k4510

Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368 Đặt vấn đề Các chất kháng sinh có nguồn gốc vi sinh vật thờng đợc phân lập từ vi khuẩn (Bacteria), vi nấm (Microfungi) và xạ khuẩn (Actinomycetes). Kháng sinh từ xạ khuẩn chiếm 80% tổng số chất kháng nhận đợc từ vi sinh vật [14] Xạ khuẩn có 2 chi cho kháng sinh nhiều nhất là Streptomyces và Micromonospora. Chi Streptomyces đã đợc các nhà sinh vật nghiên cứu trong nhiều năm, rất nhiều chất kháng sinh từ chi này đợc ứng dụng trong điều trị, song cơ hội tìm đ- ợc những chất kháng sinh mới có giá trị từ Streptomyces ngày càng ít. Vì vậy trong những năm gần đây một chi khác của xạ khuẩn đợc thế giới quan tâm nhiều là Micromonospora. Ngời ta đã nhận đợc từ chi này một số chất kháng sinh tốt, phổ rộng nh: Gentamycin, Neomycin-B, Rifamycin . ở Việt Nam chi Micromonospora mới đợc nghiên cứu từ những năm 90 nhng kết quả còn rất hạn chế. Với mong muốn đợc tiếp tục tìm hiểu về đặc tính phân loại và khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của Micromonospora ở Việt Nam, hy vọng có thể nhận đợc những chủng cho chất kháng sinh có ý nghĩa . Chúng tôi chọn đề tài: Phân lập Micromonospora có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh từ bùn hồ Bẩy Mẫu - Hà Nội . Với các nhiệm vụ sau: - Phân lập Micromonospora từ bùn hồ và thử phổ kháng khuẩn của các chủng phân lập. - Nghiên cứu phân loại một số chủng có hoạt tính kháng sinh tốt. - Sơ bộ xác định một số thành phần dinh dỡng thích hợp cho sự phát triển và sinh tổng hợp kháng sinh của các chủng đã chọn. Từ kết quả nghiên cứu ban đầu của khoá luận chúng tôi hy vọng nó sẽ là cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo. 1 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368 Phần 1. Tổng quan 1.1 Đại cơng về chi Micromonospora [ 7, 8, 12, 13,14] 1.1.1 Đặc điểm sinh thái của Micromonospora: Micromonospora là một chi thuộc họ Micromonosporaceae, bộ Actinomycetales, lớp Actynomycetes. Micromonospora có rất ít trong đất Teplakova và Maximova (1957) đã chỉ tìm thấy 1,2% Micromonospora trong các phân lập Actinomycetes. SzaboZsusza (1986) đã nhận thấy tỷ lệ của Micromonospora trong đất núi là 2,6%, đất trồng trọt là 14%, đất than bùn từ 50%-60%. - Đất bùn giàu nguyên liệu hữu cơ rất thích hợp cho sự phát triển của Micromonospora. Theo Cross và Collins (1966), 1 gam bùn hồ có khoảng 4000 Micromonospora. - Nớc hồ có rất ít Actinomycetes nhng có đến 76% là Micromonospora streptomyces chỉ có 6% (Unbreit và McCoy, 1941). - Gramein và Meyers (1958) đã tìm thấy Micromonospora từ nớc biển và đất phù sa, những Micromonospora này rất chịu muối, chúng chiếm đa số trong các phân lập Actinomycetes từ đất phù sa của biển. 1.1.2 Đặc điểm hình thái của Micromonospora : -Micromonospora có khuẩn ticơ chất phân nhánh, thờng không có khuẩn ti khí sinh, bắt màu Gram(+), không kháng acid. Đờng kính khuẩn ti từ 0,2 đến 0,6àm. - Bào tử riêng lẻ không cuống hoặc có cuống nằm phân tán hoặc thành từng đám trên hệ sợi cơ chất phân nhánh. Thành bào tử dày tạo sự khúc xạ ánh sáng mạnh. Bào tử hình tròn, oval, hoặc các dạng khác nhau, bề mặt bào tử nhẵn, có gai hoặc xù xì. 2 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368 - Khuẩn lạc của Micromonospora có dạng hình cầu nhỏ nhô lên trên bề mặt môi trờng. Trong những ngày phát triển đầu tiên khuẩn lạc của các loài rất giống nhau có màu da cam nhạt đến da cam. - Khi nuôi cấy già có thể tạo sắc tố đặc trng tuỳ thuộc vào môi trờng nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy . Khi hình thành bào tử khuẩn lạc có mầu nâu hoặc màu đen, chúng có thể khô hoặc trở thành ớt và nhầy. 1.1.3 Tính chất hoá học của thành tế bào: Cơ sở để phân biệt chi Micromonospora với các chi khác của xạ khuẩn là không có khuẩn ti khí sinh và sự hình thành bào tử, ngoài ra còn dựa trên tính chất thành tế bào kiểu II của nó. Thành tế bào kiểu II đặc trng bởi thành phần hóa học có: m-diaminopimelic acid ,glycin và glutamic acid, thành phần đờng là xylose và arabinose. Glucose, galactose, manose và rhamnose thì khác nhau của các loài. 1.1.4 Tính chất sinh lý, sinh hoá của Micromonospora. Micromonospora đóng vai trò vô cơ hoá các nguyên liệu hữu cơ và trong sự mùn hoá, ngoài ra Micromonospora có thể phân huỷ cellulose, kitin, lignin, xylan, tinh bột, casein, khử nitrat, protein. Nhiệt độ phát triển từ 20 0 C -> 40 0 C, nhng không phát triển ở trên 50 0 C. Hầu hết các loài hiếu khí, mẫn cảm với pH < 6,0. - Bào tử của Micromonospora ngợc lại với bào tử Streptomyces, chịu đợc nhiệt độ và dung môi hữu cơ. Chúng có thể tồn tại trong nớc 60 0 C trong 90 phút, nh- ng chết ở 90 0 C trong 15 phút. Bào tử chịu đợc pH từ 6 ữ 8, thờng bị mẫn cảm ở pH acid mạnh. Bào tử có thể sống sót trong các dung môi hữu cơ nồng độ không quá 80%, bào tử có sự kháng cao với dioxal, aceton. 1.1.5 Khả năng gây bệnh của Micromonospora: Micromonospora có thể gây bệnh cho ngời, động vật, tuy nhiên khả năng gây bệnh cũng có hạn chế và cha rõ ràng, mặc dù một số tác giả đã phân lập đợc Micromonopora từ các tổ chức bị bệnh , ví dụ : Erikson (1935) đã tìm thấy 3 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368 Micromonospora gallica từ máu; Morquer và Comby (1943) đã ghi Micromonospora caballi gây bệnh cho da giống Actinomyces; Morch (1975) đã tìm thấy một chủng M .chalcea từ tổ chức, và chủng này gây bệnh trên da của chim bồ câu. 1.1.6 Sự tạo kháng sinh của Micromonospora : Micromonospora có khả năng tạo kháng sinh thuộc nhiều nhóm khác nhau về mặt hoá học nh: amynoglycosid, macrolid, ansamycin, polypeptid. - Một số kháng sinh nhóm aminoglycosid: Gentamycin do M.echinospora và M.purpurea. (Weinstein & cộng tác 1963; Luedemann & Brodsky 1964). Micromonosporin do M.sp ATCC 10026 (Wagman & cộng tác 1974). Sisomycin do M.injoensis (Weinstein & cộng tác 1970). Neomycin B do M.sp 69-638 (Wagman & cộng tác 1973). Verdamycin do M.Gramisea (Weinstein & cộng tác 1975). Fortimycin A & B do M. olivasterospora (Naro & cộng tác 1977; Kawamoto & cộng tác 1983). - Một số kháng sinh nhóm Macrolid: Megalomycin do M.megalomicea (Weinstein & cộng tác 1969). Rosamycin do M.rosarria (Wagman & cộng tác 1972). XK - 41 do M. inositola (Kawamoto & cộng tác 1974). Juvenimycin do M. chalcea & izumensis (Hatano & cộng tác 1976). M - 4365 do M.capillata (Furumai & cộng tác 1977). Erythromycin B từ M. sp. 1225 (Marquez 1976). - Một số kháng sinh nhóm ansamycin: Halomicins do M.halophytica (Weinstein & cộng tác 1968; Luedemann & cộng tác 1970). Rifamicin từ M. ellipsaspora 71372. - Một số kháng sinh nhóm polipeptid: 4 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368 Chalcidin do M. chalcea H 85 (Gauze & cộng tác 1970). 1.2 Những nghiên cứu về phân loại trên quần thể Micromonospora. [5,7,9,12,14] : - Wagman S.A (1961) đã nhận định trong các loài đặc chủng của Micromonospora các tính chất về hình thái là những tiêu chuẩn, ban đầu cho việc xác định loài. Các đặc tính sinh lý, sinh hoá nh phân huỷ cellulose, khử nitrat cũng quan trọng. Mầu và hình dạng của khuẩn lạc không đợc coi là những đặc tính cơ bản, vì mầu của nó không cố định mà thay đổi từ vàng sang da cam, hồng, đỏ, nâu và đen. Các loài Micromonospora là hiếu khí hoặc kỵ khí. Chúng có thể sử dụng các nguồn nitrogen và carbon vô cơ, hữu cơ khác nhau. Wagman S.A đã chia chi Micromonospora thành 9 loài bao gồm: M. chalcea M. parva M. coerulea M. gallica M. fusca M.propionica M. globosa M. elongata M. bicolo - Sveshmikova và cộng tác năm (1970) đã nghiên cứu những loài Micromonospora từ đất bùn ở ngoại ô Moscow. Họ đã đa ra 5 loài mới nhng chỉ dựa trên rất ít đặc tính nh sử dụng 6 nguồn carbon, sự tạo sắc tố trong môi trờng và kiểu bào tử. Nhng theo họ tiêu chuẩn này cũng không luôn luôn ổn định. - Singal và Solovieva (1974) cũng đã nghiên cứu khả năng sử dụng nguồn carbon của Micromonospora.Tuy nhiên không có những kết luận về phân loại từ những số liệu này. - Luedemann (1970, 1971), sau những nghiên cứu chi tiết trên nhiều phân lập Micromonospora ông đã đa ra nhiều tính chất hữu ích dễ phân biệt loài trong chi Micromonospora. Theo ông ngoài sắc tố khuẩn ti màu da cam thì các endopigment luôn khác nhau (nâu, hồng, tím, xanh lá cây, xanh . ) các sắc tố hoà tan này rất có ý nghĩa. 5 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368 Sự hình thành bào tử không luôn luôn là những đặc tính có giá trị nhng cần dựa trên những kiểu khác nhau của hình thành bào tử để phân loại. Phổ sử dụng nguồn carbon cũng có ý nghĩa nhng giá trị này không đủ cho việc xác định 1 loài. Tính chất chịu NaCl và sự phát triển trên miếng khoai tây acid và trung tính cũng là những đặc tính hữu ích cho phân loại. Tuy nhiên những chủng riêng biệt có sự thay về mức độ và một số tính chất. Đặc biệt là phổ sử dụng carbon có sự lặp lại thấp. Sự so sánh với chủng chuẩn là cần thiết nó giúp cho việc phân loại nhanh và chính xác. - Ivanitskaya và cộng tác (1983) cũng đa ra một số tính chất sinh lý, sinh hoá để xác định 3 loài mới của Micromonospora và ngời ta cũng đã tìm thấy có sự liên quan giữa sự tạo kháng sinh với một số đặc tính riêng về phân loại của Micromonospora. Sổ tay định loại vi sinh vật của Bergey (1980) đã đa ra khoá phân loại của chi Micromonospora bao gồm 14 loài hiếu khí và 2 loại kỵ khí trên cơ sở những đặc tính hình thái, sinh lý, sinh hoá của chúng. - Szabó. Zsuzsa (1982) đã sử dụng phơng pháp số học để phân loại quần thể Micromonospora của bùn hồ Bulaton (Hungari). Phơng pháp này có tính u việt so với phơng pháp phân loại truyền thống. - Trong khoá luận này với khả năng và giới hạn về các thông tin cho phép chúng tôi nghiên cứu phân loại 5 Micromonospora đại diện theo khoá phân loại của Luedemann G.M (1969) và sổ tay định loại vi sinh vật của Bergey (1980) đồng thời đối chiếu với khoá phân loại của Waksman S.A (1961). Có so sánh với các chủng chuẩn là: Micromonospora chalcea ATCC 12452. Micromonospora halophytica ssp halophytica ATCC 27596. Micromonospora narashino ATCC 27331. 6 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368 Phần 2. Thực nghiệm và kết quả 2.1 Nguyên liệu và phơng pháp thực nghiệm 2.1.1 Nguyên liệu: - Nguyên liệu để phân lập chủng, các mẫu bùn của hồ Bảy Mẫu- Hà Nội. - Các môi trờng nuôi cấy: Các môi trờng của Luedemann (1971) và Szabozsuzsa (1982) đã đợc sử dụng trong nghiên cứu. - Chủng Micromonospora dùng trong nghiên cứu: Chủng Micromonospora dùng trong nghiên cứu đợc phân lập từ các mẫu bùn hồ Bẩy Mẫu. Trên cơ sở phổ kháng khuẩn chúng tôi đã chọn 5 chủng để nghiên cứu phân loại đợc ký hiệu là M 14 , M 16 , M 26 , M 30 , M 47 . - Chủng vi sinh vật chỉ thị: Gồm 9 vi khuẩn và 1 vi nấm. - Vi khuẩn Gram (+): Staphylococcus aureus ATCC 12228. Bacillus pumilus NTCC 8241. Bacillus subtilis ATCC 6633. Sarcina lutea ATCC 9314. - Vi khuẩn Gram (-) . Escherichia coli ATCC 25922. Salmonella typhi DT 220. Shigella flexneri DT 112. Proteus mirabilis BV 108 Pseudomonas aeruginosa VM 201. - Vi nấm: Candida albicans ATCC 10231 . Các chủng vi sinh vật chỉ thị là chủng quốc tế hoặc đợc phân lập tại các viện nghiên cứu của Việt Nam. 7 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368 2.1.2 Ph ơng pháp thực nghiệm: theo Szabo zs. (1982) và Luedemann (1971) 2.1.2.1 Ph ơng pháp lấy mẫu và phân lập chủng Micromonospora: Bùn đợc lấy ở lớp bề mặt từ 0 ->15cm ở các vị trí cách bờ hồ: 5m;10m; 20m; 50m, sau đó đợc trộn đều để phân lập chủng. 10g bùn đợc hoà vào 90ml dung dịch K 2 Cr 2 O 4 0,4%, lắc đều trong 2 giờ, pha loãng tiếp thành các nồng độ 10 -2 , 10 -3 , 10 -4 cấy vào các môi trờng phân lập sau: - Môi trờng men tinh bột: (MT1) Tinh bột tan 20,0g. Cao men 10,0g. Thạch 18,0g. Nớc cất 1000,0ml pH: 7 0,2. - Môi trờng Gauze I: (MT 2). Tinh bột tan 20,0g. K 2 HPO 4 . 7 H 2 0 0,5g. NaCl 0,5g. MgSO 4 . 7 H 2 0 0,5g KNO 3 1,0g. FeSO 4 .7 H 2 0 0,01g. Thạch 18,0g. Nớc cất 1000,0ml pH: 7 0,2 Sau 5 đến 7 ngày nuôi cấy ở 28 0 C đến 32 0 C các khuẩn lạc Micromonospora hình thành. Dựa vào hình dạng mầu sắc khuẩn lạc, hệ sợi cơ chất đặc trng để phân biệt Micromonospora với các khuẩn lạc vi sinh vật khác. Những khuẩn lạc sạch mọc riêng rẽ đợc cấy sang môi trờng men tinh bột và môi trờng Gauze I. 2.1.2.2 Ph ơng pháp xác định khả năng tạo kháng sinh của các chủng phân lập: 8 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368 Các phân lập sạch sau 1 tuần nuôi cấy trong ống thạch nghiêng đợc cấy lên bề mặt thạch đĩa Gauze I. Sau đó 5 đên 7 ngày nuôi cấy đợc thử hoạt tính kháng sinh bằng phơng pháp khối thạch dựa trên nguyên tắc chất kháng sinh có trong khối thạch đợc khuếch tán vào môi trờng đã cấy vi sinh vật chỉ thị tạo vòng vô khuẩn có đờng kính tỷ lệ thuận với logarit nồng độ. Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của các phân lập đợc đánh giá bằng đờng kính vòng ức chế. - Chuẩn bị nhũ dịch vi sinh vật chỉ thị: Các vi sinh vật sau 18 đến 24 giờ nuôi cấy trên các môi trờng thích hợp đợc làm thành nhũ dịch (có khoảng 10 7 10 8 tế bào trong 1ml) trong NaCl 0,9%. - Môi trờng: Môi trờng cao thịt cao men (thử ức chế vi khuẩn): MT3 Pepton 10,0g. Cao thịt 1,5g. Cao men 3,0g. Glucose 1,0g. Thạch 18,0g. Nớc cất 1000,0ml pH: 7,0 0,2. Môi trờng Sabouraud (thử ức chế vi nấm): MT 4 Pepton 10,0g. Glucose 40,0g. Thạch 18,0g. Nớc cất 1000,0ml. pH: 7,0 0,2. - Các khối thạch của Micromonospora đợc đặt lên bề mặt của các đĩa môi trờng đã có vi sinh vật chỉ thị với tỷ lệ 1% (v/v). Đo đờng kính vòng ức chế sau 9 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368 18 24 giờ nuôi cấy ở 35 0 C đến 37 0 C (đối với vi khuẩn) và 28 0 C 30 0 C (đối với vi nấm). 2.1.2.3 Ph ơng pháp xác định đặc tính hình thái: Hình dạng bề mặt và mầu sắc khuẩn lạc, màu khuẩn ti cơ chất, sự hình thành bào tử đợc theo dõi trên môi trờng: MT 1 và MT 2. Hình dạng khuẩn ti và cuống sinh bào tử đợc quan sát bằng kính hiển vi quang học và kính hiển vi đối quang với phơng pháp nuôi cấy microfilm. 2.1.2.4 Xác định đặc điểm nuôi cấy: Các đặc điểm nuôi cấy nh sự phát triển, sự tạo sắc tố hoà tan, khả năng tạo bào tử đợc nghiên cứu trên các môi trờng MT 1 & MT 2, - Môi trờng glucose- asparagine (MT 5): Glucose 10,0g Asparagine 0,5g K 2 HPO 4 0,5g. Thạch 18,0g. Nớc cất 1000,0ml. pH: 7,0 0,2. - Môi trờng Czaperk - Saccharose: (MT 6) NaNO 3 2,0g. K 2 HPO 4 . 7 H 2 O 1,0g. MgSO 4 . 7 H 2 O 0,5g. KCl 0,5g. FeSO 4 .7 H 2 O 0,1g. Saccharose 30,0g. Thạch 18,0g. Nớc cất 1000,0ml pH: 7,0 0,2. - Môi trờng thạch sữa (MT 7): Cao men 5,0g. Glucose 1,0g. CaCO 3 1,0g. 10