1 Nguyen Thi Hong Van Department of Genetics – HUS Lập bản đồ di truyền và xác định các gen bệnh ở người Chương 2 Nguyen Thi Hong Van Department of Genetics – HUS Nội dung chương Lập bản đồ di truyền các gen quy định tính trạng theo Mendel Thể tái tổ hợp và thể không tái tổ hợp Các chỉ thị di truyền Lập bản đồ hai điểm Lập bản đồ đa điểm Xác định các gen bệnh ở người Nguyên lý và chiến lược xác định các gen bệnh Chiến lược xác định gen bệnh không phụ thuộc vị trí Tách dòng vị trí Sử dụng các bất thường nst Các ví dụ về việc xác định gen bệnh Nguyen Thi Hong Van Department of Genetics – HUS Lập bản đồ di truyền các gen quy định tính trạng theo Mendel Nguyen Thi Hong Van Department of Genetics – HUS 13_01.jpg Nguyen Thi Hong Van Department of Genetics – HUS 13_02.jpg Nguyen Thi Hong Van Department of Genetics – HUS 13_03.jpg 2 Nguyen Thi Hong Van Department of Genetics – HUS 13_04.jpg Nguyen Thi Hong Van Department of Genetics – HUS 13_05.jpg Nguyen Thi Hong Van Department of Genetics – HUS 13_06.jpg Nguyen Thi Hong Van Department of Genetics – HUS 13_07.jpg Nguyen Thi Hong Van Department of Genetics – HUS 13_08.jpg Nguyen Thi Hong Van Department of Genetics – HUS 13_10.jpg 3 Nguyen Thi Hong Van Department of Genetics – HUS 13_11.jpg Nguyen Thi Hong Van Department of Genetics – HUS 2.1. Nguyên lý và chiến lược xác định các gen bệnh Mọi cách xác định các gen bệnh đều tập trung vào gen ứng viên (candicate gene). Kiểm tra gen ứng viên bằng việc sàng lọc các đột biến ở các bệnh nhân. Chỉ ra vùng nhiễm sắc thể ứng viên và xác định gen ứng viên. Từ 30000 gen người bằng tách dòng vị trí xác định vùng ứng viên mang 10 – 30 gen. Sau khi xác định gen xác định nguyên nhân gây bệnh. VD: mất chức năng của protein FMR1 chậm phát triển tâm thần; đột biến ở vùng bám TATA mất điều hòa gai tiểu não SCA17 Nguyen Thi Hong Van Department of Genetics – HUS Cách xác định gen bệnh ở người Nguyen Thi Hong Van Department of Genetics – HUS 2.2. Chiến lược xác định gen bệnh không phụ thuộc vị trí Dựa vào thông tin sản phẩm protein Xác định gen bệnh qua mô hình động vật Sử dụng hiểu biết về trình tự ADN không phụ thuộc vị trí Nguyen Thi Hong Van Department of Genetics – HUS 2.2.1 Xác định gen bệnh dựa vào thông tin sản phẩm protein Xác định protein bằng các kỹ thuật proteomic: định lượng, giải trình tự protein Dựa vào trình tự mã hóa cDNA tổng hợp mẫu dò oligonucleotide sàng lọc thư viện để khôi phục trình tự cDNA mẫu dò pải là trình tự oligonucleotide suy diễn tăng cơ hội xác định trình tự đích đúng Sàng lọc thư viện gen Sử dụng các oligonucleotide thoái hóa làm mồi PCR Lai cDNA đích vào một vector; thực hiện PCR với một mồi đặc thù vector và một mồi đặc hiệu protein. Sử dụng kháng thể với protein để tìm gen đích. dựa vào thư viện biểu hiện cDNA tạo ra protein hoặc một phần protein sàng lọc các màng lọc khuẩn lạc với kháng thể thích hợp Nguyen Thi Hong Van Department of Genetics – HUS 2.2.2 Xác định gen bệnh qua mô hình động vật Sử dụng mô hình động vật: chuột đột biến mang bệnh tương tự bệnh ở người tách dòng gen chuột và kiểm tra trình tự tương đồng ở người hoặc: xác định gen bệnh ở chuột phân lập trình tự tương đồng ở người lập bản đồ gen bằng FISH VD: xác định gen MITF gây hội chứng Waardenburg type 2 (điếc, thay đổi sắc tố da, tóc và mắt). Xét nghiệm gen trực tiếp ở bệnh nhân VD: SOX10 gene 4 Nguyen Thi Hong Van Department of Genetics – HUS 2.2.3 Sử dụng hiểu biết về trình tự ADN không phụ thuộc vị trí khi bệnh do đột biến ở một gen đã biết Tiến hành các thí nghiệm thử nghiệm biểu hiện gen phân lập mRNA từ các bệnh nhân và đối chứng so sánh trình tự để liệt kê một loạt các gen thay đổi mô hình biểu hiện ở bệnh. VD: tách dòng gen chứa các đoạn lặp ba nucleotide mới (gây các bệnh về hệ thần kinh di truyền). Nguyen Thi Hong Van Department of Genetics – HUS 2.3. Tách dòng vị trí Khi chưa có thông tin về gen, ngoại trừ vị trí tương đối của nó trên nhiễm sắc thể. Áp dụng đối với các gen mã hóa: liên quan bệnh u hạt mãn tính liên kết nst X (tế bào bạch cầu mất khả năng tiêu diệt vi khuẩn, các yếu tố gây bệnh); xơ nang (cystic fibrosis), bệnh Huntington, Nguyen Thi Hong Van Department of Genetics – HUS 14_02.jpg Logic của việc tách dòng vị trí Nguyen Thi Hong Van Department of Genetics – HUS 14_03.jpg The difficult path from candidate region to gene. Nguyen Thi Hong Van Department of Genetics – HUS 2.3.1 Tách dòng vị trí: Bước 1: xác định vùng ứng viên càng hẹp càng tốt Phụ thuộc vào kíc thước của vùng ứng viên thu hẹp vùng này càng nhiều càng tốt. Phân tích liên kết gen: 100 sản phẩm giảm phân có thông tin giúp định vị bệnh di truyền theo Mendel tới một vùng ứng viên khoảng 1Mb (= 1cM) Hạn chế về độ phân giải: lập bản đồ các thể tái tổ hợp giữa các chỉ thị gần nhàu, quyết định bởi các haplotype đang xem xét (Hình 14.4). Xác định ranh giới vùng ứng viên dựa vào các thể tái tổ hợp đơn Các kiểu hình không theo Mendel: phân tích liên kết không chính xác (~20 cM hoặc hơn) sử dụng cân bằng kép liên kết để thu hẹp vùng nghiên cứu. Nguyen Thi Hong Van Department of Genetics – HUS Xác định vùng ứng viên nhỏ nhất bằng việc xem xét các haplotype Phả hệ minh họa bệnh da di truyền trội (Darier - White), trước đó được lập bản đồ ở nst 12q. Haplotype 12 q chỉ thị phân ly cùng với bệnh được tô vàng, hộp nền xám chỉ các haplotype ở người đã chết. 5 Nguyen Thi Hong Van Department of Genetics – HUS 14_04_2.jpg Nguyen Thi Hong Van Department of Genetics – HUS 2.3.2 Tách dòng vị trí: xét nghiệm đột biến Tìm kiếm các gen thể hiện mô hình biểu hiện và/hoặc chức năng phù hợp từ danh sách các gen ứng viên. Tìm kiếm dạng tương đồng với gen đã biết là có chức năng và/hoặc biểu hiện tương tự hoặc các thể đột biến có kiểu hình liên quan. Nguyen Thi Hong Van Department of Genetics – HUS 2.3.2.1 Các gen có sự biểu hiện phù hợp Gen ứng viên có mô hình biểu hiện phù hợp với kiểu hình bệnh. được biểu hiện ở cùng thời điểm và vị trí nơi quan sát thấy tình trạng bệnh lý. Kiểm tra bằng RT-PCR, Nothern bloting hoặc SAGE (serial analysis gene expression – phân tích biểu hiện gen hàng loạt). Lai tại chỗ với mRNA ở các phần cắt mô hoặc nhuộm hóa mô miễn dịch (IHC) với các kháng thể đánh dấu – thể hiện mô hìn biểu hiện. Nghiên cứu ở các mô chuột suy diễn ra các mô người. Nguyen Thi Hong Van Department of Genetics – HUS 14_05.jpg Sử dụng trình duyệt hệ gen để liệt kê các gen trong vùng ứng viên. Trên hình là các gen được dự đoán và khẳng định trong vùng 1Mb của nhiễm sắc thể 6p21.1. Nguyen Thi Hong Van Department of Genetics – HUS 2.3.2.2 Các gen thể hiện chức năng phù hợp Khi biết chức năng của gen trong vùng ứng viên khẳng định được gen có phải là ứng viên hay không. Với các gen mới: Phân tích trình tự để biết chức năng của gen (VD: các domain xuyên màng, các motif tyrosine kinase ) Dựa vào mối quan hệ chức năng gần gũi với một gen đã biết liên quan đến bệnh gen mã hóa thụ thể – gen mã hóa ligand của nó gen mã hóa các thành phần tương tác trong mooyj con đường chuyển hóa hoặc phát triển Nguyen Thi Hong Van Department of Genetics – HUS 2.3.2.3 Sự tương đồng với một gen paralog Gen ứng viên là một gen tương đồng gần của một gen đã biết (gen paralog ở người hoặc ortholog ở các loài khác) Đột biến ở gen tương đồng gây nên kiểu hình liên quan gen mới trở thành gen ứng viên. VD: sau khi fibrillin được xác định là gen bị đột biến ở hội chứng Marfan gen paralog của nó FNB2 được xác định nằm ở nst 5q. hội chứng co màng nhện não (Contractural arachnodactyly) được xác định nằm ở cùng vùng 5q FBN2 đột biến liên quan đến bệnh này. 6 Nguyen Thi Hong Van Department of Genetics – HUS 2.3.2.4Sự tương đồng với một gen ortholog liên quan Các trình tự tương đồng về cấu trúc và chức năng giữa các loài có quan hệ xa, VD: người, cá ngựa, ruồi giấm, C. elegans, nấm men Không chỉ trình tự gen, các con đường cũng thể hiện tính bảo thủ cao. VD: các con đường phát triển hoặc điều hòa ở các sinh vật mô hình được sử dụng để dự đoán các con đường ở người Nguyen Thi Hong Van Department of Genetics – HUS 14_06.jpg Thể đột biến không có cánh Drosphila được sử dụng để hiểu về con đường phát triển ở người: gen LHX2 Loài người có một gen giúp ruồi giấm có cánh bình thường. Thể đột biến ruồi giấm không cánh (A) có thể được phục hồi thành dạng có cánh bởi gen kiểu dại của ruồi giấm (B) hoặc bởi gen LHX2 của người (C). Nguyen Thi Hong Van Department of Genetics – HUS Các đoạn bảo thủ giữa nst 6 ở người (Hsa6) và nst chuột (Mmu) Nguyen Thi Hong Van Department of Genetics – HUS 2.4. Sử dụng các đột biến nhiễm sắc thể Để định vị gen bệnh. VD: ở dạng rải rác, các thể đột biến trội nghiêm trọng: các dạng sai hỏng nst cung cấp phương pháp xác định gen ứng viên xác định vị trí chính xác Các đột biến nst cân bằng (chuyển đoạn hoặc đảo đoạn) là rất hữu ích. Các đột biến nst quan sát được (mất đoạn, chuyển đoạn) rất có giá trị Nguyen Thi Hong Van Department of Genetics – HUS Các đột biến nst cân bằng(1) Thường không ảnh hưởng đến kiểu hình của thể mang Có thể ảnh hưởng, do: sự phát hiện trùng khớp giữa kiểu hình bất thường và đột biến nst sự tái sắp xếp nst thực ra ko cân bằng: mất hoặc thêm vật chất di truyền chứa điểm đứt gãy nst gây bệnh kiểu hình mất chức năng kiểu hình giành chức năng (tạo nên gen mới) dễ định vị gen bệnh Các bất thường cân bằng là có giá trị, dựa vào các điểm đứt gãy đặc thù Điểm đứt gãy chuyển đoạn mất chức năng của một trong hai bản sao của gen không có tác động kiểu hình nếu nồng độ sản phẩm bình thường vẫn đủ Nguyen Thi Hong Van Department of Genetics – HUS 14_09.jpg Sử dụng FISH để xác định vị trí đứt gãy chuyển đoạn Chuyển đoạn được xác định nhờ di truyền tế bào t(8;16)(p22;q21) Bản đồ vật lý một phần vùng đứt gãy trrrn nst số 8 bình thường (thể hiện vị trí của 7 dòng). Các kết quả thí nghiệm FISH thành công. Các điểm đứt gãy nằm trong trình tự ở dòng D , được khẳng định sử dụng các dòng từ nst 16. 7 Nguyen Thi Hong Van Department of Genetics – HUS Các đột biến nst cân bằng (2) Các chuyển đoạn giữa nstX- nst thường ở nữ: Sự bất hoạt X là ngẫu nhiên Các tế bào mang X chuyển đoạn bị bất hoạt phải chịu sự mất cân bằng di truyền gây chết Thể mang là nữ có chuyển đoạn gồm toàn bộ các tế bào chứa nst X bình thường bị bất hoạt không có bản sao có hoạt tính chức năng của gen CD: chuyển đoạn X;21 thường gặp gen DMD (bệnh loạn dưỡng cơ Duchene) được xác định nằm ở Xp21 Nguyen Thi Hong Van Department of Genetics – HUS 14_10.jpg Sự bất hoạt X không ngẫu nhiên xảy ra ở bệnh nhân nữ bị DMD mang chuyển đoạn Xp21- nst thường Chuyển đoạn cân bằng, nhưng điểm đứt gãy nst X làm phá vỡ gen dystrophine gene (hộp màu đỏ). Sự bất hoạt X là ngẫu nhiên, nhưng các tế bào bất hoạt X mang chuyển đoạn bị chết bởi sự mất cân bằng di truyền. Phôi phát triển hoàn toàn từ các tế bào mà X bình thường bị bất hoạt, dẫn đến người phụ nữ không có gen dystrophine có chức năng bình thường. Do vậy dẫn đến bệnh DMD. Nguyen Thi Hong Van Department of Genetics – HUS 14_11.jpg A balanced 5;8 translocation disrupts the NSD1 gene in a patient with Sotos syndrome Nguyen Thi Hong Van Department of Genetics – HUS Các bệnh liên kết mất đoạn nst Các vùng mất đoạn toàn bộ là công cụ xác định nhiều gen bệnh Tách dòng tính trừ (Subtraction cloning) được sử dụng để phân lập các dòng từ ADN bình tường tương ứng với các trình tự bị mất ở bệnh nhân. VD: xác định mất đoạn Xp21 từ bệnh nhân DMD sử dụng mất đoạn liên quan gen PHEX bị đột biến ở bệnh còi xương do kháng vitamin D lập bản đồ di truyền gen này trên đoạn nhỏ ở cánh ngắn nst X Nguyen Thi Hong Van Department of Genetics – HUS Các bệnh liên kết mất đoạn nst Mất đoạn nhỏ: gây ra nhiều hội chứng di truyền Vùng mất đoạn nhỏ có giá trị xác định các gen bệnh Khẳng định các mất đoạn nghi ngờ bằng FISH hoặc điện di gel trường xung (pulsed field gel electrophoresis) và Southern blotting Nguyen Thi Hong Van Department of Genetics – HUS NSD1 microdeletion demonstrated by FISH in a patient with Sotos syndrome. Two homologs of chromosome 5 are identify by the red FISH probe that recognizes a sequence on 5pter. The green probe is a BAC from 5qter containing NSD1 gene; this sequence is lacking on one copy of chromosome 5. 8 Nguyen Thi Hong Van Department of Genetics – HUS 5. Khẳng định gen ứng viên Gen ứng viên phải được kiểm tra để xác định đột biến ở gen đó có gây bệnh hay không Các cách kiểm tra : Sàng lọc đột biến Khôi phục kiểu hình bình thường in vitro Tạo nên mô hình chuột bệnh Sau khi khẳng định, tìm hiểu chức năng của gen ứng viên Nguyen Thi Hong Van Department of Genetics – HUS Sàng lọc đột biến để kiểm tra gen ứng viên có khả năng áp dụng, tương đối nhanh Nếu tỷ lệ bệnh nhân mang các đột biến độc lập là đủ lớn tiến hành sàng lọc đôt biến liên quan đến bệnh. VD: mất chức năng gen bệnh liên kết X hoặc trội trên nst thường Kiểm tra bằng các quy trình sàng lọc đột biến Nguyen Thi Hong Van Department of Genetics – HUS 18_01.jpg Phát hiện đột biến bằng giải trình tự Double peak shows a heterozygous mutation 332CT Nguyen Thi Hong Van Department of Genetics – HUS 18_01_2.jpg Đột biến mất 1 nuceleotide A 3659delA. Trình tự phía sau vị trí mất bị nhiễu, cho thấy trình tự trùm nhau của hai alen ở thể dị hợp tử. Nguyen Thi Hong Van Department of Genetics – HUS 16_01.jpg Các đột biến mất chức năng ở gen PAX3 (trong hội chứng Waardenburg Type 1). 10 exon được biểu diễn bằng các hộp (DNA binding domains) Nguyen Thi Hong Van Department of Genetics – HUS 18_03.jpg Sàng lọ đột biến ở gen CFTR. (A) Phân tích heteroduplex và SSCP. (B) Điện di gel gradient biến tính (Denaturing gradient gel electrophoresis) 9 Nguyen Thi Hong Van Department of Genetics – HUS Xác định đột biến DMD bằng HPLC biến tính. Đường xanh: người nam bị ảnh hưởng Đường đỏ: đối chứng bình thường Giải trình tự cho thấy đột biến ở vị trí cắt nối 738+1GT Nguyen Thi Hong Van Department of Genetics – HUS Sàng lọc đột biến DMD sử dụng protein truncation test (PTT). Phản ứng cặp đôi phiên mã – dịch mã được sử dụng để tạo ra các sản phẩm polypeptide được đánh dấu được mã hóa bởi một đoạn mARN. Các đoạn cứa các codon kết thúc sớm tạo nên chuỗi pp ngắn. RT-PCR được sử dụng để quét toàn bộ gen dystrophin ở 10 đoạn trùm nhau trong một loạt các bệnh nhân DMD. Các polypeptide chạy nhanh hơn cho thấy có chứa codon kết thúc sớm Nguyen Thi Hong Van Department of Genetics – HUS 18_06.jpg Sàng lọc nhiều đột biến mất đoạn ở gen dystrophin ở nam giới. Sản phẩm multiplex PCR exon sử dụng các mẫu từ 10 người nam không có quan hệ họ hàng bị bệnh DMD. Mồi PCR được thiết kế để mỗi exon được nhân với cả trình tự intron biên, tạo ra các sản phẩm PCR kích thước khác nhau. Nguyen Thi Hong Van Department of Genetics – HUS 14_13.jpg Functional complementation in transgenic mice as a tool for identifying a human disease gene. Shaker-2 mouse mutation was identify by finding a wild-type clone that corrected the defect. Human families with a similar phenotype that mapped to the corresponding chromosomal location proved to have mutation in the orthologous gene. Nguyen Thi Hong Van Department of Genetics – HUS Các ví dụ minh họa các gen bệnh khác nhau đã được xác định Hội chứng Sotos: xác địn trực tiếp bằng đột biến nst Hội chứng Treacher Collins: bằng lập bản đồ bản mã sao Hội chứng Branchio-oto-renal: bằng giải trình tự đoạn gen lớn và tìm trình tự tương đồng Rodopsin và fibrillin: bằng xác định chức năng của gen ứng viên dựa vào vị trí. Nguyen Thi Hong Van Department of Genetics – HUS 14_13_2.jpg