BAI 8.SINH TỔNG HỢP PROTEIN

4/21/2015 1 SINH TỔNG HỢP PROTEIN 1 BÀI 8: GV: ThS. Chu Thị Bích Phượng 8.1. HỌC THUYẾT TRUNG TÂM 8.1.1 Các đặc điểm của quá trình tổng hợp protein 2  Khuôn mẫu để tổng hợp nên protein không phải là protein Nơi chứa DNA mang thông tin di truyền và chỗ sinh tổng hợp protein tách rời nhau về không gian RNA là chất trung gian chuyển thông tin từ DNA ra tế bào chất và làm khuôn để tổng hợp protein HỌC THUYẾT TRUNG TÂM (central dogma) (Crick - 1956 ) Trình tự đặc hiệu của các amino acid trên phân tử protein sẽ được mã hóa bằng nhóm các nucleotide trên phân tử DNA. Đơn vị mã hóa (codon) gồm 3 nucleotide . 3 8.1. HỌC THUYẾT TRUNG TÂM 8.1.1 DNA và mã di truyền Bảng mã di truyền  Codon kết thúc  Tính suy biến  Tính phổ biến 8.2.1 Nguyên tắc chung - Chỉ một trong hai mạch của phân tử DNA được dùng làm khuôn tổng hợp RNA. - Enzyme mRNA-polymerase bám vào DNA làm tách mạch và di chuyển theo hướng 3’ đến 5’ trên DNA để mRNA được tổng hợp theo hướng 5’ đến 3’. 4 8.2. QUÁ TRÌNH PHIÊN MÃ (TRANSCRIPTION) Tên gọi chính xác: RNA polymerase phụ thuộc DNA Ở prokaryote sự phiên mã có đặc điểm: - Chỉ có một loại RNA-polymerase tổng hợp tất cả các loại RNA. - mRNA thường chứa thông tin nhiều gene nối tiếp. 5 8.2. QUÁ TRÌNH PHIÊN MÃ (TRANSCRIPTION) 8.2.2. Sự phiên mã ở prokaryote Promoter: nơi bám vào DNA của RNA polymerase – đoạn khởi động CAT: điểm xuất phát phiên mã (CAT nằm cách khoảng 7 base phía sau chỗ bám về phía đầu 3’ mạch bổ sung. 6 8.2. QUÁ TRÌNH PHIÊN MÃ (TRANSCRIPTION) 8.2.2. Sự phiên mã ở prokaryote 4/21/2015 2 7 8.2. QUÁ TRÌNH PHIÊN MÃ (TRANSCRIPTION) 8.2.2. Sự phiên mã ở prokaryote 8 8.2. QUÁ TRÌNH PHIÊN MÃ (TRANSCRIPTION) 8.2.2. Sự phiên mã ở eukaryote Phiên mã ở eukaryote có các đặc điểm sau: • RNA-polymerase II chịu trách nhiệm tổng hợp mRNA còn hai RNA – polymerase khác tổng hợp RNA của ribosome và các loại RNA khác • mRNA chứa thông tin của 1 gene • Gen của eukaryote có tính gián đoạn: bao gồm các exon và các intron • Qua trình phiên mã phức tạp hơn nhiều: ở đầu 5’ của mRNA có gắn chóp là 7-methylguanosine còn cuối mRNA phía 3’ có thêm đuôi polyadenine dài 100-200 adenine • Đặc biệt là bản phiên mã đầu tiên còn gọi là tiền mRNA chưa được sử dụng trực tiếp mà phải qua quá trình chế biến. 3 giai đoạn: - Gắn chóp: gắn 7-methyl-Guanylate vào đầu 5’P - Thêm đuôi: nối poly -A vào đầu 3’OH - Cắt nối: cắt bỏ các intron, nối các exon lại với nhau 9 8.2. QUÁ TRÌNH PHIÊN MÃ (TRANSCRIPTION) 8.2.2. Sự phiên mã ở eukaryote 3 Loại:  rRNA: chiếm tỉ lệ cao, có thể đến 75% của tổng RNA của tế bào, là thành phần căn bản của các ribosome.  tRNA: 10 8.2. QUÁ TRÌNH PHIÊN MÃ (TRANSCRIPTION) 8.2.3. Phân loại rRNA t nht mi loi tRNA đc hiu cho 1 trong 20 amino acid. tRNA chiu di khong 73 đn 93 nucleotide, cu trc gm mt mch cun li như hnh l ch ba nh bt cp bên trong phân t, v đu mt 3' c trnh t kt thc CCA. amino acid luôn luôn gn vo đu CCA. - Ít nht mi loi tRNA đc hiu cho 1 trong 20 amino acid. Amino acid với tRNA bởi enzyme aminoacyl-tRNA synthetase  mRNA: 11 8.3. QUÁ TRÌNH DỊCH MÃ (TRANSLATION) 8.2.2. Ribosome Ribosome: gồm rRNA, enzyme và các protein cấu trúc - 2 tiểu đơn vị: Đơn vị lớn của ribosome của Prokaryote gồm 2 phân tử rRNA và 35 protein; đơn vị nhỏ có một rRNA và khoảng 20 protein. - Khi không thực hiện tổng hợp protein, mỗi đơn vị tồn tại tách rời trong tế bào chất 12 8.3. QUÁ TRÌNH DỊCH MÃ (TRANSLATION) 8.2.2. Các giai đoạn 3 giai đoạn: + Khởi sự + Nối dài + Kết thúc 4/21/2015 3 13 8.3. QUÁ TRÌNH DỊCH MÃ (TRANSLATION) 8.2.2. Các giai đoạn + Khởi sự Nhân tố khởi sự IF Codon bắt đầu: AUG mã hóa methionine Khi tRNA khi s gn vi đơn v nh ribosome, phc hp s bm vo cc trnh t nhn bit đc bit ca ribosome d đu 5' ca mRNA pha trưc đon m ha cho protein. Nh đ, anticodon ca tRNA- methyoninee khi s bt cp vi codon xut pht AUG trên mRNA,  đim-P (P-site). Sau đ, đơn v ln v nh gn vo nhau thnh ribosome nguyên vn. - tRNA khác mang anticodon tương ứng bắt cặp với codon ở điểm-A (A-site) cn trống. - Tiếp theo amino acid đã được gắn tRNA nằm ở điểm -P được tách ra gắn với amino acid trên tRNA ở điểm-A. - tRNA ở điểm-P sẽ được phóng thích. - Phản ứng nối các amino acid kề nhau được xúc tác bởi enzyme peptidyl transferase. - Ribosome di chuyển từ đầu 5' của mRNA đến đầu 3' 14 8.3. QUÁ TRÌNH DỊCH MÃ (TRANSLATION) 8.2.2. Các giai đoạn + Nối dài 15 8.3. QUÁ TRÌNH DỊCH MÃ (TRANSLATION) 8.2.2. Các giai đoạn + Nối dài 16 8.3. QUÁ TRÌNH DỊCH MÃ (TRANSLATION) 8.2.2. Các giai đoạn + Kết thúc Nhân tố tách mạch RF Codon kết thúc: UAA, UAG, UGA 17 8.3. KỸ THUẬT TÁI TỔ HỢP DNA 2. ENZYME CẮT GIỚI HẠN 18 Enzyme là công cụ hữu hiệu được sử dụng trong quá trình cắt, nối và chép gen. Các enzyme nuclease, ligase, DNA polymerase,… và có vai trò hàng đầu là các enzyme cắt giới h 4/21/2015 4  Enzyme cắt giới hạn (Restriction Endonucleases) 19 - Là các enzyme nội sinh đặc biệt (phát hiện đầu tiên ở tế bào vi khuẩn Haemophilus influenzae – Hind II) - Có thể nhận biết một trình tự nucleotide đặc hiệu trong chuỗi DNA sợi đôi và cắt cả hai sợi DNA đó. Enzyme giới hạn trong tế bào có vai trò phát hiện và phân cắt DNA của các tế bào lạ. Chúng không phân cắt DNA của chính chúng do trong tế bào còn tồn tại hệ thống enzyme cải biên (thường là enzyme methylase – methyl hóa cytosine ở vị trí C5 và adenine ở vị trí C6 thuộc vùng giới hạn – chuỗi đích) enzyme cải biên bảo vệ DNA Bảng 1. Các loại enzyme giới hạn chính 20 Công bố mới nhất hiện nay có 3945 RE, trong đó có 3834 enzyme loại II (97%) và 641 enzyme loại này được thương mại hóa (R. Roberts, 2009). (http://rebase.neb.com/rebase/rebase.html) Enzyme loại 2 nhận biết DNA mạch kép ở những trình tự nhận biết và cắt DNA ở điểm này hay điểm kế cận Enzyme giới hạn loại II là các endonuclease cắt DNA ở các vị trí chuyên biệt  sử dụng trong các nghiên cứu về sinh học phân tử 21 2 dạng cắt:  Cắt đầu dính (sticky ends)  Cắt đầu bằng (blunt ends) Palindrome Enzyme nối: ligase 22 - Nối một sợi đơn không liên tục trong chuỗi kép DNA - Nối vị trí bị đứt gãy ở cả 2 mạch DNA bổ sung với nhau trong chuỗi kép DNA Enzyme nối: ligase 23 Cơ chế: Hình thành cầu nối phosphodiester giữa nhóm 3’- hydroxyl của một nucleotide này với nhóm phosphate của một nucleotide khác Video: enzyme cắt giới hạn DNA ligase 24 4/21/2015 5 3. CÁC VECTOR 25 Khái niệm về vector Là 1 phân tử DNA có khả năng tự tái sinh, tồn tại độc lập trong tế bào và mang được gen cần chuyển:  Có điểm khởi đầu sao chép ori để có thể tự sao chép mà tồn tại độc lập  Có trình tự nhận biết để RE cắt và gắn đoạn gen mới vào Có trình tự điều hòa (promoter) tạo thuận lợi cho sự phiên mã gen lạ Có các gen đánh dấu để dễ dàng phát hiện ra chúng và các gen lạ gắn vào Để chuyển gen từ Sv này sang Sv khác có thể thực hiện bằng cách biến nạp hoặc bơm trực tiếp DNA vào TB. Tuy nhiên: -Phần lớn DNA xâm nhập vào tb sẽ bị phân hủy hoặc mất sau qtr phân bào -Gen thường chỉ có 1 đoạn duy nhất, rất nhỏ so với chiều dài bộ máy DNA  khó biểu hiện tính trạng mong muốn  Muốn chuyển gen có chủ định phải sao chép ra nhiều bản Plasmid 27 Plasmid thường thấy ở tế bào vi khuẩn, và nấm men, có kích thước từ 1 – 1000 kbp, số lượng có thể thay đổi từ 1 – 1000 , được xem là bộ gen di động vì có khả năng tiếp hợp, một cơ chế chuyển gen theo chiều dọc. Plasmid là một công cụ quan trọng trong CNDT và SHPT để nhân hay biểu hiện gen đặc biệt Gen mong muốn chèn vào plasmid sau đó plasmid chèn vào VK. Sử dụng chất kháng sinh để chọn lọc Hai trường hợp tồn tại của plasmid ở trong tế bào VK CÁC VECTOR Các ứng dụng của vector • Tạo dòng và khuếch đại trình tự của DNA • Nghiên cứu sự biểu hiện của 1 đoạn trình tự DNA • Đưa gen vào các tế bào vi sinh vật hay động thực vật • Sản xuất RNA • Sản xuất protein từ gen được tạo dòng CÁC VECTOR Các loại plasmid • Plasmid thế hệ thứ nhất: tìm thấy trong tự nhiên (ColE1, pSC101 ) ColE1 Plasmid thế hệ thứ 1 hiện nay không sd nữa CÁC VECTOR Các loại plasmid • Plasmid thế hệ thứ hai: tập trung các đặc tính quý của plasmid tự nhiên vào 1 cấu trúc duy nhất (các pBR, ví dụ: pBR322) pBR322 Có khả năng sao chép độc lập với tế bào E. coli và tồn tại trung bình từ 20 – 30 bản sao cho 1 tê bào pBR322 có chứa gen kháng Amp, gen kháng Tetra và nhiều trình tự nhận biết của enzme cắt giới hạn. 4/21/2015 6 CÁC VECTOR Các loại plasmid • Plasmid thế hệ thứ ba: mạnh nhất hiện nay. Có kích thước nhỏ, mang 1 polylinker (nhóm pUC, nhóm pSP và Gemini, nhóm Bluescript) pUC 18 Plasmid đa năng và chuyên dụng. Polylinker có chứa cả chục trình tự nhận biết khác nhau CÁC VECTOR Các phage: Là virus xâm nhiễm và phân giải VK Ưu điểm: Xâm nhập dễ dàng vào TB vi khuẩn và có khả năng sinh sôi nhanh, hiệu quả Kích thước nhận lớn hơn plasmid Nhược điểm: Thao tác phức tạp Lamda phage CÁC VECTOR Sự chuyển gen bởi phage lamda Ưu điểm nổi bật của phage là có hệ thống tự động xâm nhập và sinh sản trong tế bào chủ Phage  34 VECTOR TÁI TỔ HỢP 35 Vetor tái tổ hợp (recombinant vector) Định nghĩa: Vector chuyển gen + DNA lạ = vector tái tổ hợp (Plasmid + DNA lạ = plasmid tái tổ hợp) 36 VIDEO: DNA recombinant 4/21/2015 7 Vector tái tổ hợp  Qua 3 bước chính: B1: Tách DNA plasmid và DNA tế bào cho. B2: Cắt DNA plasmid và DNA tế bào cho với cùng một loại emzim giới hạn. B3: Nối DNA plasmid và DNA tế bào cho nhờ enzim nối ligase tạo thành vector tái tổ hợp. Ứng dụng: Insuline là một protein do tuyến tụy tiết ra để điều hòa lượng đường trong máu. Cơ thể thiếu insulin dẫn đến quá trình rối loạn TDC làm tích tụ đường trong nước tiểu. Trước đây, insulin được trích từ tuyến tụy của gia súc hoặc tổng hợp hóa học qua 170 phản ứng khác nhau  chuyển gen tổng hợp insulin vào E.coli nuôi cấy trong nồi lên men 1000 lit sau 1 tg ngắn thu được 200 g insulin tương đương lượng chiết từ 8000 – 10.000 con bò Interferon: trước đây phải tách chiết từ máu nên rất tốn kém  từ 1980 đã điều chế thành công interferon bằng cách nuôi cấy E. coli HGH (somatotropin): thông thường muốn chế được HGH phải chích từ tuyến yên của tử thi, muốn chữa bệnh lùn cần HGH từ 100 – 150 tử thi  1 lit dịch E. coli lên men thu lượng HGH tương đương 60 tử thi . 4/21/2015 1 SINH TỔNG HỢP PROTEIN 1 BÀI 8: GV: ThS. Chu Thị Bích Phượng 8. 1. HỌC THUYẾT TRUNG TÂM 8. 1.1 Các đặc điểm của quá trình tổng hợp protein 2  Khuôn mẫu để tổng hợp nên protein không. 35 protein; đơn vị nhỏ có một rRNA và khoảng 20 protein. - Khi không thực hiện tổng hợp protein, mỗi đơn vị tồn tại tách rời trong tế bào chất 12 8. 3. QUÁ TRÌNH DỊCH MÃ (TRANSLATION) 8. 2.2 sung. 6 8. 2. QUÁ TRÌNH PHIÊN MÃ (TRANSCRIPTION) 8. 2.2. Sự phiên mã ở prokaryote 4/21/2015 2 7 8. 2. QUÁ TRÌNH PHIÊN MÃ (TRANSCRIPTION) 8. 2.2. Sự phiên mã ở prokaryote 8 8. 2. QUÁ TRÌNH