GIÁO TRÌNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG SẢN XUẤT - PGS.TS. TRƯƠNG VĂN LUNG - 2 docx

21 CNSH phục vụ nông lâm ngư nghiệp Lung Trương Văn * Điều kiện vô trùng phải nghiêm ngặt, kể từ chuẩn bị mơi trường đến xử lí mơ Vì vậy, phải có buồng cấy vơ trùng tủ cấy Laminaire, thao tác dụng cụ phải tuân theo nguyên tắc vô trùng triệt để * Chọn lựa mơ phải có đủ điều kiện để phát triển mạnh phải có đủ khả để tạo thành callus môi trường chứa chất dinh dưỡng thích hợp Thường người ta chọn mơ phân sinh hay chồi nách * Điều kiện xử lí mơ phải thích hợp Tuy mơ một lượng thông tin di truyền cho callus phát triển hoàn toàn khác khả tái sinh chồi, phát triển rễ hay thành hồn chỉnh Đó xử lí chất điều hịa sinh trưởng (ĐHST) khác nhau, xử lí nhiệt độ ánh sáng khác Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật phương pháp nhân giống lí tưởng khơng địi hỏi diện tích, nhanh, mà cịn giữ ngun tính ưu việt giống ban đầu Nhân giống nhân dịng vơ tính có ý nghĩa đặc biệt nhiệt đới chúng có độ dị hợp cao, thường nhiễm nhiều loại virus Các trồng sau đưa vào nhân giống vơ tính in vitro với mục tiêu thương mại hóa qui mơ lớn: Atiso, măng tây, củ cải đường, tỏi, gừng, khoai tây, Raspberry, dâu tây, mía đường, khoai lang, khoai nước, dứa dại, hạnh nhân, táo tây, chuối, cam, chanh, dừa, anh đào, kiwi, cọ dầu, đu đủ, lê, dứa, chuối bột, nho, hạt dẻ, tre, lim, bạch đàn, vả, cẩm chướng, cúc, Iris, Gerbera, huệ, lan, Pelagonium, đỗ quyên, hoa hồng, …Một số tái sinh phịng thí nghiệm: bơ, ca cao, cà phê, Jojoba, cao su, chà là, thuốc lá, cà rốt, Endive, cải dầu, ngô, đậu, củ từ, đậu nành, (theo tài liệu Zimmerman, 1986; Ketchum, 1987; Picrik, 1987) Ỏ Trung Mĩ Nam Mĩ, kĩ thuật nuôi cấy mô áp dụng nhằm tạo giống bệnh nhân giống vơ tính cọ dầu (Brazil, Colombia, Costa Rica, Cộng hòa Dominique), cam, chanh, khoai tây, dâu tây (Brazil), cà phê (Costa Rica Mexico) Nhiều công ti tư nhân dùng kĩ thuật để tăng sản lượng cọ dầu (Costa Rica, Cộng hòa Dominique), chuối (Honduras), lan (Brazil) cẩm chướng, cúc, dứa cảnh (Colombia, Costa Rica) Năm 1987, Ở khoa Sinh học Đại học Maranhão thành lập phịng thí nghiệm cấy mơ để thực chương trình chọn giống ăn nhiệt đới: dừa hột, gỗ cung cấp lương thực khác Các công ti tư nhân Brazil Biomatris S.A (Rio de Janeo) chi nhánh công ti giống khổng lồ AGROCERES tham gia vào nghiên cứu triển khai việc nhân giống in vitro khoai tây, ăn ôn đới 22 CNSH phục vụ nông lâm ngư nghiệp Lung Trương Văn nhiệt đới, cảnh Cơng ti trải rộng tồn lãnh thổ Brazil sản lượng hàng năm tới 2,4 triệu giống (Biotechnologia Fundacão) Ở Việt Nam, Trung tâm Thực nghiệm Sinh học thành phố Hồ Chí Minh (1979-1980) nhân giống vơ tính in vitro giống khoai tây để phục vụ cho hợp tác xã sản xuất thành phố Đà Lạt Ở Viện Khoa học Việt Nam Hà Nội (nay Viện Khoa học Cơng nghệ Việt Nam) thí nghiệm nhân giống vơ tính in vitro khoai tây, cà, lúa, thuốc từ năm 1974-1975 Cho đến nay, nhân nhiều giống trồng mía, ngơ, dứa sợi, lúa, thuốc lá, …có khả chống chịu để phục vụ cho việc trồng trọt địa bàn miền Bắc Ở Đại học Nông nghiệp I, viện Di truyền Nông nghiệp TW, nhân giống vơ tính kĩ thuật dung hợp protoplast tạo nhiều giống trồng phục vụ cho sản xuất nông nghiệp Việc nhân giống khai thác chịu hạn (serophyte) mang lại nhiều mối lợi cho nước ĐPT vùng khô hạn bán khô hạn Trong số 350.000 loài thực vật nhà thực vật học mô tả, người thử trồng khoảng 3.000 loài làm lương thực, lấy sợi, làm thuốc thu ngun liệu Chỉ có khoảng 100 lồi trồng diện rộng 90% lương thực loài người khoảng 10 lồi cung cấp, khơng có lồi thuộc chịu hạn Vì vậy, cần thiết phải tìm lồi chịu hạn có khả cho sản phẩm dồi vùng khô hạn chiếm 1/3 diện tích đất Các nguồn nước tưới ngày trở thành nhân tố hạn chế phát triển nông nghiệp Vì vậy, tìm chịu hạn có ý nghĩa quan trọng sản xuất Năm 1960, Viện Nghiên cứu ứng dụng, Đại học Ben Gurion Negev, Israel thành lập với mục đích du nhập phát triển thích nghi với điều kiện khơ hạn bán khô hạn Lúc đầu viện thực gọi “nông nghiệp sa mạc” nghĩa du nhập phát triển từ vùng khơ cằn, lồi sử dụng nước mưa (lượng mưa 200 mm), cần bổ sung nước tối thiểu Sau đó, nhà khoa học Israel chuyển sang “làm nông nghiệp sa mạc”, nghĩa làm cho người định cư vùng khơ cằn có thu nhập cao để đủ cho họ có mức sống Người ta đưa vào sử dụng việc tưới nước lợ hay mặn (nước có vùng sa mạc Negev) Viện Rodolph Rhoda Boyko (Viện Nghiên cứu Nông nghiệp Sinh học ứng dụng) Israel tiến hành nhiều chương trình nghiên cứu nhằm áp dụng tiến nơng học CNSH vào vùng sa mạc Negev vùng khơ hạn nói chung (chương trình có tham gia Israel, Mĩ, Ai Cập, Hà Lan, Cộng hòa Liên bang Đức) theo tài liệu Raz, 1987) Người ta trồng chịu hạn nhiều năm có cao 23 CNSH phục vụ nơng lâm ngư nghiệp Lung Trương Văn bụi Atriplex mummularia (Saltbusch) Atriplex canescens Cassia sturtii) cho kết đặc biệt tốt Qua nghiên cứu so sánh 120 lồi chịu hạn Atriplex nummularia, Atriplex barclayama Atriplex lentiformis chịu mặn cho suất cao dùng làm thức ăn gia súc Cây Distchlis spicata (cỏ chịu mặn) sống điều kiện cực khô mặn dùng phủ xanh cải thiện ô nhiễm vùng Texcoco (Mexico) Cây Jojoba (Simmondsia chinensis) loại bụi có thường xuyên thuộc họ Buxaceae (cao đến m) tìm thấy tây bắc Mexico sa mạc Sonora vùng khô cằn bang California Arizona Mĩ (có thể mọc sa mạc có lượng nước mưa 75 mm cho có thấp) Cây Jojoba có dày, thô, chịu nhiệt độ 50oC nhờ rễ ăn sâu 30 m Từ xa xưa, dầu Jojoba dùng bôi tóc xử lí da súc vật (thổ dân Apaches sử dụng) Hạt Jojoba (bằng hạt Lạc) chứa loại sáp lỏng chiếm 30-60% màu vàng, có mùi, thành phần không chứa glyceride mà chứa hỗn hợp rượu ester acid béo mạch dài từ 2022 nguyên tử C Dầu Jojoba thay dầu cá voi dùng bôi trơn trục chuyền thủy lực hộp số xe đua áp suất nhiệt độ cao, dùng công nghiệp da, công nghiệp mĩ phẩm, công nghiệp dược, chất chống bọt lên men vi sinh vật, sáp bóng phủ loại giấy carbon đặc biệt Khơ dầu chứa dầu dư khoảng 30% protein, xơ, tannin chất khác Cây Guayule (Parthenium argentatum) lấy nhựa mủ tự nhiên làm cao su Cây Crambe (Crambe abyssinia) thuộc họ Thập tự Cruciferae chứa lượng lớn acid erucic thay cải dầu Cây bí trâu Cucurbita foetidissima (Buffalo gourd) có hạt giàu dầu protein, rễ chứa nhiều tinh bột Sau 4-5 năm sinh trưởng, thân, lá, rễ nặng 40 kg có 20% tinh bột, chi Grindelia gồm nhiều loài dùng làm nhựa dẻo Cây Ocnothera spp làm thuốc, hạt có nhiều acid γ-linoleic dùng chất bổ sung dinh dưỡng làm mĩ phẩm Những nêu trên, người ta dùng CNSH nuôi cấy mô tế bào để nhân giống trồng qui mơ rộng, vừa chịu hạn, chịu mặn, chịu nóng, chịu nghèo dinh dưỡng mà đạt suất cao dùng nhiều ngành công nghiệp khác nhau, phục vụ cho đời sống Đối với rừng, xuất gỗ giữ vai trò quan trọng nước ĐPT Theo số liệu thống kê Nông nghiệp Pháp: năm 1984-85, mậu dịch gỗ nhiệt đới 35.236 triệu m3 châu Phi: 35%, châu Á: 60%, Trung Nam Mĩ: 5% 24 CNSH phục vụ nông lâm ngư nghiệp Lung Trương Văn Nhân giống vơ tính in vitro rừng lấy gỗ hay làm bột giấy có ý nghĩa kinh tế lớn Chi bạch đàn (Eucalyptus) có nhiều lồi đặc hữu Australia, Timor, Tân Guinê, Philippinnes Bạch đàn du nhập trồng Nam Mĩ, châu Phi, Spain, Portugan, châu Á, Trung Cận Đông Bắc Mĩ Các phương pháp nhân giống vô tính truyền thống giâm cành, chiết cành, ghép bạch đàn không cho hiệu Người ta tạo callus từ phần khác loài bạch đàn tái sinh từ callus từ phận khác bạch đàn chanh Ecalyptus citriodova bạch đàn trắng E alba Từ năm 1970, nuôi cấy thành công mảnh lá, đoạn thân, rễ bạch đàn Các nhà nghiên cứu Mĩ thu nhận ni cấy đoạn thân lồi: E grandis, E gunni, E dalrrympleana, E pauciflora, E ficifolia Từ năm 1973, AFOCEL (Association Franҫaise Forêt-cellulose) khởi nhân vô tính in vitro bạch đàn nhằm mục tiêu sản xuất lớn dịng vơ tính chịu lạnh suất gỗ cao Từ năm 1975, bắt đầu trồng đất tháng trồng 20.000 bao gồm 18 dịng vơ tính Hartney (1982) nhân vơ tính thành công giống E camadulensis, E curtisi, E ficifolia, E grandis, E obtusifolia E rudis, cách nuôi cấy chồi nách từ con.Mchra-Palta (1982) thành công tạo chồi phụ từ mầm đoạn thân bạch đàn E nova angelica E.viminalis điều kiện in vitro Diallo Duhoux (1984) làm việc phịng thí nghiệm Sinh lí thực vật Đại học Dacar, Senegal nuôi cấy mầm tạo thành công chồi E camaldulensis, mơi trường có chứa NAA (naphtalen acetic acid auxin) 6.BA (6-benzylaminopurine loại cytokinine) kĩ thuật cho phép tạo 200 từ tháng 1013 năm, kĩ thuật cắt đoạn Gupta đạt 106 cây/năm Davies (1984) làm việc phịng thí nghiệm Dhoux phát triển kĩ thuật nhân vơ tính Faidherbia (Acacia albida) Cây họ Đậu mọc hầu hết vùng khô hạn châu Phi, đặc biệt Tây Phi Chúng đóng vai trị quan trọng kinh tế đồng cỏ vùng Sudan Sahel Chúng cố định N2 rụng vào mùa mưa Lá dùng làm thức ăn cho đại gia súc vào mùa khô Acacia albida tạo môi trường thuận lợi cho kê, lúa miến, lạc mọc tán chúng vào mùa mưa Hai rừng khác có khả cố định N2: họ Đậu Acacia senegalensis không họ Đậu Casuarina equisetifolia quan tâm nghiên cứu nuôi cấy mô 25 CNSH phục vụ nông lâm ngư nghiệp Lung Trương Văn  Nghiên cứu tạo phôi soma Một hướng khác tổ chức trồng trọt việc tạo phôi soma Theo mô tả Steward cộng sự, chuyển sang mơi trường có nồng độ auxin thấp gây sinh trưởng tế bào phôi Chúng trải qua tất giai đoạn phát triển bào thai hợp tử tạo thành từ tế bào soma sản phẩm hòa hợp giao tử đực Sự nuôi cấy phôi tế bào soma có số tiến bộ: * Phơi phát triển hai hướng đem đến rễ, chồi phát triển thành tồn vẹn từ đầu * Ni cấy phơi tạo hướng lớn đường nuôi cấy mô * Khi lớn lên mơi trường nước phơi tách thành phơi khác bơi tự do, đó, không cần nhiều thiết bị Hàng ngàn phôi phát triển bình ni cấy cổ thắt có tốc độ sinh trưởng nhanh không tốc độ sinh trưởng ni cấy vi sinh vật Ngồi cà rốt, cần tây, khác đậu, chanh, cà phê, chà là, kê nuôi cấy phôi tế bào soma Sự chín phơi tế bào soma cải biến chất ĐHST đặc biệt dùng acid abscicic thay đổi mơi trường Cơng nghệ hồn tồn cho phép nhân lên phơi soma cho số lớn loài thu hoạch quan trọng Một vài trồng tái sinh thành công nuôi cấy phôi soma: cà rốt, cần tây, đậu, cà phê, chanh, cọ dầu, v.v Thí dụ: cọ dầu tạo từ phơi soma thực trực tiếp từ callus sơ cấp môi trường chứa auxin, cytokinine than hoạt tính Các thể phơi hình thành tháng sau đưa phân đoạn nuôi cấy Có thể thu tới 500.000 thể phơi từ mẫu vịng năm Các thể phơi thành thục, tách tạo cây, phôi non dùng để tiếp tục nhân (Noirel, 1984-85) Chúng phân biệt giai đoạn nhân giống in vitro cọ dầu: giai đoạn thứ nhất: từ lúc tạo callus rút ngắn cịn tháng hay tùy tốc độ tạo phôi soma, giai đoạn hai: thường kéo dài tháng phơi tự nhân lên hình thành Việc chuyển vận thể phơi từ Pháp đến Malaysia Indonesia khơng có khó khăn Giữ đông lạnh thể phôi thực phịng thí nghiệm Nghiên cứu Sinh lí quan thực vật Sau thu hoạch CPOVAR viện Nghiên cứu Khoa học Quốc gia Pháp CNRS Phôi bảo quản -196oC thời gian dài Người ta nhận thấy cọ dầu xuất xứ từ phôi đông lạnh sau 15 tháng trồng đồi khơng có biến dị hình thái Vì vậy, Viện Nghiên cứu dầu có dầu Pháp (IRHO) đề xuất kĩ thuật cho khách 26 CNSH phục vụ nông lâm ngư nghiệp Lung Trương Văn hàng hải ngoại Kĩ thuật thích hợp lồi khơng thích hợp với nhiệt độ bảo quản ơn đới (0-5oC) Hơn giảm thiểu hiểm họa tiềm tàng số lần chuyền để nhân giống tăng lên lớn (Biofuture, 1987, số 56) Dầu cọ loại dầu ăn sử dụng nhiều giới, đứng hàng thứ sau dầu đậu tương chiếm 17% tổng sản lượng dầu béo mỡ (3-11 tấn/ha/năm), nên cần có giống cọ dầu để trồng, nước cận xích đạo Về dừa, từ năm 1981 nhà khoa học Pháp thuộc Viện Nghiên cứu Khoa học Sự phát triển (ORSTOM) IRHO bắt đầu thí nghiệm ni cấy mơ dừa nhằm tạo phôi soma Các nuôi cấy mô tạo từ mô phần non dừa tuổi trồng nhà kính thuộc giống PB-121 lai giống lùn vàng Malaysia (Malaysia Yellow Drafs) giống cao Tây Phi chọn lai Côte d’Ivoire Các thể phôi thu sau tháng nuôi cấy Các nghiên cứu tạo hồn chỉnh từ phơi tiến hành từ năm 1984 (Pannetier Noirel, 1984) Theo nhà khoa học Pháp, trình phát sinh phơi soma xuất giai đoạn ngắn từ mô non dừa từ đến tuổi thu với trưởng thành Bằng phương pháp này, dừa cho suất cao (số sản lượng cơm dừa) gấp lần Đối với cà phê, nhà nghiên cứu Pháp GERDAT (Groupement d’Etude et de Recherche d’Agronomie Tropical), Montpellier nuôi cấy mô cà phê từ năm 1978-1979 năm 1981 thành công thu nhận phôi soma trực tiếp từ mô cấy ban đầu mà thông qua giai đoạn tạo callus trung gian (Dublin, 1982) Các phơi vơ tính hình thành từ bó mạch phiến đem nuôi cấy bề mặt môi trường Từ mảnh tạo 1.000 Qua vài ví dụ cụ thể nêu cho thấy rằng, việc nghiên cứu tạo phôi soma biện pháp kĩ thuật có triển vọng CNSH, nhằm nhân nhanh giống trồng nông lâm nghiệp qui mô rộng  Nghiên cứu nhân giống virus Để tiến hành tạo bệnh virus kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào, người ta thường dùng mô phân sinh đỉnh chồi Những mô chứa tế bào sinh trưởng bao lớp vỏ cutin Sự hình thành quan thực vật bắt đầu mô phân sinh đỉnh chồi Các mô phân hóa từ giai đoạn đầu phơi giữ lại suốt q trình sống Mô phân sinh vùng khỏe mạnh cây, người ta thấy rằng, trình sinh tổng hợp DNA virus 27 CNSH phục vụ nông lâm ngư nghiệp Lung Trương Văn thực vật không xẩy vùng – chế chưa rõ, chí bị bệnh virus phần khơng bị nhiễm virus Vì mơ phân sinh có tế bào phơi nên nuôi cấy tạo nên callus Dùng chất ĐHST khác gibbrelline, auxin, cytokinine, v.v để kích thích khối tế bào khơng phân hóa đâm chồi Từ hình thành nên khỏe mạnh khơng bị virus Bằng cách người ta sản xuất dâu tây, khoai tây, đu đủ, khoai mỡ, sắn nhiều cảnh… bệnh virus  Nhân giống sản xuất hạt nhân tạo Ngày người ta dùng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật để sản xuất hạt nhân tạo Tế bào thực vật có đặc trưng khơng trở thành tế bào sinh dưỡng mà cịn trở thành tế bào phơi mầm, cần điều khiển chúng chất ĐHST thích hợp Do vậy, người ta cho vào bình dung dịch dinh dưỡng có chất ĐHST định tế bào trở thành tế bào phơi Các tế bào phơi bình sinh sản nhiều tụ họp lại Các phôi bao bọc chất keo - gồm hỗn hợp chất dinh dưỡng gọi hạt nhân tạo Khi gieo hạt xuống đất mọc thành bình thường Việc sản xuất hạt nhân tạo cần thiết nơng lâm nghiệp Bởi vì, cải tạo giống nhiều tạo giống có suất cao chống chịu giỏi lại hạt hạt để gieo trồng lại Bằng phương pháp nói trên, người ta sản xuất hạt nhân tạo tế bào bình thường với lượng lớn nồi lên men Một loạt vấn đề lí thú hạt nhân tạo là: * Khi cịn bình ni cấy lên men tiện lợi cho người ta xử lí nhiệt mơ để làm hết virus, tạo hạt bệnh * Người ta đưa vào vỏ hạt nhân tạo lồi vi khuẩn cố định N2 trưởng thành, vi khuẩn lấy N từ khơng khí để cung cấp phân đạm cho * Cũng cách tương tự trên, người ta đưa lượng thuốc trừ sâu trừ cỏ dại vào vỏ hạt nhân tạo để bảo vệ khỏi bị sâu cỏ dại phá hoại * Hạt nhân tạo đối tượng dễ dàng để nạp gene lạ vào để tạo giống có đặc tính mong muốn Rất mừng thị trường giới có bán nhiều hạt nhân tạo với tính ưu việt nói trên, có hạt lúa mì, hạt lúa, hạt lương thực sống sống người 2.2 Tạo giống có suất cao thơng qua phương pháp tạo dịng soma ni cấy mơ tế bào 28 CNSH phục vụ nông lâm ngư nghiệp Lung Trương Văn Soma tên gọi tế bào thể (sinh dưỡng), khác với tế bào sinh dục Chúng ta biết rằng, từ tế bào soma tạo nên phận Đó đặc điểm tồn tế bào thực vật Từ callus khơi phục lại phận đó: rễ, thân tạo thành hoàn chỉnh dựa đặc điểm toàn Có điều callus cấy cấy lại nhiều lần thường xẩy biến đổi di truyền Những lớn lên từ tế bào biến đổi cho hạt Những hạt lại mọc thành cho đặc tính quí mà ta mong muốn Như vậy, lúc nguồn ban đầu để nhân lên hệ sau tạo mà ta gọi dòng soma Phương pháp tạo giống kiểu gọi phương pháp tạo dòng soma Cơ sở khoa học việc chọn giống tượng biến dị soma - tức biến đổi di truyền tế bào sinh dục mà tế bào thể (sinh dưỡng) Có ba cách: * Biến đổi NST kiểu đa bội thể (polyploid) cà chua, đậu, cảnh * Biến đổi NST kiểu thêm, bớt vài NST NST tế bào * Biến đổi kiểu đột biến số gene định NST gene ti thể, lạp thể (lục lạp) Có nhiều kiểu biến đổi: Sự biến dị tự nhiên: thường thấp, hàng triệu tế bào Bằng biện pháp chọn lọc cổ điển (sau lai ghép đột biến) khó có sư phối hợp cũ Biến đổi dòng tế bào soma, đặc biệt từ tế bào callus ni cấy tần số xảy nhiều Khoai tây tái sinh từ callus thử nghiệm, có 13 biến dị gene đơn giản phát 230 khoai tây tái sinh Tỉ lệ biến đổi dòng soma 1/18, có nghĩa từ 18 tái sinh có biến dị Tỉ lệ biến dị thật lớn Một số biến dị gene đơn giản xẩy cà chua xác định biến dị nằm cánh tay dài NST 10 đồ gene Vừa qua đạt số kết biến dị soma số trồng kích thích áp dụng phương pháp chọn lọc dòng soma vào việc đổi trồng Bằng phương pháp chọn dòng soma, người ta tạo nên giồng lúa vừa chín sớm vừa có hạt dạng dài nhằm vừa tăng suất thu hoạch lại vừa tạo chất xanh làm thức ăn cho gia súc 29 CNSH phục vụ nơng lâm ngư nghiệp Lung Trương Văn Về mía, phương pháp chọn dòng soma tạo giống mía chống số bệnh virus bệnh fip, nấm lông, bệnh than, bệnh đột mắt Ta biết Mía bát bội (octoploid) thập bội (decaploid) dị hợp tử Điều gây trở ngại cho việc mơ hình hóa lí thuyết phân tích di truyền Heinz, 1977 Hawaii sau nhà khoa học Đài Loan, Pháp, Cuba, Argenetina, thành cơng tái sinh mía từ callus, từ nuôi cấy túi phấn tạo đơn bội có suất cao điều kiện tự nhiên so với bố mẹ, phương pháp chọn lọc dòng soma cho phép phân lập dòng kháng bệnh Bằng phương pháp chọn dòng soma, nhà nghiên cứu thực nghiệm chống bệnh tàn lụi cà chua, chống virus khảm thuốc thuốc Từ biến đổi dòng soma, phát to nhỏ khác nhau, từ áp dụng vào việc chọn lọc ăn bưởi, cam, để thu đặc tính quí Đối với cọ dầu, tái sinh từ callus, không giống mà xuất số đột biến soma (Jones, 1983) Những biến dị soma theo Cocking Đại học Tổng hợp Notlingham, có nguyên nhân di truyền điều kiện nuôi cấy tạo nên (Cocking, 1981) Nói tóm lại, ni cấy mơ tế bào thực vật, người ta thừa nhận có biến đổi di truyền Sự biến đổi có ích thu hoạch người Trong trình nghiên cứu sở di truyền biến đổi tế bào thực vật nuôi cấy, người ta nhận thấy rằng, công nghệ nuôi cấy tế bào in vitro cho lợi khí quan trọng để làm thay đổi giống trồng theo hướng có lợi Đó biến đổi dịng soma giúp ta tạo nhiều giống với đặc tính ưu việt 2.3 Tạo lai có tính ưu việt kĩ thuật protoplast Protoplast tế bào trần Thành tế bào cellulose bị tiêu hủy enzyme cellulase hay drilselase, cịn màng sinh chất bao quanh Protoplast có khả dung hợp (fusion) với để tạo thành thể lai vơ tính tác dụng tác nhân hóa học hay vật lí để làm màng kết dính lại với gây chuyển vận đại phân tử DNA, protein, bào tử từ tế bào sang tế bào Dung hợp trình hợp protoplast lại làm Hiện tượng phổ biến Sự thật người sinh kết dung hợp tinh trùng nỗn trứng, tạo thành hợp tử có dấu hiệu di truyền tế bào hợp lại Chỉ có điều q trình gọi lai hữu tính Các tế bào thực vật có khả dung hợp dạng protoplast Hai protoplast 30 CNSH phục vụ nông lâm ngư nghiệp Lung Trương Văn dung hợp lại sinh hồn chỉnh dấu hiệu di truyền hai tế bào hợp lại Nhưng q trình q trình lai vơ tính (somatic hybridization) Ngày nhờ lai vơ tính mà người ta cải tạo nhanh chóng máy di truyền tế bào nhằm tạo giống có suất cao Sử dụng kĩ thuật protoplast, người ta lai tạo trồng với hoang dại để đề kháng số trạng thái môi trường bất thuận tạo chịu hạn cao, chịu rét giỏi, chống chịu sâu bệnh, phèn, mặn, v.v Kĩ thuật nuôi cấy dung hợp protoplast đến thực tốt mầm mà có mầm lúa, chí lồi rong, tảo Kĩ thuật protoplast tạo giống thực vật gồm giai đoạn sau: a Giai đoạn tách nuôi cấy protoplast Ở giai đoạn người ta tách tế bào để xử lí tạo thành protoplast từ tất thành phần rễ, thân lá, nốt sần rễ, mầm, hạt phấn, callus v.v hay dùng từ mô Giai đoạn gồm bước sau đây: + Xử lí mẫu cho vơ trùng cồn 70o, sau calcium hypochloride, cuối nước cất vô trùng + Cắt mẫu Mẫu cắt nhỏ thành mảnh 0,5×2 cm thành sợi + Xử lí mẫu enzyme Sử dụng enzyme hỗn hợp pectinase, cellulase Onozuka R10 mannitol pH=5,8 thời gian điều kiện ánh sáng nhiệt độ tối ưu + Tách, làm protoplast phương pháp lọc li tâm Các bước chung vậy, song chi tiết lồi địi hỏi loại enzyme để tách protoplast, nồng độ enzyme nồng độ chất gây co nguyên sinh chất khác để có lượng tế bào protoplast cao b Giai đoạn dung hợp protoplast Trong giai đoạn người ta sử dụng hai phương pháp sau để dung hợp: * Phương pháp sử dụng tác nhân hóa học: sử dụng chất polyethylene glycol (PEG) Chất gây nên kết dính protoplast tạo điều kiện để phân tử DNA thành phần khác dễ qua màng * Phương pháp sử dụng tác nhân vật lí: xung điện (electroporation) để tạo lỗ nhỏ màng, tạo điều kiện cho đại phân tử qua Thực chất vấn đề kĩ thuật dung hợp 31 CNSH phục vụ nông lâm ngư nghiệp Lung Trương Văn protoplast việc phân biệt tách thể lai thông qua mắt thường, dùng gene đánh dấu, dùng môi trường chọn lọc, dùng phản ứng màu enzyme, dùng protoplast từ loại mô khác nhau, nhuộm chất phát huỳnh quang Q trình dung hợp thực bước sau: + Hai tế bào protoplast loại định lai cho tiếp xúc theo tỉ lệ định nhỏ giọt dịch hỗn hợp lên đĩa nhựa petri + Nhỏ nhẹ nhàng PEG lên đỉnh giọt dịch chứa protoplast hỗn hợp đó, ủ thời gian nhiệt độ phịng nhắc lại vài lần + Rửa PEG cho vào mơi trường ni cấy có chứa muối ammonium để phục hồi tế bào sau trình tách dung hợp + Độ vài ngày sau, tế bào phân chia, cấy chuyền sang môi trường chọn lọc cấy chuyền vài lần môi trường chứa chất ĐHST thích hợp để tạo callus, tạo chồi, tạo rễ,v.v + Có thể thử phản ứng enzyme mẫu lai cắt nhỏ để nhận có lai tạo hay không Ngày người ta sử dụng kĩ thuật dung hợp protoplast để tạo lai Chẳng hạn, lai khoai tây trồng khoai tây hoang dại Gene hoang dại giúp trồng chống bệnh virus Người ta lai cà chua với khoai tây (họ hàng chúng xa nhau) cho lai mang cà chua củ khoai tây Bằng cách này, người ta tạo lai cà rốt rau mùi, cam chanh, … Đối với cọ dầu, từ protoplast sử dụng kĩ thuật tái tổ hợp gene nâng cao hiệu quả, chọn lọc dịng có dầu có suất cao Hình II.1 Cây Khoai-Cà (Pomato) Đối với mía, dung hợp protoplast có ý nghĩa lớn việc phổ biến giống mía khơng hoa (trốn cờ) bất thụ Các kết nghiên cứu CENA (Centre de Nuclear Energy in Agriculture) CEBTEC (Divisão de Biotechnology de Plantas et Centro de Biotechnologia Agricola) Brazil cho thấy, dung hợp 32 CNSH phục vụ nông lâm ngư nghiệp Lung Trương Văn protoplast mía giúp chuyển gene kháng thuốc trừ sâu có từ dịng mía qua dịng mía khác Dung hợp protoplast chọn giúp dòng cà phê kháng bệnh độc tố nấm tiết để đưa vào môi trường nuôi cấy nhằm chọn dòng tế bào kháng độc tố cho cà phê Năm 1987, Costa Rica tái sinh cà phê vối từ protoplast tách từ phơi vơ tính hình thành từ huyền phù tế bào callus Sau nuôi cấy protoplast vài lần môi trường chứa 0,5 mg/l kinetine, 0,5 mg/l 2,4D 0,5 mg/l NAA, tác giả thu callus nhỏ Khi cấy chuyền sang mơi trường khơng có chất sinh trưởng callus phát triển thành phôi phát triển thành hoàn chỉnh Người ta dung hợp protoplast cao su từ tế bào phơi vơ tính Đến có 70 lồi sinh từ protoplast Khi dung hợp protoplast, người ta tạo giống lai tế bào thực vật vi khuẩn Sự dung hợp protoplast tế bào tảo lam (vừa có đặc tính quang hợp vừa có đặc tính cố định N2 khơng khí) với callus thực vật làm kích thích phát triển chúng Cũng với kĩ thuật trên, người ta cịn dung hợp tế bào soma với tế bào sinh dục (hạt phấn) để tạo lai họ với Tóm lại, kĩ thuật dung hợp protoplast mở khả rộng lớn việc tạo ta giống tập hợp nhiều đặc tính tốt từ khác Hơn nữa, nhờ việc tạo thành protoplast (bóc trần vỏ tế bào), trở thành cơng cụ nghiên cứu q trình sinh hóa, đặc biệt acid nucleic protein tế bào, dùng mơ hình nghiên cứu di truyền phân tử, nghiên cứu xâm nhập vi khuẩn vào tế bào, nghiên cứu trình cộng sinh vi khuẩn Đậu, nghiên cứu enzyme, nghiên cứu chế trình quang hợp v.v làm sở khoa học cho việc nghiên cứu ứng dụng phục vụ cho đời sống người 2.4 Tạo đặc tính mong muốn qua việc đưa nguyên liệu di truyền vào tế bào trồng kĩ thuật tái tổ hợp DNA (DNA recombination) Việc cải tiến đưa gene vào tế bào thực vật qua cách đưa nguyên liệu di truyền ngoại lai vào đường tái tổ hợp DNA mở nhiều triển vọng tốt đẹp: Cách thứ nhất: chuyển gene trực tiếp Phương pháp hóa học polyethylene glycol Phương pháp vật lí xung điện dung hợp protoplast Phương pháp ngâm hạt phấn vào dung dich DNA 33 CNSH phục vụ nông lâm ngư nghiệp Lung Trương Văn Phương pháp vi tiêm gene Phương pháp bắn gene Cách thứ hai: chuyển gene gián tiếp qua sử dụng vector, đặc biệt vector plasmid pBI12A chứa sẵn gene khởi đầu promoter mạnh gene CaMV35S (Cauliflower mosaic virus) gene kết thúc gene đánh dấu GUS-A Plasmid gắn thêm gene lạ có đặc tính mong muốn đưa vào vi khuẩn hay thực vật dùng Agrobacterium tumefaciene để đưa vào Người ta đưa gene ngoại lai vào qua đường vector plasmid: DNA đánh dấu phóng xạ đưa vào hạt phấn, chồi non, tế bào nuôi cấy protoplast hay nhân tế bào tách DNA ngoại lai dễ nhận cảm với tiêu hóa enzyme nuclease vật chủ Phải đưa DNA vào lyposome, sau dung hợp vào protoplast để làm giảm tác dụng công nuclease tế bào chủ Dần dà người ta nghiên cứu đưa DNA ngoại lai vào qua đường vector plasmid DNA plasmid tìm thấy ti thể động vật bậc cao Những plasmid hệ thống chuyển gene Chúng chép cách tự quản ti thể Plasmid tìm thấy nhiều vi khuẩn Những plasmid thường liên kết với vi khuẩn bệnh lí dùng để kiểm tra sinh bệnh tác nhân gây bệnh trồng Vai trò plasmid Ti Agrobacterium tumefaciens hình thành khối u ngày sử dụng phổ biến để chuyển gene thực vật Agrbacterium gồm loài A tumefaciens A rhizogenes A tumefaciens vi khuẩn đất gram âm, hình que Vi khuẩn có họ Rhizobiaceae có khả gây u thực vật Nó plasmid dài vào khoảng 120-150 kb, có tính chất gây u nên gọi plasmid Ti Ti bắt nguồn từ chữ đầu tumer inducing Cịn A rhizogenes plasmid có khả gây bệnh rễ tóc (hairy root) gọi plasmid Ri Ri bắt nguồn từ chữ đầu root inducing tức sinh rễ Kích thước plasmid tương tự plasmid Ti Đối với trồng, người ta tạo giống có đặc tính mong muốn qua việc chuyển gene Các gene từ khơng có quan hệ họ hàng từ động vật, Côn trùng, nấm men, từ vi sinh vật Các nhận gene nhiều cách khác gần nhờ hệ thống vi khuẩn Agrobacterium có đặc tính sẵn có tự nhiên chuyển gene chúng vào cối thông qua phần T-DNA plasmid Ti Ri Chính T-DNA vi khuẩn 34 CNSH phục vụ nông lâm ngư nghiệp Lung Trương Văn gắn vào gene thực vật làm xuất khối u rễ tóc chúng chứa oncogene Hình II.2 Mơ hình plasmid Ti T-DNA có kích thước 25 kb chứa gene mã hóa cho sinh tổng hợp auxin, cytokinine, opine gene gây khối u (oncogene) Trong plasmid Ti, vị trí T-DNA giới hạn bờ phải bờ trái Ngồi plasmid Ti cịn có vùng DNA mã hóa cho việc tái sinh plasmid, cho khả lây nhiễm (vùng vir) chuyển nạp, cho việc tiêu hóa opine Trong vùng DNA plasmid Ti, T-DNA nghiên cứu nhiều vùng DNA phụ trách khả lây nhiễm gọi vùng vir Sản phẩm hoạt động gene nằm vùng vir tác động kích thích hợp chất phenol tiết từ vết thương loại protein đặc biệt vir E2, vir B, vir D, vir D2, vir C1…Các protein nhận biết vết thương chủ thích hợp (hầu hết mầm), kích thích sinh sản đoạn T-DNA bao bọc che chở đoạn DNA giúp chúng tiếp cận với hệ gene chủ cách an toàn Khi nhiễm bệnh T-DNA nạp vào hệ gene chủ bắt đầu hoạt động sản sinh auxin, cytokinine opine, toàn sinh trưởng bị rối loạn, tế bào phân chia vô tổ chức tạo khối u Opine vi khuẩn sử dụng loại “thức ăn” nhờ gene chuyển hóa opine plasmid Ti Cơ chế lây nhiễm A rhizigenes mầm tương tự vùng T-DNA A rhizogenes có gene sản sinh auxin, thay đổi hình thái thực vật chúng tạo nhiều rễ tóc bị nhiễm bệnh 35 CNSH phục vụ nông lâm ngư nghiệp Lung Trương Văn Trên thực tế bệnh cây, Agrobacterium gây hại mầm Vì vậy, người ta cho chúng nạp T-DNA vào hệ gene mầm Gần nhiều tác giả chứng minh nhiễm vi khuẩn, mầm sản xuất opine khai thác khả biến nạp gene Agrobacterium mầm Nhưng phần T-DNA bị cắt plasmid Ti giữ nguyên khả chuyển gene lạ vào thực vật Do đó, plasmid Ti trở thành công cụ sắc bén theo đặc tính gây u vào trồng Việc chuyển gene lạ tiến hành theo bước sau: * Tách plasmid Ti từ vi khuẩn A tumefaciens * Cắt bỏ phần T-DNA plasmid * Chuẩn bị gene lạ chứa di truyền mong muốn, chẳng hạn gene độc tố Bacillus thuringiensis để tiêu diệt sâu bọ hại trồng * Chuẩn bị gene đánh dấu để theo dõi việc chuyển gene lạ vào thực vật có thành cơng hay khơng? Chẳng hạn, gene mã hóa cho enzyme có phản ứng màu mà thực vật có gene mã hóa enzyme βglucuronidase gọi tắt GUS-A tạo màu xanh da trời đặc trưng với chất 5-bromo-4-chloro-3-indolyl, β-galactopyranoside kí hiệu Xgluc Đôi người ta sử dụng khả đánh dấu gene mã hóa luciferase - enzyme Đom đóm phát sáng tối mơ chuyển gene Cũng có sử dụng gene kháng kháng sinh kanamycine - chất ức chế sinh trưởng thực vật * Gắn gene lạ gene đánh dấu vào plasmid Ti thay vào chỗ TDNA bị cắt bỏ đưa vào vi khuẩn Agrobacterium *Chuẩn bị tế bào vật chủ tiếp nhận vi khuẩn Agrobacterium chứa plasmid có gene lạ chuẩn bị protoplast từ thể mô, đĩa * Nuôi cấy chung vật chủ với vi khuẩn A tumefaciens chứa plasmid Ti gắn gene lạ thời gian vài ngày nhiệt độ ánh sáng thích hợp * Loại bỏ vi khuẩn dùng kháng sinh đặc hiệu carbenicilline * Chuyển nguyên liệu thực vật vào môi trường dinh dưỡng nuôi cấy tế bào mơ để tái sinh có thêm chất kích thích sinh trưởng 2,4 D, auxin khác v.v * Cây tái sinh nuôi vườn ươm cuối trồng đất * Theo dõi đặc tính gene lạ biểu trồng Cần ý: - Cây biến đổi di truyền cần phải trồng vài vụ; 36 CNSH phục vụ nông lâm ngư nghiệp Lung Trương Văn - Cây chủ vi khuẩn Agrobacterium làm hạn chế biến đổi nhiều vụ thu hoạch - Muốn chuyển gene thành cơng cần phải phân tích mở rộng gene thực vật, biết rõ tổ chức phân tử gene đưa vào mối quan hệ với tổ chức cấu trúc di truyền điều hòa di truyền Đối với chuyển gene thực vật, virus thực vật chứa DNA coi vector Loại virus khảm thực vật hoa súp lơ (Cauliflower mosaic virus: CaMV) ví dụ hấp dẫn Đó vector dùng để chuyển gene, DNA ngoại lai chuyển vào thực vật qua gây nhiễm virus Thêm vào CaMV nhân lên bào tương loại trừ khả gây trở ngại cho chức phận tế bào chủ S.H Howell cộng năm 1987, gài phân tử linker EcoRI gồm đôi base vào vùng “intergeneic” virus khảm hoa súp lơ mà không làm suy yếu lây nhiễm chúng Khả CaMV vector chuyển gene chứng minh Cronenbor cộng đưa vào củ cải đoạn operator operon lac E coli DNA virus tách từ bị nhiễm thấy chứa đoạn operator lac CaMV có số hạn chế: gây nhiễm cho họ cải bắp cải, xải xoăn, cải Bauxel Thứ lượng định DNA ngoại lai gài vào (khoảng 250 đôi base) Việc dùng hệ vi khuẩn Agrobacterium hàng trăm sở công nghiệp phịng thí nghiệm giới sử dụng Chỉ Monsanto có 45.000 dịng thực vật chuyển gene tự sản xuất theo kiểu Tuy vậy, lúa, ngơ, lúa mì phải chủ tự nhiên Agrobacterium Do đó, phải đưa DNA ngoại lai vào protoplast thực vật Song, khả lai tạo thấp mặt khác lại không nguyên vẹn, phải phá vỏ tế bào để lai ghép Do đó, người ta có biện pháp đơn giản tiêm DNA ngoại lai trực tiếp vào tế bào Song vấp phải điều tiêm trực tiếp khó có hiệu cao do: kim nhỏ dễ gãy tắc; công việc buồn tẻ, tỉ lệ DNA ngoại lai tổ hợp vào gene tế bào chủ thấp Tiêm khoảng 10.000 tế bào hi vọng tế bào có gene để nâng cao hiệu tổ hợp gene Joh Sanford trường Đại học Tổng hợp Cornell đề nghị dùng biện pháp bắn phá liên tục nguyên liệu gene vào tế bào thực vật Tác giả dùng viên đạn kim loại có đường kính 1-2 µ có phủ DNA ngoại lai Làm tăng nhanh dần tốc độ viên đạn kim loại xuyên vào thành tế bào nguyên vẹn phân tán DNA bào tương Năm 1987, họ cải tiến viên đạn bạch kim để bắn vào tế bào thực vật sau họ dùng đạn vàng đẩy bốc giọt nước 37 CNSH phục vụ nông lâm ngư nghiệp Lung Trương Văn Việc bắn DNA vào tế bào giai đoạn đầu việc làm thay đổi trồng trước phải kết cấu cho vùng quan trọng gene Đó là: * Vùng promotor – vùng phát động biểu gene * Vùng mã hóa - tạo protein mong muốn để thu hoạch tốt mùa màng * Vùng poly A (polyadenine hóa) – vùng tham gia mở đầu chép RNA thơng tin Cơng nghệ gene có khả tạo thức ăn Các gene protein có phẩm chất dinh dưỡng siêu đẳng tách ra, sau đó, gài gene vào Cây sản xuất chất hóa học đặc biệt tinh bột, dầu cơng nghiệp, enzyme, dược chất Hơn 400 phép thử đồng ruộng trồng cơng nghệ hóa Mĩ, châu Âu Những thử nghiệm xác nhận hiệu kinh tế trồng có dấu hiệu tốt triển khai đồng ruộng từ năm 1990 Tuy nhiên, cơng nghệ gene có số hạn chế như: cải tiến số điểm biểu không 3-5 gene Một vài trồng khơng thích ứng phương pháp chuyển gene hành Sự tách gene có ích để chuyển có gặp khó khăn định Việc sử dụng gene việc tạo giống cây, hoa, quả,…, G Glili dùng vi khuẩn E coli để chiết xuất lấy gene mã hóa loại enzyme tổng hợp lysine, sau đưa vào khoai tây thuốc làm cho khoai tây lượng lysine tăng củ lần, lần thân lần Người ta đưa acid amin khác vào khoai tây làm cho chất lượng chúng trở nên quí giá Ở Mĩ vừa thành cơng cà chua chín mọng mọc cành nho Cà chua loại thối hỏng Người ta tạo bơng có màu sắc tự nhiên CNSH Ở Pháp đây, người ta tạo bắp cải to cao người thao tác di truyền Trong 20-30 năm lại đây, CNSH làm đổi nơng nghiệp tồn giới nhờ kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào, phương pháp chọn lọc dòng soma, kĩ thuật dung hợp protoplast đặc biệt sử dụng công nghệ gene tái tổ hợp DNA, người ta đưa vào trồng nguyên liệu di truyền mới, gene có ích để làm thay đổi loài trồng, tạo loạt giống có suất cao, phẩm chất tốt, chống chịu giỏi điều kiện bất lợi môi trường khu vực, có hứa hẹn mùa màng tốt đẹp không ngừng phát triển tương lai không xa 38 CNSH phục vụ nông lâm ngư nghiệp Lung Trương Văn Ở nước ta, Đảng Nhà nước quan tâm đến vấn đề khoa học công nghệ, đặc biệt ưu tiên CNSH (nằm ưu tiên chung: tin học, CNSH, vật liệu đại hóa cơng nghiệp) Với khoảng 20 triệu lao động nơng nghiệp, có nhiệm vụ sản xuất 20-25 triệu lương thực hàng năm, Việt Nam đứng hàng thứ 2, thứ xuất gạo giới, muốn làm cho nông nghiệp không ngừng tăng lên, việc tạo giống trồng đặt cho nhà khoa học nhiệm vụ nặng nề vinh quang Dưới xin giới thiệu phương pháp tạo giống tham khảo: Hình II.3 Bằng phương pháp trực tiếp (dùng súng bắn gene) phương pháp gián tiếp (Agrobacterium) để chuyển gene vào tế bào thực vật CNSH việc bảo vệ trồng Hàng ngàn năm nay, người nông dân luôn thay đổi trồng, thay đổi lối canh tác để có tiến thu hoạch Họ tuyển chọn 39 CNSH phục vụ nông lâm ngư nghiệp Lung Trương Văn giống trồng ngày có suất cao phẩm chất tốt Phẩm chất tốt ăn ngon lành cho muôn vàn vi sinh vật, sâu bọ Theo thống kê, sâu bọ gây thiệt hại lớn cho mùa màng khoảng 2040% Năng suất mùa màng cao thiệt hại lớn Người nông dân từ xưa đến nay, qua kinh nghiệm thực tế có nhiều biện pháp phịng trừ xới xáo, chăm sóc bắt sâu bọ, thay đổi vụ trồng hợp lí, trồng thảm xen kẽ, phun thuốc trừ sâu v.v Riêng nước Mĩ, năm 2,5 tỉ USD thuốc trừ sâu để bảo vệ mùa màng Nhưng việc sử dụng thuốc trừ sâu bệnh, thuốc trừ cỏ dại (herbicide), ví dụ, thuốc trừ nấm phun trừ sâu vùng trồng chuối (sweet banana) nơi sản xuất khoảng 10% sản lượng chuối để đưa vào thị trường quốc tế, 90% sản lượng chuối lại chuối bột (platain), nguồn lương thực nhiều nước nhiệt đới chủ yếu trồng qui mơ gia đình rải rác Vì khó sử dụng thuốc trừ nấm giá thành không kinh tế Hơn thuốc trừ sâu bệnh để lại hậu khôn lường, người bị ngộ độc, chí ung thư, động vật chết Vì vậy, cơng tác bảo vệ trồng theo hướng CNSH tốt Người ta nuôi cấy đỉnh sinh trưởng khoai tây, dâu tây, khoai mỡ (Yam) gọi khoai Ấn Độ, để làm virus Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng giúp tạo giống sắn bệnh Kĩ thuật ni cấy mơ in vitro giúp giải phóng sừa khỏi bệnh virus Mycoplasma nghiêm trọng dừa, chà (Date palm), kháng bệnh nhiễm bệnh nấm hoa từ nhân vô tính, đặc biệt chống chịu bệnh bayoud nấm (Fusarium oxyporum f-sp-albidinis) gây bệnh gây tổn thất nghiêm trọng cho chà Viện IRAT (Institute de Recherches Agronomiques Tropicales et des Cultures vivrieres: Viện Nghiên cứu Nông nghiệp nhiệt đới Các lương thực) Pháp xây dựng phương pháp cấy tác nhân gây bệnh vào tái sinh từ callus, Việc sàng lọc tế bào cho phép phân lập dòng kháng bệnh, kháng loại bệnh quan trọng: sinut, ieafscala bệnh rỉ sắt Tương tự vậy, người ta tách dòng tế bào kháng mặn, kháng phèn độc tố nấm (Helminthosporium sacchari) Các kết nghiên cứu CENA (Centre de Nuclear Energy in Agriculture) CEBTEC (Divisão de Biotechnology de Plantas et Centro de Biotechnologia Agricola) Brazil cho thấy dung hợp protoplast Mía giúp chuyển gene kháng thuốc trừ sâu có từ dịng mía qua dịng mía khác Từ năm 1985, phòng Hiển vi Điện tử CENA bắt đầu chương trình nghiên cứu cấy chuyền gene kháng bệnh khuẩn virus vào tế bào trồng, sau tách protoplast dung hợp chúng điện trường 40 CNSH phục vụ nông lâm ngư nghiệp Lung Trương Văn Ở Mexico, tác giả Merino Madrigal trường Đại học Chapingo cộng tác với nhà nghiên cứu Đại học Purduc (Mĩ) thử tách dòng biến dị kháng nòi rỉ sắt gây hại châu Mĩ Latinh đối tượng cà phê Dung hợp protoplast giúp cho cà phê kháng bệnh người ta dùng độc tố nấm tiết để dưa vào môi trường nuôi cấy nhằm chọn dòng tế bào kháng độc tố Ngày công nghệ gene dùng để tạo giống chống bệnh virus, đề kháng trùng có hại, tạo giống chống cỏ dại, chống hư hại mùa vụ trồng Roger Beachy trường Đại học Tổng hợp Washington Stephen Roger Monsanto áp dụng công nghệ gene cấu trúc nên vector gene để dưa vào thuốc cà chua protein phủ mặt virus khảm thuốc (tobacco mosaic virus: TMV) Những đối kháng mạnh mẽ với nhiễm trùng xác định giả thuyết ban đầu Beachy - thành phần đơn giản virus sử dụng để bảo vệ công virus Ngày nay, biểu protein phủ mặt ngồi virus sử dụng để chống virus thực vật trở thành chế chung để bảo vệ trồng khỏi bệnh virus Trong vịng 30 năm qua, người nơng dân nhà làm vườn tin tưởng vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt) chúng sản xuất protein chống Côn trùng Vi khuẩn làm chết hàng loạt sâu tơ, Sâu róm vùng Thuringi Các chế phẩm Bt đặc hiệu cao với côn trùng thuộc loài bướm Cơ chế hoạt động phân tử Bt sau: protein Bt liên kết với proceptor đặc hiệu khu trú màng ruột côn trùng gây hại Sự liên kết gây cản trở cho dịng vận chuyển ion vào tế bào biểu mơ ruột làm khả ăn uống dinh dưỡng côn trùng Những thuốc trừ sâu thiên nhiên không gây độc hại cho người động vật, chí lồi trùng khác Mặt khác, tính chất có ích thuốc trừ sâu Bt thường bị hạn chế dễ dàng bị rửa khỏi cây, hiệu chúng đồng ruộng thường kéo dài Giữa năm 1980, công nghệ gene vài hãng lớn hãng Hệ thống gene thực vật Belgium, hãng Di truyền Nông nghiệp Middleton v.v thành công việc tách rời gene vi khuẩn mã hóa protein thuốc trừ sâu Họ dùng súng có Agrobacterium tumefaciens gắn gene tách nói để bắn vào khoai tây, chua Lúc đầu gene biểu nghèo nàn Những protein Bt trồng sản xuất giết trùng phịng thí nghiệm nhạy cảm 41 CNSH phục vụ nơng lâm ngư nghiệp Lung Trương Văn Các nhà khoa học Monsanto David Fichhoff Frédrick Perlak cải tiến Họ xem xét kĩ lại gene vi khuẩn nguyên thủy để bắt chước chặt chẽ đoạn DNA thực vật Một cải tiến nhỏ làm tăng lên kiểm tra côn trùng cách mạnh mẽ Hai năm thử nghiệm đồng ruộng xác định có mặt gene Bt bơng kiểm tra cách có hiệu tất hư hại đại phận loài bướm sâu bao gồm màng trứng chúng Những bơng thực cơng nghệ gene làm giảm hẳn việc sử dụng thuốc trừ sâu từ 40 đến 60% Các nhà khoa học sàng lọc cách mở rộng dòng Bacillus thuringiensis tự nhiên Những dịng có hiệu trùng khác lồi bướm Họ chọn dịng có gene có hiệu chống lại loài gián cánh cứng phá hoại khoai tây: Colorado Mùa xuân năm 1991, Russet Burbank ghép gene kiểm tra loài cánh cứng khoai tây thử vài nơi Maine Oregon Khoai tây miễn dịch loài cánh cứng Các nhà khoa học tổ hợp Mycogene San Diego phát gene Bt chồng Giun trịn kí sinh thực vật gene chống Muỗi Hiện cố gắng sản xuất protein trừ Muỗi (mosquitocidal protein) Tảo để sử dụng vào biện pháp chống sốt rét Tính đặc hiệu protein Bt khu trú mơ nói protein chống lại bọn Côn trùng công Protein khu trú nội bào chắn không bị rửa thuộc loại thuốc trừ sâu an toàn Bên cạnh việc đề kháng virus, Côn trùng gây hại trồng cịn phải chống đối lồi cỏ dại Cỏ dại làm giảm sản lượng mùa màng có tới 70% Trước người ta phối hợp thuốc diệt cỏ với việc làm cỏ để hạn chế cỏ dại Vì thuốc diệt cỏ có phổ hạn chế hoạt động, gây ảnh hưởng nhỏ cỏ dại Cơng nghệ gene dùng để kiểm tra cách hữu hiệu cỏ dại Vấn đề chỗ tạo cho trồng sản xuất thuốc trừ cỏ dại với phổ rộng, đơn giản an tồn cho mơi trường Nếu sử dụng cơng nghệ vào cho trồng làm cho nông nghiệp giảm lượng lớn thuốc trừ cỏ dại Có hướng công nghệ để tạo thuốc trừ cỏ dại: * Các nhà nghiên cứu Monsanto, Calgene, California dùng thuốc trừ cỏ dại tên Roundup Roundup thành phần phổ rộng trừ cỏ dại to mọc dày Roundup ức chế hoạt động enzyme tổng hợp EPSP – enzyme tham gia vào việc tạo acid amin thơm cần cho sinh trưởng 42 CNSH phục vụ nông lâm ngư nghiệp Lung Trương Văn cỏ dại Roundup không làm ảnh hưởng tới động vật (động vật không tiến hành tạo acid amin thơm) Hơn nữa, Roundup lại thóai hóa nhanh chóng mơi trường để trở thành vô hại Năm 1983, Luca Comai David Stalker Calgene, Roger Ganesh Kishore Monsanto tách gene enzyme tổng hợp EPSP từ vi khuẩn trồng Sau nhà khoa học tạo gene sản xuất lượng protein lớn lên trồng đưa vào cà chua, đậu, bông, cải dầu, số khác, trồng trừ cỏ dại cách có hiệu * Các nhà nghiên cứu Du Pont dùng kĩ thuật nghiên cứu tương tự để tiến hành cơng nghệ gene hóa trồng khơng dùng thuốc diệt cỏ sulffonylurea * Các nhà khoa học Hệ thống di truyền thực vật hãng Hoechst - Đức có hướng tìm kiếm khác để loại trừ thuốc diệt cỏ Từ vi khuẩn Streptomyces hygroscopicus tách gene để enzyme ức chế chất diệt cỏ gọi Basta Basta ảnh hưởng tới việc tổng hơp glutamine enzyme cỏ dại làm cho cỏ dại không lớn lên Nhưng trước gây hại, xảy trồng có gene làm ức chế Basta Trong bảo vệ bị hư hại, cơng nghệ gene phát huy tác dụng Người ta xác định tách số gene đóng vai trò sinh tổng hợp ethylene - phân tử liên quan đến chín hoa Sự chín kéo chậm lại để kịp thu hoạch tạo mùi tốt làm phẩm chất tăng lên Có phương pháp di truyền để tăng nguồn thu hoạch Một gài đoạn dịch mã antisen gene chín để liên kết với RNA thông tin làm tắt gene Athanosios theologis California Don Grierson trường Đại học Tổng hợp Nottingham chứng minh rằng, Cà chua có gene antisen chống làm mềm Thứ hai đưa gene vào để tạo enzyme làm thóai hóa thành phần tiền chất hình thành ethylene, làm chậm chín hư hỏng (cơng trình Kishora Harry Klee Monsanto) Gần nhà khoa học Mĩ cấy vào gene vi khuẩn sản sinh chất chitinase tiêu diệt tế bào nấm (cấy vào cà chua, khoai tây, rau diếp giống tương tự chưa làm lúa, lúa mì, ngơ có hạt khác) Ngồi CNSH ra, người ta dùng số biện pháp sinh học để thay thuốc trừ sâu hóa học như; ni ong mắt đỏ để diệt Sâu đay, dùng hạt sầu đâu để diệt gần 2000 loài sâu hại (trong sầu đâu có azadirachitine có tác dụng diệt trùng mạnh) Ấn Độ xây dựng nhà 43 CNSH phục vụ nông lâm ngư nghiệp Lung Trương Văn máy công suất 20 hạt sầu đâu/ngày Ở Pháp, người ta dùng bọ rùa để diệt rệp Một ngày ăn khoảng 100 rệp hại ăn quả, nên người ta gọi “con bọ rùa dọn vườn” Ở Mĩ, người ta ước tính cỏ dại Leafy Spurge năm tới mọc dày triệu đất trồng Bắc Mĩ, Canada, làm tổn thất 100 triệu USD Người ta dùng bọ cánh cứng để tiêu diệt cỏ dại Ở Đức, hàng ngàn rừng Sồi bị loại nhện tàn phá mùa đâm chồi Người ta phun Bacillus thuringiensis lên Khi côn trùng ăn vào với chồi non, non làm cho chúng khơng muốn ăn sau chúng bị thủng bụng, lăn chết Ở Mĩ, người ta dùng loài virus polyeder để “săn đuổi giết chết” lồi sâu trùng độc hại, loại nhện độc Ở Việt Nam ta thử nghiệm ni sâu xanh cho trộn thức ăn có virus Sau 6-8 ngày virus thành 10.000 virus khác, tức chiếm khoảng 30% trọng lượng khô sâu Khi sâu chết, gắp riêng ra, nghiền nát lấy nước dịch Dịch lại đem phun diệt sâu xanh phái hại trồng Nấm Boveroa dùng trừ sâu róm thơng Nấm Metthirum nghiên cứu trừ rầy nâu hại lúa Virus NPV - virus đa nhân (nuclear polyhedrosis virus) GV (graluclar virus) sử dụng vào việc diệt sâu Hiện người ta dùng pheronom - chất tỏa mùi hương để dẫn dụ côn trùng tập trung vào chỗ mà tiêu diệt CNSH việc sản xuất phân bón Nitrogen nguyên tố sống, nitrogene chiếm khoảng 16% protein Nitrogen lại thành phần quan trọng acid nucleic mà protein acid nucleic thành phần quan trọng sống Ta biết rằng, không khí có 80-150 N2/ha tức gấp vạn lần so với nitrogene đất Nhưng N2 dạng phân tử bền “dạng khí trơ” khơng lấy trực tiếp Vì vậy, người phải tạo nhà máy khổng lồ tốn để biến N2 thành dạng phân đạm urea, đạm nitrate, nitrite bón cho Số lượng đạm nhà máy khơng đủ cho nhu cầu dinh dưỡng (chỉ cung cấp 2-3% lượng đạm cho cây) Trong đất có số vi sinh vật đất có khả cố định N2 khơng khí, vi khuẩn cộng sinh với Đậu, tảo lam sống tự cộng sinh với bèo dâu sản xuất phân bón cho trồng  ... dưỡng (chỉ cung cấp 2- 3 % lượng đạm cho cây) Trong đất có số vi sinh vật đất có khả cố định N2 khơng khí, vi khuẩn cộng sinh với Đậu, tảo lam sống tự cộng sinh với bèo dâu sản xuất phân bón cho... Sinh học thành phố Hồ Chí Minh (197 9-1 980) nhân giống vơ tính in vitro giống khoai tây để phục vụ cho hợp tác xã sản xuất thành phố Đà Lạt Ở Viện Khoa học Việt Nam Hà Nội (nay Viện Khoa học Công. .. người 2. 2 Tạo giống có suất cao thơng qua phương pháp tạo dịng soma ni cấy mô tế bào 28 CNSH phục vụ nông lâm ngư nghiệp Lung Trương Văn Soma tên gọi tế bào thể (sinh dưỡng), khác với tế bào sinh