§ §§ §§ §§ §¹i häc khoa häc tù nhiªn ¹i häc khoa häc tù nhiªn ¹i häc khoa häc tù nhiªn ¹i häc khoa häc tù nhiªn ¹i häc khoa häc tù nhiªn ¹i häc khoa häc tù nhiªn ¹i häc khoa häc tù nhiªn ¹i häc khoa häc tù nhiªn - - § §§ §§ §§ §¹i häc quèc gia hµ néi ¹i häc quèc gia hµ néi¹i häc quèc gia hµ néi ¹i häc quèc gia hµ néi¹i häc quèc gia hµ néi ¹i häc quèc gia hµ néi¹i häc quèc gia hµ néi ¹i häc quèc gia hµ néi Khoa sinh häc Khoa sinh häc Khoa sinh häc Khoa sinh häc Khoa sinh häc Khoa sinh häc Khoa sinh häc Khoa sinh häc - - bé m«n di truyÒn häc bé m«n di truyÒn häcbé m«n di truyÒn häc bé m«n di truyÒn häcbé m«n di truyÒn häc bé m«n di truyÒn häcbé m«n di truyÒn häc bé m«n di truyÒn häc CÔNG NGHỆ CÔNG NGHỆ ADN TÁI TỔ HỢPADN TÁI TỔ HỢP ADN TÁI TỔ HỢPADN TÁI TỔ HỢP Di Di Di Di Di Di Di Di truyÒn truyÒntruyÒn truyÒntruyÒn truyÒntruyÒn truyÒn häc hächäc hächäc hächäc häc ph©n ph©nph©n ph©nph©n ph©nph©n ph©n tö tötö tötö tötö tö vµ vµ vµ vµ vµ vµ vµ vµ tÕ tÕtÕ tÕtÕ tÕtÕ tÕ bµo bµobµo bµobµo bµobµo bµo § §§ §§ §§ §INH INH INH INH INH INH INH INH § §§ §§ §§ §OµN LONG OµN LONGOµN LONG OµN LONGOµN LONG OµN LONGOµN LONG OµN LONG Kh¸i niÖm chung ADN t¸i tæ hîp ®−îc thùc hiÖn nh− thÕ nµo? T¸ch chiÕt vµ tinh s¹ch c¸c axit nucleic T¹o vÐct¬ t¸i tæ hîp Néi dung T¹o vÐct¬ t¸i tæ hîp C¸c lo¹i enzym sö dông trong ADN t¸i tæ hîp Nh©n dßng gen vµ x©y dùng ng©n hµng gen Sµng läc c¸c dßng gen trong ng©n hµng gen Kh¸i niÖm chung ADN t¸i tæ hîp ®−îc thùc hiÖn nh− thÕ nµo? T¸ch chiÕt vµ tinh s¹ch c¸c axit nucleic T¹o vÐct¬ t¸i tæ hîp Néi dung 3 T¹o vÐct¬ t¸i tæ hîp C¸c lo¹i enzym sö dông trong ADN t¸i tæ hîp Nh©n dßng gen vµ x©y dùng ng©n hµng gen Sµng läc c¸c dßng gen trong ng©n hµng gen Khái niệm chung ADN tái tổ hợp (recombinant DNA) đợc dùng để chỉ các phân tử ADN đợc tạo ra từ hai hay nhiều phân đoạn ADN xuất xứ từ các nguồn gốc khác nhau. Trong thực tế, công nghệ ADN 4 Trong thực tế, công nghệ ADN tái tổ hợp đôi khi đợc dùng đồng nghĩa với các thuật ngữ nhân dòng phân tử (molecular/DNA cloning), hay kỹ thuật di truyền (genetic engineering). Nhng thực chất các thuật ngữ này có khác nhau. Khái niệm chung Mục đích 1. Phân lập các gen từ hỗn hợp nhiều gen trong tế bào, để có thể phân tích và nghiên cứu từng gen riêng lẻ. 2. Nhân một dòng gen đã đợc phân lập lên một số lợng lớn, để đáp ứng đủ cho nhu cầu 5 số lợng lớn, để đáp ứng đủ cho nhu cầu nghiên cứu. 3. Khả năng tạo ra những gen/tổ hợp gen mới. Vật liệu tách dòng gen 1. ADN 2. mARN (sử dụng kỹ thuật RT-PCR). 6 Kh¸i niÖm chung ADN t¸i tæ hîp ®−îc thùc hiÖn nh− thÕ nµo? T¸ch chiÕt vµ tinh s¹ch c¸c axit nucleic T¹o vÐct¬ t¸i tæ hîp Néi dung 7 T¹o vÐct¬ t¸i tæ hîp C¸c lo¹i enzym sö dông trong ADN t¸i tæ hîp Nh©n dßng gen vµ x©y dùng ng©n hµng gen Sµng läc c¸c dßng gen trong ng©n hµng gen ADN tái tổ hợp thực hiện nh thế nào? Các bớc cơ bản thực hiện ADn tái tổ hợp 1. Chọn nguồn gen cần tách dòng chứa trình tự quan tâm. 2. Chuẩn bị ADN ngoại lai có các đầu 3, 5 phù hợp. 3. Chọn lọc véctơ (thể truyền) phù hợp. 4. Cải biến đầu 3 và 5của véctơ và phân tử ADN ngoại lai. 8 5. Nối phân tử ADN véctơ và ADN ngoại lai. 6. Đa véctơ tái tổ hợp vào tế bào chủ và nhân lên. 7. Sàng lọc để chọn các dòng tế bào mang véctơ tái tổ hợp. 8. Xác định đặc tính các dòng, và sử dụng các dòng cho các mục đích nghiên cứu khác nhau. Kh¸i niÖm chung ADN t¸i tæ hîp ®−îc thùc hiÖn nh− thÕ nµo? T¸ch chiÕt vµ tinh s¹ch c¸c axit nucleic T¹o vÐct¬ t¸i tæ hîp Néi dung 9 T¹o vÐct¬ t¸i tæ hîp C¸c lo¹i enzym sö dông trong ADN t¸i tæ hîp Nh©n dßng gen vµ x©y dùng ng©n hµng gen Sµng läc c¸c dßng gen trong ng©n hµng gen Tách chiết và tinh sạch axit nucleic Một số nguyên tắc cơ bản Tách chiết ADN Các dung môi hữu cơ làm mất nớc, thay đổi môi trờng điện môi kết tủa protein & ADN. Độ pH thờng trung tính hoặc hơi kiềm (7,0 8,5). Phenol, chloroform, isoamylalcohol thờng đợc dùng để kết tủa protein (vd. Chloroform/isoamylalcohol 24/1). Một số hợp chất chống oxy hóa nh 2 - mercapthoethanol, DTT 10 Một số hợp chất chống oxy hóa nh 2 - mercapthoethanol, DTT (dithiothreito), 8-hydroxyquinoline làm giảm nguy cơ gây biến tính axit nucleic. SDS làm vỡ màng tế bào. EDTA loại các ion kim loại. Các dung môi alcohol (vd. EtOH, MeOH, 2-propanol) đợc dùng để kết tủa axit nucleic. Các muối (vd. acetate) trung hòa điện tích và làm giảm khả năng tan của axit nucleic. T o -20 o C / 0 o C (1/2h 24h). CTAB loại bỏ các hợp chất polysaccharide / polyphenol ở thực vật. Lysozyme đợc dùng để phân giải lớp peptidoglycan ở vi khuẩn. [...]... 1,0 A260nm 50 à / ml dsADN àg 1,0 A260nm 40 à / ml ssADN / ARN àg 1,0 A260nm 33 à / ml dNTP / oligonucleotide àg 12 ĐIệN DI PHÂN TíCH AXIT NUCLEIC Gel polyacrylamid ADN 1 1000 bp Gel agarose ADN / ARN 20 bp 20 kb PFGE ADN 10 kb 10 Mb DGGE ADN/ ARN Sai khác một v i nucleotit Điện cực Gradient biến tính 70% Các giếng tra mẫu Gradient biến tính Thể đột biến 1 dễ biến tính hơn ADN kiểu dại Thể đột biến... u (Onc) T -ADN ADN nhân VK Vùng phân giải nopaline A Vùng tái bản B Ti plasmid Vùng gây độc vir D pTiC58 (Nopaline) C Agrobacterium tumefaciens Vùng tiếp hợp plasmid 31 Véctơ tách dòng Ti plasmid Vùng gây khối u (Onc) LB Cấu trúc T- ADN RB Tms 2 Tms 1 Tmr TGGCGGATATATATGTGGTGTAAAC nos TGACAGGATATATGGCGGGTAAAC Quá trình chuyển T -ADN v o tế b o thực vật Vùng Vir Ti plasmid SSBP Vết nứt 1 T -ADN Vết nứt... axit nucleic ADN và ARN trong nớc B SUNG PHENOL ADN, ARN và protein trong pha nớc L C M NH LY TM Phenol Protein trong phenol DNG PHENOL LO I PROTEIN KH I D CH CHI T ADN V ARN 11 Tách chiết và tinh sạch axit nucleic Một số nguyên tắc cơ bản Tách chiết aRN Để tách chiết mARN, ngời ta thờng dùng cột Oligo dT celluloza, hoặc cột hấp thụ từ tính với biotin-oligo(dT) Định tính v định lợng ADN dựa trên phơng... vật, thực vật, 32 Nội dung Khái niệm chung ADN tái tổ hợp đợc thực hiện nh thế nào? Tách chiết và tinh sạch các axit nucleic Tạo véctơ tái tổ hợp Các loại enzym sử dụng trong ADN tái tổ hợp Nhân dòng gen và xây dựng ngân hàng gen Sàng lọc các dòng gen trong ngân hàng gen 33 Các loại enzym sử dụng trong ADN tái tổ hợp Có thể chia các enzym trong công nghệ ADN tái tổ hợp thành 5 nhóm cơ bản 1 Các enzym... nuclease S1, ) 2 Các enzym nối khung phân tử ADN (nối các đoạn ADN) Ví dụ: E coli ligase, T4 DNA ligase, T4 RNA ligase, 3 Các enzym bổ sung hoặc loại nhóm phosphate ở đầu tận cùng của axit nucleic Ví dụ: T4 polynucleotide kinase, alkaline phosphatase, tobacco acid pyrophosphatase, 34 Các loại enzym sử dụng trong ADN tái tổ hợp 5 nhóm enzym cơ bản trong công nghệ ADN tái tổ hợp 4 Các enzym tổng hợp các... 1 dễ biến tính hơn ADN kiểu dại Thể đột biến 2 khó biến tính hơn DGGE vuông góc 70% Ch iều dịch chuyển của ADN 40% 0% DGGE song song 13 Nội dung Khái niệm chung ADN tái tổ hợp đợc thực hiện nh thế nào? Tách chiết và tinh sạch các axit nucleic Tạo véctơ tái tổ hợp Các loại enzym sử dụng trong ADN tái tổ hợp Nhân dòng gen và xây dựng ngân hàng gen Sàng lọc các dòng gen trong ngân hàng gen 14 Về vectơ... trong phân tử axit nucleic Ví dụ: các enzym ADN polymerase (T4 DNA polymerase, T7 DNA polymerase, Taq DNA polymerase, ), RNA polymerase, Reverse transcriptase, Poly(A) polymerase, Terminal deoxynucleotidyl transferase, polynucleotide phosphorylase, 5 Các enzym tham gia bảo vệ, đóng gói, xoắn v giãn xoắn phân tử ADN Ví dụ: DNA methylase, các protein liên kết ADN (RecA, SSB, DnaB ), topoisomerase I &... chất l phân tử ADN mạch đơn Không l m phân giải tế b o chủ khi giải phóng khỏi tế b o nên tách dòng thuận tiện 22 véctơ plasmid u điểm Cấu trúc đơn giản, kích thớc nhỏ Dễ tinh sạch, dễ phân tích đoạn tái tổ hợp Có thể nhân lên với số lợng lớn, tốc độ nhanh Nhợc điểm Đôi khi, hiệu suất biến nạp v o tế b o chủ thấp Không hiệu quả khi biến nạp ở eukaryote Không tách dòng đợc các phân đoạn ADN kích thớc... quả khi biến nạp ở eukaryote Không tách dòng đợc các phân đoạn ADN kích thớc lớn (> 10 kb) 23 véctơ Phage Phần lớn xuất phát từ phage Kích thớc khoảng 48,5 kb Có thể mang các đoạn ADN c i đến ~20 kb (virut có thể đóng gói ADN đến 40-50 kb) Khả năng xâm nhập tế b o chủ nhanh Có thể tách dòng ở cả prokaryote v eukaryote 24 véctơ phage u điểm Khả năng xâm nhập tế b o chủ nhanh Có thể tách dòng ở cả prokaryote... phù hợp tế b o chủ 4 Nhận biết nhờ các gen chỉ thị hoặc gen đánh dấu 5 Có vị trí gắn phân tử ADN ngoại lai (vị trí đa tách dòng polycloning site / MCS) 16 Các đặc điểm cơ bản của véctơ tách dòng 17 véctơ plasmid Kích thớc 1 200 kb, sợi kép, vòng pBR332 do Bolivar v Rodiguez (1977) thiết kế cho phép mang đoạn ADN c i đến 6 kb pBR332 4363 bp 18 plasmid Nhóm pUC l nhóm véctơ plasmid thuộc thế hệ thứ 3 . di truyÒn häcbé m«n di truyÒn häc bé m«n di truyÒn häc CÔNG NGHỆ CÔNG NGHỆ ADN TÁI TỔ HỢPADN TÁI TỔ HỢP ADN TÁI TỔ HỢPADN TÁI TỔ HỢP Di Di Di Di Di Di Di Di truyÒn truyÒntruyÒn truyÒntruyÒn truyÒntruyÒn truyÒn. niệm chung ADN tái tổ hợp (recombinant DNA) đợc dùng để chỉ các phân tử ADN đợc tạo ra từ hai hay nhiều phân đoạn ADN xuất xứ từ các nguồn gốc khác nhau. Trong thực tế, công nghệ ADN 4 Trong thực tế, công nghệ ADN tái. tâm. 2. Chuẩn bị ADN ngoại lai có các đầu 3, 5 phù hợp. 3. Chọn lọc véctơ (thể truyền) phù hợp. 4. Cải biến đầu 3 và 5của véctơ và phân tử ADN ngoại lai. 8 5. Nối phân tử ADN véctơ và ADN ngoại lai. 6.