Giáo trình CÔNG NGHỆ TẾ BÀO - Nhà xuất bản Đại học Huế Phần 6 potx

được sử dụng trường hợp tế bào gan, người ta bắt đầu sử dụng tế bào thận phổi để mở rộng nghiên cứu Nhìn chung, triển vọng mơ hình tế bào động vật nuôi cấy lớn, đặc biệt với phát triển nhiều kỹ thuật đại cho phép đảm bảo khả sống chức ổn định cho tất loại tế bào nuôi cấy, khả phục hồi sửa chữa hư hỏng tế bào tự động hóa thao tác Tài liệu tham khảo/đọc thêm Pham Kim Ngọc Hồ Huỳnh Thùy Dương 2001 Sinh học sinh sản NXB Giáo dục, TP Hồ Chí Minh Bronzino JD 1995 The Biomedical Engineering Handbook CRC Press and IEEF Press, USA Fox SR, Patel UA, Yap MG and Wang DI 2004 Maximizing interferon-gamma production by Chinese hamster ovary cells through temperature shift optimization: experimental and modeling Biotechnol Bioeng 85(2):177-84 Lee JM 2001 Biochemical Engineering Prentice Hall, Inc USA Lindner-Olsson E, Chatzissavidou N and Lüllau E 2001 Animal Cell Technology: From Target to Market Proceedings of the 17th ESACT Meeting, Sweden Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherland Pollard JW and Walker JM 1997 Basic Cell Culture Protocols Humana Press Inc Totowa, New Jersey, USA Shuler ML and Kargi F 2002 Bioprocess Engineering-Basic Concepts nd ed Prentice Hall, Inc NJ, USA Wurm FM 2004 Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells Nature Biotech 22: 1393-1398 Công nghệ tế bào 99 Chương Nuôi cấy tế bào thực vật I Mở đầu Thực vật nguồn cung cấp hợp chất hóa học khác có giá trị, chẳng hạn chất dùng làm dược liệu, chất tạo mùi, chất dùng làm gia vị, sắc tố hóa chất dùng nơng nghiệp (Bảng 7.1) Những sản phẩm này, biết chất trao đổi thứ cấp (secondary metabolites), thường sản xuất với lượng nhỏ (dạng vết) thực vật khơng có chức trao đổi chất rõ ràng1 Chúng dường sản phẩm phản ứng hóa học thực vật với mơi trường chung quanh, thích nghi với stress mơi trường bảo vệ hóa học chống lại vi sinh vật động vật Mặc dù, hóa học tổng hợp hữu đạt nhiều thành tựu quan trọng nhiều hợp chất trao đổi thứ cấp (thường gọi chất thứ cấp) cịn khó tổng hợp tổng hợp chi phí đắt Chẳng hạn, số hỗn hợp phức tạp tinh dầu hoa hồng khơng thể tổng hợp hóa học Để sản xuất sản phẩm thứ cấp từ thực vật, mô thực vật ngoại sinh (chẳng hạn từ hồn chỉnh) sử dụng để ni cấy tế bào dịch huyền phù (cell suspension culture) điều kiện vô trùng Cơ sở khoa học kỹ thuật dựa tính tồn thể hóa sinh (biochemical totipotency) tế bào thực vật Nuôi cấy tế bào thực vật điều kiện in vitro để sản xuất chất thứ cấp có số ưu điểm sau: - Các tế bào thực vật nuôi cấy điều kiện nhân tạo mà không phụ thuộc vào thời tiết địa lý Không cần thiết để vận chuyển bảo quản số lượng lớn nguyên liệu thô Các chất sơ cấp sản xuất với số lượng lớn chất thứ cấp có chức trao đổi đặc biệt Các chất sơ cấp thu từ thực vật bậc cao sử dụng thực phẩm, phụ gia thực phẩm, nguyên liệu thô công nghiệp carbohydrate, dầu thực vật, protein acid béo Công nghệ tế bào 100 Bảng 7.1 Các sản phẩm tiềm thực vật quan tâm Chất màu Chất mùi Chất Miraculin, thaumatin Bạch đậu khấu, long não, hương thảo, nghệ, ngải đắng Tinh dầu Tỏi, hoa nhài, chanh, hành tây, bạc hà, hoắc hương, hoa hồng, vetiver Các alkaloid Ajmalacine, atropine, berberine, codein, hyoscyamine, morphine, scopolamine, vinblastine, vincristine, camptothecin, quinine, serpentine Các steroid Digitoxin, digoxin, diosgenin Các chất khác Dược liệu Chuối, mơ, táo, đào, nho, lê, dứa, mâm xôi, nho, măng tây, capsicum, cà chua, cần tây, vanilla, cocoa Gia vị Thực phẩm Anthocyanin, betacyanin, saffron Ginsengoside, shikonin, ubiquinone-10, rosmarinic acid, diosgenin, L-Dopa, saponin monellin, stevioside, Các protein tái Kháng thể đơn dòng, interleukin, tổ hợp GM-CSF, enzyme khác Nơng nghiệp Hóa chất Pyrethrin, rotenone, neriifolin, salannin, azadirachtin, hóa chất alleopathic - Có thể kiểm soát chất lượng hiệu suất sản phẩm cách loại bỏ trở ngại trình sản xuất thực vật, chất lượng nguyên liệu thô, đồng lô sản xuất hư hỏng trình vận chuyển bảo quản - Một số sản phẩm trao đổi chất sản xuất từ nuôi cấy dịch huyền phù có chất lượng cao hồn chỉnh Thách thức lớn công nghệ tế bào thực vật ổn định cho phép nuôi cấy tế bào thực vật quy mô lớn đạt hiệu suất tối đa Công nghệ tế bào 101 cho tích lũy sản xuất chất thứ cấp Điều thực cách chọn lọc kiểu gen thích hợp dịng tế bào có sản lượng cao, xây dựng công thức môi trường dinh dưỡng hợp lý để nuôi cấy tế bào, thiết kế vận hành hệ thống nuôi cấy tế bào (bioreactor) hiệu Chúng ta sử dụng kinh nghiệm kiến thức có từ ni cấy vi sinh vật để áp dụng cho nuôi cấy tế bào thực vật Tuy nhiên, tế bào thực vật vi sinh vật có số đặc điểm khác nhau, cần phải cải tiến điều chỉnh điều kiện ni cấy cấu hình nồi phản ứng (reactor) để tìm yêu cầu đặc thù nuôi cấy tế bào thực vật Một số đặc điểm khác tế bào thực vật vi sinh vật: - Tế bào thực vật lớn tế bào vi khuẩn vi nấm từ 10-100 lần - Sự trao đổi chất tế bào thực vật chậm địi hỏi phải trì điều kiện vơ trùng thời gian lâu - Tế bào thực vật có khuynh hướng kết thành khối gây lắng đọng, có khả hòa trộn - Các tế bào thực vật mẫn cảm dễ biến dạng tế bào vi sinh vật - Quá trình sản xuất chất thứ cấp tế bào thực vật phụ thuộc chế điều hòa phức tạp so với tế bào vi sinh vật - Các tế bào thực vật có độ ổn định di truyền thấp tế bào vi sinh vật II Tế bào thực vật Hình ảnh tế bào thực vật minh họa hình 7.1 Một tế bào đơn thực vật thường có đường kính khoảng từ 20-40 µm dài 100-200 µm Cấu trúc tế bào thực vật tương tự tế bào đặc trưng eukaryote Tuy nhiên, tế bào thực vật có số đặc điểm riêng biệt thành tế bào dày, khơng bào lớn có lục lạp Tế bào thực vật bọc chung quanh thành tế bào Lớp thành tế bào chứa pectin để giúp liên kết với tế bào bên cạnh Lớp thành tế bào màng tế bào Màng tế bào hoàn toàn khác với thành tế bào hình dạng, thành phần chức Trong thành tế bào cứng rắn, có cấu trúc tương đối dày màng tế bào chất lại mỏng (khoảng o 75 A ) mềm dẻo Màng tế bào bao gồm protein lipid thành tế bào carbohydrate tự nhiên Thành tế bào có chức nâng đỡ cho màng tế bào điều hòa vận chuyển chất vào khỏi tế bào Công nghệ tế bào 102 Chloroplast Thành tế bào Màng tế bào Tế bào chất Không bào Lưới nội sinh chất Ribosome Ty thể Nhân Bộ máy Golgi Hình 7.1 Minh họa tế bào thực vật Khơng bào (vacuole) có vai trị tiếp nhận chất thải trao đổi chất chất thứ cấp thực vật Ở tế bào non không bào thường nhỏ nhiều Khi tế bào lớn dần già khơng bào mở rộng lên kết thành khối Ở tế bào thực vật trưởng thành, khơng bào chiếm tới 90% thể tích tế bào Khơng bào bọc chung quanh màng huyết tương (plasma) Thành phần khơng bào lớn nước chứa chất hòa tan ion vô cơ, amino acid, acid hữu cơ, sắc tố hòa tan nước (anthocyanin) chất khơng hịa tan dạng tinh thể hình kim Ngồi ra, khơng bào chứa protein hydrolyse, catalase photphatase Phần bào tan muốn đề cập đến lipid chung quanh tất cấu trúc nhân màng tế bào Lục lạp (chloroplast) vị trí quang hợp tế bào thực vật, chứa chlorophyll sắc tố lục phản ứng với ánh sáng để sản xuất carbohydrate Nhân (nuclear) trung tâm điều khiển tế bào chứa DNA để phiên mã dịch mã thành protein Các protein tổng hợp xếp đóng gói túi máy Golgi Nội sinh chất (endoplasmic reticulum) mạng lưới ống nhỏ nối liền phần khác tế bào Ribosome tập trung bề mặt mạng lưới nội sinh chất Công nghệ tế bào 103 tham gia vào hoạt động sinh tổng hợp protein Ty thể (mitochondrion) chứa vật liệu di truyền nhiều enzyme quan trọng trao đổi chất tế bào III Các loại nuôi cấy tế bào mô thực vật Khái niệm nuôi cấy tế bào mô thực vật thường dùng thuật ngữ chung để mô tả tất loại nuôi cấy thực vật điều kiện in vitro Trong q trình ni cấy thường xuất hai kiểu sinh trưởng sau: Sinh trưởng khơng phân hóa (undifferentiated growth) Sinh trưởng khơng phân hóa xuất thường xun mẫu mơ hồn chỉnh ni cấy in vitro Mẫu mơ sau làm biến cấu trúc nhận biết nguyên vẹn ban đầu 1.1 Nuôi cấy callus Nuôi cấy callus cho phép khối tế bào khơng có hình dạng định tăng lên từ sinh trưởng khơng phân hóa mẫu vật mơi trường dinh dưỡng rắn vơ trùng (Hình 7.2) Mẫu vật thường quan tử nhỏ mẫu mô Các khối tế bào không tương ứng với cấu trúc mô đặc trưng hồn chỉnh Thuật ngữ ni cấy callus sử dụng phân chia vô tổ chức tế bào mà lúc đầu nghĩ cảm ứng với tổn thương thực thể thực vật trình tách khỏi hồn chỉnh Tuy nhiên, sau người ta nhận thấy được cảm ứng chất điều hòa sinh trưởng thực vật (plant growth regulators) mơi trường dinh dưỡng rắn Hình 7.2 Nuôi cấy callus Công nghệ tế bào 104 1.2 Nuôi cấy dịch huyền phù tế bào Nuôi cấy dịch huyền phù tế bào chứa tế bào khối tế bào, sinh trưởng phân tán môi trường lỏng (Hình 7.3 7.4) Thường khởi đầu cách đặt khối mô callus dễ vỡ vụn môi trường lỏng chuyển động (lắc khuấy) Nuôi cấy dịch huyền phù tiến triển từ thực vật đến mẫu vật, tới callus, cuối tới dịch huyền phù Ni cấy dịch huyền phù thích hợp cho việc sản xuất sinh khối tế bào thực vật so với nuôi cấy callus, nuôi cấy dịch huyền phù trì thao tác tương tự với hệ thống lên men vi sinh vật ngập chìm mơi trường lỏng 1.3 Nuôi cấy tế bào trần Nuôi cấy tế bào trần (protoplast) địi hỏi sinh trưởng protoplast mơi trường đặc lỏng Protoplast chuẩn bị phương pháp học enzyme để loại bỏ thành tế bào Các protoplast phân lập sử dụng để: (1) biến đổi thông tin di truyền tế bào thực vật, (2) tạo lai vơ tính thơng qua dung hợp protoplast (protoplast fusion), (3) nghiên cứu xâm nhiễm virus thực vật vấn đề khác Một ứng dụng đầy triển vọng khác nuôi cấy protoplast vi nhân giống thực vật Sau phân chia protoplast, thành tế bào tái sinh để tăng phát triển callus hồn chỉnh nhờ thực vật nhân lên nhiều lần Sinh trưởng có phân hóa (differentiated growth) Sinh trưởng có phân hóa xuất phận thực vật chuyển lên môi trường nuôi cấy nơi chúng tiếp tục sinh trưởng với cấu trúc trì từ trước Các quan thực vật phân hóa sinh trưởng q trình ni cấy mà khơng bị tồn vẹn cịn gọi ni cấy quan (organ culture) 2.1 Ni cấy rễ tơ Ni cấy rễ tơ thiết lập từ đầu rễ tách nhiều lồi thực vật khác Các ni cấy rễ sinh trưởng nhanh thu từ lồi hai mầm cách gây nhiễm chúng với vi khuẩn đất Agrobacterium Công nghệ tế bào 105 rhizogenes Các dịng rễ tơ (hairy root) hình thành dùng nuôi cấy để sản xuất chất thứ cấp (Hình 7.5) A Ni cấy dịch huyền phù tế bào thực vật B Bơm khí vơ trùng, khơng khí ẩm Bình thu Bơm nhu động nhiều kênh Bioreactor Bình chất lắc liên tục Máy lắc Hình 7.3 Nuôi cấy dịch huyền phù tế bào thực vật máy lắc A: Ni bình tam giác có lắc để chuẩn bị tế bào B: Nuôi hệ lên men lắc để sản xuất sinh khối Hình 7.4 Hệ lên men có cánh khuấy (bình ni L) dùng để nuôi cấy dịch huyền phù tế bào thực vật quy mơ phịng thí nghiệm Cơng nghệ tế bào 106 Hình 7.5 Ni cấy rễ tơ 2.2 Ni cấy phơi Ni cấy phơi (embryo) thiết lập cho phôi tách từ hạt vô trùng, nỗn Các phơi sản xuất từ kỹ thuật nuôi cấy tế bào, gọi phơi vơ tính (somatic embryo), phân lập nảy mầm cung cấp mẫu vật Ni cấy phơi ứng dụng để sản xuất nhanh giống từ hạt có thời gian ngủ nghĩ dài Phương pháp có nhiều ưu điểm hệ thống nhân giống truyền thống trình đồng di truyền, sản xuất sinh khối nhân giống trồng bệnh IV Môi trường nuôi cấy Mặc dù nhu cầu dinh dưỡng loại mô nuôi cấy khác môi trường nuôi cấy mô thực vật đặc trưng chứa thành phần sau: - Các nguyên tố đa lượng Bao gồm loại muối nitrogen, potassium, calcium, phosphorus, magnesium sulfur Đây sáu nguyên tố cần thiết cho sinh trưởng thực vật bậc cao - Các nguyên tố vi lượng Bao gồm loại muối sắt, kẽm, mangan, boron, copper, molybdenum cobalt dạng vết - Các phụ gia hữu Một lượng nhỏ loại vitamin (myo-inositol, thiamine, nicotinic acid, pyridoxine, riboflavin…), amino acid (thường cho phép bỏ qua số trường hợp đặc biệt dùng), phụ gia hữu không xác định khác (malt, dịch chiết nấm men, dịch thủy phân casein, nước dừa…) - Các chất kích thích sinh trưởng thực vật Thành phần phụ gia quan trọng định kết ni cấy chất điều hịa sinh Công nghệ tế bào 107 trưởng Các auxin (IAA2 dạng tương tự tổng hợp nhân tạo 2,4-D3, NAA4, IBA5, NOA6…), cytokinin (zeatin, 2i-P7 dạng tương tự tổng hợp nhân tạo kinetin, BA8…) nhóm chất kích thích sinh trưởng phát sinh hình thái chủ yếu ni cấy mô quan thực vật - Nguồn carbon Thường sử dụng sucrose làm nguồn carbon thay cho nguồn carbon thực vật cố định từ khí quang hợp Trong đa số thí nghiệm ni cấy, tế bào thực vật khả quang hợp Glucose thường đưa vào môi trường cho hiệu tương đương sucrose, fructose cho hiệu - Các tác nhân làm rắn (tạo gel) môi trường Thường sử dụng agar, loại polysaccharide thu từ số loài tảo thuộc ngành tảo đỏ (Rhodophyta) Một số hợp chất khác thử nghiệm thành công alginate, phytagel, methacel gel-rite Murasghige Skoog (1962) xây dựng môi trường dinh dưỡng (gọi mơi trường MS) thích hợp cho hầu hết thí nghiệm ni cấy tế bào thực vật Thành phần mơi trường ni cấy trình bày bảng 7.2 V Sản xuất chất thứ cấp Các chất trao đổi thứ cấp hay gọi chất thứ cấp xếp ba nhóm chính: alkaloid, tinh dầu glycoside Các alkaloid có dạng tinh thể hợp chất chứa nitrogen, tách chiết cách dùng dung dịch acid9 Alkaloid có hoạt tính sinh lý tất động vật sử dụng công nghiệp dược Họ alkaloid bao gồm: codein, nicotine, caffeine morphine Các tinh dầu chứa hỗn hợp terpenoid sử dụng chất mùi, chất thơm dung môi Glycoside bao gồm phenolic, tanin flavonoid, saponin IAA: indoleacetic acid 2,4-D: 2,4-dichlorophenoxyacetic acid NAA: α-naphthaleneacetic acid IBA: indole-3-butyric acid NOA: 2-naphthoxyacetic acid 2-iP: 6-(γ,γ-dimethylallylamino)purine BA: N6-benzyladenine hay 6-benzylaminopurine (BAP) Tên alkaloid có nghĩa giống kiềm (alkali) Cơng nghệ tế bào 108 cyanogenic glycoside, số chúng sử dụng làm chất nhuộm, chất mùi thực phẩm dược phẩm Bảng 7.2 Thành phần môi trường Murashige Skoog (1962) Thành phần Các nguyên tố đa lượng MgSO4.7H2O KH2PO4 KNO3 NH4NO3 CaCl2.2H2O Các nguyên tố vi lượng H3BO3 MnSO4.4H2O ZnSO4.7H2O Na2MoO4.2H2O CuSO4.5H2O CoCl2.6H2O KI Nồng độ (mg/L) Thành phần Nồng độ (mg/L) FeSO4.7H2O Na2EDTA.2H2O 370 170 1900 1650 440 6,2 22,3 8,6 0,25 0,025 0,025 0,83 27,8 37,3 Nguồn carbon Sucrose 30000 Các phụ gia hữu - Các vitamin Thiamine.HCl Pyridoxine.HCl Nicotinic acid myo-inositol - Các chất khác Glycine 0,5 0,5 0,5 100 Một nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến việc sản xuất chất thứ cấp từ tế bào thực vật phân hóa hình thái Nhiều chất thứ cấp sản xuất suốt trình phân hóa tế bào Vì thế, chúng thường tìm thấy mơ có tính đặc trưng cao rễ, hoa Do phân hóa hình thái trưởng thành khơng xuất ni cấy tế bào, nên chất thứ cấp có khuynh hướng ngưng tạo thành nuôi cấy tế bào thực vật Chỉ số giới hạn hệ thống nuôi cấy tế bào thực vật sản xuất lượng vừa phải chất thứ cấp, cho dù thực vật tự nhiên mà từ tế bào thu thập, sản xuất chúng Cơng nghệ tế bào 109 thường chứa nhiều sucrose thành phần vô vitamin so với mơi trường sinh trưởng Tích lũy sản phẩm ni cấy tế bào thực vật kích thích elicitor sống khơng sống Các elicitor sống hợp chất chất có nguồn gốc từ vi sinh vật elicitor không sống tác nhân gây stress chiếu xạ UV, sốc thẩm thấu, ion kim loại nặng Các elicitor sống (biotic) thường sản xuất cách nghiền đồng thể hệ sợi nấm vô trùng dịch thu Ảnh hưởng biotic elicitor lên tích lũy chất thứ cấp tùy thuộc vào đặc trưng nồng độ elicitor, thời gian tiếp xúc elicitor, giai đoạn sinh trưởng tế bào thực vật Các chất thứ cấp dùng thực phẩm 1.1 Các chất màu - Anthocyanin Các anthocyanin sắc tố tiêu biểu có lồi thực vật hạt kín (angiosperms) lồi thực vật có hoa (flowering plants) họ Poaceae, Fabaceae, Rosaceae, Cruciferae, Vitaceae Solanaceae tập trung phận khác như: rễ, lá, hoa Anthocyanin tách chiết từ nho nguồn tiềm tàng giới Hiện nay, người ta tiến hành nuôi cấy tế bào loài Vitis vinifera, Daucus carota Euphorbia millii để sản xuất anthocyanin Kỹ thuật nuôi cấy tế bào phương tiện lý tưởng để sản xuất anthocyanin với sản lượng cao từ 10-20% trọng lượng khô Sản xuất anthocyanin nói chung đạt cực đại suốt pha tĩnh Stress thẩm thấu tạo sucrose tác nhân khác cho thấy điều hịa q trình sản xuất anthocyanin ni cấy tế bào V vinifera - Betalaine Các betalaine sắc tố tiêu biểu có lồi thực vật hạt kín lồi thực vật có hoa thuộc họ Chenopodiaceae, Amaranthaceae Phytolacaceae Một số loài nấm ăn thuộc Agaricinales sản xuất betalaine Nuôi cấy tế bào thực vật chứng minh khả sản xuất betalaine Giống nhiều chất thứ cấp khác, betalaine nuôi cấy tế bào thực vật đạt nồng độ cực đại pha tĩnh sinh trưởng tế bào Tuy nhiên, nuôi cấy tế bào dịch huyền phù Phytolacca americana lại cho Công nghệ tế bào 111 thấy betalaine đạt nồng độ cao pha sinh trưởng hàm mũ (pha log) Tế bào Chenopodium rubrum nuôi cấy 15 ngày tuổi sản xuất 35-45 mg betalaine/L môi trường Nuôi cấy tế bào nuôi cấy rễ tơ Beta vulgaris tiến hành để sản xuất betalaine - Crocin crocetin Crocus sativus (cây nghệ tây) nguồn cung cấp crocin chủ yếu, loại sắc tố màu đỏ tươi tìm thấy đầu nhụy Đầu nhụy nghệ tây (saffron) sản xuất crocetin Crocin digentiobiocide ester crocetin Đây loại nguyên liệu có giá trị cao, thực tế nghệ tây sinh trưởng vùng địa lý đặc biệt giới địi hỏi nhiều nhân cơng thu hoạch Muốn thu hoạch kg đầu nhụy nghệ tây (một loại gia vị có giá trị) cần phải có khoảng 150.000 hoa Hiện nay, người ta phát triển phương pháp nuôi cấy tế bào đầu nhụy nghệ tây điều kiện in vitro để sản xuất gốc saffron Mô nuôi cấy trường hợp cảm ứng để sản xuất callus có màu chứa crocin crocetin safrana (gốc chất màu) saffron - Capsaicin capsaicinoid Capsaicin gốc cay chủ yếu ớt, capsaicinoid chịu trách nhiệm cho vị cay dihydrocapsaicin, nordihydrocapsaicin, homocapsaicin homodihydrocapsaicin Capsaicinoid sử dụng công nghiệp thực phẩm phụ gia Ngồi ra, người ta cịn sử dụng capsaicin tinh khiết để bào chế dược phẩm điều trị chứng viêm khớp làm thuốc giảm đau Capsaicin sản xuất nuôi cấy bất động tế bào Capsicum frutescens Các tế bào Capsicum bất động sản xuất capsaicin cao gấp vài lần so với tế bào dịch huyền phù tự Mơ giá nỗn (placenta) Capsicum bất động sản xuất lượng capsaicin cao tế bào bất động 1.2 Các chất mùi - Vanilla Đây nguyên liệu tạo mùi phổ biến sử dụng rộng rãi Vanilla tự nhiên thị trường hứa hẹn cho sản xuất chất mùi phương pháp cơng nghệ sinh học Nó hỗn hợp phức tạp thành Công nghệ tế bào 112 phần chất mùi chiết từ hạt Vanilla planifolia Đây hóa chất mùi phổ biến sử dụng rộng rãi cho nhiều loại thực phẩm Khoảng 12.000 vanilla tiêu thụ năm, khoảng 20 tách chiết từ hạt, phần lại sản xuất phương pháp tổng hợp hóa học, thường từ sản phẩm hóa dầu guaiacol đơi từ lignin, sản phẩm bột giấy Sản xuất hợp chất mùi vanilla phương pháp nuôi cấy tế bào V planifolia chứng minh thành công Nuôi cấy tế bào V planifolia khởi đầu nuôi cấy quan khác đoạn thân cách dùng tổ hợp chất kích thích sinh trưởng khác Thơng thường, kinetin dùng để khởi động tổng hợp vanillic acid nuôi cấy dịch huyền phù V planifolia Sản xuất vanilla cải thiện cách bổ sung thêm than hoạt tính vào mơi trường ni cấy Sản lượng vanilla nuôi cấy tế bào thường 2,2% Một số cải tiến điều kiện nuôi cấy làm giảm thời gian nuôi cấy tế bào từ 160 50 sản lượng vanilla tăng từ 100 mg/L lên đến 1.000 mg/L, tương đương 8% hàm lượng vanilla trọng lượng khô - Garlic onion Các chất mùi garlic onion sản xuất nuôi cấy tế bào Các chất mùi phát triển từ tiền chất (precusor) ngoại sinh trình xử lý sau thu hoạch Ni cấy tế bào tỏi (Allium sativum) khơng phân hóa (hoặc callus phân hóa có màu xanh lục) thu số loại tiền chất amino acid (methyl, propyl, allyl cysteine sulphoxides) hai loại hợp chất ninhydrin-positive không xác định Chất mùi tổng số thu callus hình cầu màu trắng (globular white callus) callus màu xanh lục phân hóa chậm (semidifferentiated green callus) tương ứng 4% 13% so với trồng tự nhiên Kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật hành (Allium cepa) để sản xuất chất mùi onion phát triển Prince (1991) chứng minh tăng lên hợp chất mùi onion nuôi cấy rễ Thông qua việc bổ sung amino acid cysteine, methionine glutathione, nồng độ cuối sản phẩm tăng lên lớn 1.3 Các chất - Stevioside Stevioside tự nhiên sucrose khoảng 300 lần Dịch chiết từ hoàn chỉnh chứa khoảng 41% stevioside Các kiểm nghiệm độc chất Công nghệ tế bào 113 học cho thấy stevioside hoàn toàn an toàn cho người dùng Hơn nữa, nghiên cứu nha khoa gợi ý sản phẩm ức chế thực sinh trưởng vi sinh vật vùng miệng Sản xuất stevioside nuôi cấy callus Stevia rebaudiana nghiên cứu chi tiết Những nuôi cấy chồi tạo rễ cho vị ngọt, chứng minh hai: rễ cần thiết cho tổng hợp stevioside Các chất thứ cấp dùng dược phẩm 2.1 Các alkaloid Người ta thu chất caffein từ nuôi cấy tế bào Coffea arabica, betalain callus củ cải đường, berberin từ tế bào Coptis japonica (loài phải trồng từ 4-6 năm thu hàm lượng đáng kể berberin rễ, hàm lượng thu sau tuần phương pháp nuôi cấy tế bào)… Những chất sử dụng rộng rãi công nghiệp hương liệu y học Chất reserpine có tác dụng chữa bệnh cao huyết áp bệnh rối loạn tuần hồn sản xuất phương pháp ni cấy tế bào Rauwolfia serpentina Nuôi cấy tế bào 30 ngày hệ lên men quy mơ lớn sản xuất 3.500 kg reserpine, tương đương với lượng hàng năm giới thu từ rễ Các nhà nghiên cứu thuộc tổ hợp dược phẩm Gibageigy (Based, Thụy Sĩ) sản xuất loại alkaloid scopolamine từ tế bào Hyoscyanus aegypticus nuôi cấy hệ lên men cánh khuấy Bằng cách chọn lọc dịng tế bào cao sản nhờ kỹ thuật đột biến tế bào trần, biến dị đơn dòng (monoclonal variation) kỹ thuật gen, người ta tăng sản lượng scopolamine lên gấp hàng ngàn lần Nhiều nghiên cứu cho thấy nuôi cấy callus tế bào Catharanthus roseus có hàm lượng serpentin ngang với dược liệu bình thường Một số nghiên cứu phân lập dòng tế bào Cantharanthus sản xuất serpentin ajmalacine từ nuôi cấy in vitro Bằng loại môi trường sản xuất đặc biệt người ta đưa sản lượng alkaloid hai dòng tế bào tốt lên mức cao nữa, dịng tạo 162 mg/L serpentin, dòng tạo 72 mg/L serpentin với 264 mg/L ajmalacine Mới đây, người ta hoàn thiện công nghệ nuôi cấy tế bào C roseus để sản xuất viblastine vincristine Công nghệ tế bào 114 hai chất chống ung thư mạnh, có nhu cầu cao chúng sử dụng để chữa ung thư máu Sikuli cộng (1997) sau gây nhiễm Datura stramonium với Agrobacterium rhizogenes nhận thấy hàm lượng hyoscyamine rễ đạt cực đại sau tuần nuôi cấy < 100 mg/L 2.2 Các steroid Trong lĩnh vực steroid chuyển hóa steroid, dịng tế bào có suất cao Kaul cs đề cập đến từ năm 1969 Họ nuôi cấy thành công tế bào Dioscorea deltoidea để sản xuất diosgenin, nguyên liệu thô chủ yếu để sản xuất steroid chống thụ thai hormone tuyến thượng thận Quá trình chuyển hóa hợp chất glycoside tim (cardiac) ni cấy tế bào Digitalis lanata nghiên cứu Người ta nhận thấy, tế bào Digitalis ngừng sản xuất glycoside tim chúng có khả hydroxyd hóa digitoxin nguyên tử C12 để tạo digoxin Digoxin hợp chất có ý nghĩa y học lớn digitoxin Quá trình hydroxyd hóa xảy ni cấy tế bào nhanh hiệu đưa vào môi trường nuôi cấy chất β-methyl-digitoxin Sau 12 ngày, người ta thu g β-methyl-digitoxin bình ni dung tích 20 L 2.3 Một số chất khác Thí dụ điển hình cơng nghệ sản xuất shikonin, loại sắc tố đỏ có khả diệt khuẩn, có rễ Lithospermum erythrorhizon Bình thường shikonin tích lũy không nhiều rễ Tuy nhiên, nhà khoa học Nhật tạo dòng tế bào rễ Lithospermum có khả tích lũy đến 15% shikonin hồn chỉnh cơng nghệ ni cấy tế bào sản xuất shikonin Công nghệ cho phép chu kỳ nuôi cấy thu hoạch tới kg hoạt chất giúp giảm nhiều giá thành shikonin Hàm lượng tương đối cao ubiquinone-10 tìm thấy tế bào thuốc nuôi cấy in vitro L-dopa môi trường nuôi cấy tế bào Mucuma pruriens Nuôi cấy tế bào Panax pseudoginseng cho hàm lượng saponin cao Nuôi cấy tế bào Glycyrrhiza glabra thu hàm lượng glycyrrhizin từ 3-4% trọng lượng khô Công nghệ tế bào 115 Hàm lượng chất thứ cấp cao tìm thấy ni cấy tế bào Coleus blumei chất rosmarinic acid chiếm 13-15% trọng lượng khô chu kỳ nuôi 13 ngày, lớn gấp lần so với hàm lượng trồng điều kiện tự nhiên Trong năm 1980, người ta sản xuất có hiệu ginsengoside hoạt chất chủ yếu nhân sâm Panax ginseng Các anthraquinone nhóm sản phẩm tự nhiên quan trọng có vi khuẩn, nấm, địa y thực vật bậc cao có hoạt tính sinh học như: kháng khuẩn, kháng nấm, giảm huyết áp, giảm đau, chống sốt rét, chống oxy hóa, kháng bệnh bạch cầu chức đột biến Ở thực vật bậc cao, chúng tìm thấy nhiều họ thực vật khác nhau, chẳng hạn Rubiaceae, Rhamnaceae, Polygonaceae, Leguminosae Nuôi cấy tế bào loài họ Rubiaceae cho phép thu lượng lớn anthraquinone chí số trường hợp vượt hàm lượng anthraquinone bố mẹ Công ty Escagenetics (California, Mỹ) thành công sản xuất taxol nuôi cấy rễ tơ (hairy-root) Taxol chất tách chiết từ vỏ kim thủy tùng (Taxus brerifolia) sử dụng hiệu điều trị nhiều loại ung thư Việc cung cấp taxol gặp khó khăn thân thủy tùng khan hàm lượng taxol chúng thấp Escagenetics sản xuất taxol với nồng độ cao nồng độ tự nhiên thấy vỏ thủy tùng VI Sản xuất protein tái tổ hợp Nuôi cấy tế bào thực vật sử dụng để sản xuất sản phẩm tự nhiên cách 20 năm gần chúng dùng để sản xuất protein tái tổ hợp Protein tái tổ hợp (protein ngoại lai) protein tự nhiên sửa đổi công nghệ gen nhằm nâng cao thay đổi hoạt tính chúng Tương tự tế bào vi sinh vật, tế bào thực vật thích hợp cho nguyên liệu tái tổ hợp chúng sinh trưởng mơi trường tương đối đơn giản không cần bổ sung protein, chúng sinh vật eukaryote bậc cao nên tiến hành biến đổi hậu dịch mã tế bào người Nếu protein ngoại lai sản xuất nuôi cấy tế bào tiết môi trường, nhiều phần tích lũy tế bào, việc thu hồi tinh sản phẩm tiến hành mà khơng có nhiều protein nhiễm bẩn Các Cơng nghệ tế bào 116 protein có nguồn gốc thực vật an tồn cho người protein có nguồn gốc từ tế bào động vật chất nhiễm bẩn virus thực vật tác nhân gây bệnh người Ngồi ra, ni cấy tế bào thực vật công cụ thực nghiệm thuận lợi cho việc khảo sát sản xuất protein ngoại lai hoàn chỉnh (whole plants) (Bảng 7.3) Thực vật chuyển gen xem hệ thống sản xuất kinh tế cho việc sản xuất protein ngoại lai kháng thể, enzyme hormone Sản xuất thương mại số protein vi khuẩn động vật tiến hành thực vật Yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu kinh tế sản xuất protein dựa sở thực vật hiệu suất protein ngoại lai nồng độ sản phẩm tích lũy sinh khối Theo đó, người ta ý cải thiện biểu gen ngoại lai chuyển gen thông qua việc phát triển promoter tốt hơn, chọn lọc dòng chuyển gen ổn định, ức chế gen im lặng (silence gene) Tuy nhiên, yếu tố quan trọng đứt gãy protein ngoại lai làm giảm nồng độ sản phẩm chức mô thực vật sau phân tử tổng hợp lắp ráp Sự đứt gãy protein ngoại lai làm bẩn sản phẩm với đoạn protein hoạt tính, người ta gặp khó khăn loại bỏ protein đứt gãy hoạt động thu hồi protein chức sản xuất quy mơ lớn Tìm hiểu chi tiết vị trí chế đứt gãy nội ngoại bào cần thiết để phát triển phương pháp cho giảm thiểu tổn thất protein hậu sau dịch mã GM-CSF người GM-CSF người (human granulocyte macrophage-colony stimulate factor), bốn glycoprotein đặc biệt kích thích quần lạc đại thực bào tế bào bạch cầu hạt tổ tiên sản sinh bạch cầu hạt, đại thực khuẩn hai loại tế bào máu trắng quan trọng GM-CSF người ứng dụng lâm sàng điều trị bệnh giảm bạch cầu trung tính (neutropenia) bệnh thiếu máu không tái tạo (aplastic anemia) Sử dụng GM-CSF người cấy ghép tủy xương giảm thiểu đáng kể nguy nhiễm trùng chúng kích thích tăng tổng số bạch cầu trung tính GM-CSF người biểu nhiều thể vật chủ khác như: E coli, Công nghệ tế bào 117 nấm men, A niger, tế bào động vật có vú tế bào thực vật, sản xuất để dùng lâm sàng Bảng 7.3 Một số protein tái tổ hợp sản xuất nuôi cấy tế bào thực vật Protein biểu Loài thực vật Nhân tố sinh trưởng biểu mô người Nicotiana tabacum Hormone sinh trưởng người N tabacum Albumin huyết người N tabacum, Solanum tuberosum Nhân tố sinh trưởng cá hồi N tabacum α-interferon người Oryza sativa Hirudin (chống đông máu) N tabacum Erythropoietin người N tabacum α and β haemoglobin người N tabacum Human muscarinic cholinergic receptors N tabacum GM-CSF chuột N tabacum Interleukin-2 Interleukin-4 người N tabacum Alkaline phosphatase thai người N tabacum α1-antitrypsin người O sativa HBsAg N tabacum, Glycine max GM-CSF người N tabacum, O sativa, Lycopersicum esculentum Kháng thể đơn dòng (Mab) chống HBsAg N tabacum Lysozyme người O sativa Mab chuỗi nặng N tabacum IgG2b/κ chuột N tabacum Đoạn kháng thể scFv N tabacum, O sativa Đoạn kháng thể biscFv N tabacum IgG2b/κ kích thước hồn chỉnh N tabacum Chuỗi nặng γ đơn dòng chuột N tabacum Bryodin N tabacum Công nghệ tế bào 118 Kháng thể IgG1 chuột Đã sản xuất cách nuôi cấy rễ tơ tế bào dịch huyền phù thuốc (Nicotiana tabacum) chuyển gen Để thực lắp ráp kháng thể hoàn chỉnh, từ đến đoạn kháng thể nhỏ tích lũy sinh khối tế bào Các nhân tố ức chế protease, tác nhân ổn định protein, nhân tố ức chế N-glycosylation tiết protein, tác nhân tái hoạt động glycan (polysaccharide) mẫu dò lực sử dụng để nghiên cứu đặc điểm đoạn này, khảo sát vị trí chúng chế hình thành Tất phân tử kháng thể tiết môi trường nuôi cấy Interleukin Là thuật ngữ chung cho cytokine bạch cầu sản xuất (lymphokine), interleukin-2 cytokine quan trọng phát triển đáp ứng miễn dịch thích ứng, sử dụng để điều trị số bệnh viêm nhiễm virus bệnh ung thư Interleukin-2 (IL-2) interleukin-4 (IL-4) người sản xuất tiết môi trường nuôi cấy dịch huyền phù tế bào N tabacum biến đổi di truyền Sự tiết qua màng huyết tương thành tế bào vào mơi trường thuận lợi nhờ trình tự leader tự nhiên của động vật có vú Nồng độ IL-2 IL-4 môi trường nuôi cấy tương ứng 0,10 0,18µg/mL, nồng độ chúng bên lymphokine cao (IL-2 khoảng 0,8 µg/mL IL-4 khoảng 0,28 µg/mL) Phân tích Western blot10 cho thấy IL-4 tiết mơi trường nuôi cấy tế bào thực vật hai chuỗi polypeptide nhỏ với trọng lượng phân tử khoảng 18-20 kDa Hoạt tính sinh học IL-2 xác định sinh sản tế bào dòng tế bào CTLL-2 chuột phụ thuộc IL-2 [CT.h4S] 10 Western blot: kỹ thuật phân tích protein dựa nguyên lý liên kết kháng nguyên-kháng thể để phát protein đặc hiệu có chất kháng nguyên (thường thẩm tích lên màng nitrocellulose sau chạy điện di SDS-PAGE, cố định đó) Sau protein màng lai gắn với kháng thể thứ đặc hiệu tiếp đến kháng thể thứ hai có đánh dấu enzyme (alkaline phosphatase horse-radish peroxidase…) phức hợp liên kết với chất để tạo màu Sự diện protein ngoại lai (sản phẩm dịch mã gen ngoại lai chuyển vào tế bào vật chủ) phát nhờ xuất màu phản ứng lai Công nghệ tế bào 119 ... thành tế bào Lớp thành tế bào chứa pectin để giúp liên kết với tế bào bên cạnh Lớp thành tế bào màng tế bào Màng tế bào hoàn toàn khác với thành tế bào hình dạng, thành phần chức Trong thành tế bào. .. khỏi tế bào Công nghệ tế bào 102 Chloroplast Thành tế bào Màng tế bào Tế bào chất Không bào Lưới nội sinh chất Ribosome Ty thể Nhân Bộ máy Golgi Hình 7.1 Minh họa tế bào thực vật Không bào (vacuole)... 2,4-D: 2,4-dichlorophenoxyacetic acid NAA: α-naphthaleneacetic acid IBA: indole-3-butyric acid NOA: 2-naphthoxyacetic acid 2-iP: 6- ( γ,γ-dimethylallylamino)purine BA: N6-benzyladenine hay 6- benzylaminopurine