Giáo trình CƠ SƠ VÀ PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ - Chương 6 doc

Chương 6 KĨ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG PHÂN TÍCH HỆ GENE Ở SINH VẬT Tóm tắt: Sinh học phân tử là nòng cốt của công nghệ sinh học. Phân tích sinh học phân tử được bắt đầu từ việc thu nhận dịch chiết ADN từ tế bào sống đủ sạch để thực hiện các phân tích tiếp theo. Tuỳ theo vật liệu nghiên cứu mà có phương pháp tách chiết ADN phù hợp. Dung dịch ADN sau khi kiểm tra hàm lượng và độ sạch được sử dụng để phân tích theo những mục đích khác nhau như Southem blot, Northem blot, xác định trình tự ADN, PCR, RFLP, AFLP, Nội dung của chương gồm 5 vấn đề cơ bản: (1). Phương pháp tách chiết ADN, (2). Lai phân tử, (3). Xác điịh trình tự nucleotit, (4). Kĩ thuật RFLP, (5). Trình tự nucteotit lặp lại. Thành tựu của sinh học hiện đại và những hiểu biết về di truyền học phân tử làm cơ sở cho việc nghiên cứu, xây dựng các kĩ thuật sinh học hiện đại. Những kĩ thuật sinh học phân tử ứng dụng trong phân tích genome của sinh vật đã được công bố trong các tạp chí khoa học và các sách chuyên khảo. §1. PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT ADN Mọi nghiên cứu và ứng dụng sinh học phân tử đều bắt đầu bằng việc thu nhận một lượng axit nucleic, đủ tinh sạch để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. Điều quan tâm hàng đầu là các kĩ thuật tách chiết axit nucleic là thu nhận các phân tử ở trạng thái nguyên vẹn không bị phân huỷ bởi các tác nhân cơ học hoặc hoá học. Có thể lấy ví dụ các bước tách ADN từ mầm hạt đậu dưới dây: 79 Hình 6.1. Sơ đồ quy trình tách chiết ADN từ mầm hạt đậu tương và đậu xanh Từ ví dụ cụ thể ở trên ta thấy quy trình tách chiết ADN gồm ba bước cơ bản sau: Bước 1: Phá màng tế bào và màng nhân (tế bào Eukaryot). Thông thường người ta nghiền tế bào, mô trong hỗn hợp chất tẩy (SDS, sarcosyl) và proteinase K. Hỗn hợp này phá vỡ màng tế bào và màng nhân, giải phóng ADN ra môi trường đồng thời phân huỷ các protein. Bước 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn, chủ yếu là protein bằng li tâm. Bước 3: Tủa axit nucleic trong ethanol hoặc trong isopropanol thu nhận được axit nucleic dưới dạng cô đặc. Sau khi thu nhận axit nucleic ở dạng sạch, người ta tiến hành phân tích định tính và định lượng chúng bằng một số phương pháp như đo mật độ quang, điện đi, siêu li tâm, sắc kí (hình 6.2 và 6.3). 80 Hình 6.2. Phổ hấp thụ ADN ở bước sóng 260 nm Điện di ADN là kĩ thuật được sử dụng để kiểm tra chất lượng của chế phẩm ADN tách từ tế bào sống. Đồng thời kết quả điện di còn cho phép dự đoán được hàm lượng ADN trong dung dịch tách chiết. Phương pháp điện di dược sử dụng kiểm tra sản phẩm PCR, giải trình tự ADN Hình 6.3. Cấu trúc của agarose (theo Nông Văn Hải, 2002) Gel agarose được sử dụng để phân tích điện di ADN. Agarose ở dạng bột dược pha với dung dịch TBE hoặc TAE và tuỳ theo mục đích phân tích ADN mà pha gel với nồng độ thích hợp. Kĩ thuật điện di ADN bao gồm các bước (hình 6.4): 81 Hình 6.4. Các bước tạo gel điện di agarose (1, 2) Tạo khuôn ga agarose; (3) Đổ ga trên khuôn ga ; (4) Tra dung dịch ADN ; (5) Chạy điện di. Sản phẩm điện di ADN được nhuộm bởi EtBr và chụp ảnh dưới ánh sáng đèn cực tím. (1) Nhuộm gel bằng EtBr ; (2) Soi gel trên ánh sáng đèn cực tím để phát hiện sự có mặt của ADN ; (3) Chụp ảnh để phân tích. 82 Hình 6.5. Hình ảnh điện di ADN tách từ mầm đậu tương 1. ADN chuẩn 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8: ADN tách từ mầm đậu tương Hình 6.6. Cấu trúc của EtBr (theo Nông Văn Hải, 2002) §2. LAI PHÂN TỬ Mục đích của kĩ thuật này là phát hiện trình tự nucleotit đặc thù, nghiên cứu cấu trúc ADN hệ gene (gencomic ADN). Phân tử ADN bị phân cắt bởi enzyme giới hạn thành những phân đoạn ADN riêng biệt. Bằng phương pháp điện di các phân đoạn ADN này với những kích thước khác nhau được tách ra (separate) trên gel thạch hoặc hoặc poliacrylamit và được chuyển sang màng lai phân tử. Quá trình lai phân tử xảy ra giữa phân tử ADN và đoạn dò ADN có gắn nhãn phóng xạ theo quy tắc liên kết bổ trợ. Các đoạn ADN đặc thù được phát hiện theo phương pháp thẩm tách của Southern và phương pháp lai phân tử với đoạn dò ADN có trình tự nucleotit tương đồng. Phương pháp tự ghi phóng xạ (autoradiogrophy) có thể nhận biết vị trí đoạn dò ADN trên màng lai phân tử. Từ khi E.M Southern thuộc Trường Đại học tổng hợp Edinburgh phát hiện ra kĩ thuật này (1975) gọi là kĩ thuật phân tích màng thấm truyền Southern (Southern blot analisis) gọi tắt là Southern, nó đã được ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực nghiên cứu sinh học phân tử và di truyền. Khi ứng dụng kĩ thuật Southern đối với ARN thì gọi là Northern, còn với protein thì được gọi là Western. Hiện nay đã có nhiều cải tiến về phương pháp, hình thành nhiều kĩ thuật phối hợp như Southwestern. 83 2.1. Phương pháp Southern blot Sử dụng một trình tự ADN biết trước lai với đoạn ADN cần tìm. Các bước tiến hành có thể thực hiện theo các bước sau: - Cắt ADN bởi enzyme giới hạn thành các đoạn ADN nhỏ có thể dịch chuyển trên gel agasore. - Biến tính các sợi ADN kép trên gel agarose bằng phương pháp xử lí với kiềm. - Chuyển ADN đã biến tính sang màng nylon hoặc nitrocellulose. - Lai với trình tự ADN đã được đánh dấu bằng phóng xạ hoặc huỳnh quang. Hình 6.7. Sơ đồ mô tả phương pháp Southern blot Phương pháp Southern blot cho phép xác định được trình tự đoạn ADN cần tìm, có thể phát hiện được đột biến mất đoạn hoặc thêm đoạn khi so sánh cá thể đột biến với cá thể bình thường. 2.2. Phương pháp Northern blot Phương pháp Northern blot tương tự như phương pháp Southern blt, nhưng mục tiêu của phương pháp Northern blot là nghiên cứu cấu trúc của mARN. Đó là kỹ thuật lai giữa mARN với trình tự ADN biết trước, đánh dấu phóng xạ. (1) Tách chiết ARN tổng số và biến tính. (2). ARN được chuyển sang màng và lai với trình tự ADN đặc hiệu. (3). Vị trí và số lượng các đoạn của ARN lai với ADN được phát hiện trên phim phóng xạ. Phương pháp Northern blot cho phép nghiên cứu cấu trúc ARN, phát hiện đột biến. 84 §3. XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIT CỦA ADN Có nhiều kĩ thuật xác định trình tự các đôi bazơ trong một chuỗi ADN: - Kĩ thuật điện đi phân đoạn đánh dấu đầu cuối cho phép xác định trình tự chuỗi ADN sợi đơn. - Xác định trình tự nucleotit thông qua trình tự amino axit dựa vào các bộ ba mã hoá, tuy nhiên số mã của các amino axit thường có một số nucleotit trùng lặp hoặc một số bộ ba cùng quy định một loại amino axit, cho nên trình tự ADN thu được chỉ là tương đối. - Xác định trực tiếp thông qua phản ứng kết thúc đầu cuối. Nguyên tắc chính là tạo ADN sợi đơn, mà phân tử sau có cùng trình tự và chỉ dài hơn phân tử trước một nucleotit ở một đầu cuối. Gene ở tế bào tiền nhân có trình tự liên tục, còn gene ở sinh vật nhân thực có thể gián đoạn. Đoạn nucleotit mã hoá protein được gọi là exon, còn đoạn không mã hoá gọi là intron. 3.1. Phương pháp hoá học của Maxam-Gilbert Nguyên tắc của phương pháp hoá học của Maxam-Gilbert là sử dụng phương pháp đánh dấu phóng xạ (P 32 ), xử lí hoá học để phá huỷ 1 nucleotit tạo ra hàng loạt các đoạn ADN có kích thước khác nhau. Các đoạn DNA bị phá huỷ 1 nucleotit Điện di trên gel poliacrylamid Hình 6.8. Sơ đồ minh hoạ phương pháp Maxam-Gilbert Các khâu trong phương pháp Maxam-Gilbert : (1). ADN sợi kép biến tính thành dạng sợi đơn. (2). Đánh dấu phóng xạ (P32) ở đầu 5'. (3). Sử dụng 4 loại hoá chất khác nhau, mỗi loại hoá chất chỉ phá huỷ một loại nucleotit nhất định và tiến hành 4 phản ứng độc lập, kết qủa tạo ra các đoạn ADN kích thước khác nhau. 85 (4). Sản phẩm của 4 phản ứng được tiến hành điện di trên gel poliacrylamid. Trình tự nucleotit được đọc từ dưới lên theo chiều từ 5'→3'. 3.2. Phương pháp Sanger Nguyên tắc của phương pháp này là sử dụng deoxynucleotit không có nhóm OH ở vị trí 3' do vậy trong quá trình kéo dài chuỗi polinucleotit enzyme polimerase gắn chúng vào chuỗi polinucleotit thì quá trình tổng hợp bị dừng lại. Kết quả tạo ra các đoạn ADN có kích thước hơn kém nhau một nucleotit, trên cơ sở đó xác định được trình tự nucleotit. Hình 6.9. Deoxynucleotit mất oxy ở vị trí C 3' của phân tử đường Các khâu của phương pháp Sanger: (1) Biến tính ADN sợi kép thành ADN 2 sợi đơn. (2). Mồi tiếp hợp với ADN sợi đơn. (3). Phản ứng tổng hợp chuỗi polinucleotit gồm: ADN sợi khuôn, primer, ADN polimerase và dNTP. Sự gắn dNTP mất nhóm OH ở vị trí 3' vào chuỗi polinucleotit làm quá trình tổng hợp bị dừng lại. (4). Điện di trên gel poliacrylamid sẽ xác định được trình tự của đoạn ADN. Hình 6.10. Sơ đồ xác định trình tự nucleotit theo Sanger 86 §4. RFLP TECHNOLOGY (Kĩ thuật phân tích hiện tượng đa hình của độ dài các phân đoạn ADN) Trong những năm gần đây kĩ thuật phân lập gene đã dần thúc đẩy cơ bản trong lĩnh vực thú vị nhất là việc sử dụng các đoạn ADN phân lập như các chỉ thị phân tử. Kĩ thuật phân tích hiện đa hình của độ dài các phân đoạn ADN là một kĩ thuật mới mẻ đầy hứa hẹn làm thay đổi hoàn toàn một số lĩnh vực trong đi truyền và chọn giống. Thông tin di truyền được chứa trong các chuỗi ADN của các nhiễm sắc thể nhân và bộ gene của các cơ quan tử. Cây trồng có khả năng sao chép phân tử ADN với chế độ chính xác cao và mau lẹ song có nhiều tác động tự nhiên và nhân tạo gây ra biến dị trong trình tự ADN. Những biến đổi về cặp bazơ nitơ có thể xuất hiện hoặc do biến đổi chuỗi ADN trên phạm vi rộng lớn như là kết quả của sự đảo đoạn, chuyển đoạn và khuyếtđoạn hoặc do chuyển chỗ trong nhiễm sắc thể. Có một số cách xác định biến dị của chuỗi ADN, đó là xác định trình tự ADN và so sánh từng đoạn; sử dụng enzyme cắt hạn chế để cắt ADN thành những phân đoạn có chiều dài khác nhau. Hình 6.11. Thiết bị tự động xác định trinh tự ADN mao quản Biến đổi trình tự nucleotit tại một locus dẫn đến xuất hiện bằng ADN mới trên gel thạch hoặc poliacrylamid. Hiện tượng này được gọi là đa hình của độ dài các phân đoạn ADN. Hiện tượng đa hình độ dài phân đoạn ADN là các chỉ thị phân tử. Bằng cách sử dụng các chỉ thị phân tử đó (chỉ thị phân tử RFLP) các nhà sinh học phân tử và di truyền chọn giống có thể thiết lập các bản đồ gene liên kết di truyền và định vị các gene có tầm quan trọng về kinh tế. Kĩ thuật RFLP được tiến hành theo các bước sau: 87 (1). Tách ADN từ mô sống. (2). Sử dụng các enzyme cắt hạn chế để cắt ADN thành các đoạn có kích thước khác nhau. (3). Điện di trên gel agarose. (4). So sánh các đoạn ADN giữa các đối tượng nghiên cứu. 4.1. Bản đồ RFLP 4.1.1. Nguyên lí Nguyên lí của kĩ thuật này dựa trên sự khác biệt tự nhiên của các chuỗi nucleotit trong phân tử ADN và khi phân tử ADN bị cắt thành nhiều đoạn nhỏ bởi enzyme cắt hạn chế thì các đoạn ADN có thể khác nhau về kích thước hay chiều dài. Sự khác nhau này có thể được khai thác để phân tích sự phân li của các đoạn nhiễm sắc thể khi lai tạo. Các phân tử ADN có kích thước nhỏ như ADN lục lạp có thể sử dụng enzyme (RE) giới hạn để lập bản đồ RFLP, tuy nhiên khả năng ứng dụng ADN lục lạp trong tạo giống rất hạn chế, vì hầu hết các gene có ý nghĩa kinh tế quan trọng lại nằm trong nhân. Phân tích RFLP có thể ứng dụng với ADN nhân, nhưng rất phức tạp vì ADN nhân có kích thước lớn và hàm lượng nhiều. Khi sử dụng RE đối với ADN thì hàng triệu phân đoạn ADN được tạo thành. 4.1.2. Thư viện chỉ thị RFLP Người ta dùng những đoạn nhiễm sắc thể làm chỉ thị đánh dấu để nhận biết các phân đoạn cắt hạn chế. áp dụng phương pháp lai ADN - ADN có tính đặc hiệu cao bởi việc sử dụng các đoạn ADN mẫu để nhận biết các phân đoạn ADN nhân từ hỗn hợp các đoạn ADN tạo thành bởi việc xử lí RE. Tập hợp các đoạn ADN mẫu đó được gọi là thư viện RFLP. Đoạn ADN mẫu có độ dài 2-5 kb ở trạng thái tinh khiết và được sử dụng để lai phân tử. Các đoạn ADN tinh khiết người ta cần phải thực hiện kĩ thuật nhân gene (gene cloning). Kĩ thuật nhân đoạn ADN có thể được hiện như sau: Đoạn ADN được gắn vào plasmit rồi biến nạp vào vi khuẩn. Vi khuẩn sinh sản dẫn đến đoạn ADN được nhân lên tạo nhiều bản sao đoạn ADN. Bằng kĩ thuật nuôi cấy và phân lập plasmit từ vi khuẩn sẽ tạo ra một số lượng lớn các đoạn ADN dùng làm mẫu cho lai ADN. Quy trình xác định RFLP được thực hiện theo các bước sau : (1) Tách chiết ADN nhân ; (2). Xử lí ADN với enzyme cắt giới hạn ; (3). điện di sản phân cắt bởi RE ; (4). Biến tính ADN thành dạng sợi đơn; (5). Chuyển lên màng lai nitrocellulose (Southern blot) để đoạn nADN mẫu lai với đoạn ADN tương đồng theo nguyên tắc bổ sung giữa các cặp bazơ. Người ta sử dụng kĩ thuật phát quang hoá học (Enhanced Chemical Luminesence = ECL) hoặc đánh dấu phóng xạ để xác định kết quả lai bằng phim âm bản hoặc bằng phóng xạ tự ghi. 88 [...]... trong công tác lai tạo và chọn giống thực 90 vật Đồng thời việc xác lập các chỉ thị phân tử RFLP đã mở ra một hướng mới là phân lập các gene mà vẫn chưa biết sản phẩm của nó THẢO LUẬN 1 Thế nào là lai phân tử? Phân biệt phương pháp Southern blot, Northern blot Những ứng dụng của các phương pháp này 2 Vấn đề xác định trình tự ADN Nguyên tắc và phương pháp 3 Vấn đề xác định chỉ thị RFLP và bản đồ RFLP 91... chỉ thị phân tử RFLP (Mackill và cộng sự, 1993, Ronald và cộng sự, 1992, Mc Couch và Tanksley, 1991, Yu và cộng sự, 1991, Yoshimura và cộng sự, 1992) Kĩ thuật phân tích hiện tượng đa hình của độ dài các phân đoạn ADN cho phép phát hiện hiện tượng đa hình của bộ gene thông qua so sánh các bản đồ phân cắt ADN giữa các cá thể khác nhau Các chỉ thị phân tử RFLP mang tính chất riêng biệt, đồng trội và không... không gây hại Các chỉ thị phân tử này không chịu tác động bởi điều kiện môi trường (kể cả sự thay đổi về mùa vụ và vị trí địa lí và giai đoạn phát triển của cây Việc phân tích hiện tượng đa hình của độ dài các phân đoạn ADN được tiến hành trên phân tử ADN tách chiết từ lá non, tránh việc phải chăm sóc cây còn non tới lúc trưởng thành Người ta đã áp dụng các chỉ thị phân tử RFLP vào công tác chọn giống... gián tiếp, làm rút ngắn quá trình chọn lọc các gene quý hiếm, các gene có tầm quan trọng về kinh tế Bởi lẽ các chỉ thị phân tử RFLP có thể liên kết chặt chẽ với các gene trên và vẫn được duy trì trong quá trình phân li Vì vậy người ta có thể theo dõi và chọn lọc các gene thông qua các chỉ thị phân tử đó N R Apuyru và cộng sự (1988) đã xác định hiện tượng đa hình của độ dài các phân đoạn ADN của hai giống... cộng sự, 1988, 1990, 1991), đậu tương (Keim và cộng sự, 1990), lúa mì (Sharp và cộng sự, 1989), Ngô (Burr và cộng sự, 1988, Grant và cộng sự 1989, Beavis và cộng sự 1991, Stuber và cộng sự, 1992) đã chứng tỏ rằng việc lập bản đồ các chỉ thị phân tử RFLP là một phương pháp có sức mạnh lớn lao trong việc xác định các locus điều khiển các tính trạng số lượng - các đặc tính có tầm quan trọng về mặt nông... đa dạng phân tử, tính hữu hiệu của các chỉ thị phân tử được thể hiện ít nhất trong số các giống đậu tương dạng trồng và nó được biểu hiện nhiều nhất giữa các giống thuộc các loài đậu tương khác nhau như Glicine max (L) Merr, G soja Sieb và Zucc Các chỉ thị phân tử RFLP được áp dụng cho việc lập bản đồ gene, nghiên cứu đa dạng sinh học, phân loại phát sinh chủng loại cho đến điều khiển vật nuôi cây... Minsoy và Norin 1 bằng cách sử dụng các dòng ADN chọn lọc ngẫu nhiên làm đoạn dò ADN Các tác giả đã nhận thấy rằng một trong số năm đoạn dò thử nghiệm đã bộc lộ tính đa hình Hơn nữa số băng đa hình xuất hiện là do có sự sắp xếp lại phân tử ADN P Kềnh và cộng sự (1989) đã khảo sát 58 giống đậu tương chọn lọc từ Geneus Glicine và Subgeneus Soja bằng 17 chỉ thị phân tử RFLP để đánh giá mức độ đa dạng phân tử, ... được F1 và cho F1 tự thụ cho F2 Khi F1 giảm phân hình thành giao tử thì các nhiễm sắc thể có sự tái tổ hợp thông qua trao đổi chéo Trao đổi chéo dẫn đến tái tổ hợp là cơ sở cho việc thiết lập bản đồ di truyền truyền thống (bản đồ liên kết) Kĩ thuật RFLP cho phép quan sát trực tiếp các phân tử chỉ thị ADN trên đoạn nhiễm sắc thể Các chỉ thị RFLP phân li hoàn toàn chính xác như các chỉ thị gene và tuân... của từng chỉ thị và nhóm chỉ thị 4.2 Ứng dụng của RFLP Việc phát triển kĩ thuật phân tính hiện tượng đa hình của độ dài các phân đoạn ADN đã mở rộng cánh cửa đi tới phát hiện, theo dõi và điều khiển sự biến dị di truyền ở nhiều loại cây trồng mà trước đây không thể làm được (Tanksley 89 và cộng sự, 1989) Những nghiên cứu gần đây về lúa (Mc Couch và cộng sự, 1988), cà chua (Pettersun và cộng sự, 1988,... ADN từng cá thể và tiến hành kĩ thuật RFLP Quá trình lập bản đồ được tiến hành theo 3 quá trình sau: - Sàng lọc RFLP: Mẫu được thử với cặp bố mẹ để phát hiện ra loại enzyme giới hạn thích hợp tạo ra sự đa dạng RFLP rõ rệt nhất giữa hai cá thể bố mẹ - Chọn cặp chỉ thị 1enzyme: Chọn cặp chỉ thị /enzyme thích hợp, đó là loại enzyme cắt ADN Có thể tiến hành như sau: tách ADN ở cây bố, cây mẹ và từng cây con . Chương 6 KĨ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG PHÂN TÍCH HỆ GENE Ở SINH VẬT Tóm tắt: Sinh học phân tử là nòng cốt của công nghệ sinh học. Phân tích sinh học phân tử được bắt đầu. của sinh học hiện đại và những hiểu biết về di truyền học phân tử làm cơ sở cho việc nghiên cứu, xây dựng các kĩ thuật sinh học hiện đại. Những kĩ thuật sinh học phân tử ứng dụng trong phân. độ dài các phân đoạn ADN. Hiện tượng đa hình độ dài phân đoạn ADN là các chỉ thị phân tử. Bằng cách sử dụng các chỉ thị phân tử đó (chỉ thị phân tử RFLP) các nhà sinh học phân tử và di truyền