Cơ chế phân tử của sao chép DNA 1. Nguyên tắc chung - DNA sao chép theo khuôn. Ưu điểm: + Với phân tử lớn như vậy thì việc tổng hợp theo khuôn sẽ chính xác hơn + Tiết kiệm được ezyme + Đạt hiệu quả nhanh - Sao chép theo nguyên tắc bán bảo tồn (semi-conservative) phân tử DNA mới được tổng hợp gồm một mạch cũ làm khuôn và một mạch mới tổng hợp - Quá trình tổng hợp DNA xảy ra đòi hỏi phải có “ mỗi “ (primer) - Quá trình tổng hợp xảy ra theo chiều 5' - 3'. 2. Thí nghiệm tổng hợp nhân tạo DNA Kornberg (1956) thực hiện phản ứng tổng hợp DNA in vitro. Trong quá trình tổng hợp ông sử dụng DNA polymerase I, 4 loại desoxynucleotid triphosphate (ATP, GTP, CTP, TTP), Mg2+ làm xúc tác. Ngoài ra còn có ít DNA làm khuôn mẫu. 3. Thí nghiệm chứng minh có sự tự nhân đôi theo nguyên tắc bán bảo tồn Meselson, Stahl (1958) đã chứng minh kiểu sao chép bán bảo tồn. Nuôi E.coli nhiều thế hệ trên môi trường có nguồn nitơ đồng vị nặng N15. Như vậy tất cả DNA của vi khuẩn đều mang đồng vị nặng N15 thay cho N14 bình thường. Sau đó tế bào được chuyển sang môi trường chỉ chứa N14 nhẹ, mẫu các tế bào được lấy ra theo những khoảng thời gian đều đặn và chiết tách DNA. Bằng phương pháp ly tâm trên thang nồng độ CsCl, các loại DNA nặng, nhẹ và lai được tách ra. Kết quả cho thấy DNA nặng ban đầu (thế hệ 0) chứa N15, sau một lần phân chia cho thế hệ I với DNA lai có tỷ trọng nằm giữa DNA nặng N15 và DNA nhẹ N14. Nói cách khác sau một lần sao chép phân tử DNA mới chứa một nữa mang N15 và một nữa N14. Ở thế hệ II một nữa số phân tử DNA là lai, nữa còn lại là DNA nhẹ N14. Thí nghiệm này khẳng định giả thuyết của Watson và Crick là đúng tức 2 mạch DNA mẹ tách ra, mỗi cái làm khuôn để tổng hợp nên mạch mới bổ sung. 4. Diễn biến sao chép DNA ở nhiễm sắc thể E.coli Quá trình sao chép DNA ở E.Coli diễn ra qua hai giai đoạn: 4.1. Giai đoạn khởi sự (initiation) + Mở xoắn: Ở E.coliquá trình bắt đầu khi một protein B đặc hiệu nhận biết điểm khởi sự sao chép (replication orgine) ori và gắn vào trình tự base đặc biệt đó. Tiếp theo enzyme gyrase (một loại topoisomerase) cắt DNA làm tháo xoắn ở 2 phía của protein B. Trong khi 2 phân tử enzyme gyrase chuyển động ngược chiều nhau so với điểm ori thì 2 phân tử của enzyme helicase tham gia tách mạch tạo chẻ ba sao chép. Helicase sử dụng năng lượng ATP làm đứt các liên kết hydro giữa 2 base bắt cặp với nhau. + Các protein làm căng mạch SSB (single-strand binding protein) gắn vào các mạch đơn DNA làm chúng tách nhau, thẳng ra và ngăn không cho chập lại hoặc xoắn để việc sao chép được dễ dàng. + Tổng hợp mồi (primer) dặc trưng cho quá trình kéo dài chuỗi là DNA polymerase chỉ hoạt động khi đã có mồi, nên trước khi tổng hợp chuỗi thì phải có qua trình tổng hợp mồi. Mồi là một đoạn khoảng 9 -10 nu, có thể là DNA hoặc ARN. 4.2. Giai đoạn nối dài (elongation) Do tính chất đối song song nên khi tách ra thành 2 mạch đơn khuôn thì một mạch có đầu 3’, mạch kia có đầu 5’ nên để đảm bảo hướng sao chép của DNA theo chiều 5’ -3’ thì sự polymer hóa dựa vào 2 mạch khuôn DNA diễn ra khác nhau. Mạch khuôn có đầu 3’ được DNA polymerase III gắn vào và tổng hợp ngay mạch bổ sung 5’-3’ hướng vào chẻ ba sao chép. Mạch khuôn này được gọi là mạch khuôn trước, còn mạch mới được tổng hợp gọi là mạch trước (leading strand). Ở mạch có đầu 5’ (mạch khuôn sau) việc tổng hợp phức tạp hơn và thực hiện từ chẻ ba sao chép hướng ra ngoài để đảm bảo đúng hướng 5’-3’. Khi mạch kép tách ra ở gần chẻ ba sao chép , enzyme primase gắn mồi (primer) ARN khoảng 10 nucleotid có trình tự bổ sung với mạch khuôn. DNA- polymerase III nối theo mồi ARN, theo hướng ngược với chẻ ba sao chép, tổng hợp các đoạn ngắn 1000-2000 nucleotid, gọi là các đoạn Okazaki (người phát hiện là Reiji Okazaki). DNA polymerase nối dài đoạn Okazaki đến khi gặp ARN mồi phía trước thì dừng lại, rồi lùi ra sau tiếp tục tổng hợp từ ARN mồi mới được tạo nên gần chẻ ba sao chép. Tiếp theo DNA-polymerase I nhờ hoạt tính exonuclease 5’-3’ cắt bỏ mồi ARN, lắp các nucleotid của DNA vào chỗ trống và thực hiện polymer hóa hướng 5’-3’. Đoạn DNA ngắn 10 nucleotid này còn hở 2 đầu, chỗ hở được nối nhờ enzyme ligase của DNA mạch được tổng hợp từ chẻ ba sao chép hướng ra ngoài được tổng hợp chậm hơn nên gọi là mạch sau (lagging strand). Quá trình sao chép DNA ở E.coli diễn ra với tốc độ rất nhanh, có thể đạt đến 50.000 nucleotid/phút. . Cơ chế phân tử của sao chép DNA 1. Nguyên tắc chung - DNA sao chép theo khuôn. Ưu điểm: + Với phân tử lớn như vậy thì việc tổng hợp theo khuôn. với DNA lai có tỷ trọng nằm giữa DNA nặng N15 và DNA nhẹ N14. Nói cách khác sau một lần sao chép phân tử DNA mới chứa một nữa mang N15 và một nữa N14. Ở thế hệ II một nữa số phân tử DNA. DNA làm tháo xoắn ở 2 phía của protein B. Trong khi 2 phân tử enzyme gyrase chuyển động ngược chiều nhau so với điểm ori thì 2 phân tử của enzyme helicase tham gia tách mạch tạo chẻ ba sao