Luận văn tốt nghiệp SVTH: Hồ Thanh Hoàng Download» Agriviet.com 10 học. Theo ông PTSHBC là việc sử dụng sinh vật, gen và các sản phẩm của gen để điều khiển tác nhân gây bệnh. Các cách điều khiển tác nhân gây bệnh có thể là: (i) duy trì mật số nguồn bệnh ở mức thấp dưới ngưỡng kinh tế, (ii) làm chậm hoặc loại trừ tiến trình xâm nhiễm của bệnh, (iii) kích hoạt và tạo điều kiện phát huy hệ thống tự vệ của cây. 2.8.2 Lựa chọn tác nhân phòng trừ sinh học Chiến lược PTSHBC có thể chia thành hai loại (1) chiến lược dựa trên nguyên tắc cơ bản về sinh thái học hay còn gọi là phòng trừ sinh học cổ điển (Hokkaness và Lynch, 1995) hay phòng trừ sinh học chỉ xử lý một lần (Cook, 1993), (2) chiến lược sử dụng vi sinh vật như là một loại thuốc sinh học và việc xử lý có những điểm gần giống như xử lý thuốc hoá học nhằm mục đích kiểm soát bệnh trong một khoảng thời gian giới hạn. Chiến lược này còn được gọi là phòng trừ sinh học tăng dần (Hokkaness và Lynch, 1995). Sự khác nhau về chiến lược phòng trừ ảnh hưởng đến sự lựa chọn và phương pháp sàng lọc tác nhân phòng trừ sinh học. Đối với chiến lược PTSHBC tăng dần, người ta chú ý đến nguồn gốc của vi sinh vật đối kháng. Tuy nhiên những hiểu biết về khía cạnh này là điều cần thiết cho việc đánh giá rủi ro và là một trong những yêu cầu cần thiết cho quá trình đăng ký thương mại hoá sản phẩm (Lumsden và Lewis, 1989). Có một số phương pháp sàng lọc tác nhân phòng trừ sinh học dựa trên hoạt tính của men thủy phân của vi sinh vật đối kháng, tương tác giữa vi sinh vật gây bệnh và vi sinh vật đối kháng, phương pháp có liên quan đến cây kí chủ. 2.8.3 Vi khuẩn - một tác nhân phòng trừ sinh học: Nhiều công trình nghiên cứu về các tác nhân phòng trừ sinh học đã công bố từ dầu thế kỷ 20 trong đó có vi khuẩn. Đang là nhóm vi khuẩn hoại sinh mà phổ Luận văn tốt nghiệp SVTH: Hồ Thanh Hoàng Download» Agriviet.com 11 biến nhất là Pseudomonas spp., kế đến là Bacillus spp. và Streptomyces (Burr và ctv, 1978, Weller và Cook, 1983). Những nghiên cứu về vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn trên thân lá cây đã dẫn đến việc chia chúng thành ba loại: loại có hại cho cây, loại trung tính và loại có ích cho cây. nh hưởng có ích của nhóm vi khuẩn này là do chúng sản sinh ra chất kích thích tăng trưởng cây, các chất ức chế hoặc làm suy yếu tác nhân gây bệnh hoặc cả hai (Baker, 1988). Cơ chế ban đầu ức chế tác nhân gây bệnh là tiết ra các chất kháng sinh (Fravell, 1988). Tuy nhiên những yếu tố khác như việc tiết ra chất sidrophores, HCN, sự cạnh tranh dinh dưỡng cũng có vai trò quan trọng trong việc ức chế tác nhân gây bệnh (Cook và Baker, 1983). Trong số các loài Pseudomonas spp., Pseudomonas fluorescens được chú ý và tăng cường nghiên cứu hơn hết, vì ngoài khả năng đối kháng với 10 loại nấm bệnh lưu tồn trong đất, loài vi khuẩn này có khả năng kích thích sự phát triển cây trồng. Bằng cách xử lý hạt có hay không có chất mang hoạt chủng vào đất cùng với giá thể làm thức ăn nền, đã làm giảm mức trầm trọng cũa bệnh, làm gia tăng sự phát triển và tăng năng suất cây trồng. Với thuận lợi là có nhiều cơ chế tác dụng như: đònh cư, chiếm chỗ, loại trừ mầm bệnh ra khỏi vùng thích hợp, tiết chất kháng sinh (Pyrrolnitrin, pyoluteorin) ngoại ký sinh, cạnh tranh dinh dưỡng (hợp chất sắt), gia tăng sức đề kháng cho cây, Pseudomonas rất có triển vọng sử dụng trên lãnh vực thương mại. Biện pháp sinh học trong phòng trừ bệnh cây là điều khiển môi trường, cây trồng và sinh vật đối kháng một cách thích hợp, để tạo nên một thế cân bằng sinh học cần thiết, giúp giảm mật số của mầm bệnh xuống dưới ngưỡng gây hại. Nhờ đó, bệnh của cây trồng chỉ xuất hiện ở mức độ nhẹ, không gây ảnh hưởng quan trọng về mặt kinh tế. Biện pháp sinh học không có mục đích tiêu diệt toàn bộ mầm bệnh, và cũng không có khả năng này (Phạm Văn Kim, 1999). Luận văn tốt nghiệp SVTH: Hồ Thanh Hoàng Download» Agriviet.com 12 2.8.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước: 2.8.4.1Nghiên cứu trong nước: Lê Lương Tề, 2002 nghiên cứu “phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn cà chua có hiệu quả kinh tế cao bằng biện pháp sử dụng rộng rãi các giống cà chua kháng bệnh, có năng suất cao CLN-1462A và P.T4719A ở vùng đồng bằng sông Hồng”. Đã đưa vào trồng đại trà ở các tỉnh thuộc đồng bằng sông Hồng và các tỉnh phía Bắc nước ta. Lê Như Kiểu, Nguyễn Ngọc Cường, Đào Thu Hằng, 2003 nghiên cứu “phát hiện biovar 1 và 5 trong quần thể vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh cà chua”. Điều này cho thấy quần thể gây bệnh héo xanh cà chua ở Việt Nam là rất đa dạng (có 5 biovar). Phạm Minh Sang, 2003 nghiên cứu “Hiệu lực của vi khuẩn đối kháng và kích thích sinh trưởng trong phòng trừ bệnh khô vằn do nấm Rhizoctonia solani” bước đầu đã khống chế được bệnh khô vằn cho lúa và kích thích cây tăng trưởng mạnh bằng VKĐK. Nguyễn Trung Thành, 2004 cũng đã thành công trong việc nghiên cứu “Bước đầu chọn lọc và đánh giá dòng VKĐK, phân lập từ đất để khống chế nấm Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii, và vi khuẩn Ralsronia solanacearum gây bệnh trên cây cà chua”. Các dòng VKĐK có khả năng kháng với cả ba tác nhân gây bệnh trong điều kiện In vitro và trong nhà lưới VKĐK đã khống chế được bệnh do nấm Sclerotium rolfsii gây ra. Phạm Mỹ Liên, 2004 nghiên cứu về vấn đề “Chọn lọc và đánh giá dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens đối kháng với nấm Sclerotium rolfsii gây bệnh trên cây cà chua” cũng đã thành công trong quá trình nghiên cứu. 2.8.4.2 Nghiên cứu ngoài nước Luận văn tốt nghiệp SVTH: Hồ Thanh Hoàng Download» Agriviet.com 13 Tại Đài Loan, bằng phương pháp PCR với cặp primer PS-IS đặc hiệu với vi khuẩn Ralstonia solanacearum thuộc race 1, kết quả phân tích cho thấy tất cả các dòng vi khuẩn Ralstonia solanacearum thu thập trên cà chua, khoai tây, ớt, đậu phộng, cà tím, thuốc lá, dâu tây, chuối và nhiều loại cây trồng khác đều thuộc race 1 (Yang An Lee, 2001). Phân tích trên 120 dòng vi khuẩn Ralstonia solanacearum phân lập trên cà chua, khoai tây, cà tím, ớt, chuối, gừng và nhiều loại cây trồng khác từ Châu , Mỹ, u, Phi và Châu Đại Dương cho thấy vi khuẩn Ralstonia solanacearum thuộc division Châu thường bao gồm biovar 3 và 4, division Châu Mỹ thường bao gồm biovar 1 và 2. Theo Rindran và Vidhiaekaran (1996) cho rằng những loại vi khuẩn Pseudomonas fluorescens được phân lập từ vùng rễ, có sắc tố phát huỳnh quang vàng xanh cũng kìm hãm sự phát triển của nấm Rhizoctonia solani . Một trong những dòng có hiệu quả nhất là PFAIR2, phân lập trên than bùn được dùng để xử lý hạt, xử lý rể, rải vào đất và phun trên lá. Từng nghiệm thức riêng lẻ đã kiểm soát bệnh có hiệu quả. Tuy nhiên, sự kết hợp của bốn cách dẫn đến hiệu quả phòng trừ tốt nhất trong nhà lưới. Trên đồng ruộng, sử dụng PFAIR2 phòng trừ bệnh có hiệu quả, gia tăng năng suất và có thể so sánh với các loại thuốc trừ nấm thông dụng như carbendazim. Luận văn tốt nghiệp SVTH: Hồ Thanh Hoàng Download» Agriviet.com 14 Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và đòa điểm nghiên cứu 3.1.1 Thời gian Đề tài được thực hiện từ ngày 5/6/2005 – 30/8/2005 3.1.2 Đòa điểm - Nơi tiến hành nghiên cứu: Công ty Hai Mũi Tên Đỏ thuộc công ty giống Đông Tây, xã Nhuận Đức, huyện Củ Chi, Thành Phố Hồ Chí Minh. - Nơi phân lập và nuôi cấy: Phòng thực tập Bệnh cây – Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật – Trường Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. Luận văn tốt nghiệp SVTH: Hồ Thanh Hoàng Download» Agriviet.com 15 - Nơi phân tích: Trung tâm phân tích thí nghiệm hoá sinh – Trường Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. 3.2 Phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Vật liệu nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens đối kháng: 18, 73, 85, 123, 124, 187 và các dòng vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh: RST004, RST005, RST006, RST01, RSBog3, RSBog4. Hạt cà chua với tỷ lệ nẩy mầm 90%. Môi trường phân lập và nuôi cấy: - PDA (potato, dextrose, agar) - LB (tryptone, yeast extract, sodium chloride) - WA (water, agar) Vật liệu lây nhiễm: hạt giống cà chua (1628) 3.2.2 Phương pháp đánh giá khả năng đối kháng của các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens với các dòng vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên đóa petri trong phòng thí nghiệm Điều kiện tiến hành: thí nghiệm được tiến hành trong phòng thí nghiệm tại Phòng Thực tập Bệnh cây – Bộ môn Bảo vệ Thục vật – Trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Vật liệu nghiên cứu: - Các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens:18, 73, 85, 123, 124. - Các dòng vi khuẩn Ralstonia solanacearum: RST004, RST005, RST006, RST01, RSBog3, RSBog4. Dụng cụ thí nghiệm: Que trang vi khuẩn, pipet và đầu tiếp đã được vô trùng. Luận văn tốt nghiệp SVTH: Hồ Thanh Hoàng Download» Agriviet.com 16 Môi trường sử dụng: PDA (200g Potato, 15g Agar, 20g Dextrose và 1 lít nước cất). Phương pháp tiến hành: Lấy 100µl các dòng vi khuẩn Ralstonia solanacearum tran đều trên môi trường PDA đã chuẩn bò sẵn. Dùng pipet hút 20µl dòch vi khuẩn và tiến hành cấy dòch vi khuẩn thành 5 điểm tương ứng với các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens đã chuẩn bò sẵn. Cuối cùng đem ủ ở nhiệt độ phòng (27-30 0 C), khoảng 24 giờ sau xem kết quả đối kháng của các dòng vi khuẩn. Chỉ tiêu theo dõi: Khả năng đối kháng của 5 dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens 3.2.3 Phương pháp đánh giá khả năng phòng trừ của dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens với dòng vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên cây cà chua trong nhà lưới Thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện nhà lưới tại công ty Hai Mũi Tên Đỏ. Vật liệu nghiên cứu: - Nguồn vi khuẩn kháng mạnh nhất và gây độc mạnh nhất được chọn lọc trong phòng thí nghiệm. - Hạt cà chua với tỉ lệ nảy mầm 90%. - Đất. - Chậu nhựa 7x12cm (đường kính x chiều cao). - Khay xốp (60 lổ). Luận văn tốt nghiệp SVTH: Hồ Thanh Hoàng Download» Agriviet.com 17 - Trang thiết bò thí nghiệm tại phòng thực tập Bệnh cây – Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật và tại trung tâm phân tích thí nghiệm Hoá Sinh trường Đại học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh. Môi trường sử dụng: LB lỏng (tryptone, yeast extract, sodium chloride). Phương pháp tiến hành: Lây nhiễm theo phương pháp của Phạm Đăng Minh (2003) có cải tiến - Sau khi khảo sát tính độc của các dòng vi khuẩn Ralstonia solanacearum trong phòng thí nghiệm, ta chọn ra các dòng gây độc cho cây cà chua và chọn ra một dòng mạnh nhất. Tương tự, ta cũng chọn ra một dòng VKĐK mạnh nhất. - Nguồn vi khuẩn: từ nguồn vi khuẩn trữ ở -80 0 C, nuôi cấy trên môi trường LB lỏng khoảng 16 giờ, ly tâm thu vi khuẩn ở 3000 vòng/phút, hoà vi khuẩn vào nước cất vô trùng. - Hạt giống cà chua được rửa bằng cồn 70% trong 1 phút, NaOCl 2% trong 5 phút, sau đó rửa lại nhiều lần với nước cất vô trùng, ủ hạt trên giấy thấm được làm ẩm bằng nước cất vô trùng đặt trong đóa petri, giữ ở nhiệt độ 27 0 C. - Lấy hạt cà chua đã nẩy mầm khoảng 0,5 – 2mm ngâm trong dòch huyền phù đã chuẩn bò ở trên, nồng độ 10 9 cfu/ml vi khuẩn đối kháng (khoảng 20 phút) đã chuẩn bò sẵn, sau đó làm khô hạt trên giấy thấm đem gieo khay xốp đã chuẩn bò sẵn đất (khay 60 lổ). - Khi cây cà chua được 15 ngày tuổi đem trồng vào chậu đất đã có chủng sẵn dung dòch vi khuẩn gây độc, với mật số vi khuẩn: 10 3 cfu/g đất, các cây cà chua được chia thành 4 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 30 cây, với 3 lần lặp lại. Tiến hành theo dõi trong vòng 20 ngày. Chỉ tiêu theo dõi: Chiều cao cây: đo từ hai lá mầm lên đến đầu ngọn lá, 5 ngày/lần. Số lá: đếm toàn bộ số lá trên cây, 5 ngày/lần. Các nghiệm thức: Luận văn tốt nghiệp SVTH: Hồ Thanh Hoàng Download» Agriviet.com 18 NT1 (T 1 ): không xử lý vi khuẩn gây bệnh và đối kháng. NT2 (T 2 ): chỉ xử lý vi khuẩn gây bệnh trong ly đất. NT3 (T 3 ): xử lý vi khuẩn đối kháng ở giai đoạn hạt nứt nanh và vi khuẩn gây bệnh trong ly đất. NT4 (T 4 ): xử lý vi khuẩn đối kháng ở giai đoạn hạt nứt nanh, trước khi trồng vào ly đất đã chủng sẵn vi khuẩn gây bệnh tiến hành nhúng cây cà chua vào dòch vi khuẩn đối kháng đã chuẩn bò sẵn với mật số 10 9 cfu/ml, (khoảng 20 phút). 3.2.4 Phương pháp đánh giá tính độc của vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên cây cà chua trong điều kiện nhà lưới Các phương pháp đánh giá giống như mục 3.2.3 nhưng chủng vi khuẩn gây độc với mật số vi khuẩn: 10 10 cfu/g đất, tiến hành theo dõi trong 12 ngày sau trồng. Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ chết của cây cà chua (%) 3.2.5 Phương pháp đánh giá khả năng phòng trừ của dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens với dòng vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên cây cà chua ngoài đồng ruộng. Thí nghiệm được tiến hành ngoài đồng ruộng tại công ty Hai Mũi Tên Đỏ. Vật liệu nghiên cứu: - Nguồn VKĐK mạnh nhất được chọn lọc trong phòng thí nghiệm. - Hạt cà chua với tỉ lệ nẩy mầm 90%. - Đất được lên luống, phủ bạt và đục lổ đã chuẩn bò trước. - Khay xốp (60 lổ). Phương pháp tiến hành: Khi cây được 15 ngày tuổi đem trồng ngoài đồng ruộng, các cây cà chua được chia thành 2 nghiệm thức, sau trồng 3 ngày tưới dòch VKĐK. Tiến hành theo dõi trong 20 ngày sau trồng. . 5 dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens 3 .2. 3 Phương pháp đánh giá khả năng phòng trừ của dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens với dòng vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên cây cà chua. nhiễm: hạt giống cà chua (1 628 ) 3 .2. 2 Phương pháp đánh giá khả năng đối kháng của các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens với các dòng vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên đóa petri trong phòng. nước: Lê Lương Tề, 20 02 nghiên cứu phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn cà chua có hiệu quả kinh tế cao bằng biện pháp sử dụng rộng rãi các giống cà chua kháng bệnh, có năng suất cao CLN-1462A