MỤC LỤC I. Giới thiệu 1. Lựa chọn protein: 1.1. Trình tự DNA mã hóa protein 1.2 Chức năng của protein 1.3 Bản đồ của các trang web enzyme giới hạn trong các trình tự nucleotide mã hóa các protein 2. Lựa chọn plasmid: 3. Lựa chọn enzyme cắt 4. Thết kế chiến lược nhân dòng 5. Bản đồ chi tiết về tái tổ hợp plasmid II. Tài liệu tham khảo I. Giới thiệu 1. Lựa chọn protein: insulin 1.1. Trình tự DNA mã hóa protein Các chuỗi ADN mã hóa protein insulin dưới đây lấy từ: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/J00265.1?report=fasta&log$=seqview >gi|186429|gb|J00265.1|HUMINS01 Human insulin gene, complete cds Dưới đây là trình tự đoạn ADN mã hóa cho pretein insulin: CTCGAGGGGCCTAGACATTGCCCTCCAGAGAGAGCACCCAACACCCTCCAGGCTTGACCGGCCAGGGTGT CCCCTTCCTACCTTGGAGAGAGCAGCCCCAGGGCATCCTGCAGGGGGTGCTGGGACACCAGCTGGCCTTC AAGGTCTCTGCCTCCCTCCAGCCACCCCACTACACGCTGCTGGGATCCTGGATCTCAGCTCCCTGGCCGA CAACACTGGCAAACTCCTACTCATCCACGAAGGCCCTCCTGGGCATGGTGGTCCTTCCCAGCCTGGCAGT CTGTTCCTCACACACCTTGTTAGTGCCCAGCCCCTGAGGTTGCAGCTGGGGGTGTCTCTGAAGGGCTGTG AGCCCCCAGGAAGCCCTGGGGAAGTGCCTGCCTTGCCTCCCCCCGGCCCTGCCAGCGCCTGGCTCTGCCC TCCTACCTGGGCTCCCCCCATCCAGCCTCCCTCCCTACACACTCCTCTCAAGGAGGCACCCATGTCCTCT CCAGCTGCCGGGCCTCAGAGCACTGTGGCGTCCTGGGGCAGCCACCGCATGTCCTGCTGTGGCATGGCTC AGGGTGGAAAGGGCGGAAGGGAGGGGTCCTGCAGATAGCTGGTGCCCACTACCAAACCCGCTCGGGGCAG GAGAGCCAAAGGCTGGGTGTGTGCAGAGCGGCCCCGAGAGGTTCCGAGGCTGAGGCCAGGGTGGGACATA GGGATGCGAGGGGCCGGGGCACAGGATACTCCAACCTGCCTGCCCCCATGGTCTCATCCTCCTGCTTCTG GGACCTCCTGATCCTGCCCCTGGTGCTAAGAGGCAGGTAAGGGGCTGCAGGCAGCAGGGCTCGGA GCCCATGCCCCCTCACCATGGGTCAGGCTGGACCTCCAGGTGCCTGTTCTGGGGAGCTGGGAGGGC CGGAGGGGTGTACCCCAGGGGCTCAGCCCAGATGACACTATGGGGGTGATGGTGTCATGGGACCTGGCC AGGAGAGGGGAGATGGGCTCCCAGAAGAGGAGTGGGGGCTGAGAGGGTGCCTGGGGGGCCAGGACGGAGCTGGGC CAGTGCACAGCTTCCCACACCTGCCCACCCCCAGAGTCCTGCCGCCACCCCCAGATCACACGGAAGATGAGGTCC GAGTGGCCTGCTGAGGACTTGCTGCTTGTCCCCAGGTCCCCAGGTCATGCCCTCCTTCTGCCACCCTGGG GAGCTGAGGGCCTCAGCTGGGGCTGCTGTCCTAAGGCAGGGTGGGAACTAGGCAGCCAGCAGGGAGGGGA CCCCTCCCTCACTCCCACTCTCCCACCCCCACCACCTTGGCCCATCCATGGCGGCATCTTGGGCCATCCG GGACTGGGGACAGGGGTCCTGGGGACAGGGGTCCGGGGACAGGGTCCTGGGGACAGGGGTGTGGGGACAG GGGTCTGGGGACAGGGGTGTGGGGACAGGGGTGTGGGGACAGGGGTCTGGGGACAGGGGTGTGGGGACAG GGGTCCGGGGACAGGGGTGTGGGGACAGGGGTCTGGGGACAGGGGTGTGGGGACAGGGGTGTGGGGACAG GGGTCTGGGGACAGGGGTGTGGGGACAGGGGTCCTGGGGACAGGGGTGTGGGGACAGGGGTGTGGGGACA GGGGTGTGGGGACAGGGGTGTGGGGACAGGGGTCCTGGGGATAGGGGTGTGGGGACAGGGGTGTGGGGAC AGGGGTCCCGGGGACAGGGGTGTGGGGACAGGGGTGTGGGGACAGGGGTCCTGGGGACAGGGGTCTGAGG ACAGGGGTGTGGGCACAGGGGTCCTGGGGACAGGGGTCCTGGGGACAGGGGTCCTGGGGACAGGGGTCTG GGGACAGCAGCGCAAAGAGCCCCGCCCTGCAGCCTCCAGCTCTCCTGGTCTAATGTGGAAAGTGGCCCAG GTGAGGGCTTTGCTCTCCTGGAGACATTTGCCCCCAGCTGTGAGCAGGGACAGGTCTGGCCACCGGGCCC CTGGTTAAGACTCTAATGACCCGCTGGTCCTGAGGAAGAGGTGCTGACGACCAAGGAGATCTTCCCACAG ACCCAGCACCAGGGAAATGGTCCGGAAATTGCAGCCTCAGCCCCCAGCCATCTGCCGACCCCCCCACCCC GCCCTAATGGGCCAGGCGGCAGGGGTTGACAGGTAGGGGAGATGGGCTCTGAGACTATAAAGCCAGCGGG GGCCCAGCAGCCCTCAGCCCTCCAGGACAGGCTGCATCAGAAGAGGCCATCAAGCAGGTCTGTTCCAAGG GCCTTTGCGTCAGGTGGGCTCAGGGTTCCAGGGTGGCTGGACCCCAGGCCCCAGCTCTGCAGCAGGGAGG ACGTGGCTGGGCTCGTGAAGCATGTGGGGGTGAGCCCAGGGGCCCCAAGGCAGGGCACCTGGCCTTCAGC CTGCCTCAGCCCTGCCTGTCTCCCAGATCACTGTCCTTCTGCCATGGCCCTGTGGATGCGCCTCCTGCCC CTGCTGGCGCTGCTGGCCCTCTGGGGACCTGACCCAGCCGCAGCCTTTGTGAACCAACACCTGTGCGGCT CACACCTGGTGGAAGCTCTCTACCTAGTGTGCGGGGAACGAGGCTTCTTCTACACACCCAAGACCCGCCG GGAGGCAGAGGACCTGCAGGGTGAGCCAACCGCCCATTGCTGCCCCTGGCCGCCCCCAGCCACCCCCTGC TCCTGGCGCTCCCACCCAGCATGGGCAGAAGGGGGCAGGAGGCTGCCACCCAGCAGGGGGTCAGGTGCAC TTTTTTAAAAAGAAGTTCTCTTGGTCACGTCCTAAAAGTGACCAGCTCCCTGTGGCCCAGTCAGAATCTC AGCCTGAGGACGGTGTTGGCTTCGGCAGCCCCGAGATACATCAGAGGGTGGGCACGCTCCTCCCTCCACT CGCCCCTCAAACAAATGCCCCGCAGCCCATTTCTCCACCCTCATTTGATGACCGCAGATTCAAGTGTTTT GTTAAGTAAAGTCCTGGGTGACCTGGGGTCACAGGGTGCCCCACGCTGCCTGCCTCTGGGCGAACACCCC ATCACGCCCGGAGGAGGGCGTGGCTGCCTGCCTGAGTGGGCCAGACCCCTGTCGCCAGCCTCACGGCAGC TCCATAGTCAGGAGATGGGGAAGATGCTGGGGACAGGCCCTGGGGAGAAGTACTGGGATCACCTGTTCAG GCTCCCACTGTGACGCTGCCCCGGGGCGGGGGAAGGAGGTGGGACATGTGGGCGTTGGGGCCTGTAGGTC CACACCCAGTGTGGGTGACCCTCCCTCTAACCTGGGTCCAGCCCGGCTGGAGATGGGTGGGAGTGCGACC TAGGGCTGGCGGGCAGGCGGGCACTGTGTCTCCCTGACTGTGTCCTCCTGTGTCCCTCTGCCTCGCCGCT GTTCCGGAACCTGCTCTGCGCGGCACGTCCTGGCAGTGGGGCAGGTGGAGCTGGGCGGGGGCCCTGGTGC AGGCAGCCTGCAGCCCTTGGCCCTGGAGGGGTCCCTGCAGAAGCGTGGCATTGTGGAACAATGCTGTACC AGCATCTGCTCCCTCTACCAGCTGGAGAACTACTGCAACTAGACGCAGCCTGCAGGCAGCCCCACACCCG CCGCCTCCTGCACCGAGAGAGATGGAATAAAGCCCTTGAACCAGCCCTGCTGTGCCGTCTGTGTGTCTTG GGGGCCCTGGGCCAAGCCCCACTTCCCGGCACTGTTGTGAGCCCCTCCCAGCTCTCTCCACGCTCTCTGG GTGCCCACAGGTGCCAACGCCGGCCAGGCCCAGCATGCAGTGGCTCTCCCCAAAGCGGCCATGCCTGTTG GCTGCCTGCTGCCCCCACCCTGTGGCTCAGGGTCCAGTATGGGAGCTTCGGGGGTCTCTGAGGGGCCAGG GATGGTGGGGCCACTGAGAAGTGACTTCTTGTTCAGTAGCTCTGGACTCTTGGAGTCCCCAGAGACCTTG TTCAGGAAAGGGAATGAGAACATTCCAGCAATTTTCCCCCCACCTAGCCCTCCCAGGTTCTATTTTTAGA GTTATTTCTGATGGAGTCCCTGTGGAGGGAGGAGGCTGGGCTGAGGGAGGGGGT Các 5'-và 3'-chuỗi chưa dịch được xác định trong chữ thường, trong khi các vùng mã hóa là chữ hoa. Codon khởi đầu (ATG) codon kết thúc (TGA) được tô đậm và gạch dưới. 1.2. Chức năng của protein 1.3. Bản đồ của các trang web enzyme giới hạn trong các trình tự nucleotide mã hóa các protein 2. Lựa chọn plasmid: - Chọn plasmid là: pBR322 GC = 54%, AT = 46% 3. Chọn enzyme cắt. Enzyme Mèo # Nhiệt độ NEBuffer cung cấp Bổ sung % Hoạt động trong NEBuffer SAM 1.1 2.1 3.1 CutSmart BamHI R0136 37 ° C NEBuffer 3.1 không 75 * 100 * 100 100 * EcoRI R0101 37 ° C NEBuffer EcoRI không 25 100 * 50 50 * Tăng gấp đôi Digest khuyến nghị cho BamHI + EcoRI: • Tiêu hóa trong NEBuffer 3.1 ở 37 ° C. • Ít nhất một enzym có <100% hoạt động trong bộ đệm này, vì vậy đơn vị bổ sung các men tiêu hóa và / hoặc lâu hơn thời gian ủ bệnh có thể cần thiết. • BamHI có một Fidelity cao phiên bản BamHI-HF ® (R3136) EcoRI có một Fidelity cao phiên bản EcoRI-HF ® (R3101) High Fidelity (HF) enzyme hạn chế đã được thiết kế cho hoạt động sao giảm và đã hoạt động 100% trong CutSmart đệm mà có thể đơn giản hóa tiêu hóa đôi của bạn. 4. Thiết kế chiến lược nhân dòng: -Thiết kế primer: 5’ATG GTCTCATCCTCCTGCTTCTGGGACCTCCTGATCCTGCCCCTGGTGCTAAGAGGCAGGTAAGGGGCTGCAG GCAGCAGGGCTCGGAGCCCATGCCCCCTCACCATGGGTCAGGCTGGACCTCCAGGTGCCTGTTCTGGGGAGCTGG GAGGGCCGGAGGGGTGTACCCCAGGGGCTCAGCCCAGA TGA 3’ 3’TACCAGAGTAGGAGGACGAAGACCCTGGAGGACTAGGACGGGGACCACGATTCTCCGTCCATTCCCCGACGTC CGTCGTCCCGAGCCTCGGGTACGGGGGAGTGGTACCCAGTCCGACCTGGAGGTCCACGGACAAGACCCCTCGACC CTCCCGGCCTCCCCACATGGGGTCCCCGAGTCGGGTCTACT 5’