Giáo trình miễn dịch học ứng dụng part 9 pps

- 152 - t bo, mi nng huyt thanh gõy nhim cho 5 i tng, mi i tng 0,2ml ri theo dừi trong 96 gi. Hm lng khỏng th trong huyt thanh c biu din thụng qua hiu giỏ khỏng th v n v trung ho (vth). Hiu giỏ khỏng th chng virus l pha loóng ln nht ca huyt thanh ngn cn hon ton s gõy nhim hay cht phụi hoc ng vt thớ nghim. n v trung ho c tớnh nh sau: Nu lng khỏng th trung hũa cú trong huyt thanh thớ nghim trung hũa c 1EID 50 (LD 50 , TCID 50 ) virus th tớch tng ng thỡ trong mu huyt thanh ú cha 1 n v trung hũa. Vớ d: nu 0,1 ml huyt thanh pha loóng 1/4 trung ho ht 0,1ml virus cha 50EID 50 (LD 50 , TCID 50 ) (vỡ khi pha 0,2ml virus vi 0,2ml huyt thanh trung hũa ó lm th tớch tng lờn gp ụi nờn nng virus gim xung mt na), cú ngha l 0,1ml huy t thanh pha loóng 1/4 cú cha 50 vth, nh vy trong 0,1 ml huyt thanh c s cú 50 x 4 = 200 (vth), do ú 1ml huyt thanh c cha 200 x 10 = 2000 (vth). Cng nh cỏch th nht, nu mu huyt thanh thớ nghim trung hũa c t 50 vth tr lờn, phn ng trung hũa l dng tớnh. Tuy nhiờn, bo h c ng vt, hm lng khỏng th trong huyt thanh min dch phi cng cao cng tt v tựy thuc vo tng trng hp. Trong trng hp xỏc nh hiu lc ca vacxin dch t vt, theo tỏc gi Woolcock P.R. v cng s (1991) khi lm phn ng trung ho theo phng phỏp huyt thanh pha loóng, virus c nh; vo ngy 21 sau khi tiờm vacxin, nu n v trung hũa ca huyt thanh t trờn 32000 vth thỡ vacxin cú hiu lc bo h - ng dng phn ng trung ho trong chn oỏn bnh truyn nhim: Dch t vt, viờm gan vt, l mm long múng, dch t ln, Marek. Phản ứng trung hoà trên thỏ chẩn đoán bệnh Dch t ln - Nguyờn lý: Da vo tớnh gõy bnh khỏc nhau trờn th v ln ca 2 chng virus dch t ln cng c v nhc c, nhng chỳng li cú chung c tớnh khỏng nguyờn. + Chng virus cng c dch t ln: gõy bnh cho ln nhng khụng c cho th, nu tiờm cho th gõy c min dch . + Chng virus nhc c dch t ln: khụng c vi ln nhng c vi th, nu tiờm cho th lm th st. Dựng bnh phm nghi dch t ln tiờm cho th nu bnh phm cú virus dch t ln cng c, th s c min dch, trong mỏu cú khỏng th trung ho virus dch t ln. Tiờm tip cho th bng virus dch t ln nhc c, virus ny s b khỏng th trung ho cú trong mỏu th trung ho ht nờn khụng gõy st cho th. - Tin hnh: Dựng bnh phm l lỏch ca ln nghi mc bnh, nghin vi nc sinh lý thnh 2 nng 1/10 v 1/100 tiờm bp tht cho 2 th kho mnh: + Th 1: tiờm 1ml huyn dch 1/10 + Th 2: tiờm 1ml huyn dch 1/100 Sau 5 - 10 ngy, dựng ging virus nhc c dch t ln qua th pha thnh 2 nng 1/10 v 1/100 tiờm bp tht cho 2 th trờn: + Th 1: tiờm 1ml huyn dch 1/10 + Th 2: tiờm 1ml huyn dch 1/100 Kt qu l hai th ny khụng st. Ly mỏu ca hai th ny tiờm qua 2 th kho khỏc, 2 th ny cng khụng st chng t virus dch t ln nhc c ó b trung ho bi khỏng th dch t ln. Khỏng th ny cú c l do trong bnh phm cú virus dch t ln cng c kớch thớch sn xut ra, chng t ln ó mc bnh. - 153 - Trong khi lụ i chng: Tiờm mỏu hoc lỏch ca ln khe, 10 ngy sau tiờm tip bng virus dch t ln nhc c, 2 th ny cú phn ng st. Phản ứng trung hoà trên gà và trên phôi gà chẩn đoán virus Newcastle * Trung ho trờn g thớ nghim: - Dựng hai lụ g: Mt lụ thớ nghim v mt lụ i chng. Lụ thớ nghim c tiờm vacxin Newcastle; Lụ i chng khụng c tiờm vacxin. Sau 5 - 7 ngy c hai lụ u c tiờm bnh phm ca g nghi mc bnh Newcastle vo di da hay bp tht ựi ca g. - Nu bnh phm cha virus Newcastle thỡ lụ thớ nghim g khụng b cht, g vn phỏt trin bỡnh th ng. iu ny l do sau khi tiờm vacxin g ó cú khỏng th chng virus Newcastle, nờn khỏng th ó trung ho ht virus cú trong bnh phm. Trong khi ú lụ i chng g b cht, bi vỡ g lụ ny khụng c tiờm vacxin nờn khụng cú khỏng th bo h chng virus. * Trung ho trờn mụi trng t bo, trờn phụi g. Dựng hai lụ: 1 lụ thớ nghim v 1 lụ i chng. - Lụ thớ nghim: c tiờm hoc cy hn dch bnh phm sau khi ó c hn hp vi 1 lng khỏng huyt thanh Newcastle tng ng 37 0 C/1 - 2h - Lụ i chng: Ch c tiờm hoc cy hn dch bnh phm nghi cú virus Newcastle Kt qu: Nu trong bnh phm cú cha virus Newcastle thỡ cỏc lụ thớ nghim l phụi g, t bo vn phỏt trin v sng bỡnh thng vỡ virus cú trong bnh phm ó b khỏng huyt thanh Newcastle trung ho khụng cũn kh nng gõy hu hoi t bo hay phụi g.Trong khi ú cỏc lụ i chng, t bo nuụi b hu hoi, phụi b cht 3. Cỏc phn ng huyt thanh hc phi dựng k thut ỏnh du phỏt hin Trong nhiều trờng hợp để phát hiện sự kết hợp kháng nguyên - kháng thể, ngời ta phải dùng những chất đánh dấu nh: chất phát huỳnh quang, enzyme, chất đồng vị phóng xạ gắn vào kháng nguyên hoặc kháng thể, thì độ nhạy của phản ứng đợc tăng lên nhiều lần. Những chất dùng để đánh dấu phải đạt tiêu chuẩn: - Không đợc làm biến tính kháng nguyên, kháng thể. - Không dễ bị bong ra sau khi gắn. 3.1. Phản ứng miễn dịch huỳnh quang (Immuno - fluorescent - test) IF Dùng chất đánh dấu là chất phát huỳnh quang (khi hấp thụ 1 ánh sáng có bớc sóng nhất định sẽ phát ra 1 ánh sáng có bớc sóng dài hơn). . Nguyên lý Khi dùng kháng thể hoặc kháng kháng thể đã đợc nhuộm bằng chất phát huỳnh quang, rồi cho kết hợp với kháng nguyên cần chẩn đoán. Nếu có phức hợp kháng nguyên - kháng thể khi soi dới kính hiển vi huỳnh quang sẽ phát sáng. Có thể dùng các chất phát huỳnh quang sau để nhuộm kháng thể: - Fluorescent Isothiocyanat: cho màu xanh lục - Rodamin: màu đỏ gạch - Lixamin: có màu đỏ gạch - Rodamin B (RB200): màu vàng da cam Có 2 phơng pháp: trực tiếp và gián tiếp. . Phản ứng miễn dịch huỳnh quang trực tiếp Trong phản ứng này thờng dùng kháng thể đặc hiệu nhuộm chất phát huỳnh quang để phát hiện kháng nguyên cha biết. Cách làm: - Lấy bệnh phẩm cần chẩn đoán, làm thành tiêu bản (phiết bệnh phẩm lên phiến kính, cố định) để kháng nguyên gắn chặt lên phiến kính. - Nhỏ một giọt kháng thể đặc hiệu đã gắn chất phát huỳnh quang lên tiêu bản. - Để một thời gian 30 phút, rửa nớc, để khô, quan sát dới kính hiển vi huỳnh quang (ánh sáng tia tử ngoại). Đọc kết quả. - Phản ứng dơng tính: - 154 - Có hiện tợng phát sáng do có sự kết hợp của kháng nguyên - kháng thể đã gắn chất phát huỳnh quang. - Phản ứng âm tính: Không có phát sáng, do không có sự kết hợp kháng nguyên - kháng thể. . Phản ứng miễn dịch huỳnh quang gián tiếp Dùng kháng kháng thể đợc nhuộm chất phát huỳnh quang để phát hiện kháng nguyên cần chẩn đoán. Phơng pháp này còn gọi là kỹ thuật 2 lớp với 3 thành phần tham gia. - Kháng nguyên cần chẩn đoán (kháng nguyên nghi). - Kháng thể đặc hiệu. - Kháng kháng thể đã gắn chất phát huỳnh quang. Trong đó kháng thể đặc hiệu có 2 chức năng: - Là kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên cần chẩn đoán - Là kháng nguyên của kháng kháng thể đã đánh dấu (kháng kháng thể là kháng thể kháng globulin cùng loài). * Cách tiến hành: - Lấy bệnh phẩm cần chẩn đoán làm tiêu bản để kháng nguyên gắn chặt lên phiến kính. - Nhỏ một giọt kháng thể đặc hiệu lên phiến kính. Để tác động 15 phút, rồi rửa nớc. - Nhỏ tiếp 1 - 2 giọt kháng kháng thể đã gắn chất phát huỳnh quang. Để tác động một thời gian, rửa nớc, để khô, quan sát dới kính hiển vi huỳnh quang. * Đọc kết quả: - Phản ứng dơng tính: Có hiện tợng phát sáng, tức là có hiện tợng kết hợp kháng nguyên + kháng thể + kháng kháng thể, gia súc mắc bệnh. - Phản ứng âm tính: Không có hiện tợng phát sáng, tức là không có hiện tợng kết hợp kháng nguyên + kháng thể + kháng kháng thể. Bởi vì kháng nguyên và kháng thể không tơng ứng, không có sự kết hợp kháng nguyên - kháng thể, kháng thể bị rửa trôi. Tuy nhiên, phơng pháp gián tiếp hay đợc sử dụng vì chỉ cần một lần gắn kháng kháng thể với chất huỳnh quang ta có thể sử dụng để chẩn đoán nhiều kháng nguyên khác nhau, với điều kiện kháng thể đặc hiệu của chúng phải đợc chế trên cùng một loài vật. Mặt khác, độ nhạy của phản ứng cao hơn, bởi vì 1 phân tử kháng nguyên có thể bị nhiều kháng kháng thể bám vào làm cho độ phát quang tăng lên, dễ phát hiện. Hình 6.13. Phản ứng miễn dịch huỳnh quang . Kỹ thuật Sandwich ("Bánh mì kẹp chả") Đây là một dạng cải biến của miễn dịch huỳnh quang, dùng để phát hiện tế bào tạo kháng thể. Cắt một mảnh tổ chức dạng lympho, đặt mảnh tổ chức lên phiến kính. Chất phát huỳnh quang Mẫu thí nghiệm Kháng thể Kháng nguyên Giá thể Kháng kháng thể gắn huỳnh quang Kháng thể gắn huỳnh quang Tế bào plasma Đèn cực tím Đèn cực tím Đèn cực tím (1) Trực tiếp (2) Gián tiếp (3) Sandwich - 155 - Lấy kháng nguyên phủ lên mảnh cắt. Để một thời gian, rửa nớc, loại bỏ kháng nguyên cha gắn với kháng thể đặc hiệu trên bề mặt tế bào lympho. Nhỏ tiếp kháng thể đặc hiệu đã gắn chất phát huỳnh quang, để một thời gian, rửa nớc, để khô, quan sát dới kính hiển vi huỳnh quang. Đọc kết quả. - Nếu có hiện tợng phát sáng, chứng tỏ các tế bào đang sản xuất kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên. Phản ứng đợc ứng dụng trong chẩn đoán bệnh dịch tả lợn, Marerk, dại ng dng trong chn oỏn bnh di * K thut min dch hunh quang trc tip Dựng khỏng th c hiu nhum mu hunh quang phỏt hin khỏng nguyờn di. Chun b: - Chun b khỏng nguyờn nghi: dựng bnh phm l nóo, n c bt hoc ỏp kớnh vo vựng sng Amon ca ng vt nghi mc bnh di, c nh tiờu bn bng ete hoc h núng trờn ngn la ốn cn. - Chun b khỏng th c hiu nhum hunh quang: dựng virus di gõy ti min dch cho th, ly mỏu cht huyt thanh, tỏch phn gamma globulin (Ig) em nhum mu hunh quang. Tin hnh phn ng: - Nh 1 - 2 git khỏng th ó nhum mu hunh quang lờn tiờu bn, 37 0 C/30 phỳt, ri em ra nc, lm khụ. c kt qu di kớnh hin vi hunh quang. Kt qu: - Phn ng dng tớnh: Có hiện tợng phát sáng do có sự kết hợp của kháng nguyên - kháng thể đã gắn chất phát huỳnh quang, con vt mc bnh di - Phản ứng âm tính: Không có hiện tợng phát sáng, do không có sự kết hợp kháng nguyên - kháng thể. * K thut min dch hunh quang giỏn tip Dựng khỏng khỏng th ó nhum mu hunh quang phỏt hin khỏng nguyờn cn chn oỏn. Chun b: - Chun b khỏng nguyờn nghi: ging nh trong phn ng trc tip. - Chun b khỏng th khỏng Ig: dựng Ig ca th tiờm cho g trng, sau 2 - 3 tun l, ly mỏu g, cht huyt thanh, ri tỏch phn Ig, s thu c khỏng khỏng th khỏng Ig ca th, em nhum mu hunh quang. - Chun b khỏng th c hiu: ging nh trong phn ng hunh quang trc tip nhng khỏng th khụng nhum mu hunh quang. Tin hnh phn ng: - Nh 1 - 2 git khỏng th c hiu lên phiến kính. Để tác động 15 phút, rồi rửa nớc. - Nhỏ tiếp 1 - 2 giọt kháng kháng thể đã gắn chất phát huỳnh quang. Để tác động một thời gian, rửa nớc, để khô. c kt qu di kớnh hin vi hunh quang. Kt qu: - Phản ứng dơng tính: Có hiện tợng phát sáng, tức là có hiện tợng kết hợp kháng nguyên + kháng thể + kháng kháng thể, con vt mắc bệnh. Trong bệnh phẩm có virus dại - Phản ứng âm tính: Không có hiện tợng phát sáng, tức là không có hiện tợng kết hợp kháng nguyên + kháng thể + kháng kháng thể. Bởi vì kháng nguyên và kháng thể không tơng ứng, không có sự kết hợp kháng nguyên - kháng thể, kháng thể bị rửa trôi. Con vật không bị bệnh dại. ứng dụng phản ứng miễn dịch huỳnh quang chẩn đoán bệnh dịch tả lợn - Chuẩn bị: + Kháng thể: là kháng thể dịch tả lợn đã nhuộm màu huỳnh quang + Kháng nguyên nghi: lấy bệnh phẩm của lợn nghi mắc bệnh dịch tả lợn (lách, hạch ) làm thành tiêu bản. - Phơng pháp tiến hành: + Nhỏ lên tiêu bản 1 - 2 giọt kháng thể dịch tả lợn đã nhuộm màu huỳnh quang, để trong hộp ẩm 1 gi ở nhiệt độ 37 0 C. Sau đó rửa nớc, để khô và đọc kết quả dới kính hiển vi huỳnh quang. - 156 - - Kết quả: + Phản ứng dơng tính: Có hiện tợng phát sáng do có sự kết hợp của kháng nguyên - kháng thể đã gắn chất phát huỳnh quang. Con vật bị bệnh dịch tả lợn + Phản ứng âm tính: Không có phát sáng, do không có sự kết hợp kháng nguyên - kháng thể. Con vật không mắc bệnh. 3.2. Phản ứng miễn dịch gắn enzyme ELISA (Enzyme linked Immuno Sorbent Assay) 3.2.1. Nhng hiu bit chung v phn ng ELISA Khỏi nim ELISA (Enzyme linked Immunosorbent Assay) l mt k thut xột nghim min dch da trờn c ch kt hp c hiu gia khỏng nguyờn v khỏng th (khỏng th cú gn enzyme) v dựng c cht c hiu vi enzym phỏt hin phc hp khỏng nguyờn khỏng th. Nguyờn lý chung Dựng khỏng th hoc khỏng khỏng th c gn enzyme ri cho kt hp trc tip hoc giỏn tip vi khỏng nguyờn, sau ú cho c cht phự hp vi enzyme vo, enzyme s tỏc ng n c cht to mu, khi c trong quang ph k s xỏc nh c mt quang hc v da trờn mt quang hc ngi ta s ỏnh giỏ c mc ca phn ng. Cỏc enzyme dựng cho phn ng ELISA phi cú hot tớnh cao, ngi ta hay dựng Peroxydaza, Alkalin photphataza, Beta - galactosidaza. Cỏc c cht phi chn sao cho phự hp vi enzyme, khi tỏc ng cú th o c mu quang ph k. Peroxydaza l enzyme ph bin trong ELISA gn vi khỏng th. C cht hay dựng l 3 3 diamin benzidin, di tỏc dng ca oxy, peroxydaza s cho mu nõu sm. Cỏc bc chun b cho phn ng ELISA + Gn khỏng nguyờn hoc khỏng th to KIT (pha rn - Solid phase): Dựng khỏng nguyờn hoc khỏng th ó bit gn lờn a phn ng to KIT. Vic la chn giỏ th lm ELISA ó cú nhiu thay i. Lỳc u ngi ta chn cỏc que, ng, cỏc viờn bi vi cỏc cht liu khỏc nhau (thu tinh, nha) lm giỏ th. Nhng s dng giỏ th loi ny rt cng knh, mt nhiu thi gian, nờn ngi ta ó nghiờn cu v ó a ra mt loi giỏ th thớch hp cho ELISA, ú l bn nha 96 ging. Vi loi bn nha ny cựng mt lỳc cú th kim tra c nhiu mu, tin li trong s dng v khụng phi ly tõm. Hin nay, a nha loi polystyrene c dựng khỏ ph bin. Ngi ta cho khỏng nguyờn hoc khỏng th hp ph th ng lờn giỏ th, phn k nc (hydropholic) ca khỏng nguyờn hoc khỏng th s gn vi mt rn, phn a nc (hydrophilic) s quay ra ngoi lm khỏng nguyờn hoc khỏng th s gn rt cht vo giỏ th. S hp ph ca khỏng nguyờn hay khỏng th trờn giỏ th nhiu hay ớt ph thuc vo cỏc yu t: - H s khuych tỏn ca cỏc phõn t c hp ph. - T l gia din tớch b mt ca cỏc ging v th tớch ca dung dch gn khỏng nguyờn. - Nng dung dch gn khỏng nguyờn. - Thi gian hp ph khỏng nguyờn. - Nhit ca quỏ trỡnh hp ph. Sau ú tin hnh ra a gn khỏng nguyờn hoc khỏng th, õy l mt khõu quan trng, nh hng nhiu n s thnh cụng ca phn ng. Bi vỡ, nu ra khụng trit s cũn sút li khỏng nguyờn hoc khỏng th tha v nh vy khụng loi b c yu t liờn kt khụng c hiu, iu ú s lm sai lc phn ng. ra a, ngi ta phi la chn mt dung dch m phự hp. Hin nay ngi ta s dng rng rói dung dch PBS (photphate buffer saline), Tween - 20 cú nng 0,05% l dung dch m tt nht. Tween - 20 va cú tỏc dng loi b nhng liờn kt khụng c hiu, va cú tỏc dng lp ch trng trờn b mt giỏ th. + To Conjugate (liờn kt enzyme - khỏng th) Vic la chn enzyme thớch hp ch conjugate cn t nhng tiờu chun sau: + Enzym phi cú hot tớnh cao v n nh; + An ton, r tin, d kim; + Cú kh nng phõn gii nhiu c cht khỏc nhau. - 157 - Cơ chất KKT gắn enzym KT đặc hiệu virus Đĩa phản ứng Hình 6.15. Mô phỏng phản ứng ELISA gián tiếp Ph bin hn c l Peroxydase v Alkalin photphataza. Mun to conjugate, enzyme khụng th gn trc tip vi khỏng th m phi thụng qua tỏc nhõn gn (cross linking agent). Cỏc tỏc nhõn ny ớt nht cú hai nhúm hot ng, mt nhúm s kt hp vi khỏng th v mt nhúm s kt hp vi enzyme. Cỏc tỏc nhõn hay c s dng l glutaraldehyde v periodate. pha loóng conjugate cú nh hng n thi gian v thi gian phn ng vi c cht. Khi conjugate pha loóng nhiu thỡ thi gian di v thi gian phn ng vi c cht lõu hn. + La chn c cht: Mc ớch ca vic la chn c cht l lm sao cho c cht phi phự hp vi enzyme trong conjugate, c cht t yờu cu phi an ton, r tin, d s dng, cú h s to mu cao giỳp vic xỏc nh s kt hp gia khỏng nguyờn v khỏng th d dng. Ngi ta thng s dng nhng c cht nh bng di õy: Cỏc c cht thng dựng cho phn ng ELISA C cht Dung dch m Bc súng hp ph (nm) Sinh mu Kh nng ho tan trong nc ABTS (2,2 azino - di - (3 ethylbenzthiazlinsulphonate (6)) Photphate/citrate pH 4,2 405 - 414 Xanh lỏ cõy Cú TMB 3,3 , 5,5 tetramethyl benzidin Acetat pH 5,6 450 - 650 Xanh da tri n vng sau khi d ng phn ng bng acid Cú OPD (1,2 phenylenediamined hydro chloride Photphate/citrate pH 5,0 492 Da cam Cú Tuluidin Photphate/citrate pH 4,2 450 - 625 Xanh da tri vng sau khi dựng phn ng Cú 3.2.2. Cỏc dng c bn ca phn ng ELISA Phản ứng ELISA trực tiếp (Direct ELISA) Dùng để phát hiện kháng nguyên: - Cho kháng nguyên cần chẩn đoán hấp phụ lên các lỗ bản nhựa, để một thời gian, rửa nớc nhằm loại bỏ kháng nguyên không gắn. - Cho kháng thể đặc hiệu đã gắn enzyme vào, để một thời gian, rửa nớc. - Cho cơ chất đặc hiệu với enzyme vào, để một thời gian. - Cho chất dừng phản ứng vào. Đọc kết quả trên quang phổ kế. + Phản ứng dơng tính: có màu xuất hiện tức là có kháng nguyên tơng ứng với kháng thể đặc hiệu. So màu trong quang phổ kế để định lợng mức độ của phản ứng. + Phản ứng âm tính: không xuất hiện màu. + Nhc im ca phn ng ny l phi gn Enzyme cho tt c cỏc loi khỏng th tng ng dựng tỡm cỏc loi khỏng nguyờn khỏc nhau, nờn ngi ta ớt dựng phn ng ny. Phản ứng ELISA gián tiếp (Indirect ELISA) Dùng để phát hiện kháng thể - Cho kháng nguyên đã biết hấp phụ lên bản nhựa, để một thời gian (qua đêm), rửa n- ớc nhằm loại bỏ kháng nguyên thừa. E Rửa nớc Rửa nớc E Kháng thể Kháng nguyên Kháng thể gắn enzyme Cơ chất E Gắn kháng nguyên Cho kháng thể vào Cho cơ chất vào Hình 6.14. Mô phỏng phản ứng ELISA trực tiếp - 158 - Cơ chất Enzym KT gắn enzym Virus KT đặc hiệu của virus Đĩa phản ứng - Cho huyết thanh cần chẩn đoán vào, để một thời gian, rửa nớc. - Cho kháng kháng thể tơng ứng gắn enzyme vào, để một thời gian, rửa nớc. - Cho cơ chất đặc hiệu với enzyme vào, để một thời gian. Sau ú cho cht dng phn ng vo, đọc kết quả. Phản ứng dơng tính: Có xuất hiện màu. So màu trong quang phổ kế để định lợng mức độ của phản ứng. Phản ứng âm tính: Không xuất hiện màu. Phản ứng Sandwich ELISA Có hai dạng phản ứng Sandwich ELISA là: * Sandwich ELISA trực tiếp (Direct Sandwich ELISA) Dùng để phát hiện kháng nguyên: Cỏc bc tin hnh: + Cho kháng thể đã biết hấp phụ lên các lỗ của bản nhựa, ủ một thời gian, rửa nớc. + Cho kháng nguyên nghi vào, để một thời gian rồi rửa nớc + Cho kháng kháng thể có gắn enzyme vào, để một thời gian, rửa nớc, sau đó cho cơ chất đặc hiệu với enzim vào mt thi gian. + Cho cht dng phn ng vo. + Đọc kết quả trên quang phổ kế. Phản ứng dơng tính: Có xuất hiện màu. So màu trong quang phổ kế để định lợng mức độ của phản ứng. Phản ứng âm tính: Không xuất hiện màu. Hỡnh 6.16. Mụ phng phn ng Sandwich ELISA trc tip * Sandwich ELISA gián tiếp (Indirect Sandwich ELISA) Dùng để phát hiện kháng thể: Hỡnh 6.17. Mụ phng phn ng Sandwich ELISA giỏn tip AP (hoặc HRP) KKT gắn enzym HRP Chuỗi xoắn Cơ chất Biotin Kháng thể phát hiện KT giữ KN Giá thể Giá thể Gắn kháng thể Cho kháng nguyên Thêm KT có gắn enzym Cho cơ chất và so màu E E Rửa nớc Rửa nớc Rửa nớc E Kháng thể Kháng nguyên Kháng thể gắn enzyme Cơ chất - 159 - Cỏc bc tin hnh + Cho khỏng th ó bit hp ph lờn cỏc l ca bn nha, ủ một thời gian, rửa nớc. + Cho khỏng nguyờn chun vào, để một thời gian, rửa nớc. + Cho khỏng th nghi vào, để một thời gian, rửa nớc. + Cho khỏng kháng th cú gn enzyme, để một thời gian, rửa nớc. + Cho c cht vào. + Cho cht dng phn ng vo. Đọc kết quả trên quang phổ kế. Phản ứng dơng tính: Có xuất hiện màu. So màu trong quang phổ kế để định lợng mức độ của phản ứng. Phản ứng âm tính: Không xuất hiện màu. Phản ứng ELISA cạnh tranh Phản ứng ELISA cạnh tranh để phát hiện kháng nguyên. * Các bớc tiến hành: + Cho khỏng th ó bit hp ph lờn cỏc l ca bn nha, ủ một thời gian, rửa nớc. + Cho kháng nguyên nghi vào, để một thời gian, rửa nớc nhằm loại bỏ kháng nguyên thừa. + Cho kháng nguyên đã biết có gắn enzyme vào, để một thời gian, rửa nớc. Cho cơ chất phù hợp với enzyme vào, để một thời gian. Sau ú cho cht dng phn ng vo. + Đọc kết quả: Phản ứng dơng tính: không xuất hiện màu, do kháng nguyên nghi phù hợp với kháng thể đã biết nên cạnh tranh sự kết hợp của kháng nguyên chuẩn có gắn enzyme Phản ứng âm tính: phức hợp xuất hiện màu đặc trng, do kháng nguyên nghi không phù hợp với kháng thể nên bị rửa trôi. Kháng nguyên đã biết có gắn enzyme trực tiếp kết hợp với kháng thể gắn trên kit. Khi cho cơ chất phù hợp vào sẽ tạo màu Hình 6.18. Mô phỏng phản ứng Elisa cạnh tranh để phát hiện kháng nguyên Phản ứng ELISA cạnh tranh để phát hiện kháng thể * Các bớc tiến hành: + Cho khỏng th ó bit hp ph lờn cỏc l ca bn nha, ủ một thời gian, rửa nớc. + Cho kháng nguyên đã biết vào, để một thời gian, rửa nớc nhằm loại bỏ kháng nguyên thừa. Đĩa gắn kháng thể Rửa Rửa Chuyển tiếp Cho KN có gắn enzym và KN cha biết Cho KN có gắn enzym Cho cơ chất của enzym Mất màu (Thí nghiệm) Có màu (Đối chứng âm) - 160 - + Cho kháng thể nghi vào, để một thời gian, rửa nớc. + Cho kháng thể chuẩn đặc hiệu với kháng nguyên đã gắn enzyme, để một thời gian, rửa nớc. + Cho cơ chất đặc hiệu với enzyme. + Cho cht dng phn ng vo. + Đọc kết quả: Phản ứng dơng tính: phức hợp không xuất hiện màu, do kháng thể nghi phù hợp với kháng nguyên đã biết nên cạnh tranh sự kết hợp của kháng thể chuẩn có gắn enzyme Phản ứng âm tính: phức hợp xuất hiện màu đặc trng, do kháng thể nghi không phù hợp với kháng nguyên chuẩn nên bị rửa trôi. Kháng thể đã biết có gắn enzyme trực tiếp kết hợp với kháng nguyên đã biết. Khi cho cơ chất phù hợp vào sẽ tạo màu. * Phng phỏp NSP - ELISA (Non structure protein - ELISA) Nguyờn lý: Virus sau khi xõm nhp vo c th s nhõn lờn, to ra trong t bo cỏc thnh phn ca mỡnh trong ú cú: protein cu trỳc (Structure Protein) tham gia cu trỳc nờn ht virus mi v protein khụng cu trỳc (NSP - Non structure protein) l enzyme xỳc tỏc tng hp cỏc thnh phn ca virion. Trong ú, NSP cú tớnh khỏng nguyờn kớch thớch c th to ra mt lng ln khỏng th, khỏng th ny tn ti nhiu trong huyt thanh con vt bnh. Khi tiờm vacxin vụ hot vo c th, virus ó b vụ hot khụng cú kh nng nhõn lờn, nờn khụng sn sinh ra NSP, do vy khụng cú khỏng th khỏng NSP. u im: Phỏt hin khỏng th c hiu khỏng khỏng nguyờn NSP t ú cú th xỏc nh c con vt ang b nhim virus vi bt k serotyp no. Phng phỏp ny cho php phõn bit c khỏng th to ra do con vt ang b nhim bnh hay do con vt c tiờm phũng vacxin vụ hot, t ú giỳp cho vic chn oỏn chớnh xỏc bnh Khỏng nguyờn NSP xut hin sm nht sau 8 ngy nhim virus trõu bũ v 10 ngy dờ cu 3.2.2. ng dng phn ng ELISA trong chn oỏn mt s bnh truyn nhim * Phng phỏp ELISA giỏn tip trong chn oỏn hi chng ri lon sinh sn v hụ hp ln (PPRS) - Nguyờn liu: B Kit INDEXX Herd Check gm: + a nha 96 ging + i chng dng, õm + Nc ra 10X + Dung dch pha loóng mu (Sample Diluent) + Antiporcine HRPO conjugate khỏng khỏng th gn enzyme. + TMB (3, 3, 5, 5 tetra methyl benzidine) substrate c cht ca phn ng ELISA. + Dung dch dng phn ng (stop solution) Mu huyt thanh cn chn oỏn - Chun b: + Mu huyt thanh cn chn oỏn: Ly mỏu con vt nghi mc bnh, cht huyt thanh, pha loóng nng 1/40 (10 l huyt thanh + 390l PBS) + Nguyờn liu dựng cho phn ng: Trc khi lm phn ng, ly ra nhit phũng t 5 10 phỳt. - 161 - + Chuẩn bị đĩa phản ứng. - Các bước tiến hành phản ứng: Bước 1: - Nhỏ huyết thanh đối chứng dương và âm theo đúng sơ đồ đĩa ELISA với số lượng 100µl. - Nhỏ mẫu huyết thanh cần chẩn đoán vào các vị trí từ 1 – 46 (theo sơ đồ), mỗi giếng 100µl. Bước 2: Ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng Bước 3: Rửa đĩa 3 – 5 lần bằng nước rửa, mỗi lần rửa cho vào mỗi giếng 300µl Bước 4: Nhỏ 100µl Conjugate vào tất cả các giếng. Bước 5: Ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút Bước 6: Rửa đĩa 3 – 5 lần bằng nước rửa, mỗi lần rửa cho vào mỗi giếng 300µl Bước 7: Nhỏ 100µl TMB Bước 8: Để ở nhiệt độ phòng trong 15 phút Bước 9: Nhỏ 100µl dung dịch dừng phản ứng vào các giếng. Bước 10: Kết quả được đọc trên máy ELISA Labsystems multiskan MS ở bước sóng 650nm Bước 11: Tính kết quả dựa vào công thức OD mẫu PRRS – OD NHC S/P = OD pos PRRS – OD NHC Chú thích: OD mẫu PRRS: Giá trị OD của mẫu huyết thanh cần kiểm tra OD NHC: Giá trị OD của huyết thanh đối chứng âm OD pos PRRS: Giá trị OD của huyết thanh đối chứng dương S/P >= 0,4 là dương tính * Lưu ý: Kết quả ELISA chính xác cần thỏa mãn các điều kiện: PC(PRRS) – NC(PRRS) >= 0,15 PC(NHC) <= 0,12 NC(NHC) <= 0,25 * Sơ đồ đĩa ELISA 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 PRRS NHC PPRS NHC PPRS NHC PPRS NHC PPRS NHC PPRS NHC A ĐC(+) ĐC(+) 7 7 15 15 23 23 31 31 39 39 B ĐC(-) ĐC(-) 8 8 16 16 24 24 32 32 40 40 C 1 1 9 9 17 17 25 25 33 33 41 41 D 2 2 10 10 18 18 26 26 34 34 42 42 E 3 3 11 11 19 19 27 27 35 35 43 43 F 4 4 12 12 20 20 28 28 36 36 44 44 G 5 5 13 13 21 21 29 29 37 37 45 45 H 6 6 14 14 22 22 30 30 38 38 46 46 * Phương pháp ELISA gián tiếp trong chẩn đoán bệnh lở mồm long móng Ở những gia súc bị nhiễm virus lở mồm long móng (LMLM), virus sẽ nhân lên trong tế bào. Trong quá trình nhân lên của virus có tạo ra: protein cấu trúc (structure protein) và [...]... Năm 194 3, Landsteiner phân miễn dịch thành 2 loại: dịch thể và tế bào Năm 195 8, Medawar đã chứng minh các lympho là những tế bào có khả năng miễn dịch Wesslen ( 195 2), Bloom ( 196 7) nhận thấy phản ứng quá mẫn muộn có thể truyền thụ động bằng các lympho bào đã mẫn cảm Năm 196 7, Mackanes và Blanden với nhiều nghiên cứu thực nghiệm đã chứng minh: - Phản ứng quá mẫn muộn, phản ứng ghép chỉ có thể truyền... miễn dịch Năm 195 8, công trình của Ederman về trình tự axit amin của globulin miễn dịch - 164 - Năm 197 5, Milstein và Kohler đưa ra phương pháp sản xuất kháng thể đơn dòng bằng kỹ thuật liên hợp tế bào Myeloma với tế bào lympho B hoạt hoá của chuột Hai mươi năm sau ( 194 1 - 194 2) bằng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang, Coons nhận thấy sự hiện diện của khỏng nguyờn, kháng thể nằm bên trong tế bào Năm 194 3,... dụng với các đối tượng này Để có được một lượng lớn huyết thanh miễn dịch, người ta thường gây miễn dịch cho ngựa Việc sử dụng huyết thanh miễn dịch từ ngựa kháng dại, kháng bạch hầu, kháng nọc rắn trong điều trị đã cứu sống được rất nhiều người, đó là một dấu mốc trong lịch sử Y học Tuy nhiên với người, đây là miễn dịch dị loài nên dễ có tai biến khi dùng Sau này ngời ta đã tinh chế được Ig miễn dịch. .. luận: huyết thanh thỏ được gây miễn dịch với độc tố có khả năng trung hòa độc tố và có tính đặc hiệu cao Hiệu quả trung hòa được quyết định bởi các đoạn protein có trong huyết thanh động vật và có thể kết tủa chúng với (NH4)2SO4, đó chính là Globulin miễn dịch (Ig) Huyết thanh chứa Ig đợc gọi là huyết thanh miễn dịch hay kháng huyết thanh Huyết thanh miễn dịch và tế bào miễn dịch là vũ khí duy nhất bảo... bệnh khác Năm 190 1, thuyết kháng thể được ra đời Năm 191 7, Landsteiner phát hiện những chất có phân tử lượng nhỏ (Hapten) cũng có tính khỏng nguyờn đã thúc đẩy hoá miễn dịch phát triển mạnh Năm 192 9, Heidelberger đưa ra phương pháp Huyết thanh học định lượng Năm 193 8, Kabat dùng điện di để phân tách các thành phần huyết thanh để xác định kháng thể nằm ở vùng globulin Năm 195 8, công trình của Porter... tượng thực bào là phương tiện bảo vệ cơ thể Năm 1887 thuyết dịch thể ra đời Học thuyết chỉ ra rằng khả năng miễn dịch của cơ thể là do chất nào đó có trong huyết thanh và dịch tiết của cơ thể Năm 1 890 , Koch phát hiện phản ứng của da khi tiếp xúc với khỏng nguyờn của vi khuẩn lao là hình thái quá mẫn muộn trong đó tế bào tham gia là chủ yếu Năm 1 891 , Emin Behring (Đức) đã nghiên cứu sản xuất ra kháng huyết... TR BNH TRUYN NHIM CA VT NUễI Mục tiêu: Nắm được những kiến thức cơ bản và ứng dụng kháng huyết thanh trong điều trị bệnh truyền nhiễm Kiến thức trọng tâm: ứng dụng của kháng thể dịch thể đặc hiệu trong điều trị bệnh Sản xuất kháng huyết thanh và các chế phẩm kháng thể ứng dụng để chẩn đoán và điều trị I LCH S PHT HIN Năm 1 890 Emil von Behring và Kitasato thông báo thí nghiệm: tiêm độc tố vi khuẩn... a phn ng CHEKIT FMD - 3ABC - BO - OV dựng cho huyt thanh trõu bũ 1 2 3 4 5 6 A N N 13 21 29 37 B P P 14 22 30 38 C 1 7 15 23 31 39 D 2 8 16 24 32 40 E 3 9 17 25 33 41 F 4 10 18 26 34 42 G 5 11 19 27 35 43 H 6 12 20 28 36 44 7 8 9 10 11 12 92 Chỳ thớch: N: huyt thanh chng õm P: Huyt thanh i chng dng 1, 2, , 92 : huyt thanh cn kim tra Chun b: + Mu huyt thanh cn chn oỏn: Ly mỏu con vt nghi mc bnh, cht... ứng miễn dịch dịch thể chỉ có thể truyền thụ động bằng huyết thanh mà không có thể bằng tế bào II KHNG TH C HIU V NG DNG Khỏng th c hiu là chất được cơ quan, tế bào miễn dịch sản xuất ra khi có sự kích thích của khỏng nguyờn, chúng sẽ tương tác với khỏng nguyờn theo nhiều cách khác nhau, mục đích cuối cùng là vô hiệu hoá và loại trừ khỏng nguyờn ra khỏi cơ thể Khỏng thể đặc hiệu gồm có: khỏng thể dịch. .. tính, cơ thể động vật chưa có miễn dịch, trong khi ú mm bnh li tn cụng t nờn có thể sử dụng kháng huyết thanh đưa vào cơ thể tạo miễn dịch thu c nhõn to bị động, giúp con vật thoát cơn nguy hiểm Các loại kháng huyết thanh dùng trong điều trị bệnh: * Kháng huyết thanh dị loài: Là kháng huyết thanh được sản xuất từ động vật khác loài Trc đây khi chưa có kháng sinh, người ta sử dụng huyết thanh ngựa hay . làm phản ứng trung hòa? 7. Trình bày phản ứng miễn dịch huỳnh quang và ứng dụng của nó? 8. Trình bày hiểu biết chung về phản ứng ELISA? 9. Các dạng cơ bản của phản ứng ELISA - ứng dụng? -. chẩn đoán? 3. Trình bày phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI) trong chẩn đoán? 4. Trình bày phản ứng kết tủa và những ứng dụng trong chẩn đoán? 5. Phản ứng kết hợp bổ thể, ứng dụng? 6. Các. (NH 4 ) 2 SO 4 , đó chính là Globulin miễn dịch (Ig). Huyết thanh chứa Ig đợc gọi là huyết thanh miễn dịch hay kháng huyết thanh. Huyết thanh miễn dịch và tế bào miễn dịch là vũ khí duy nhất bảo vệ