HPV-PCRELISA-Fulltext-Page pot

Định genotype HPV bằng kỹ thuật PCR – ELISA lai 9 dò genotype 16, 18, 31, 33, 35, 39/45 và 6/11 Lê Thúy Quyên* (1) , Phạm Hùng Vân (2) , Võ Đức Xuyên An (3) , Lê Thị Phi Yến (3) , Hòang Hiếu Ngọc (4) Tóm tắt Đặt vấn đề: HPV với các kiểu gen nguy cơ cao như 16, 18 là các tác nhân có tiềm năng sinh ung thư. Tại Việt Nam, do thiếu phương tiên chẩn đóan nên có rất ít các công trình nghiên cứu về tần suất các kiểu gen HPV phát hiện được trong các quệt cổ tử cung. Mục tiêu nghiên cứu: Xây dựng và phát triển kỹ thuật PCR-ELISA lai với 9 dò đặc hiệu kiểu gen là 16, 18, 31, 33, 35, 39/45 và 6/11 để phát hiện và xác định kiểu gen HPV từ các quệt cổ tử cung. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Bệnh phẩm nghiênc ứu là các quệt cổ tử cung. Để phát hiện và xác định genotype của human papilloma virus, chúng tôi đã xây dựng kỹ thuật PCR – ELISA với nguyên tắc như sau: đầu tiên khuếch đại 1 đoạn gen đặc hiệu dài 450 bp nằm trên vùng L1 của HPV để tạo ra những sản phẩm khuếch đại. Những sản phẩm khuếch đại này đều được đánh dấu DIG trong quá trình thực hiện phản ứng PCR. Sau đó thực hiện biến tính và lai sản phẩm với các đoạn dò đặc hiệu cho từng genotype đã được gắn trên các giếng ELISA. Sản phẩm lai gắn trên giếng sẽ được phát hiện bằng cộng hợp là anti – DIG gắn HRPO. Phức hợp này sẽ được phát hiện bằng chất hiện màu TMB. Kết quả: Tiến hành thử nghiệm PCR-ELISA trên 84 mẫu bệnh phẩm lấy từ cổ tử cung bằng que Ayre hòa trong dung dịch nước muối sinh lý được bệnh viện Từ Dũ và một số phòng khám phụ khoa khác gửi đến, chúng tôi ghi nhận có 45 mẫu có DNA – HPV dương tính chiếm tỉ lệ 55%. Đây là một tỉ lệ khá cao so với các nghiên cứu trước đây của bệnh viện Hùng Vương thực hiện trên các mẫu xét nghiệm bất kỳ. Sản phẩm PCR-ELISA của 45 mẫu này sau đó được tiếp tục định genotype bằng kỹ thuật ELISA lai với dò đặc hiệu của 9 genotype được phủ sẵn trên giếng là 16, 18, 31, 33, 35, 39/45 và 6/11; kết quả ghi nhận được như sau: type 16 chiếm 25 trường hợp (56%), các type khác chiếm tỷ lệ lần lượt là 18 (4%), 31 (2%), 33 (7%), 35 (2%), 39/45 (2%), 6/11 (16%). Có 7 trường hợp không phát hiện được genotype, chiếm 16%. Với các kết quả này, các tác giả nhận thấy rằng có một tỉ lệ nhiễm những genotype HPV khác ngoài 9 type thông thường mà các tác giả đã thiết lập trong thử nghiệm ELISA và tỉ lệ này cũng không phải là ít. Kết luận: Từ các kết quả nghiên cứu trên, các tác giả cho là kỹ thuật PCR-ELISA là kỹ thuật thích hợp nhất để có thể triển khai được tại các phòng thí nghiệm lâm sàng có phương tiện PCR để phát hiện và xác định genotype HPV trong các bệnh phẩm quệt cổ tử cung Abstract Genotyping of HPV by PCR – ELISA hybridized 9 genotype specific probes 16, 18, 31, 33, 35, 39/45 and 6/11 Background: HPV with high risk genotypes as like as 16, and 18 are the potential carcinenous pathogens for cervical cancer. In Viet Nam, because of the lack of diagnostic tool detecting and genotyping of HPV, there were still very few studies on the prevalence of HPV genotype detected from cervical swabs. Aims of the study: Develop the PCR-ELISA hybridized with 9 genotype specific probes 16, 18, 31, 33, 35, 39/45 and 6/11 to detect and genotype HPV from the cervial swabs. Methods: To detect and identify genotype of HPV, we set PCR – ELISA technique with main principle: First, a 450 bp – DNA HPV in L1 region is amplified by PCR. These PCR product were labelled with DIG in the PCR reaction, then it will be denatured and hybrided with specific probes which are attached passively to streptavidine in ELISA wells. Hybrided products will be detected by anti DIG – HRPO conjugate and then detected by TMB. Results: With 84 samples received from Tu Du hospital and other gynecology clinics, after running PCR reaction, there are 45 samples positive to DNA – HPV. These 45 PCR products, then, will be genotyped by ELISA method in which these PCR product will be hybridized with 9 genotypic probes including 16, 18, 31, 33, 35, 39/45, and 6/11. The collected result revealed that 25 are belong to type 16 (56%), other types 18, 31, 33, 35, 39/45, 6/11 have 4%, 2%, 7%, 2%, 2%, 11%, respectively. There are 7 samples positive to DNA-HPV but cannot identify genotype, have 16%. Authors realize that there is an unexpected incidence of other HPV types besides 9 HPV types that set up in ELISA. Conclusions: In Vietnam, PCR-ELISA is the most suitable technique that can be set up in the clinical laboratories with PCR facilities to detect and genotyping of HPV in the cervical swabs Đặt vấn đề Ung thư cổ tử cung là loại ung thư chiếm tỉ lệ cao nhất hoặc nhì trong các loại ung thư ở cơ quan sinh dục nữ, chiếm 12% các bệnh ác tính của phụ nữ. Xuất độ ở châu Âu và Bắc Mỹ là từ 30 đến 35 ca bệnh mới hàng năm, tính trên 100.000 dân. Tại Việt, Nam, ung thư cổ tử cung chiếm tỉ lệ 38,55%, đa số gặp ở phụ nữ độ tuổi 40 – 49 (1) . Kết quả điều trị tùy thuộc hoàn toàn vào giai đọan phát triển của ung thư được phát hiện. Nếu phát hiện và điều 1 * Tác giả chính, (1) Thạc Sĩ, BM Sinh Học, Khoa Khoa Học Cơ Bản, Đại Học Y Dược TP. HCM; (2) TS., Bộ Môn Vi Sinh, Khoa Y, Đại Học Y Dược TP. Hồ Chí Minh; (3) Cử Nhân Sinh Học, Công ty Nam Khoa Biotek; (4) BS., Bộ Môn Sinh Hóa, Khoa Y, Đại Học Y Dược TP. Hồ Chí Minh trị khi còn là giai đọan 0, tiên lượng lành bệnh thường là 100% (2) . Trước đây, người ta thấy rằng có nhiều yếu tố thuận lợi dẫn đến ung thư cổ tử cung trong đó có human papilloma virus nhưng cho đến nay, người ta đã phát hiện được rằng HPV là tác nhân gây ung thư cổ tử cung (3-5) . Cho đến nay, hơn 100 genotype HPV đã được phát hiện trong đó có khoảng 29 genotype được phân làm 3 nhóm nguy cơ lien quan đến ung thư cỏ tử cung, đó là: nhóm nguy cơ cao với 15 genotype (16, 18, 31, 33, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73 và 82) 3 genotype thuộc nhóm nguy cơ cao tiềm tàng (26, 53, 66) và 11 type thuộc nguy cơ thấp (6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, và 81) (3) . Phưong pháp tế bào học (PAP’s smear) được xem là khá hữu hiệu để tầm soát ung thư cổ tử cung vì xem xét được quá trình biến đổi của tế bào niêm mạc cổ tử cung từ bình thường sang ác tính. Tuy nhiên, phương pháp tế bào học không phải là phương pháp duy nhất để tầm soát bệnh. Cùng với sự phát triển của sinh học phân tử, người ta đã phát triển những kỹ thuật mới có khả năng phát hiện những type HPV có nguy cơ cao vơi độ nhạy và độ chính xác cao. Từ vai trò hỗ trợ cho xét nghiệm tế bào, những phương pháp này dần trở thành chủ yếu để sàng lọc sớm ung thư cổ tử cung (6-11) . Trước khi có kỹ thuật khuếch đại, người ta dùng kỹ thuật lai tại chỗ với đoạn dò đặc hiệu để phát hiện và định genotype HPV trong mẫu thử, tuy nhiên, phương pháp này lại có độ nhạy thấp và phức tạp (12-14) . Ngày nay, đã có nhiều phương pháp phát hiện và định genotype HPV như kỹ thuật micro array sử dụng DNA chip, lai trong pha lỏng (hybrid capture 2) (15,16) , phương pháp lai trên vạch (InoLiPA) (17,18) . Tuy nhiên, những phương pháp này lại khá đắt tiền, chưa phù hợp với điều kiện Việt Nam. Vì thế, chúng tôi tiến hành nghiên cứu nhằm xây dựng phương pháp PCR – ELISA phát hiện DNA – HPV đồng thời định genotype của HPV để góp phần vào việc tầm soát và chẩn đoán sớm ung thư cổ tử cung ở nước ta. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu Mẫu bệnh phẩm: 84 mẫu bệnh phẩm là các mẫu phết cổ tử cung bằng que Ayre hòa trong dung dịch nước muối sinh lý hoặc bằng gòn được bệnh nhân trực tiếp mang đến hoặc do một số phòng khám hay bệnh viện Từ Dũ ở TP.Hồ Chí Minh gửi đến phòng thí nghiệm R&D của công ty Nam Khoa trong ngày hoặc được lưu ở -20 o C vào ngày cuối tuần và được gửi đến công ty Nam Khoa vào ngày thứ hai tiếp theo. Trích biệt HPV – DNA từ các mẫu bệnh phẩm: Đầu tiên, chúng tôi xử lý mẩu bằng dung dịch PROKPREP tức là dung dịch proteinase K/detergent do công ty Nam Khoa sản xuất với mục đích dùng dung dịch này để tiêu hóa các protein bám trên DNA của virus cũng như trong bệnh phẩm. Sau đó, chúng tôi sử dụng phương pháp ly trích DNA bằng phương pháp phenol/choloform với bộ thuốc thử DNAPREP PHCHL do công ty Nam Khoa sản xuất để trích biệt DNA từ mẫu. Phát hiện HPV- DNA: Dùng 10µl dịch ly trích cho vào tube chứa sẵn HPV – ELISA mix. PCR mix này dùng để phát hiện và định genotype của HPV do công ty Nam Khoa sản xuất với các thành phần chủ yếu là PCR buffer (Biorad), dNTP (Roche), Taq polymerase (Biorad), mồi MY09 và MY11 (Invitrogen) và dUTP có gắn DIG (Roche) được pha với các nồng độ thích hợp để khuếch đại môt đoạn DNA dài 450 bp trên vùng gen L1 của HPV đồng thời sẽ tạo ra những sản phẩm PCR có đánh dấu DIG. Sau đó chạy chương trình luân nhiệt dành cho HPV như sau: 40 o C trong 10 phút; 95 o C trong 5 phút; 95 o C trong 30giây và 70 o C trong 30 giây được lặp lại 20 chu kỳ; sau đó là 95 o C trong 1 phút, 55 o C trong 1 phút và 72 o C trong 1 phút được lặp lại trong 35 chu kỳ kế tiếp; cuối cùng là 72 o C trong 10 phút. Sản phẩm khuếch đại được điện di trên gel agarose 2% pha trong TBE 0.5X (dùng bộ AGE do công ty Nam Khoa sản xuất) cùng với một giếng chứa thang DNA chuẩn từ 100 – 1000 bp (Biorad) với mỗi băng DNA chuẩn cách nhau 100 base. Kết quả được cho là dương tính khi vạch khuếch đại rõ nét ở vị trí 450 bp. Xác định genotype của HPV: Những mẫu HPV – DNA (+) được tiến hành xác định genotype như sau: Chúng tôi sử dụng các giếng ELISA đã được phủ streptavidin và đã gắn kết thụ động lần lượt với các đoạn dò đặc hiệu cho các genotype của HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39/45, 6/11 trên từng giếng tương ứng của 1 thanh ELISA.Thực hiện biến tính sản phẩm PCR ở 95 o C trong 10 phút, sản phẩm sau khi biến tính phải được giữ ngay trong đá để duy trì tình trạng biến tính. Sau đó chúng tôi tiến hành lai những sản phẩm PCR đã được biến tính vào các giếng ELISA, với mỗi thanh ELISA tương ứng với 1 mẫu. Khi đó, đoạn dò sẽ tóm bắt đặc hiệu với mỗi mạch đơn (đã được đánh dấu DIG) tương ứng với từng genotype. Sau đó, sản phẩm lai gắn trên giếng sẽ được phát hiện bằng cộng hợp là anti – DIG gắn HRPO. Phức hợp này sẽ được phát hiện bằng chất hiện màu TMB. Kết quả sẽ được đọc ở bước sóng 450nm. Khi OD của giếng có giá trị > 1.7 OD của giếng chứng âm và có trị số cao nhất so với OD của các giếng khác trong cùng một mẫu thì đó là kiểu gen của mẫu. Nếu tất cả các giếng có OD < OD của giếng chứng 2 âm thì kết luận là mẫu dương tính với HPV nhưng với kiểu gen khác với kiểu gen 16, 18, 31, 33, 35, 39/45, 6/11. Kết quả Kết quả phát hiện HPV dựa trên PCR khuếch đại đoạn DNA dài 450bp trên gene L1: Trong thời gian từ 15/03/2005 – 15/07/2005, chúng tôi đã thử nghiệm được 84 mẫu bệnh phẩm. Hình 1 trình bày kết quả PCR của 84 mẫu DNA đã được trích biệt. Kết quả cho thấy là có những mẫu không hiện lên vạch sáng nào, điều này chứng tỏ mẫu âm tính với DNA-HPV, có những mẫu hiện lên vạch sáng tương ứng vạch 450bp, rõ chứng tỏ mẫu dương tính với DNA – HPV. Trong tổng số 84 mẫu bau đầu, sau khi chạy PCR, có 45 mẫu dương tính chiếm tỉ lệ 55% và 39 mẫu âm tính chiếm tỉ lệ 45%. Kết quả phát hiện genotype HPV: Với 45 mẫu dương tính, chúng tôi tiến hành định genotype bằng phương pháp ELISA và đã thu được kết quả nhu sau: type 16 có 25 trường hợp, chiếm đa số (tỉ lệ 56%), các genotype khác lần lượt chiếm tỉ lệ là 18 (4%), 31 (2%), 33(7%), 35(2%), 39/45(2%), 6/11(11%). Có 7 trường hợp (16%) không xác định được genotype. Biểu đồ 1 dưới đây trình bày tỷ lệ các genotype HPV phát hiện được. Bàn luận Trong kết quả thu nhận được, chúng tôi nhận thấy có đến 16% các trường hợp dù PCR dương tính rất rõ với HPV nhưng vẫn không thể định 3 56% 4% 2% 7% 2% 2% 11% 16% Genotype 16 Genotype 18 Genotype 31 Genotype 33 Genotype 35 Genotype 39/45 Genotype 6/11 Không xác đ?nh Genotype 16 Genotype 18 Genotype 35 Genotype 33 Genotype 31 Genotype 39/45 Genotype 6/11 Không xác định Biểu đồ 1: Số trường hợp phát hiện genotype của HPV. Hình 1: Kết quả PCR phát hiện HPV của 84 mẫu DNA trích biệt từ quệt cổ tử cung bệnh nhận. Các số thứ tự được đánh dấu bên bước là mã số của mẫu thử nghiệm. MK là thang DNA chuẩn từ 100 đến 1000bp với các vạch cách nhau 100bp. được genotype. Điều này chứng tỏ có một số genotype mà chúng tôi chưa phủ dò đặc hiệu lên trên giếng ELISA. Do vậy chúng tôi đã thực hiện lai thêm sản phẩm PCR với dò của genotype 58. Kết quả trong 7 mẫu không xác định được genotype này có 3 mẫu dương tính với genotype 58. Còn 4 mẫu còn lại chúng tôi đã thực hiện kỹ thuật giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR và kết quả cho thất có 1 là genotype 52, 1 là genotype 54, một là genotype 62 và 1 là genotype 83 (kết quả này được trình bày trong một bài báo tiếp theo sắp đăng). Như vậy để có thể hòan thiện được kỹ thuật PCR-ELISA, chúng tôi cho rằng vấn đề kỹ thuật cần phải giải quyết đó là nên có thêm các giếng phủ thêm các dò đặc hiệu genotype, lí tưởng nhất là đủ 29 genotype (3) của đủ 3 nhóm nguy cơ cao, tiềm tàng hay nguy cơ thấp. Tuy nhiên nấu làm như vậy thì vấn đề phải giải quyết tiếp theo là giá thành vì như vậy một mẫu bệnh phẩm là phải thực hiện trên ½ bảng nhựa ELISA và 6 HPV-PCR ELISA mix, do vậy giá thành sẽ đắt hơn 6 lần giá củ. Chính vi vậy con đường đi thích hợp nhất là có thêm các mẫu thử để thăm dò các genotype thường lưu hành để xây dựng bộ thuốc thử PCR- ELISA phát hiện HPV, và đây chính là đích nhắm mà chúng tôi đang tiếp tục thực hiện. Về mặt nguyên tắc, có nhiều cách để xây dựng kỹ thuật PCR-ELISA phát hiện và định genotype của HPV (19) . Chúng tôi chọn cách dùng DIG dUTP để đánh dấu sản phâm PCR vì theo kinh nghiệm chúng tôi thấy rằng đây là phương pháp khá nhạy, ngòai ra chúng ta có thể chế sẵn các bản nhựa ELISA phủ sẵn probe thông qua cầu nối Streptavitin trên bản nhựa và Biotin trên đầu 5’ của dò đặc hiệu. Tất cả các kỹ thuật để chế tạo bản nhựa phủ streptavidine và sau đó phủ dò đặc hiệu chúng tôi đã có sẵn và thành thục. Đây cũng chính là yếu tố giúp làm giảm giá thành của sản phẩm khi chế tạo kit. Dù với số mẫu còn giới hạn, nhưng kết quả cũng cho thấy tỷ lệ cao (55%) nhiễm HPV của các mẫu thử lấy từ cổ tử cung của phụ nữ gửi đến xét nghiệm tại phòng nghiên cứu và phát triển của công ty Nam Khoa. Sự phân bố các genotype cũng cho thấy đa số là có mang các genotype nguy cơ cao mà chủ yếu là genotype 16. Tuy nhiên đây chỉ là những số liệu nhỏ chưa thể nói lên được sự phân bố dịch tễ học của các genotype HPV lưu hành. Việc xây dựng thành công bộ kit PCR- ELISA thích hợp tại Việt Nam sẽ có giá trị đóng góp lớn sau này trong các điều tra dịch tễ học như vậy. Kết luận. Phát hiện và định genotype của HPV trong các mẫu quệt cổ tử cung là xét nghiệm rất cần thiết để chẩn đoán và tầm soát sớm ung thư cổ tử cung và nếu xét về mặt địch tễ học thì xét nghiệm này cũng nên được đưa vào sử dụng đại trà để xác định được các genotype lưu hành trong các vùng dịch tễ khác nhau đồng thời từ đó giúp tiên đoán và đánh giá được sự hữu dụng của các phươgn pháp phòng chống lây nhiễm cững như sự hữu hiệu của vaccine phòng ngừa sẽ được đưa vào áp dụng cho dân số trong tưong lai. Mặc dù phương pháp PCR – ELISA được xem là khá hữu hiệu để phát hiện và định genotype HPV nhưng phương pháp này bị giới hạn số genotype HPV cần xác định vì phụ thuộc vào đọan dò đặc hiệu cho từng genotype cũng như bị hạn chế về số giếng cần để thử nghiệm. Trong tương lai, chúng tôi sẽ hoàn thiện thêm kỹ thuật ELISA bằng cách gia tăng số genotype cần được phát hiện chứ không dừng lại ở 9 genotype như trên. Bên cạnh đó, chúng tôi cũng sẽ tích cực nghiên cứu để đưa vào một kỹ thuật mới cũng nhằm để phục vụ cho việc xác định genotype của HPV được chính xác và đa dạng hơn đồng thời giúp hoàn thiện them bộ kit PCR – ELISA hiện có. Tài liệu tham khảo. 1. Trường Đại học Y dược Thành phố Hồ Chí Minh. Bộ môn Ung bướu. Ung thư học lâm sàng.Ung thư cổ tử cung: p191 - 210 2. Trường Đại học Y dược Thành phố Hồ Chí Minh. Bộ môn Sản Phụ Khoa. Ung thư cổ tử cung: p918 – 929 (2000) 3. Munoz., N., F.X. Bosch, S. de Sanjose, R. Herrero, X. Castellsague, K.V. Shah, P.J. Snijders, and C.J. Meijer Epidemiologic classification of human papillomavirus types associated with cervical cancer. (2003) Feb 6;348(6):518-27 4. Castellsaque X, Diaz M et al, Worldwide human papillomavirus etiology of cervical adenocarcinoma and its cofactors: implications for screening and prevention. J Natl Cancer Inst. 2006 Mar 1;98(5):303-15 5. Chen CA, Liu CY, Chou HH, Cho CM, Twu NF et al. The distribution and differential risks of human papillomavirus genotypes in cervical preinvasive lesions: A Taiwan Cooperative Oncologic Group Study. Int J Gynecol Cancer (2006) Sep-Oct;16(5):1801-8. 6. Bosch, F. X., A. Lorincz, N. Munoz, C. J. Meijer, and K. V. Shah. 2002. The causal relation between human papillomavirus and cervical cancer. J. Clin. Pathol. 55:244–265. 7. Bosch, F. X., and S. de Sanjose. 2003. Chapter 1: Human papillomavirus and cervical cancer- 4 burden and assessment of causality. J. Natl. Cancer Inst. Monogr. 31:3–13. 8. Dannecker, C., U. Siebert, C. J. Thaler, D. Kiermeir, H. Hepp, and P. Hillemanns. 2004. Primary cervical cancer screening by self- sampling of human papillomavirus DNA in internal medicine outpatient clinics. Ann. Oncol. 15:863–869. 9. Jin, X. W., K. Zanotti, and B. Yen-Lieberman. 2005. New cervical cancer screening strategy: combined Pap and HPV testing. Cleveland Clin. J. Med. 72:141–148. 10. Munoz, N., S. Franceschi, C. Bosetti, V. Moreno, R. Herrero, J. S. Smith, K. V. Shah, C. J. Meijer, and F. X. Bosch. 2002. Role of parity and human papillomavirus in cervical cancer: the IARC multicentric case-control study. Lancet 359:1093– 1101. 11. Nieminen, P., S. Vuorma, M. Viikki, M. Hakama, and A. Anttila. 2004. Comparison of HPV test versus conventional and automation-assisted Pap screening as potential screening tools for preventing cervical cancer. BJOG 111:842–848. 12. Melchers, W. J., P. Herbrink, W. G. Quint, J. M. Walboomers, C. J. Meijer, and J. Lindeman. 1988. Prevalence of genital HPV infections in a regularly screened population in The Netherlands in relation to cervical cytology. J. Med. Virol. 25:11-16. 13. Melchers, W. J., P. Herbrink, J. M. Walboomers, C. J. Meijer, H. V. D. Drift, J. Lindeman, and W. G. Quint. 1989. Optimization of human papillomavirus genotype detection in cervical scrapes by a modified filter in situ hybridization test. J. Clin. Microbiol. 27:106-110. 14. Walboomers, J. M., W. J. Melchers, H. Mullink, C. J. Meijer, A. Struyk, W. G. Quint, J. van der Noordaa, and J. ter Schegget. 1988. Sensitivity of in situ detection with biotinylated probes of human papilloma virus type 16 DNA in frozen tissue sections of squamous cell carcinomas of the cervix. Am. J. Pathol. 131:587-594 15 Cox, J. T., A. T. Lorincz, M. H. Schiffman, M. E. Sherman, A. Cullen, and R. J. Kurman. 1995. Human papillomavirus testing by hybrid capture appears to be useful in triaging women with a cytologic diagnosis of atypical squamous cells of undetermined significance. Am. J. Obstet. Gynecol. 172:946-954. 16. The Atypical Squamous Cells of Undetermined Significance/Low-Grade Squamous Intraepithelial Lesions Triage Study (ALTS) Group. 2000. Human papillomavirus testing for triage of women with cytologic evidence of low-grade squamous intraepithelial lesions: baseline data from a randomized trial. J. Natl. Cancer Inst. 92:397-402 17. Kleter, B., L. J. Van Doorn, L. Schrauwen, A. Molijn, S. Sastrowijoto, J. ter Schegget, J. Lindeman, B. ter Harmsel, M. Burger, and W. Quint. 1999. Development and clinical evaluation of a highly sensitive PCR-reverse hybridization line probe assay for detection and identification of anogenital human papillomavirus. J. Clin. Microbiol. 37:2508-2517 18. Melchers, W. J., J. M. Bakkers, J. Wang, P. C. de Wilde, H. Boonstra, W. G. Quint, and A. G. Hanselaar. 1999. Short fragment polymerase chain reaction reverse hybridization line probe assay to detect and genotype a broad spectrum of human papillomavirus types. Clinical evaluation and follow-up. Am. J. Pathol. 155:1473-1478. 19 Phạm Hùng Vân. 2005. PCR-ELISA and real- time PCR – Principle and applications. Short course focusing on the advanced PCR that can be appied in developing countries 5 . 31, 33, 35, 39/45 and 6/11 Background: HPV with high risk genotypes as like as 16, and 18 are the potential carcinenous pathogens for cervical cancer. In Viet Nam, because of the lack of diagnostic. Anttila. 2004. Comparison of HPV test versus conventional and automation-assisted Pap screening as potential screening tools for preventing cervical cancer. BJOG 111:842–848. 12. Melchers, W. J.,