HỆ THỐNG ĐIỆN DI (ELECTROPHORESIS SYSTEMS)

HỆ THỐNG ĐIỆN DI (ELECTROPHORESIS SYSTEMS)

G.V.H.D: Nguyễn Hoàng Lộc

HỆ THỐNG ĐIỆN DI

(ELECTROPHORESIS SYSTEMS)

A Hệ thống điện di DNA nằm ngang

I. Nguyên lý hoạt động

II Thành phần cấu tạo và đặc điểm kỹ thuật

của máy điện di Sub-cell® GT Agarose

1 Thành phần cấu tạo

2 Đặc điểm kỹ thuật

III Vận hành

1. Chuẩn bị DNA gel:

 Cân một lượng agarose nhất định phụ thuộc vào yêu

cầu nồng độ vào thể tích agarose gel

Bảng 1: Nồng độ gel phù hợp với kích thước DNA cần phân tách

Bảng 2: Thể tích gel yêu cầu.

- Cho agarose vào trong bình chứa có thể tích thích hợp(e.g.,

250 ml bình nón, Wheaton bottle, etc.), thêm một lượng đệm phù hợp và khuấy

- Có thể làm nóng chảy agarose bằng nước sôi, bằng đĩa từ, hay bằng lò vi sóng Người ta thường dùng lò vi sóng nhiều hơn, cài đặt thời gian khoảng 5 phút sau đó để khoảng 30 giây, rồi lấy ra đưa nhiệt độ về khoảng 60 o C bằng nước lạnh trước khi đổ gel

Chú ý: Luôn mang các dụng cụ bảo vệ và mặc áo blue trong phòng thí nghiệm khi chuẩn bị và đổ gel

2 Đúc gel agarose

Đúc gel trên Sub-cell base:

- Đặt Sub-cell cho cân bằng

- Đẩy trượt cổng đổ gels tới các rãnh đối diện ở điểm cuối của bệ gel

- Cắm lược có số răng thích hợp để tạo ra các giếng chứa mẫu cần thiết trên gel gần phía cathode

- Chuẩn bị nồng độ và khối lượng agarose thích hợp trong 1x electrophoresis buffer Khi agarose nóng chảy được làm lạnh xuống khoảng 50-60 độ C thì chúng ta đổ gel vào giữa

Chú ý: Nếu nhiệt độ đổ gel lớn hơn 60 thì có thể làm plastic bị giãn ra và làm giảm tuổi thọ của Sub-cell base Và kết quả là bề mặt của Sub-cell không còn bằng phẳng.

- Để khoảng 20-40 phút cho gel đông đặc ở nhiệt độ phòng

- Cẩn thận khi rút lược ra khỏi gel đông đặc và tháo rời cổng đổ gel

 Đúc gel trên UVTP tray.

- Đặt khay lên một cái bệ và giữ cân bằng.

- Đẩy cổng đổ gel theo các rãnh tới vị trí đối diện ở cuối

bệ Phải chắc chắn là bờ và rãnh của khay phải cân bằng và đều Khối lượng của the gates thì phải kín để ngăn chặn sự rò rỉ trong quá trình đúc gel.

- Cắm lược có số răng thích hợp để tạo ra các giếng chứa mẫu cần thiết trên gel gần phía cathode.

- Chuẩn bị nồng độ và khối lượng agarose thích hợp trong 1x electrophoresis buffer Khi agarose nóng chảy được làm lạnh xuống khoảng 50-600c thì chúng ta đổ gel vào giữa

- Để khoảng 20-40 phút cho gel đông đặc ở nhiệt độ phòng

- Cẩn thận khi rút lược ra khỏi gel đông đặc và tháo rời cổng đổ gel

 Đúc gel trên UVTP tray sử dụng Gel-caster.

Lắp ráp khay UVTP để đổ gel

 Đúc gel trên UVTP tray sử dụng Gel-caster.

- Kiểm tra cân bằng leveling bubble.

- Mở khoá và trượt movable walk để mở phần cuối của gel caster bằng cách xoay và nhấn chốt lên.

- Đặt phần cạnh hở của UVTP tray sát với fix wall.

- Trượt MW đến cạnh của UVTP tray.

- Để đóng kín khay, xoáy chốt cam bằng cách xoay và ấn xuống đồng thời

- Khi chốt cam đã rơi vào khe thích hợp, tiếp tục xoay chốt nếu thấy cần Việc này đảm bảo đóng kín các cạnh của khay để đổ gel.

- Đặt lược vào khay thích hợp của khay

- Đổ gel 20-40 phút cho đông gel, lấy lược ra.

- Mở khoá của chốt cam Trượt MW xa khay Lấy ra khỏi gel caster.

- Đặt khay lên bệ của Sub-Cell, mẫu gần cực (-).

- Cho gel chìm trong 2-6 mm dung dịch đệm.

3 Tiến hành điện di

- Một số đệm thường được dùng để điện di Nucleic acid trên agarose gel như Tris-Acetate-EDTA (TAE) buffer

or Tris-Borate-EDTA (TBE) buffer

- Chuẩn bị mẫu gel loading

- Cho thêm loading dye cho tới khi đạt nồng độ 1x, điều này giúp cho mẫu nặng hơn và chìm xuống đáy giếng

- Load mẫu vào trong giếng bằng cách sử dụng một pipets chuẩn hoặc Multichannel pipets.

- Đậy nắp lại cẩn thận, không được làm xáo trộn mẫu Nắp chỉ được gắn theo một hướng xác định phù hợp

- Chúng ta có thể thay đổi độ dày của gel, chiều dài, nồng độ gel và loại đệm được sử dụng trong diện di

4 Nhuộm và quan sát DNA.

Quy trình nhuộm EtBr:

- Lấy một lượng EtBr thích hợp ( 0,5 µg/ml) nhuộm từ 15-30 phút

- Làm loãng thuốc nhuộm bằng cách ngâm trong nước (15-30 phút) với thể tích bằng thể tích bằng với thể tích thuốc nhuộm đã dùng

- Rửa nhẹ thuốc nhuộm còn dư trên gel bằng nước trong thời gian ngắn

- Đặt gel lên trên UV transilluminator để quan sát và phân tích ở bước sóng 302 nm

- Dùng thiết bị chuyên dụng để chụp và quan sát hình ảnh DNA

B Hệ thống điện di protein thẳng đứng

I Nguyên lý hoạt động: tương tự hệ thống điện di

DNA nằm ngang.

II Cấu tạo: Điện di SDS-PAGE

Hệ thống Mini-PROTEAN® Tetra Cell

Hình:

cấu tạo buồng điện di

Hình: giá đổ gel

III Vận hành

1 Lắp khuôn đổ gel

2 Đổ gel: Polyacrylamide gel không liên tục:

- Đặt lược vào khuôn gel Đánh dấu trên tấm kính cách răng lược 1cm Lấy lược ra

- Chuẩn bị dung dịch monomer Khử khí dung dịch dưới điều kiện chân không tối thiểu 15 phút

- Thêm APS và TEMED vào và đổ gel đến chỗ đánh dấu Đổ gel nhẹ nhàng để tránh trộn lẫn gel với không khí

- Ngay lập tức phủ lên dung dịch monomer bằng nước hay t-amyl alcohol

- Polymer hóa trong vòng 45phút đến 1h Rửa bề mặt gel bằng nước cất

Chú ý: Ở thời điểm này, gel phân giải có thể được bảo quản ở RT qua đêm

- Chuẩn bị dung dịch monomer của stacking gel Trộn tất cả các thành phần ngoại trừ APS và TEMED Khử khí dưới điều kiện chân không tối thiểu 15 phút

- Làm khô phần đỉnh của gel phân giải với giấy thấm trước khi đổ stacking gel

- Thêm APS và TEMED vào dung dịch monomer,

đổ gel vào 2 tấm kính Tiếp tục đổ cho đến khi tới đỉnh của ShP

- Cho lược vào

- Cho polymer hóa trong vòng 45 phút đến 1h

- Nhẹ nhàng lấy lược ra và rửa các giếng bằng nước cất hay đệm chạy

- Rửa khung đổ gel và giá với nước cất và nước khử ion sau khi dùng

3 Hệ thống điện di và loading mẫu

a) Lắp ráp:

b) Loading mẫu:

- Đổ đệm vào lên đến mép

của tấm kính bên ngoài

- Load mẫu ở bên ngoài

buồng điện di

4 Đặt hệ thống điện cực vào trong buồng điện di

- Đặt buồng điện di trên bề mặt phẳng, phía trước của buồng điện di quay về phía người sử dụng, khi đã đặt đúng hướng, màu đỏ bên phải màu đen bên trái.

- Đặt điện cực vào, chú ý (+) với màu đỏ

- Đổ đầy đệm vào buồng điện di.

5 Lắp buồng điện di:

Đậy nắp buồng điện di Sau khi kiểm tra xong, ấn nắp xuống cho đến khi nắp nằm vững trên buồng điện di.

6 Nguồn điện:

- 200V là điện áp được đề nghị để thực hiện SDS page

7 Lấy gel:

- Sau khi đã hoàn thành điện di, tắt nguồn

- Mở nắp và cẩn thận nâng các điện cực lên Loại bỏ đệm chạy.

- Mở khóa và lấy gel cassettes ra.

- Tách 2 tấm kính một cách nhẹ nhàng.

- Lấy gel ra bằng cách ngâm gel trong dung dịch cố định, nhẹ nhàng khuấy động cho đến khi gel tách khỏi tấm kính.

C ĐIỆN DI TẬP TRUNG ĐẲNG ĐIỆN

(isoelectric focusing – IEF)

I. Nguyên lý hoạt động

- Ngoài điện di SDS, có thể điện di các protein

tùy theo điểm đẳng điện (isoelectric point, IEP) của chúng Phương pháp này được gọi

là điện di tập trung đẳng điện (isoelectric focusing, IEF) Trong dung dịch đệm có pH biến thiên liên tục (gradient pH), các protein

sẽ phân ly đến vị trí tương thích với điểm đẳng điện của mình

Hình: nguyên

lý hoạt động của IEF

II Cấu tạo:

Máy PROTEAN® IEF Cell.

1 Các đặc tính

kỹ thuật:

2 Bên ngoài:

-Front panel display

3 Khay: có 2 loại khay

Khay rehydration/equilibration Khay focusing.

4 IPG strip (immobilized pH Gradient Strip)

Ưu điểm của IPG strip:

-Reproducibility:

+Được cung cấp sẵn sàng để sử dụng

+Sự thiết lập Gradient nhờ sự điều khiển của máy tính

+Gradient pH không thay đổi.

+Gradient pH và chiều dài gel được điều chỉnh chặt chẽ cho bước phân tách chiều thứ 1.

-Dễ sử dụng:

+Có tấm plastic nâng đỡ khuôn acrylamide.

+Bảo quản trong tủ lạnh cho đến khi sử dụng

+Strips dễ dàng nạp vào đỉnh của gel ở bước điện di chiều thứ 2

+Có thế nạp một lượng lớn mẫu protein.

-Số lượng:

+Có thể chạy một lần 24 strips 7cm hay 12 strips 11 cm hay 17cm.

Broad range:pH 3-10,

Narrow range:pH 3-6,5-8,7-10, 4-7,

Micro range:3.9-5.1, 4.7-5.9, 5.5-6.7, 6.3-8.3

III Vận hành.

1 Rehydration

- IPG strip đã được dehydrate do đó phải được rehydrate

để nó đạt được độ dày ban đầu là 0,5 mm trước khi sử dụng

+ Rehydration không có mẫu:

- Mẫu có thể được nạp vào IPG strip sau quá trình rehydration trước khi chuyển sang focusing

- IPG strip được dehydrate trong đệm rehydration mà không có mẫu và mẫu được nạp vào thông qua cái kênh của focusing tray

a Cài đặt các thông số:

a1 Rehydration:

IEF Cell cung cấp sự lựa chọn bao gồm bước rehydration được điều nhiệt trong quá trình chạy điện di đẳng điện hoặc lập chương trình rehydration tách biệt

+ Active rehydration:

- Mẫu có chứa trong đệm rehydration

- Sử dụng điện áp 50V

- Sử dụng khay Focusing

a2 Peltier Platform temperature:

PPT có thế được điều khiển trong suốt quá trình rehydration và bước điện di tập trung đẳng điện.Nhiệt

độ đựơc cài đặt dao động từ 10 đến 25 độ C

a3 Các thông số về năng lượng:

+ Các phương pháp tăng điện áp: có 3 sự lựa chọn

để gia tăng điện áp: nhanh(RAPID), thẳng (LINEAR), chậm ( SLOW)

+ Điện áp: Điện áp tối đa 10 000V

+ Thời gian tập trung đẳng điện: Thời gian có thể được cài đặt lên đến 99h

+ Giới hạn dòng điện:

- Dòng điện ra tối đa là 2.4mA Giá trị điện áp tối

đa là 99µA/strip Trong chương trình được cài đặt sẵn, giới hạn dòng điện được cài đặt đến 50 µA để ngăn ngừa việc đun nóng quá hay làm cháy IPG strip

+ Hold step:

- Hold step duy trì điện áp ở 500V cho đến khi quá trình chạy được dừng bởi người sử dụng

b Điện di tập trung đẳng điện:

- Khi IPG strip đã được rehydrate chúng có thể được tập trung khi có hoặc không có electrode wicks đã được làm ướt

- Làm ướt electrode wicks trong nước khử ion, thấm nước thừa đi Đặt electrode wicks trực triếp trên đỉnh của cả cathode và anode trong focusing tray ngay trước khi focusing

c Cài đặt các chương trình:

Chương trình rehydration:

- Có 2 phương pháp rehydration khác nhau, passive và active Khi sử dụng phưong pháp active rehydration, IPG strip được đặt trong focusing tray, passive rehydration, IPG strip có thể được đặt trong rehydration/ equilibration tray hay focusing tray

Màn hình biểu diễn trên

thiết bị

 Chạy chương trình có sẵn:

 IEF Cell bao gồm 3 phương pháp có sẵn Mỗi phương pháp dựa vào các cách mà điện áp gia tăng

 Trong tất cả các phương pháp có sẵn thì giá trị điện

áp tối đa dựa vào chiều dài của IPG strip (4000v/7cm, 8000v/11cm, 10000v/17cm)

 Mỗi phương pháp cung cấp 1 cường độ điện trường tối đa là khoảng ~600V/cm của IPG strip Cường độ dòng điện giới hạn là 50microA/IPG strip

Hình:

Các

bước thiết lập chương trình có sẵn

 Chương trình dự trữ:

 Chọn mục Store method

 Màn hình sẽ hiển thị những phương pháp đã có Chọn phương pháp mong muốn

 Có thể RUN, EDIT, DELETE phương pháp

 Trong mục EDIT, có thể thay đổi tên phương pháp, thay đổi từng bước trong phương pháp, thay đổi các thông số….Sau khi EDIT có thế save lại hoặc không save mà cho chạy luôn, có thể đổi tên hoặc thay thế luôn phương pháp cũ

Hình:

Các

bước thiết lập chương trình dự trữ.

 Cài đặt phương pháp mới:

• Sửa chữa phương pháp trong lúc chạy:

2.2.Điện di chiều thứ hai:

- Ngâm IPG strip trong đệm chứa SDS và dán strip

lên đỉnh của 2nd D gel

- Cố định bằng dung dịch agarose 0.5-1% để đảm

bảo mỗi liên kết tốt giữa gel và strip

- Chạy điện di

Hình: kết quả điện di 2 chiều

THE END