Luận văn : NGHIÊN CỨU TẠO CÂY DỨA CAYENNE IN VITRO SẠCH VIRUS GÂY BỆNH HÉO ĐỎ ĐẦU LÁ (PMWaV- Pineapple mealybug wilt associated virus) part 1 pdf

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU TẠO CÂY DỨA CAYENNE IN VITRO SẠCH VIRUS GÂY BỆNH HÉO ĐỎ ĐẦU LÁ (PMWaV- Pineapple mealybug wilt associated virus) NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC NIÊN KHÓA: 2001 – 2005 SINH VIÊN THỰC HIỆN: TÔN BẢO LINH Thành phố Hồ Chí Minh 2005 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGHIÊN CỨU TẠO CÂY DỨA CAYENNE IN VITRO SẠCH VIRUS GÂY BỆNH HÉO ĐỎ ĐẦU LÁ (PMWaV- Pineapple mealybug wilt associated virus) GVHD: TS. TRẦN THỊ DUNG SVTH: TÔN BẢO LINH CN. LƢU PHÚC LỢI Thành phố Hồ Chí Minh 2005 iii LỜI CẢM ƠN Xin chân thành cảm ơn: - Ban Giám Hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập. - Các thầy cô trong Bộ môn Công Nghệ Sinh Học cùng các thầy cô đã trực tiếp giảng dạy trong suốt bốn năm qua. - TS. Trần Thị Dung và CN. Lƣu Phúc Lợi đã tận tình hƣớng dẫn và động viên trong thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp. - TS. Bùi Minh Trí và các anh chị phụ trách phòng CNSH thuộc Trung tâm phân tích thí nghiệm Đại học Nông Lâm Tp. HCM. - Thầy Trần Ngọc Hùng cùng các chị thuộc Trung tâm Công nghệ sinh học Đại học Nông Lâm Tp.HCM. - Trung tâm phân tích môi trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. HCM. - Hai bạn Nguyễn Phú Dũng, Lê Thái Bảo Ngọc, chị Trƣơng Bùi Nguyệt Hảo cùng toàn thể lớp CNSH27 thân yêu đã hỗ trợ, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian làm đề tài. Thành kính ghi ơn ba mẹ cùng những ngƣời thân trong gia đình luôn tạo điều kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập tại trƣờng. Tháng 08 năm 2005 Tôn Bảo Linh iv TÓM TẮT TÔN BẢO LINH, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 08/2005. “NGHIÊN CỨU TẠO CÂY DỨA CAYENNE IN VITRO SẠCH VIRUS GÂY BỆNH HÉO ĐỎ ĐẦU LÁ (PMWaV- Pineapple mealybug wilt associated virus)” Hội đồng hướng dẫn:  TS. Trần Thị Dung  CN. Lưu Phúc Lợi Đề tài được thực hiện tại Bộ môn Công nghệ sinh học và Trung tâm phân tích thí nghiệm Đại học Nông Lâm Tp. HCM trên đối tượng cây dứa Cayenne in vitro thuộc 3 giống Trung Quốc, Thái Lan và Lâm Đồng bắt nguồn từ chồi ban đầu nhiễm virus gây bệnh héo đỏ đầu lá (PMWaV). Tiến hành tạo chồi dứa Cayenne in vitro sạch PMWaV từ chồi in vitro bị nhiễm virus bằng phương pháp xử lí nhiệt kết hợp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (ĐST). Nguồn chồi tái sinh theo phương pháp tạo cây sạch virus sẽ được kiểm chứng bằng kĩ thuật RT-PCR với mồi đặc hiệu cho PMWaV. Trên cơ sở tạo chồi sạch virus, tiến hành nghiên cứu khả năng tái sinh của ĐST nuôi cấy với 12 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 3 lần lặp lại với các chỉ tiêu theo dõi như thời gian tái sinh, tỉ lệ tái sinh và hệ số nhân chồi; nghiên cứu sự sinh trưởng của chồi tái sinh từ ĐST với các chỉ tiêu theo dõi như chiều cao chồi, số lá, số rễ và chiều dài rễ. Bằng kĩ thuật RT – PCR, thực hiện kiểm tra PMWaV – 1 và PMWaV – 2 đối với 12 mẫu lá của chồi tái sinh từ ĐST sau 70 ngày nuôi cấy. Những kết quả thu được: 1. Khả năng tái sinh của ĐST: thời gian và tỉ lệ tái sinh chủ yếu do kích thước mẫu cấy quyết định. Mẫu cấy có kích thước từ 0,5 – 1 mm tái sinh trong vòng 14 – 15 ngày và tỉ lệ tái sinh vào khoảng 79,63%. 2. Sự sinh trưởng của chồi tái sinh từ ĐST: sự khác biệt có ý nghĩa của các chỉ tiêu theo dõi chủ yếu do giống quyết định, giống Cayenne Trung Quốc và Thái Lan sinh trưởng nhanh hơn so với giống Cayenne Lâm Đồng. Nhìn chung, quá trình xử lí nhiệt (37 0 C, 30 ngày) không ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của chồi tái sinh. v 3. Việc tạo cây sạch virus bằng phương pháp xử lí nhiệt kết hợp nuôi cấy ĐST hiệu quả hơn so với phương pháp đối chứng chỉ nuôi cấy ĐST. Với phương pháp kết hợp xử lí nhiệt và nuôi cấy ĐST, tỉ lệ cây sạch PMWaV -1 đạt 66,67% và PMWaV – 2 đạt 100%, trong khi chỉ nuôi cấy ĐST chồi tái sinh vẫn còn nhiễm PMWaV – 1. vi SUMMARY TON BAO LINH, Nong Lam University Ho Chi Minh City. August, 2005. “Study of producing in vitro free PMWaV (Pineapple mealybug wilt associated virus) Cayenne pineapple plants”. Two free – virus plant producing methods involving heat treatment followed by meristem culture and simply meristem culture were used to eliminate PMWaV-1 and PMWaV-2 from in vitro PMWaV infected pineapple plants. Three Smooth Cayenne cultivars originated from China, Thailand and Lam Dong were used as culturing materials. With the completely randomized design, factors that influenced on the regeneration and growth of propagated meristem tip, especially heat treatment at 37 0 C in 30 days was also studied. The experiment result showed that meristem regeneration was mainly influenced by the size of the excised tissue. Meanwhile, the growth of the regenerative shoots were influenced by cultivar factors. Heat treatment did not considerably influence on the regeneration and subsequent growth of propagated meristem. All samples (3/3) without heat treatment were still infected with PMWaV-1 and one third of samples (3/9) with heat treatment showed negative infection results with PMWaV-1. Finally, all samples (12/12) had negative results when tested for PMWaV-2 with RT-PCR. vii MỤC LỤC Trang tựa i Lời cảm ơn iii Tóm tắt iv Summary vi Mục lục vii Danh sách các bảng xi Danh sách các hình và sơ đồ xii Danh sách các chữ viết tắt xiii PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1 1.1.Cơ sở tiến hành và ý nghĩa của nghiên cứu 1 1.2. Mục tiêu nghiên cứu 2 1.3.Giới hạn của đề tài 2 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1.Nguồn gốc của cây dứa 3 2.2. Đặc điểm thực vật học và sinh thái cây dứa 3 2.2.1. Đặc điểm thực vật học 3 2.2.2.Sinh thái cây dứa 4 2.3.Phân loại 5 2.4.Các nhóm dứa chính và các giống dứa phổ biến ở Việt Nam 6 2.4.1.Các nhóm dứa chính 6 2.4.1.1. Nhóm Cayenne 6 2.4.1.2. Nhóm Queen 7 2.4.1.3. Nhóm Spanish 7 2.4.2. Các giống dứa phổ biến ở Việt Nam 7 viii 2.4.2.1. Dứa hoa Phú Thọ 7 2.4.2.2. Dứa hoa Na Hoa (Hoa Bali) 8 2.4.2.3. Dứa Kiên Giang và dứa Bến Lức (từ địa phƣơng là “khóm”) 8 2.4.2.4. Nhóm dứa Cayenne 8 2.5. Tình hình sản xuất và sản lƣợng dứa 9 2.5.1. Tình hình sản xuất và sản lƣợng dứa trên thế giới 9 2.5.2. Tình hình sản xuất và sản lƣợng dứa ở Việt Nam 9 2.5.2.1. Tình hình sản xuất 9 2.5.2.2. Sản lƣợng dứa 10 2.6. Tình hình sâu bệnh trên cây dứa 10 2.6.1. Các loại sâu hại dứa 10 2.6.2. Bệnh hại dứa và phòng trừ 11 2.6.2.1. Bệnh thối lõi và thối rễ 11 2.6.2.2. Bệnh thối mềm 11 2.6.2.3. Bệnh “luộc lá” 12 2.6.2.4. Tuyến trùng hại dứa 12 2.7.Bệnh héo do virus 13 2.8. Phƣơng pháp tạo cây sạch virus 14 2.8.1. Sơ lƣợc về hình thái, cấu tạo và sự di chuyển của virus thực vật 14 2.8.2. Cơ sở của các phƣơng pháp tạo cây sạch virus 15 2.8.3. Các phƣơng pháp tạo cây sạch virus 15 2.8.3.1. Xử lí nhiệt 16 2.8.3.2. Nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng 16 ix 2.8.3.3 Xử lí nhiệt kết hợp nuôi cấy ĐST 19 2.8.3.4 Tạo chồi bất định kết hợp nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng 20 2.8.3.5. Vi ghép 21 2.9. Các phƣơng pháp chẩn đoán bệnh cây do virus 21 2.9.1. Các phƣơng pháp kiểm tra dựa trên quá trình huyết thanh học 21 2.9.1.1. Cơ sở khoa học của kĩ thuật huyết thanh học 21 2.9.1.2. Phƣơng pháp ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) 21 2.9.1.3. Phƣơng pháp TBIA (Tissue blot immunoassay) 22 2.9.2. Phƣơng pháp hiển vi quang học và vi điện tử 22 2.9.2.1. Quan sát bằng kính hiển vi quang học 22 2.9.2.2. Quan sát bằng kính hiển vi điện tử 22 2.9.3. Phƣơng pháp chẩn đoán sinh học phân tử 23 2.9.3.1. Cơ sở khoa học của các phƣơng pháp chẩn đoán sinh học phân tử 23 2.9.3.2. Polymerase chain reaction (PCR) và Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) 23 2.9.3.3. Phƣơng pháp sử dụng các đoạn đa dạng về chiều dài hạn chế (Restriction fragment length polymorphism – RFLP) 23 2.9.3.4. Probe đánh dấu (Labelled probes) 24 2.10. Các nghiên cứu về bệnh héo đỏ đầu lá (bệnh wilt) 24 2.10.1. Các nghiên cứu ngoài nƣớc 24 2.10.2. Các nghiên cứu trong nƣớc 26 PHẦN 3. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 3.1. Nội dung 28 3.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 28 x 3.3. Nội dung 1: Tạo cây dứa Cayenne in vitro sạch virus bằng cách kết hợp xử lí nhiệt và nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng 28 3.3.1. Vật liệu 28 3.3.1.1 Mẫu nuôi cấy 28 3.3.1.2. Thiết bị và dụng cụ 28 3.3.1.3. Hóa chất 29 3.3.1.4. Phƣơng pháp tiến hành 29 3.3.1.5. Phƣơng pháp nghiên cứu 30 3.4. Nội dung 2: Kiểm tra PMWaV trên chồi dứa in vitro tái sinh từ đỉnh sinh trƣởng 32 3.4.1. Vật liệu 32 3.4.2. Phƣơng pháp tiến hành 32 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 4.1.Khảo sát khả năng tái sinh của ĐST nuôi cấy trên môi trƣờng MS 35 4.1.1Thời gian tái sinh 35 4.1.2. Tỷ lệ tái sinh 36 4.1.3. Hệ số nhân chồi 36 4.2.Khảo sát ảnh hƣởng của giống và quá trình xử lí nhiệt lên sự sinh trƣởng của cây tái sinh từ ĐST 38 4.2.1 Chiều cao chồi 38 4.2.2. Số lá 39 4.2.3. Số rễ 40 4.2.4 Chiều dài rễ 41 4.3. Kết quả kiểm tra PMWaV chồi tái sinh từ ĐST 43 4.3.1. Kết quả kiểm tra PMWaV-1 43 . Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 08/2005. “NGHIÊN CỨU TẠO CÂY DỨA CAYENNE IN VITRO SẠCH VIRUS GÂY BỆNH HÉO ĐỎ ĐẦU LÁ (PMWaV- Pineapple mealybug wilt associated virus) ” Hội đồng hướng dẫn:  TS. Trần. ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGHIÊN CỨU TẠO CÂY DỨA CAYENNE IN VITRO SẠCH VIRUS GÂY BỆNH HÉO ĐỎ ĐẦU LÁ (PMWaV- Pineapple. 2.6.2 .1. Bệnh thối lõi và thối rễ 11 2.6.2.2. Bệnh thối mềm 11 2.6.2.3. Bệnh “luộc lá 12 2.6.2.4. Tuyến trùng hại dứa 12 2.7 .Bệnh héo do virus 13 2.8. Phƣơng pháp tạo cây sạch virus 14 2.8 .1.