6.3 Nhóm thụ thể Tyrosine Kinase: (Tyrosine kinase receptors) Distinct mechanisms of small-molecule inhibitors and monoclonal antibodies for targeting receptor tyrosine kinases in cancer cells. a | Epidermal growth factor receptor (EGFR) and receptor tyrosine kinase (RTK)-dependent growth signalling in cancer cells. The extracellular region of EGFR consists of four domains, the ligand-binding domains (L1 and L2) and the cysteine-rich domains (CR1 and CR2), and the C-terminal domain of EGFR contains six tyrosine residues (Y; only two are depicted here for simplicity). Following the activation of EGFR by ligand binding or ligand-independent dimerization, the Ras–Raf– MEK–MAPK pathway is activated through the growth factor receptor-bound protein 2 (GRB2)–SOS complex. EGFR-mediated signalling also activates the phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)–AKT pathway, which contributes to anti-apoptotic effects of EGFR activation. Additionally, signal transducer and activator of transcription (Stat) proteins (STAT1, STAT3 and STAT5) are also activated. The coordinated effects of these EGFR downstream signalling pathways lead to the induction of cellular responses including proliferation, differentiation, cell motility, adhesion and angiogenesis. The deregulation of EGFR-mediated signalling in some cancer cells leads to aberrant proliferation, invasion, metastasis and neovascularization.[9] b | Small-molecule tyrosine kinase inhibitors (TKIs) such as gefitinib function as ATP analogues and inhibit EGFR signalling by competing with ATP binding within the catalytic kinase domain of RTKs. As a result, the activation of various downstream signalling pathways is blocked. Each TKI has a different selectivity for RTKs, and some are dual- or multi-selective, which might provide a therapeutic advantage. c | By contrast, therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) bind to the ectodomain of the RTK with high specificity (for example, cetuximab binds to the L2 domain of EGFR, and thereby inhibits its downstream signalling by triggering receptor internalization and hindering ligand–receptor interaction. Unlike small-molecule inhibitors, mAbs also activate Fcγ-receptor- dependent phagocytosis or cytolysis by immune-effector cells such as neutrophils, macrophages and natural killer cells by inducing complement-dependent cytotoxicity (CDC) or antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC).[107] MAPK, mitogen-activated protein kinase; MEK, mitogen-activated protein kinase kinase. Khám phá thụ thể Tyrosine kinase Khoảng hơn 30 năm trước, các thụ thể của hormone polypeptide như là insulin và GH đã được phát hiện như là vùng nối kết kích hoạt hoạt động của màng tế bào, tế bào hoặc các protein xuyên màng bằng cách sử dụng protein đánh dấu phóng xạ. Tuy nhiên, sự truyền tín hiệu của những thụ thể này vẫn còn là điều bí mật trong suốt 10 năm sau đó cho đến khi hoạt tính của PTK được khám phá. RTK đầu tiên được khám phá cả về cấu tạo và chức năng là thụ thể EGF (epidermal growth factor). Stanley Cohen và đồng sự đã tách ly được thụ thể EGF và chứng minh nó là một glycoprotein trong màng tế bào và có trọng lượng là 170kDa, ngoài ra người ta còn thấy nó có một vùng nối kết đặc biệt. Cấu trúc hoàn chỉnh của thụ thể EFG được phát hiện nhờ vào phương pháp phân dòng cDNA (cDNA cloning) và trình tự mRNA, PTK được cố định ở trong bào tương tại thụ thể chuỗi polypeptide (receptor polypeptide chain). Ligand nối kết làm nhị hợp hóa thụ thể EGF và nhanh chóng kích hoạt PTK tự phosphoryl hóa một vài phân tử tyrosine tại đầu C của thụ thể. Các phosphotyrosine là vùng nối kết cho vùng Src homology 2 (SH2) hoặc vùng gắn kết phosphotyrosine (phosphotyrosine-binding domain, PTB) của một vài phân tử protein tín hiệu. Sau đó, RTKs được phát hiện có 20 dòng nhỏ khác nhau và tất cả đã được phân lập. Những cấu trúc này hằng định trong vùng xúc tác của PTK nhưng chúng biến động rất lớn trong khu vực ngoại bào cũng như là tại juxtamembrane và vị trí tại đầu C trong bào tương. Sự phân loại các dòng nhỏ (subfamilies) dựa vào các trình tự tương đồng chính yếu (primary-sequence homology) và sự tương khớp trong cấu trúc bậc 2. Vùng giàu cysteine, vùng immunoglobulin-like (Ig-like), vùng giàu leucine, vùng giàu cadherin-like, vùng fibronectin type III, vùng EGF-like, và vùng kringle-like chỉ rõ đặc điểm của khu vực ngoại bào của RTKs. Hình 6.11: Minh họa 20 họ của siêu họ RTK. (Theo Textbook of Receptor Pharmacology 2nd ed - J. Foreman_ T. Johansen) Nhìn chung, tyrosine kinase là họ thụ thể được cấu tạo bởi 2 thành phần chính: Ngoại bào và nội bào, chúng nối kết với nhau bằng một chuỗi polypeptide xuyên màng. Thành phần ngoại bào là nơi gắn kết với ligand (khu vực gắn ligand, ligand biding domain-LBD). Thành phần nội bào có những amino acid tyrosine, là vị trí phosphoryl hóa dưới sự xúc tác của tyrosine kinase. Chuỗi polypeptide xuyên màng là một vòng α có cấu trúc bậc II, cấu trúc mỏng manh của vòng xoắn α làm thành phần ngoại bào dễ bị lệch trục khi màng bào tương trở nên giảm linh động do sự tích hợp của protein, cholesterol tự do hay acid béo no lên màng bào tương nên LBD không thể gắn được với ligand. Tình trạng này được xem là một trong những nguyên nhân gây ra hiện tượng kháng insulin trong hội chứng chuyển hóa cũng như tình trạng miễn dịch kém trong hội chứng này, vì thụ thể insulin và cytokines thuộc họ RTK. Hình 6.12: Cấu trúc SH2 Các học thuyết về sự kích hoạt thụ thể Tyrosine Kinase Các nghiên cứu trên chức năng của thụ thể EGF đã xác lập được 2 hệ luận trong sự hoạt hóa RTK và sự truyền tín hiệu. Trước hết, RTKs được kích hoạt bởi sự nhị hợp hóa phát sinh bởi sự liên kết với ligand. Ngoại trừ họ thụ thể insulin, tất cả các thụ thể RTK khác (EGF, thụ thể platelet-derived growth factor (PDGF)) đều có cấu trúc monomer trên màng tế bào. Khi ligand nối kết với thụ thể đã khiến nó trải qua quá trình dimer hóa và quá trình tự phosphoryl hóa xảy ra trên vùng C (nội tế bào chất) của nó. Thụ thể insulin là một thụ thể dimer disulfide, 2 chuỗi polypeptide được gọi là α 2 β 2 heterotetramer. Insulin nối kết với tiểu đơn vị α ngoài màng tế bào dẫn đến quá trình sắp xếp lại (rearrangement) trong cấu trúc của thụ thể (quaternary heterotetrameric) và kích hoạt PTK, tăng cường quá trình tự phosphoryl hóa của vùng nội bào. Thể hoạt hóa của thụ thể insulin và các thụ thể monomer PTK khác đều ở trạng thái dimer, và cơ chế hoạt hóa các thụ thể này rất tương đồng với nhau. Hình 6.13: Minh họa sự dimer hóa của RTK (Theo Textbook of Receptor Pharmacology 2nd ed - J. Foreman_ T. Johansen) Thứ hai, thụ thể tự phosphoryl hóa tạo ra vùng phosphotyrosine (phosphotyrosine sites) tại vị trí trong màng bào tương của thụ thể, tạo ra một vùng neo (docking site) để nối kết với vùng SH2 và PTB. Hơn nữa, để cho thấy vai trò trung tâm trong quá trình điều hòa hoạt động của PTK, sự tự phosphoryl hóa tyrosine của RTK là một quá trình thiết yếu để tái cấu trúc và kích hoạt các phân tử protein tín hiệu. Hầu hết các vùng tự phosphoryl hóa tyrosine đều nằm ở vùng không xúc tác (noncatalytic regions) của vùng nội bào phân tử thụ thể. Những vùng này gồm đuôi C (C- terminal tail) (như với thụ thể EGF) hoặc vùng nối phosphate (kinase insert region) (như đối với thụ thể PDGF). Sự tương tác giữa vùng SH2 và các motif phosphotyrosine tạo ra cơ chế hiệp đồng và tái cấu trúc của phức hợp tín hiệu (signaling complex) bằng cách kích hoạt RTK. Do vậy, tất cả RTK cần phải được biết đến không chỉ dưới vai trò thụ thể (PTK activity) mà còn phải xem như là nền tảng của sự nhận diện và tái cấu trúc (bổ sung) các thành phần đặc biệt của phân tử protein tín hiệu. Hình 6.14: Thụ thể của Growth hormone (GH). Các cấu trúc monomer GH kết hợp với phần khác để tạo thành cấu trúc dimer khi có GH nối kết. Quá trình này được xúc tác bởi JAK2 kinase trans-phosphorylate JAK2 và thụ thể GH, yếu tố phiên mã STAT được phosphoryl bởi JAK2.(Theo Textbook of Receptor Pharmacology 2nd ed - J. Foreman_ T. Johansen) Hình 6.15: Các dạng RTK tiêu biểu và cấu trúc bất hoạt/hoạt động Chi tiết sự hoạt hóa dimer hóa tysosine Trong gần 20 năm trở lại đây, những quá trình tín hiệu đã được hiểu rõ dựa vào sự hiểu biết về nền tảng phân tử của quá trình dimer hóa RTKs. Nền tảng này được các nghiên cứu hóa sinh học về việc nối kết ligand và hoạt hóa RTK chứng minh là đúng. Tuy nhiên, các phân tử nền tảng chính xác cho sự hình thành này vẫn chưa được biết đầy đủ. Các hiểu biết về ligand trong phức hợp của nó với vùng kết nối thụ thể đã cho thấy cơ chế tự nhiên của sự dimer hóa này. Một vài cấu trúc lập thể của thụ thể trong phức hợp của nó với ligand tương ứng đã được chứng minh, bao gồm cả cytokin cũng như các thụ thể của yếu tố tăng trưởng (growth factor). Những ligand khác nhau dẫn đến các cơ chế tác động khác nhau nhưng đều có điểm chung là kích thích vùng dimer hóa của RTK. Cấu trúc lập thể của những monomer ligand như GH và EPO trong phức hợp với các thụ thể đặc hiệu cho thấy những hormone này tạo nối kết với thụ thể theo tỉ lệ 1:2. Sự dimer hóa thụ thể được làm ổn định hóa hơn nữa bởi sự tương tác giữa các thụ thể kế cận. Một vài yếu tố tăng trưởng là cấu trúc dimer thuần (homodimers), như vascular endothelial growth factor (VEGF) và PDGF chứng minh cho việc dimer hóa của thụ thể. Thụ thể VEGF chứa 7 vùng Ig-like trong cấu trúc xuyên màng của nó, trong đó chỉ có vùng 2 và 3 là có nối kết với ligand. Cấu trúc lập thể của VEGF trong phức hợp với Ig-like 2 của thụ thể Flt-1 VEGF là bằng chứng trực tiếp xác nhận sự dimer hóa của thụ thể. Cấu trúc này cho thấy một phân tử thụ thể bám vào phần còn lại bởi 2 vùng nối liền giữa các VEGF protomer tạo thành phức hợp có 2 thành phần đối xứng (twofold symmetric), ngoài ra chứa thêm 2 VEGF protomer của vùng Ig- like 2. Fibroblast growth factor (FGF) là một monomer ligand, nó hoạt hóa thụ thể FGF với sự bổ trợ của phân tử phụ - heparin sulfate proteoglycan. Cấu trúc lập thể của FGF trong phức hợp với ligand tại vùng nối kết (bao gồm cả vùng 2 và 3 của Ig-like) cho tỉ lệ 2:2 (FGF:FGF) phức hợp thụ thể, nghĩa là FGF tương tác bền với vùng 2 và 3 của Ig-like mà các nối kết này nằm trong cùng 1 thụ thể. Cấu trúc dimer được giữ ổn định bởi một vùng liên kết thứ cấp có sự tương tác giữa FGF và D2 của thụ thể thứ cấp trong phức hợp cũng như là sự tương tác giữa 2 thụ thể. Ngược lại với liên kết disulfide của VEGF dimer, 2 phân tử FGF trong liên hệ 2:2 (FGF:FGF) không có sự liên hệ với nhau. 2 thụ thể FGF không hoàn toàn cố định thành thụ thể FGF dimer hóa trên bề mặt tế bào. Heparin hay heparan sulfate proteoglycan là thành phần ổn định hóa cấu trúc dimer này. Heparin bám vào vùng eo có điện tích dương được tạo bởi Lys và Arg kéo dài xuyên qua vùng D2 (D2 domain) của cả 2 thụ thể trong cấu trúc dimer và nối tiếp biên phân tử FGF. . phosphoryl hóa một vài phân tử tyrosine tại đầu C của thụ thể. Các phosphotyrosine là vùng nối kết cho vùng Src homology 2 (SH2) hoặc vùng gắn kết phosphotyrosine (phosphotyrosine-binding domain,. những quá trình tín hiệu đã được hiểu rõ dựa vào sự hiểu biết về nền tảng phân tử của quá trình dimer hóa RTKs. Nền tảng này được các nghiên cứu hóa sinh học về việc nối kết ligand và hoạt hóa. 6.3 Nhóm thụ thể Tyrosine Kinase: (Tyrosine kinase receptors) Distinct mechanisms of small-molecule inhibitors and monoclonal antibodies for targeting receptor tyrosine kinases in cancer