Luận văn : BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA QUẦN THỂ ĐIỀU (Anacardium occidental L.) TẠI TỈNH BÀ RỊA – VŨNG TÀU BẰNG KỸ THUẬT RAPD VÀ AFLP part 3 ppsx

19 Một ưu điểm khác của PCR trong chẩn đoán bệnh nhiễm khuẩn là PCR không những có thể phát hiện được tác nhân vi sinh vật gây bệnh trực tiếp trong bệnh phẩm mà còn có thể phân loại kiểu di truyền của các vi sinh vật này, không cần phải nuôi cấy được vi khuẩn. Ðây là một đóng góp rất lớn trong nghiên cứu dịch tễ học tìm hiểu mối liên quan của các tác nhân gây bệnh trong cộng đồng. Ngoài ra, PCR còn có thể phát hiện vi khuẩn kháng kháng sinh, ví dụ phát hiện M. tuberculosis kháng rifampicin, một chìa khóa chủ yếu để bác sĩ điều trị có thể sử dụng phát đồ điều trị đúng cho bệnh nhân ( www.ykhoa.net). 2.11.6. PCR với tiến hóa và khảo cổ học Từ năm 1963, các nhà nghiên cứu đã bắt đầu nghiên cứu về tiến hóa dựa trên cấu trúc phân tử của protein (cytochrome c, hemoglobin, ribonuclease). Sau đó, bắt đầu nghiên cứu tập trung vào trình tự chuỗi 16S RNA của ribosome trên vi khuẩn hay bộ gene của ty thể và lục lạp của thực vật. Ngày nay, PCR đã góp phần làm công việc nghiên cứu về tiến hóa phân tử học trở nên dễ dàng và nhanh chóng hơn. Người ta có thể so sánh các loài với nhau bằng cách dùng các mồi đặc hiệu cho những vùng có tính ổn định cao trong bộ gen, nhờ đó khuếch đại các vùng biến đổi, rồi so sánh với nhau. Ưu điểm vượt trội nhất của PCR trong lĩnh vực này là chỉ cần một số lượng rất nhỏ mẫu vật là đủ để có thể tiến hành phân tích. Trong lĩnh vực khảo cổ học, nhờ DNA là một loại phân tử khá bền vững, có những mảnh DNA có thể tồn tại nguyên vẹn trong thời gian khá dài. Có rất nhiều trường hợp những mảnh DNA cổ đại đã được PCR khuếch đại thành công: người ta có thể khuếch đại DNA ty thể từ một người Châu Mỹ sống cách đây 7000 năm hay từ các mảnh xương của cọp răng chồn sống cách đây 14.000 năm ( www.ykhoa.net). 2.11.7. PCR với phát hiện các khiếm khuyết gene Khiếm khuyết gene gây các bệnh di truyền hay ung thư là do bị đột biến đoạn hay đột biến điểm. Phát hiện các đột biến bằng phương pháp PCR, khi đoạn DNA đặc hiệu đuợc khuếch đại lên có kích thước khác bình thường (do thêm hay mất đoạn). Với các trường hợp đột biến điểm, PCR hiện nay đã chiếm độc quyền trong lãnh vực này vì khả năng thực hiện các thí nghiệm tương đối đơn giản và ít tốn thời gian so với các thử 20 nghiệm sinh học phân tử không dùng PCR. Dùng PCR với các cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại các đoạn DNA có chứa đột biến điểm rồi phân tích bằng các kỹ thuật sinh học phân tử khác; hay dùng cặp primer chỉ khuếch đại đuợc đoạn DNA có đột biến điểm mà không khuếch đại đoạn gene bình thường ( www.ykhoa.net). 2.11.8. PCR và việc định loại các mô Các mô được định loại (type) khác nhau dựa vào sự khác nhau về các kháng nguyên của phức hợp phù hợp tổ chức chính (MHC), ở người gọi là kháng nguyên HLA. Ðịnh type các mô là một việc hết sức cần thiết trong ngân hàng dữ liệu mô ghép và trước khi thực hiện phẫu thuật ghép mô hay cơ quan. Hiện nay, định type các mô được dựa vào các phương pháp miễn dịch học. Tuy nhiên, PCR cũng là một triển vọng đầy hứa hẹn trong lĩnh vực này, vì định type các mô dựa vào PCR cho được nhiều thông tin hơn là các phương pháp miễn dịch học ( www.ykhoa.net). 2.11.9. PCR và việc xác định các dấu ấn di truyền Dấu ấn di truyền được nói ở đây là những dấu ấn giúp phân biệt các cá thể trong cùng loài, xem có liên hệ với nhau hay không. Các dấu ấn này hoàn toàn không có ý nghĩa gì trong việc biểu hiện kiểu hình thông qua tổng hợp protein. Trước đây, để phát hiện các dấu ấn di truyền phải ly trích được bộ gene từ một khối lượng khá nhiều tế bào của cá thể cần khảo sát (mô, máu, ) sau đó cắt đoạn bộ gene này bằng các restriction enzyme, điện di trên thạch, làm Southern blotting, rồi dùng các đoạn dò đặc hiệu được đánh dấu để phát hiện. Kết quả là mỗi cá thể sẽ có một hình ảnh đặc trưng bằng các vạch được đánh dấu bằng các đoạn dò khi lai ghép trên Southern blotting. Người ta gọi kỹ thuật này là kỹ thuật phân tích sự đa hình về chiều dài của các mảnh DNA bị cắt đoạn, RFLP (Restriction Fragment Lengh Polymorphism). Với PCR, công việc trở nên đơn giản hơn rất nhiều. Có hai kiểu PCR phát hiện dấu ấn di truyền hiện đang được dùng. Kiểu thứ nhất là dùng PCR với các đoạn mồi nằm trước và sau các microsatellite, là các cấu trúc CACACA lặp đi lặp lại khoảng 100000 lần trong bộ gene của động vật có vú và khuếch đại các microsatellite này. Vì các cá thể khác nhau có sự khác nhau về số lượng các cấu trúc CA tạo thành các 21 microsatellite nên sau khi khuếch đại bằng PCR và phân tích các vạch trên thạch điện di, sẽ thấy các kiểu mẫu vạch khác nhau tùy từng cá thể được phân tích. Kiểu thứ hai gọi là phương pháp khuếch đại ngẫu nhiên các DNA đa hình (Random Amplified polymorphic DNA - RAPD) là dùng các đoạn mồi ngẫu nhiên, thường ngắn khoảng 10 nucleotide, cho bắt cặp với nucleic acid đích trong điều kiện bắt cặp không chặt chẽ, ở nhiệt độ khoảng 30 – 40 o C chẳng hạn. Nhờ vậy khi thực hiện PCR, sẽ có sản phẩm PCR là những đoạn DNA dài ngắn khác nhau do các đoạn mồi bắt cặp ngẫu nhiên trên DNA đích (ngẫu nhiên nhưng là tất nhiên, vì đoạn mồi sẽ bắt cặp trên chuỗi đích nào tương đối bổ sung nhất với nó) và các kích thước của những đoạn này sẽ được phát hiện trên thạch điện di. Sự giống và khác nhau về hình ảnh trên thạch điện di sẽ cho biết các cá thể đuợc phân tích có giống hay khác nhau, hay có liên hệ với nhau như thế nào. Kỹ thuật PCR phát hiện dấu ấn di truyền đã có những đóng góp rất lớn trong khoa học hình sự. Chỉ cần tội phạm để lại trên hiện trường rất ít mẫu vật: một vài giọt máu khô, vết tinh dịch, vài sợi lông hay tóc, hay thậm chí mẫu tàn thuốc có dính lại vài tế bào niêm mạc miệng, là có thể truy tìm được dấu ấn di truyền và phát hiện được ngay đúng tội phạm mà không thể nào chối cãi được. (www.ykhoa.net) 2.11.10. PCR và kỹ thuật phát hiện trình tự chuỗi của một đoạn DNA (DNA sequencing) Trước đây, để làm DNA sequencing, người ta phải dùng kỹ thuật Maxam và Gilbert, kỹ thuật này tương đối phức tạp. Hiện nay làm DNA sequencing bằng kỹ thuật PCR đơn giản hơn nhiều, kỹ thuật này được gọi là kỹ thuật Sanger. Được rất được nhiều phòng thí nghiệm sinh học phân tử hiện nay sử dụng. Giá trị sử dụng Phương pháp PCR có ý nghĩa lớn vì nhiều lí do : Thời gian thực hiện cực nhanh : Chỉ cần mất 3 giờ để khuếch đại một trình tự DNA được quan tâm, so với phương pháp tạo dòng của kĩ thuật tái tổ hợp DNA phải mất cả tuần hoặc lâu hơn. Đơn giản và ít tốn kém: Nó được thực hiện trong ống nghiệm plastic nhỏ gồm các thành phần tối thiểu được sử dụng đồng thời. Trong khi đó, phương pháp tạo dòng 22 điển hình cần các vật liệu đắt tiền như màng, nucleotide triphosphate mang dấu phóng xạ và việc thực hiện cần thao tác khéo léo đặc biệt. Độ tinh sạch của mẫu không cần cao: PCR có thể thực hiện với các mẫu nucleotide thô. Ví dụ mẫu máu hay dấu vết trong phân tích pháp y. Điều này ngược với kĩ thuật tái tổ hợp DNA, đoạn gen hoặc vector đều cần tương đối tinh khiết. Nhờ ưu thế trên, PCR đã hấp dẫn các nhà nghiên cứu ngay từ lúc ra đời trong việc khuếch đại các trình tự nucleotide đặc hiệu và chẩn đoán phân tử. Giới hạn duy nhất đối với phương pháp này là phải biết trình tự nucleotide (hoặc ít nhất một phần) của đoạn DNA cần khuếch đại. Nó không thay thế kĩ thuật tái tổ hợp DNA mà góp phần đáng kể bổ sung kĩ thuật này. Như vậy, từ khi ra đời đến nay, PCR đã có vai trò cách mạng hóa trong nghiên cứu cấu trúc và chức năng gene. Nó được hoàn thiện không ngừng và có nhiều ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như xác định trình tự nucleotide của gene, gây đột biến điểm định hướng,…Có thể thực hiện PCR in situ (ngay trong tế bào) với cả DNA, RNA. Nó được sử dụng trong pháp y để phân tích di truyền vệt máu khô, chẩn đoán các bệnh di truyền và lây nhiễm, dự báo các sai hỏng di truyền. PCR có thể dùng để nghiên cứu DNA cổ xưa từ mẫu khảo cổ. PCR kết hợp với các kĩ thuật khác của tạo dòng phân tử giúp sinh học xâm nhập vào nhiều lĩnh vực mà trước đây khó với tới (www.ykhoa.net). 2.12. Thành phần hóa học của DNA Deoxyribonucleic acid là một hợp chất polymer cấu tạo bởi các đơn phân nucleotide. Nó được tạo nên do sự nối liền nhiều đơn phân cùng kiểu là các nucleotide. Kết quả phân tích hóa học DNA của những sinh vật khác nhau cho thấy sự giống nhau đặc biệt giữa các đơn chất hợp thành DNA. Thành phần hóa học của DNA gồm có gốc acid phosphoric, đường 5-desoxyribose và các base nitrogenous. base nitrogenuos ở DNA gồm có hai purine là adenine (A) và guanine (G) và hai pyrimidine là cytosine (C) và thymine (T); ở RNA còn có uracil (U) thay cho thymine (T). Đường pentose (5C) desoxyribose gắn với nitrogenous base ở vị trí C 1 sẽ tạo nên nucleoside. Nucleoside được gắn thêm nhóm phosphate vào C 5 của đường pentose thành 23 nucleotide. Tính đặc hiệu của nucleotide do base, nên khi nói đến acid nucleic, base thường được sử dụng thay cho nucleotide. Cách gọi thường dùng là cặp base, kí hiệu bp hay kb (Phạm Thành Hổ, 2000, trang 140 - 141). Hình 2.11 Cấu tạo hóa học của acid nucleic 24 Phần 3. Vật liệu và cách thức tiến hành 3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành  Quá trình chế tạo bắt đầu từ 3 / 2005 đến 8 / 2005.  Tiến hành chế tạo tại Trường Đại Học Nông Lâm TP. HCM.  Quá trình chế tạo tại Bộ môn Điều Khiển Tự Động trực thuộc khoa Cơ Khí.  Chạy mẫu kiểm tra và so sánh kết quả tại Trung Tâm Phân Tích Hóa Sinh. 3.2. Vật liệu 3.2.1. Linh kiện cho bộ khuếch đại tín hiệu từ cảm biến  Nhiệt điện trở Platine Pt100 (sản xuất tại Đức)  Sensor cảm ứng nhiệt Lm35 (sản xuất tại Đài Loan)  Tụ 1000 µF , 100 µF ,10 µF, 1 µF, 104 pF (sản xuất tại Đài Loan)  Điện trở sai số 1% không thay đổi theo nhiệt độ (sản xuất tại Singapore)  Biến trở vi chỉnh (sản xuất tại Đài Loan)  Điốt cầu 3A (sản xuất tại Trung Quốc)  Op07 (sản xuất tại Đài Loan)  Ổn áp 7805, 7905 (sản xuất tại Đài Loan) 3.2.2. Linh kiện cho mạch vi xử lý  Tụ 1000 µF,100 µF (sản xuất tại Đài Loan)  Tụ 33 pF,1000 µF, 100 µF (sản xuất tại Đài Loan)  Điốt cầu 3A  Vi xử lý AT90S8535 (sản xuất tại Đài Loan)  Thạch anh 4M  LM358 (sản xuất tại Đài Loan)  LCD 20 x 4 (Sản xuất tại Trung Quốc)  Ổn áp 7805  Phím 4x4  Optodiac P521 (sản xuất tại Đài Loan) 25 3.2.3. Linh kiện cho mạch khuyếch đại công suất  Điôt 10A, N4007 (sản xuất tại Nga và Trung Quốc)  Tụ : 2200 µF, 10000 µF  IRF 2807 (sản xuất tại Đài Loan)  Điện trở 1 MΩ 3.2.4. Linh kiện và thiết bị cho bộ nguồn  Biến áp các nguồn ra 9V(3A), 9-0-9(3A), 24V(15A) (sản xuất tại Việt Nam)  Điôt cầu 50A (sản xuất tại Đài Loan)  Tụ 10000µF,4700 µF  Ổn áp 7805, 7809, 7812, 7818, 7824  Transitor C3998 (sản xuất tại Đài Loan) 3.2.5. Linh kiện cho bộ luân nhiệt và nắp chống ngưng  TE 7000/127/085BS (sản xuất tại Singapore)  Dây điện trở cung cấp nhiệt  Nhôm tản nhiệt 10 x 21 x 3 mm  Quạt 10 cm x10 cm, DC 12V, 0,6A (sản xuất tại Nhật)  Mỡ Silicon  Keo chịu nhiệt (sản xuất tại Mỹ)  Fip 5 mm  Cao su silicon  Dây dẫn chịu nhiệt (sản xuất tại Nhật)  Giấy cách điện dẫn nhiệt 3.2.6. Vật liệu làm khung và vỏ máy  Inox 5 dem  Sắt V 2  Giấy cách điện  Thép chống từ  Máy bào kim loại 26  Máy khoan kim loại  Máy hàn  Máy cắt  Que hàn 5 mm  Máy đánh bóng 3.2.7. Hoá chất chạy PCR và dụng cụ điện di  DNA khuôn mẫu  dNTP  Taq polymerase  Primer  Dung dịch đệm thích hợp và MgCl 2 3.3. Cách thức tiến hành 3.3.1. Thiết kế 3.3.1.1. Thiết kế khung và vỏ máy a. Bộ phận bên ngoài của máy Nắp chống ngưng tụ hơi nước được bố trí bên trên tiện sử dụng, phía trên nắp được thiết kế thêm nút điều khiển dễ sử dụng và chế tạo. Nút điều khiển điều khiển vị trí chống ngưng tụ hơi nước có hai chế độ: điều chỉnh theo ý muốn và điều chỉnh tự động nhờ lực đàn hồi của lò xo. Khóa cố định giữ nắp chống ngưng áp sát vào ống eppendorff trong suốt quá trình chạy mẫu. Khoá được thiết kế đơn giản và dễ chế tạo. Bàn phím nhập số liệu và LCD thiết kế nghiêng góc 48 0 so với đáy, thuận tiện cho thao tác và quan sát hiển thị trên LCD. b. Bộ phận bên trong Gồm biến áp, bộ khuếch đại, nhôm tản nhiệt, mạch vi xử lý, bộ chỉnh lưu điện xoay chiều thành điện một chiều. Biến áp và bộ khuếch đại được bố trí xa với mạch điều khiển nhằm hạn chế nhiễu. 27 Hình 3.1 Vỏ máy . (sản xuất tại Đài Loan)  Tụ 33 pF,1000 µF, 100 µF (sản xuất tại Đài Loan)  Điốt cầu 3A  Vi xử l AT90S8 535 (sản xuất tại Đài Loan)  Thạch anh 4M  LM358 (sản xuất tại Đài Loan)  LCD 20. l m DNA sequencing, người ta phải dùng kỹ thuật Maxam và Gilbert, kỹ thuật này tương đối phức tạp. Hiện nay l m DNA sequencing bằng kỹ thuật PCR đơn giản hơn nhiều, kỹ thuật này được gọi l . (sản xuất tại Đài Loan)  Điốt cầu 3A (sản xuất tại Trung Quốc)  Op07 (sản xuất tại Đài Loan)  Ổn áp 7805, 7905 (sản xuất tại Đài Loan) 3. 2.2. Linh kiện cho mạch vi xử l  Tụ 1000 µF,100