Kh¸i niÖm chung ADN t¸i tæ hîp ®−îc thùc hiÖn nh− thÕ nµo? T¸ch chiÕt vµ tinh s¹ch c¸c axit nucleic T¹o vÐct¬ t¸i tæ hîp Néi dung 7 T¹o vÐct¬ t¸i tæ hîp C¸c lo¹i enzym sö dông trong ADN t¸i tæ hîp Nh©n dßng gen vµ x©y dùng ng©n hµng gen Sµng läc c¸c dßng gen trong ng©n hµng gen ADN tái tổ hợp thực hiện nh thế nào? Các bớc cơ bản thực hiện ADn tái tổ hợp 1. Chọn nguồn gen cần tách dòng chứa trình tự quan tâm. 2. Chuẩn bị ADN ngoại lai có các đầu 3, 5 phù hợp. 3. Chọn lọc véctơ (thể truyền) phù hợp. 4. Cải biến đầu 3 và 5của véctơ và phân tử ADN ngoại lai. 8 5. Nối phân tử ADN véctơ và ADN ngoại lai. 6. Đa véctơ tái tổ hợp vào tế bào chủ và nhân lên. 7. Sàng lọc để chọn các dòng tế bào mang véctơ tái tổ hợp. 8. Xác định đặc tính các dòng, và sử dụng các dòng cho các mục đích nghiên cứu khác nhau. Kh¸i niÖm chung ADN t¸i tæ hîp ®−îc thùc hiÖn nh− thÕ nµo? T¸ch chiÕt vµ tinh s¹ch c¸c axit nucleic T¹o vÐct¬ t¸i tæ hîp Néi dung 9 T¹o vÐct¬ t¸i tæ hîp C¸c lo¹i enzym sö dông trong ADN t¸i tæ hîp Nh©n dßng gen vµ x©y dùng ng©n hµng gen Sµng läc c¸c dßng gen trong ng©n hµng gen Tách chiết và tinh sạch axit nucleic Một số nguyên tắc cơ bản Tách chiết ADN Các dung môi hữu cơ làm mất nớc, thay đổi môi trờng điện môi kết tủa protein & ADN. Độ pH thờng trung tính hoặc hơi kiềm (7,0 8,5). Phenol, chloroform, isoamylalcohol thờng đợc dùng để kết tủa protein (vd. Chloroform/isoamylalcohol 24/1). Một số hợp chất chống oxy hóa nh 2 - mercapthoethanol, DTT 10 Một số hợp chất chống oxy hóa nh 2 - mercapthoethanol, DTT (dithiothreito), 8-hydroxyquinoline làm giảm nguy cơ gây biến tính axit nucleic. SDS làm vỡ màng tế bào. EDTA loại các ion kim loại. Các dung môi alcohol (vd. EtOH, MeOH, 2-propanol) đợc dùng để kết tủa axit nucleic. Các muối (vd. acetate) trung hòa điện tích và làm giảm khả năng tan của axit nucleic. T o -20 o C / 0 o C (1/2h 24h). CTAB loại bỏ các hợp chất polysaccharide / polyphenol ở thực vật. Lysozyme đợc dùng để phân giải lớp peptidoglycan ở vi khuẩn. T¸ch chiÕt vµ tinh s¹ch axit nucleic BỔ SUNG PHENOL ADN vµ ARN trong n−íc LẮC MẠNH LY TÂM 11 DÙNG PHENOL LOẠI PROTEIN KHỎI DỊCH CHIẾT ADN VÀ ARN ADN, ARN vµ protein trong pha n−íc Phenol Protein trong phenol Tách chiết và tinh sạch axit nucleic Một số nguyên tắc cơ bản Tách chiết aRN Để tách chiết mARN, ngời ta thờng dùng cột Oligo dT celluloza, hoặc cột hấp thụ từ tính với biotin-oligo(dT). Định tính và định lợng ADN dựa trên phơng pháp điện di và đo quang phổ ở các bớc sóng 260 và 280 nm. 1 , 0 A 260 nm 50 à à à à g / ml dsADN 12 1 , 0 A 260 nm 50 à à à à g / ml dsADN 1,0 A 260nm 40 à à à àg / ml ssADN / ARN 1,0 A 260nm 33 à à à àg / ml dNTP / oligonucleotide . hµng gen ADN tái tổ hợp thực hiện nh thế nào? Các bớc cơ bản thực hiện ADn tái tổ hợp 1. Chọn nguồn gen cần tách dòng chứa trình tự quan tâm. 2. Chuẩn bị ADN ngoại lai có các đầu 3, 5 phù hợp. 3 lợng ADN dựa trên phơng pháp điện di và đo quang phổ ở các bớc sóng 26 0 và 28 0 nm. 1 , 0 A 26 0 nm 50 à à à à g / ml dsADN 12 1 , 0 A 26 0 nm 50 à à à à g / ml dsADN 1,0 A 26 0nm . Chọn lọc véctơ (thể truyền) phù hợp. 4. Cải biến đầu 3 và 5của véctơ và phân tử ADN ngoại lai. 8 5. Nối phân tử ADN véctơ và ADN ngoại lai. 6. Đa véctơ tái tổ hợp vào tế bào chủ và nhân lên. 7.