏ từ từ và hơ nóng nhẹ đến hết 1 ml dịch chiết
Kết quả: trên tờ giấy lọc có vét trong như giấy bóng kính
Kết luận: Dịch chiết đậu tương có chất béo
3.1.4 Định tính Isoflavonoid - Phản ứng với kiêm
Lấy 0,5m] dịch chiết nhỏ lên trên 1 tờ giấy lọc, hơ nhẹ đến khô Cứ làm
như thé cho đến khi hết 0,5ml dịch chiết
Làm tương tự với 1 tờ giấy lọc khác, dùng để làm kiểm chứng và đối chiếu
* Ho hoi Amoniac (NH,OH 25%)
Hơ các vết dịch chiết lên miệng lọ Amoniac và quan sát sự đổi màu của
các vết chất so với tờ chứng, kết quả cho thấy vết chất chuyển sang màu vàng
nghệ: Phản ứng (++)
* Với dung dịch kiềm loãng
Lấy 1 ml dịch chiết cho vào ống nghiệm, thêm vào mỗi ống nghiệm 2 —
3 giọt TT NaOH 10% (so sánh với mẫu chứng) Dịch chiết có màu vàng đậm
Phản ứng (+++)
- Phan wng voi TT FeCl; 5%
Lấy 1 ml địch chiết mỗi loại , thêm 2-3 giọt FeCl; 5% Kết qua cho thay
Trang 2821
Kết luận chung: dịch chiết EtOH 90° của hạt đậu tương cho phản ứng
dương tính rõ với 3 nhóm chất acid amin, chất béo, đường, và cho phản ứng
dương tính vừa với nhóm flavonoid
3.2 Chiết xuất Isoflavonoid
3.2.1 Quy trình chiết xuất isoflavonoid
Nhóm nghiên cứu chiêt xuât isoflavonoid từ một sô cây họ Đậu đã thực
hiện đã khảo sát chiết xuất isoflavonoid từ hạt đậu tương bằng 2 phương
pháp: (1) chiết nóng (chiết hồi lưu với các dung môi có độ phân cực khác nhau
như MeOH, EtOH và EtOAc); (ii) ngâm lạnh với EtOH 90 % Kế thừa các kết
qua nghiên cứu của nhóm, chúng tôi đã xây dựng quy trình chiết xuất
isoflavonoid với dung môi EtOH bằng phương pháp ngâm lạnh Quy trình chiết xuất được khảo sát với 2 độ cồn khác nhau là EtOH 70° và 969
Quy trình chiết xuất được thực hiện giống nhau và song song với 2 độ
con 1a EtOH 70° và 96°
Lay 300 g bot dau tuong (d6 am 3,91%) cho vao binh chiét ngam kiét,
thêm 900 ml EtOH, ngâm trong 24h ở nhiệt độ phòng (25°C) rồi rút dịch
chiết lần 1 Thêm tiếp 500 ml EtOH ngâm trong 24 h rồi rút dịch chiết rồi rút dich chiết lần 2 Tiếp tục thêm 400 ml EtOH, ngâm trong 24 h rồi rút dịch
chiết lần 3 Gộp cả 3 dịch chiết thu được đem cất thu hồi dung môi dưới áp
suất giảm ở 60°C Căn được làm khô trong bình hút âm
Trang 2922
3.2.2 Định tính 4 nhóm chất chính trong dịch chiết EtOH70° và 96" Các tiền hành định tính 4 nhóm chất chính: chất béo, đường, acid amin và flavonoid của 2 dịch chiết EtOH 70° và 96° bằng phản ứng hóa học được
thực hiện như mục 3.1 Kết quả được trình bày ở bảng 3.1
Bảng 3.1: Kết quả định tính 4 nhóm chất chính của 2 dịch chiết
EtOH 70° va 96° tir hat đậu tương ST | Mẫu dịch chiết Nhóm chất
= Acid amin | Chấtbéo | Đường | Flavonoid
1 | Dich chiét EtOH 70° ¬ +++ +++ ++ 2 | Dịch chiết EtOH 96° + ++ + ++
- Nhận xét: cùng quy trình chiết xuất từ hạt đậu tương, với cùng dung môi EtOH với độ cồn khác nhau là 70° và 96°, cắn thu được sau khi cất thu hồi
dung môi khác nhau hơn 2 lần (mgyouzo = 14,90 ø và mguono¿= 6,26 g) Khi
định tính 4 nhóm chất chính trong hạt đậu tương trong 2 cắn dịch chiết này,
chúng tôi nhận thấy dịch chiết bằng dung môi EtOH 70° chứa nhiều đường, acid amin và chất béo hơn so với dịch chiết EtOH 96° Do vậy, chúng tôi tiền
hành thử loại tạp (chất béo, đường, acid amin) bằng các phương pháp khác
nhau
3.2.3 Quy trình loại tạp dịch chiết đậu tương EtOH70° và 96°
3.2.3.1 Quy trình loại tạp chất béo
* Loại chat béo băng dung môi n-hexan
- Căn dịch chiết EtOH 70”, thêm 30ml EtOH 70°, nguấy đều cho tan hết căn Dịch chiết EtOH 70° được chiết với n-hexan, mỗi lần với 30ml n-hexan Chiết nhiều lần cho đến khi hết chất béo Dịch chiết n-Hexan được thử xem
Trang 3023
có vết trong như bóng kính thì địch chiết có chất béo Tiếp tục chiết tiếp với n-Hexan đến khi tờ giấy lọc không còn vét như thế nữa
Dịch chiết đã loại chất béo với n-Hexan được cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cắn, căn được sây khô trong bình hút am, thu duge Mgou70 = 11,19 g
- Tién hanh tuong tu véi dich chiét EtOH 96°, thu duoc mgonos = 5,06
g) can
* Loai chat béo bang parafin
Quy trình loại chất béo bằng parafin được tiến hành như sau: thêm
30ml nước nóng vào cắn 2 dịch chiết EtOH 70° và EtOH 96°, khuấy đều, rồi
cho vào mỗi loại dịch chiết 10g parafin đun nóng, tiếp tục khuấy đều và để
yên ở nhiệt độ phòng cho parafin đông lại ta thấy lớp parafin ngả màu vàng
Lọc, loại bỏ parafin Tiếp tục làm như vậy cho đến khi parafin hòa tan hoàn
toàn chất béo có trong dịch chiết Làm 5 lần đến khi parafin không còn ngả sang màu vàng nữa, nghĩa là dịch đã hết chất béo, thì dừng lại
Nhận xét: Dịch chiết đậu tương bằng EtOH 70° và 96°, có thể loại chất
béo bằng 2 phương pháp: dung môi n-hexan; parañn Trong quá trình làm chúng tôi thấy ưu và nhược điểm của 2 phương pháp như sau:
+ Dung môi n-hexan:
- Ưu điểm: Là đung môi đễ bay hơi nên dễ dàng kiểm tra chất béo đã hết
hay chưa bằng cảm quan
- Nhược điểm: Là dung môi đắt tiền Kỹ thuật phức tạp do có cả pha nước và pha dầu nên khi lắc có thê bị nhũ hóa
+ Parafin:
- - Ưu điểm: Dễ mua, rẻ, đễ dàng kiểm tra bằng cảm quan
-_ Nhược điểm: Cần duy trì ở nhiệt độ cao trong cả quá trình, do paraln
Trang 3124
3.2.3.2 Quy trình loại đường và acid amin
Căn của 2 dịch chiết EtOH 70” và 96” sau khi loại chât béo, được hòa
tan trong MeOH và điều chỉnh pH = 6 bằng dung dịch HCI 10%, khuấy nhẹ
Lọc, thu được dịch lọc Cất thu hỏi dung môi MeOH thu được căn, có khối lượng mg¿on;o = 8,91 ø, mgtonos = 2,34 g
Kiểm tra căn với các phản ứng hóa học định tính 4 nhóm chất chính: chất béo, acid amin, đường và flavonoid Kết quả được trình bày ở bảng 3.2
Bảng 3.2: Kết quả định tính 4 nhóm chất chính của 2 dịch chiết
EtOH 70° và 96” từ hạt đậu tương sau khi đã loại tạp ST |_ Mẫu dịch chiết Nhóm chất
T Acid amin | Chấtbéo | Đường | Flavonoid
1 | Dich chiét EtOH 70° + + + 2 | Dich chiét EtOH 96° + + +4
Nhận xét: từ kết quả định tinh 4 nhóm chất chính trong 2 dịch chiết đậu tương bằng EtOH70° và 96° sau khi đã loại chất béo, acid amin và đường, chúng tôi nhận thấy, dịch chiết đậu tương bằng EtOH 96° không còn chất béo,
lượng acid amin và đường còn ít nên chúng tôi tiến hành phân lập
isoflavonoid từ dịch chiết EtOH 96°
3.3 Phan lap va nhan dang isoflavonoid
3.3.1 Dinh tinh Isoflavonoid bang sac ky lép mong
- Ban mong trang san silicagel GF254 (Merck) hoat héa 6 110°C trong 1h
- Dịch chấm sắc ký: Lấy khoảng 0,01g cắn mỗi loại thu được khi chiết với
EtOH 70° va EtOH 96°, hòa tan trong Iml MeOH làm dịch chấm sắc ký
- Hệ dung môi khai triển: CHC];— MeOH [9:1]
- Bản mỏng được khai triển theo chiều từ dưới lên trong bình sắc ký đã
bão hồ dung mơi
Trang 3225 Kết quả sắc ký đồ được trình bày ở hình 3.2 và bảng 3.2 Bảng 3.3 Bảng giá trị Rf của các vết trên sắc ký đồ hình 3.2 Vết Rf | l 0,81 2 3 2 0,75 3 0,71 4 5 4 0,55 8 5 0,49 6 0,42 Hình 3.2 Sắc kí đồ dịch chiết EtOH96° quan sát ở UV 254 nm Nhận xét:
Trên sắc ký đồ của dịch chiết hạt đậu tương trong EtOH khi quan sát dưới UV254 thấy có 6 vết màu tối trên nền xanh có giá trị Rf tương ứng như trên bảng 3.3
3.3.2, Phan lap isoflavonoid —
Căn phân lập: Sử dụng căn EtOH toàn phân (2g) dé tién hành phân lập
Chuân bị cột sắc ký: Cột thuỷ tỉnh có khoá và nút mài, đường kính
4cm, chiều dài 35cm, rửa sạch, sấy khô, cố định trên giá theo chiều thẳng
Trang 33Chất nhòi cột: 50 g silicagel (Merck,cỡ hạt 60um) được hoạt hoá ở
110°C trong 1h Nhỏi cột theo phương pháp nhồi cột ướt
Dung môi rửa giải: CH;C]; : MeOH (100 : 5) (độ phân cực tăng đần) - Nhỏi cột: Cho một lượng vừa đủ hỗn hợp dung môi rửa giải vào silicagel đã hoạt hoá, phân tán đều silicagel trong cốc có mỏ, loại hết bọt
khí rồi đồ thành dòng từ từ vào thành cột vừa đỗ vừa gõ nhẹ Rửa thành cột
bằng dung môi rửa giải Ôn định cột bằng cách vừa mở khoá cột cho dung môi chảy vừa dùng bơm áp lực dồn dịch xuống cho đến khi lượng silicagel trên cột nén xuống ở mức không đôi Cho lượng dịch chảy đến khi cach bé
mặt silicagel khoảng 3mm, khoá cột và nhồi cắn
- Đưa cắn lên cột: hoà tan 2g cắn EtOH bằng một lượng tối thiêu
dung môi rửa giải, cho một ít silicagel đã được hoạt hóa vào trộn đều, bốc
hơi hết dung môi đến khi bột cắn đều, khô mịn và tơi Nhồi cắn lên cột và
cho thêm một ít cát sạch (dày khoảng 3mm) đề cắn không bị xáo trộn khi
cho dung môi
- Rửa giải: Dùng bơm áp lực nén dịch rửa giải xuống Dung dịch rửa giải được hứng vào các ống nghiệm 10ml và được kiểm tra bằng SKLM, khai triển với bản mỏng silicagel GF;s¿ hệ dung môi CH;C]; - MeOH [8:2]
- Kết quả: Dịch rửa giải trong các ống nghiệm có số vết có Rf giống
nhau được gộp lại với nhau thành một phân đoạn, kết quả thu được 2 phân đoạn như sau:
+ PDI: gom các vết có Rf > 0,7
+ PÐ2: m = 0,12g, gồm 3 vết màu đen trên nền xanh quan sát ở
UV254 nm có Rf= 0,55; 0,49 và 0,42 tương ứng
Phân đoạn PÐ2 có 3 vết khi hơ hơi amoniac soi đưới ánh sáng
Trang 3427
không có, do đó chúng tôi sơ bộ nhận định đây là phân đoạn chứa
isoflavonoid, va tiếp tục phân lập PÐ2 bằng sắc ký lớp mỏng chế hóa
Bằng sắc ký lớp mỏng chế hóa với hệ dung môi khai triển bản mỏng là CHC]; - MeOH [9:1] chúng tôi phân lập được vết số 5 (ký hiệu GMI) 3.3.3 Nhận dạng chất GMI
Phố khối (ESI-MS) chất GMI có cho pic phân tử [M+HỊ' = 417 và
[M+Na]'= 439 đơn vị khối, tương ứng với công thức cau tạo C›¡H›z¿OÖs (M
= 416) Trong cac dan chat isoflavonoid có trong hạt đậu tương, có chất Daidzin (daidzein glucosid) có cùng khối lượng phân tử và công thức cầu tạo như trên Kết hợp tính chất lý hóa của Daidzin có huỳnh quang màu xanh đen dưới ánh sáng tử ngoại 254 nm, huỳnh quang sáng lên khi hơ bản
mỏng với amoniac, chúng tôi sơ bộ kết luận chất GMI là daidzin (Hình 3.3) HO OH Hình 3.3 Công thức cầu tạo của Daidzin (Đaidzein glucosid) 3.4 Bàn luận
Khi tiến hành chiết xuất Isoflavonoid từ hạt đậu tương bằng phương
pháp ngâm lạnh với 2 dung môi là EtOH 70° và EtOH 96°, chúng tôi thấy
chiết bằng EtOH 70° thu duge lugng căn cao hơn so với địch chiết EtOH 96°
Trang 3528
acid amin, chất béo, đường và flavonoid Tuy nhiên dịch chiết EtOH70° có
nhiều acid amin, chất béo và đường hơn so với dịch chiết EtOH96°
Tiến hành loại tạp chất béo bằng n-hexan và parafin, chúng tôi đã so
sánh được ưu nhược điểm của 2 phương pháp loại chất béo Đối với dung môi
n-hexan có ưu điểm là dung môi dễ bay hơi nên dễ dàng kiểm tra chất béo đã
hết hay chưa bằng cảm quan Tuy nhiên đây là dung môi đắt tiền Kỹ thuật
chiết để loại chất béo phức tạp do có cả pha nước và pha dầu nên khi chiết có
thể bị nhũ hóa Đối với Parafin có ưu điểm dễ mua, rẻ, dễ dàng kiểm tra bằng
cảm quan Tuy nhiên trong quá trình loại tạp cần duy trì ở nhiệt độ cao trong
cả quá trình, do parafin đễ bị đông đặc ở nhiệt độ thường
Quá trình loại đường và acid amin chúng tôi thay đôi pH để acid amin
tủa và dùng MeOH đẻ hòa tan các isoflavonoid Có những lô thí nghiệm khi
chúng tôi dùng MeOH hoà tan cắn địch chiết thì thấy đường không tan tủa rất rõ, tuy nhiền quá trình này không lặp lại, chúng tôi chưa nghiên cứu được lý do Mặt khác, mong muốn của chúng tôi là chiết xuất isoflavonoid mà không phải sử dụng các dung môi không thân thiện với môi trường nên việc sử dụng
MeOH đề hoà tan các isoflavonoid lúc tinh chế lần cuối là một lựa chọn tạm
thời
Việc phân lập và xác định cấu trúc isoflavonoid, chúng tôi không mong đợi chiết xuất được isoflavonoid mới, mà chỉ dùng chất phân lập được và có
xác định cấu trúc làm chất đối chiếu trong quá trình chiết xuất Trong khuôn
khổ khố luận này chúng tơi đã xác định được thêm | isoflavonoid 1a daidzin,
Trang 3629
KET LUẬN - ĐÈ XUẤT
KẾT LUẬN ¬
Qua 2 tháng làm thực nghiệm chúng tôi thu được một số kêt quả sau:
- Đã khảo sát chiết xuất Isoflavonoid từ hạt Dau tuong Glycine max (L.) Merr bằng 2 dung môi EtOH 70° và EtOH 96° theo phương pháp ngâm
lạnh
- Đã định tính 4 nhóm chất chính thường có trong hạt đậu tương là chất
béo, acid amin, đường và flavonoid
- Đã khảo sát quy trình loại chất béo, đường, acid amin từ hai dịch chiết EtOH 70° va EtOH 96° - Đã phân lập được 1 chất GMI tỉnh khiết bằng sắc ký cột và sắc ký chế hóa - Đã nhận dạng chất GMI dựa trên phô khối là đaidzin, một glucosid cua daidzein DE XUAT
Trang 3730 TAI LIEU THAM KHAO Tiếng Việt 1 Bộ môn Dược Liệu (2006) Trường Đại học Dược Hà Nội, Bài giảng dược liệu, tập l, tr 279 - 283
Bộ môn Dược liệu, Trường Đại học Được Hà Nội (2006), Thực ráp
Dược liệu- Kiểm nghiệm Dược liệu bằng phương pháp hóa học, tr l 8 Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương (2004), Viện dược liệu, Những cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam tap 1, NXB Khoa học và Kỹ thuật, tr 765 - 768
Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương (2004), Viện dược liệu, Những cảy thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam tập 2,
NXB Khoa học và Kỹ thuật, tr.680-68§6
Võ Văn Chỉ (1997), Từ điền cây thuốc Việt Nam, NXB Y học, tr 468 Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu (1985), Phương pháp nghiên cứu hóa học cây thuốc, NXB Y học TPHCM, tr 256-262, 282, 283
Phạm Hoàng Hộ (1999), Cáy cỏ Việt Nam — An Illustrated Flora of Việt Nam, tập I NXB Trẻ, tr.949
Trần Việt Hưng (2006) , Từ điển thảo mộc được học, tr.4T
Phạm Thị Ngọc Lan (2009), Chiết xuất và phan lap isoflavonoid trong cay Dau twong (Glycine max (L.) Merr.), Khoa luan tot nghiệp Dược sĩ, trường Đại học Dược Hà Nội, tr I 7-20
I0 Lê Thùy Linh (2009), Chiết xuất các lsoflavonoid từ cấy sắn dây, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ, trường đại học Dược Hà Nội, tr 13, 14
11 Đỗ Tất Lợi (1999), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y
Trang 3831
12 Bui Thi Héng Van (2008), Chiét xuất Isoflavonoid trong một số cây họ
Đậu, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ, trường Đại học Dược Hà Nội,
tr.10, 16-20
Tiếng Anh
13 Carlos Hermenegildo (2005), “Effects of Phytoestrogens Genistein and Daidzein on Prostacyclin Production by Human Endothelial Cells”, Jounal of Phrmacology And Experimental Therapeutics Fast Forward, 315, 722-728
14 CERHR (2006), N7P-CERHR expert panel report on the reproductive and developmental toxicity of genistein, National Toxicity Program, p 2-7
15 Genistein/ Phytochemicals data at http:/Avww.phytochemicals.info 16 G.Grynkiewicz, H.Ksycinska (2005) “Chromatographic Quantification
of Isoflavones (Why and How)”, ACTA chromatographica, 15, 33-38
17 Monika W Hajnos, Joseph Sherma, Teresa Kowlska (2008), Thin
layer chromatography in phytochemistry, CRC, 407 — 408
18 J.B Harborne (1994), Phytochemical Method — A guide to morden
techniques of Plant Analysis, Chapman and Hall, p.74-79
19 J.B Harborne (1994), The Flavonoid advances in research Chapman and Hall, p.47-162
20 Lee JS (2006), “Effects of soy protein and genistein on blood glucose, antioxidant enzyme activities, and lipid profile in streptozotocin-
induced diabetic rats”, Life Sci., 79(16), 1578-84
Trang 3922 Teresa Cornwell, Wendie Cohick, Ilya Raskin (2004), “Review
Dietary phytoestrogen and health”, Phytochemisiry, 65, p 995-1016
Trang 4033