- 28 - Bảng 4.1 Kết quả đo chiều cây cao cà chua sau 5 ngày trồng Hàng Chiều cao (cm) cây qua các lần lập lại (LLL) LLL1 LLL2 LLL3 LLL4 LLL5 LLL6 LLL7 LLL8 TB H1 3,5 3 3,5 3,2 3,2 3 3 3,5 3,24 H2 2,5 3 3 3,5 2,5 2,5 2,5 3 2,81 H3 2,5 2,5 3,5 3,2 3 3,5 3 3,2 3,05 H4 3,5 3 2,5 2,5 3 3,5 3,2 3 3,02 H5 2,5 3 3 3,5 3,2 3,5 3 3,2 3,11 H6 3,5 3,5 3 2,5 3,2 3 3,5 3,2 3,17 H7 3 3 2,5 3,5 3,2 3,2 3 3,5 3,11 H8 2,5 3 3 3,5 3,2 3,5 3 3,5 3,15 H9 3, 2,5 3 3 3,5 3,5 3,2 3 3,46 H10 2,5 3,5 3 3 3,5 2,5 3 3 3 Bảng 4.2 Kết quả đo chiều cây cao cà chua sau 10 ngày trồng Hàng Chiều cao (cm) cây qua các lần lập lại (LLL) LLL1 LLL2 LLL3 LLL4 LLL5 LLL6 LLL7 LLL8 TB H1 5,5 5 5,5 5,5 5 5 5 5,5 5,25 H2 5 5 5 5,5 4,5 4,5 5 5 4,94 H3 4,5 5,5 5,5 5 5 6 5 5 5,25 H4 5,5 5 4,5 5 4,5 4 5 5 4,88 H5 4 5 5 5,5 5,5 5,5 4,5 5,5 5,06 H6 5,5 5,5 5,5 5,5 5 5,5 5 5 5,39 H7 5 5 4,5 5 5 5 5 5 4,94 H8 4,5 5,5 4,5 5 4 5,5 5 4,5 4,81 H9 4 5 5 4,5 4,5 5,5 5 4,5 4,69 H10 5 4,5 4 5 5 4,5 5 4,5 4,69 - 29 - Bảng 4.3 Kết quả đo chiều cây cao cà chua sau 15 ngày trồng Hàng Chiều cao (cm) cây qua các lần lập lại (LLL) LLL1 LLL2 LLL3 LLL4 LLL5 LLL6 LLL7 LLL8 TB H1 9 8 9,5 10 8 9 9 9,5 9 H2 9 8,5 9,5 8,5 8,5 8,5 9 9 8,82 H3 8 9,5 10 10 8 10 8,5 9,5 9,31 H4 8,5 7,5 7,5 9 8 9 8 9,5 8,37 H5 8 8 8 8 9 9,5 8 10 8,31 H6 10 9 9 9,5 9 9 9 8,5 8,125 H7 8,5 8 7,5 8 8 9 8,5 8,5 8,25 H8 8 9 8,5 9 8,5 9 8 8 8,5 H9 7,5 8,5 8,5 8 7,5 8 9 8 8,12 H10 8 8 8 9 9,5 8 8,5 8,5 8,18 Bảng 4.4 Kết quả đo chiều cây cao cà chua sau 20 ngày trồng Hàng Chiều cao (cm) cây qua các lần lập lại (LLL) LLL1 LLL2 LLL3 LLL4 LLL5 LLL6 LLL7 LLL8 TB H1 16 16 18 18,5 15 15 17 17 17,56 H2 17 17 18 17 18 16 16,5 18 17,06 H3 16 19 19 18,5 15,5 19 16 18 17,62 H4 17 15 16 18 17 18,5 18 19 17,31 H5 17 16,5 15 16 16,5 18 18 20 17,65 H6 19,5 18 16 17 17 17 17,5 17 17,37 H7 16,5 18 17 18 17 19 18 17 17,56 H8 17 18 18 17,5 18 17 18 17,5 17,62 H9 15 16 18 17,5 15,5 16 18 16,5 17,81 H10 16,5 16 18 18 19 18,5 18 18 17,75 - 30 - Bảng 4.5 Kết quả đo chiều cây cao cà chua sau 25 ngày trồng Hàng Chiều cao (cm) cây qua các lần lập lại (LLL) LLL1 LLL2 LLL3 LLL4 LLL5 LLL6 LLL7 LLL8 TB H1 25 26,5 27 27 24 25 26 26 25,81 H2 27 27 27 26,5 27 25 26 27,5 26,37 H3 26,5 28 27,5 28 24 29 25 27 26,78 H4 26,5 26 25 27 27 28 27 28 26,81 H5 28 28 24 24,5 25 27 27 29 26,56 H6 28,5 27 25 26 26 26,5 26 26 27 H7 26 27,5 25,5 26,5 26 28 27,5 26 26,65 H8 26,5 27 27 26 27 26 27 26 26,31 H9 25 26 27 26,5 24 26 27 25 25,81 H10 27 26 27,5 27 28,5 27 27 27 27 Bảng 4.6 Kết quả đo chiều cây cao cà chua sau 30 ngày trồng Hàng Chiều cao (cm) cây qua các lần lập lại (LLL) LLL1 LLL2 LLL3 LLL4 LLL5 LLL6 LLL7 LLL8 TB H1 37 38 39 39 34 34 37 38 37 H2 39,5 39 40 39 39,5 36 36 40 38,62 H3 38 40 39 40 35 42 36,5 39 38,68 H4 39 39 37 40 35 42 39,5 41 39,06 H5 40,5 40 34 35 36 39 39,5 42 38,25 H6 41 40 36,5 37 37 39 38,5 42 38,87 H7 39 40 36 38 37 38 40 39 38,4 H8 39 40 40 39 40 39,5 40 39 39,56 H9 35 37 39 38 35 37 39 36 36,75 H10 39 38,5 40 40 42 39 39 41 39,81 - 31 - Như vậy, qua quá trình chọn lọc các môi trường dinh dưỡng để trồng cây cà chua trong hệ thống thuỷ canh, chúng tôi đã chọn được môi trường C (có thành phần nêu ở bảng 3.5 và bảng 3.6 ). Kết quả ghi nhận cụ thể ngoài nhà lưới cho thấy cây phát triển đồng đều, mạnh khoẻ không có dấu hiệu thiếu dinh dưỡng. Tuy nhiên trong quá trình trồng cà chua trong dung dòch cần chú ý một số điểm sau: + Dung dòch pha phải hoà tan hoàn toàn. + Hạt cà chua khi nẩy mầm, được đặt cẩn thận vào miếng mút, tránh hiện tượng dung dòch dinh dưỡng ngập mầm cà chua. + Khi cây bắt đầu phát triển mạnh cần chú ý điều kiện nhiệt độ, ánh sáng, kiểm tra và thêm dung dòch dinh dưỡng thường xuyên. Hình 4.1 Cà chua trồng trong dung dòch dinh dưỡng C sau 20 ngày. Hình 4.2 Cà chua trồng trong dung dòch dinh dưỡng C sau 30 ngày, sự phát triển của rễ tốt và không có triệu chứng bệnh. a b - 32 - Hình 4.1 và Hình 4.2 cho thấy cây cà chua trong hệ thống thuỷ canh với môi trường dinh dưỡng là dung dòch C và Kết quả đo chiều cao cây cho thấy cây cà chua phát triển tốt trên môi trường này, sự hình thành rễ là bình thường, không có dấu hiệu bò bệnh. Nội Dung B: đánh giá tính kháng của cây cà chua trồng trong dung dòch đối với R. solanacearum. 4.2 Kết quả phân lập, tồn trữ mẫu Theo phương pháp phân lập và tồn trữ mẫu được trình bày ở mục 3.4.2.1 và 3.4.2.2, chúng tôi đã tiến hành phân lập và chọn lọc được 4 dòng trên cây cà chua ở đòa bàn huyện Củ Chi thành phố Hồ Chí Minh. Mẫu sau khi phân lập được trữ trong môi trường LB lỏng có bổ sung glycerol 70% theo tỉ lệ thể tích là 850 l dòch nuôi cấy: 150 l glycerol và trữ ở -80 o C. 4.3 Kết quả chọn lọc trên môi trường TZC phương pháp xác đònh vi khuẩn R. solanacearum dựa vào các phản ứng sinh hoá thường đơn giản, ít tốn kém. Môi trường thường được sử dụng để phân tích là môi trường TTC và môi trường TZC (Shurfleff, 1997). Trong thí nghiệm này sử dụng môi trường TZC, kết quả ghi nhận trong bảng 4.7. Bảng 4.7 Kết quả chọn lọc vi khuẩn trên môi trường TZC Tên vi khuẩn Kết quả chọn lọc RST001 RST003 RST006 RSBog1 RSCc1 RSCc2 RSCc3 + + + - - + - - 33 - Kết quả có 4 dòng RST001, RST003, RST006, RSCc2. là các dòng độc và các dòng RSBog1, RSCc1, RSCc3. là các dòng không độc. Trên môi trường TZC có thể xác đònh được cả dòng vi khuẩn R. solanacearum độc và không độc. Các dòng vi khuẩn R. solanacearum độc thường cho khuẩn lạc có rìa ngoài màu trắng kem, ở giữa màu hồng còn các dòng vi khuẩn R. solanacearum không độc thì khuẩn lạc chỉ có màu hồng, khuẩn lạc thường mọc sau 3 – 5 ngày nuôi cấy. Hình 4.3 Vi khuẩn R.solanacearum mọc trên môi trường TZC sau 4 ngày nuôi cấy ở 27 o C (a) Khuẩn lạc R.solanacearum dòng không độc trên môi trường TZC. (b) Khuẩn lạc R.solanacearum dòng độc trên môi trường TZC. Ghi chú (+) cho khuẩn lạc ở rìa ngoài có màu trắng ở giữa màu hồng (dòng độc) (-) cho khuẩn lạc chỉ có màu hồng đậm (dòng không độc). 4.4 Kết quả kiểm tra bằng phương pháp PCR cặp primer PS-IS-F/PS-IS-R được thiềt kế dựa trên chuỗi nucleotide IS1405 đặt hiệu với vi khuẩn R. solanacearum thuộc race 1. Khuẩn lạc không độc Khuẩn lạc độc a b - 34 - Bảng 4.8 Kết quả xác đònh R. solonacearum bằng phương pháp PCR. Dòng vi khuẩn Kết quả chạy PCR RST001 RST003 RST006 RSBog1 CCCC2 + + + - + Ghi chú: (+) phản ứng PCR dương tính (-) phản ứng PCR âm tính Kết quả phản ứng PCR với cặp primers PI-IS-F/PI-IS-R của các dòng RST001, RST003, RST006, RSBog1, CCCC2 Hình 4.4 Kết quả kiểm tra bằng phương pháp PCR Theo Martin và french (1997), vi khuẩn R. solanacearum gây hại trên cà chua, khoai tây, ớt, cà tím, thuốc lá, cà pháo, chủ yếu thuộc race 1. từ kết quả này chúng ta có thể lấy các dòng vi khuẩn R. solanacearum có phản ứng PCR dương tính, được xem như là các dòng R. solanacearum độc, và các dòng có phản ứng 1 2 3 4 5 6 (1) Ladder 100bp, (2) RST001, (3) RST003, (4) RST006, (5) RSBog1, (6) CCCC2, mỗi mẫu điện di 5 l sản phẩm, điện di ở 50V, 250mA, trong 60 phút. - 35 - PCR âm tính, là các dòng R. solanacearum không độc. Dùng xác dònh tính kháng bệnh héo xanh của cây cà chua. 4.5 Đánh giá tính kháng của cây cà chua đối với R.solonacearum. Sau khi chủng bệnh và tiến hành theo dõi biểu hiện triệu chứng bệnh, chúng tôi ghi nhân chưa có triệu chứng héo xanh xuất hiện sau khi chủng 14 ngày. Theo Toyoda và ctv (2001) các dòng cà chua thương mại khi trồng trong hệ thống thủy canh thường xuất hiện héo xanh trong khoảng 5 -9 ngày sau khi chũng vi khuẩn Ralstonia solanacearum. Theo Phạm Đăng Minh (2003) thì 57 dòng vi khuẩn R .solonacearum. gây chết héo xanh trên cây ký chủ cà chua điều cho phản ứng dương tính khi chạy PCR với cặp primers PI-IS-F/PI-IS-R. Như vậy triệu chứng héo xanh chưa xuất hiện sau 14 ngày chủng trong thí nghiệm của chúng tôi, có thể là do chưa tìm được mật số chủng ban đầu thích hợp, hoặc các dòng vi khuẩn đem chủng có tính độc thấp. 3.6 Xác đònh mật số vi khuẩn R. solanacearum trong hệ thống thuỷ canh Qua thí nghiệm đánh giá tính kháng, để biết được các dòng vi khuẩn được chủng có khả năng sinh trưởng và phát triển trong hệ thống thủy canh hay không, chúng tôi đã tiến hành đếm mật số vi khuẩn R. solanacearum sau khi chủng và kết quả thu được như sau. Bảng 3.12 mật số vi khuẩn có trong 1ml dung dòch dinh dưỡng Dòng vi khuẩn Khi chủng (cfu/ml) 2NST 3NST 4NST RST001 RSCc2 RSBog1 Đối chứng 2,75x10 8 2,25x10 8 2,55x10 8 0,00 1,215x10 11 0,165x10 11 0,98x10 11 0,00 1,63x10 14 0,65x10 14 0,965x10 14 0,00 0,765x10 16 0,415x10 16 0,55x10 16 0,00 - 36 - Như vậy tất cả các dòng vi khuẩn đem chủng bệnh đều có khả năng sinh trưởng và phát triển trong dung dòch dinh dưỡng thuỷ canh. vì vậy có thể sử dụng hệ thống và dung dòch này để đánh giá tính kháng bệnh héo xanh của cây cà chua. . xác dònh tính kháng bệnh héo xanh của cây cà chua. 4. 5 Đánh giá tính kháng của cây cà chua đối với R.solonacearum. Sau khi chủng bệnh và tiến hành theo dõi biểu hiện triệu chứng bệnh, chúng. H7 5 5 4, 5 5 5 5 5 5 4, 94 H8 4, 5 5,5 4, 5 5 4 5,5 5 4, 5 4, 81 H9 4 5 5 4, 5 4, 5 5,5 5 4, 5 4, 69 H10 5 4, 5 4 5 5 4, 5 5 4, 5 4, 69 - 29 - Bảng 4. 3 Kết quả. có dấu hiệu bò bệnh. Nội Dung B: đánh giá tính kháng của cây cà chua trồng trong dung dòch đối với R. solanacearum. 4. 2 Kết quả phân lập, tồn trữ mẫu Theo phương pháp phân lập và tồn trữ