Tái lập trình nhân (NUCLEAR REPROGRAMMING) ppt

http://www.ebook.edu.vn TÁI LẬP TRÌNH NHÂN (NUCLEAR REPROGRAMMING) I. TÁI LẬP TRÌNH TẾ BÀO SINH DƯỠNG 1. Khái niệm Tái lập trình nhân là thuật ngữ dùng mô tả kỹ thuật cho phép thay đổi tiềm năng phát triển hay định hướng của tế bào. Tái lập trình nhân là lấy nhân từ một tế bào đã xác định của cơ thể (tế bào sinh dưỡng như tế bào da) và chuyển nó vào một tế bào gốc đã được loại bỏ nhân, khi đó, tế bào chuyển nhân thu được có khả năng phát triển thành nhiều loại tế bào khác nhau. Có 2 hướng tái lập trình nhân là chuyển nhân vào tế bào sinh dưỡng (somatic cell nuclear transfer SCNT) và tạo từ tế bào iPS (induced pluripotent stem cells). 2. Các hình thức chuyển nhân http://www.ebook.edu.vn a. Chuyển nhân tế bào sinh dưỡng Là phương pháp chuyển nhân của một tế bào sinh dưỡng vào một tế bào phôi đã lấy nhân. Khi đó, nhân của tế bào được chọn sẽ tái lập trình lại trong điều kiện tế bào chất của tế bào nhận. Hạn chế của phương pháp này là tiềm năng của phôi và hiệu quả tạo dòng thấp. Hơn nữa có nhiều sự bất bình thường ở thế hệ tạo dòng, đồng thời có những hạn chế về mặt xã hội khi thực hiện trên người. b. Dung hợp tế bào Tiến hành dung hợp tế bào biệt hóa và tế bào toàn năng có thể hình thành một tế bào vạn năng có khả năng biệt hóa thành nhiều loại tế bào nhưng không có khả năng phát triển thành phôi. Việc tái lập trình của tế bào dung hợp này có thể không ổn định và khó kiểm soát. http://www.ebook.edu.vn c. Dịch chiết tế bào Những tế bào thấm được có thể thu nhận dịch chiết của những tế bào vạn năng. Tế bào được xử lý với những marker vạn năng tái biểu hiện và tái biệt hóa thành những dòng khác nhau. Phương pháp này có những biểu hiện hạn chế của tế bào ngườn ban đâu và việc tái lập trình chỉ xảy ra ở mưc độ giới han thấp. d. Cấy ghép tế bào Sự biểu hiện ngoài nhân của các gene kiểm soát quá trình tái lập trình có thể vai trò như đối với những tế bào vạn năng giúp quá trình xảy ra và hình thành những tế bào vạn năng mới. Tuy nhiên, việc tái kích hoạt những gene chuyển vị có thể là xuất hiện các oncogen làm chết cá thể con vì ung thư. II. CÁC YẾU TỐ KIỂM SOÁT QUÁ TRÌNH TÁI LẬP TRÌNH Phương pháp tách chiết tế bào (cell extract) và chuyển nhân (nuclear transfer) cho thấy có sự tổ chức lại chromatin, sự cải biên DNA và histone trong tái lập trình tế bào sinh dưỡng. Một nghiên cứu khác cho thấy có sự liên quan giữa việc tái hoạt động bất thường của gene Oct-4, Nanog và Sox2 trong blastocyst được tạo dòng từ tế bào sinh dưỡng và sự phát triển bất thường của dòng. Ngược lại, những dòng từ nguồn ES (embryo sterm), EG (embryo germ), EC (embryo carcinoma) thì biểu hiện gene Oct-4 và hiệu quả tạo dòng tăng hơn. http://www.ebook.edu.vn Ngày nay, người ta đã bắt đầu từng bước hiểu về cớ chế trong nhân và ngoài nhân duy trì tình trạng chưa biệt hóa của những tế bào gốc phôi trong khi cho phép những tế bào này duy trì sự cân bằng với những tế bào khác trong sự phát triển của tế bào sinh dưỡng. Rất nhiều yếu tố đều hòa của tiến trình này được ghi nhận bao gồm cả các yếu tố môi trường ngoại bào cũng như các yếu tố trong nhân và ngoài nhân. 1. Các yếu tố ngoài tế bào Các yếu tố ngoài tế bào tham gia điều hòa quá trình tái lập trình nhân bao gồm một phức hợp các yếu tố hoạt động theo những con đường hoạt hóa riêng, đan xen nhau, chủ yếu là từ những tín hiệu truyền tin qua màng. Một số yếu tố cơ bản được biết như sau: http://www.ebook.edu.vn a LIF (leukemia inhibitort factor): là một protein thuộc họ cytokine vai trò cho phép phôi duy trì tính toàn năng. LIF là protein hòa tan và được tiết vào trong serum, trong điều kiện nuôi cấy có bổ sung LIF trong serum cũng cho kết quả tương tự. Cơ chế hoạt động của LIF là bằng cách liên kết với LIFR-gp130 heterodimer tại bề mặt tế bào và hoạt hóa tín hiệu truyền tin Stat3. Sau khi được hoạt hóa, Stat3 sẽ tự phosphoryl hóa và dimmer hóa chính nó trước khi chuyển vị vào bên trong nhân và tại đây, nó hoạt động như là một yếu tố phiên mã. Hiện nay, đích cuối của Stat3 ở vùng downstream vẫn chỉ biết một phần là c-Myc. b. BMP4 là protein thuộc họ TGFβ, BMP4 có khả năng liên kết với receptor kinase của serine hoặc threonine. Vùng downstream của BMP4 là protein SMAD. Chức năng của BMP4 là kiểm soát biệt hóa tế bào hơn là kích hoạt tự sinh. 2. Các gene kiểm soát quá trình tái lập trình trong và ngoài nhân Có 3 gene điều hòa này mã hóa cho yếu tố điều hòa phiên mã quan trọng mà ở những tế bào chưa được biệt hóa không thể hiện bao gồm Oct4, Sox2 và Nanog Nhóm protein Polycomb (PcG) là những yếu tố kìm hãm phiên mã mà chức năng của nó là duy trì sự đồng nhất tế bào trong suốt thời kỳ phát triển cuối thông qua những cải biên ngoài nhân (epigenetic modification) của cấu trúc chromatin. Bằng chứng cho thấy rằng protein PcG có chức năng kìm http://www.ebook.edu.vn hãm phiên mã những gene phát triển trong tế bào ES, biểu hiện của nó có thể xem như một promoter biệt hóa. Nhiều gene đích Oct4, Soc2 và Nanog được xác định cũng là gene đích PcG, quá trình cải biên chromatin có thể diễn ra liên quan đến sự điều hòa 3 gene chìa khóa này. Điều thú vị là cấu trúc chromatin liên quan với rất nhiều gene chìa khòa này lại liên quan đến domain bivalent bao gồm cả kìm hãm những điểm methyl hóa lysine số 27 của histone H3 và kích hoạt methyl hóa lysine số 4 của histone H3. domain bivalent này thì biến mất trong những tế bào đã biệt hóa, nó được cho là một mấu chốt quan trọng trong việc duy trì sự phát triển tính vạn năng của tế bào ES. Do đó, yếu tố toàn năng Oct4, Sox2 và Nanog hoạt động phối hợp cùng PcG để làm im lặng những tác nhân điều hòa phát triển ở trạng thái đa năng, trong khi những gene tương tự, mở những tác nhân điều hòa ngoài nhân hoạt động phiên mã chuẩn bị biệt hóa. Khi những yếu tố điều hòa phiên mã cho tính toàn năng và tự tái sinh trên tế bào ES được hiểu rõ ở mức độ phân tử thì nhiều khả năng tái lập trình nhân trên một loại tế bào thành tế bào khác bằng hoạt động của hệ thống những yếu tố điều hòa này. http://www.ebook.edu.vn Hình sau cho thấy con đường tác động của các yếu tố liên quan trong tái lập trình http://www.ebook.edu.vn Oct4, Sox2 và Nanog là những chìa khóa cho quá trình toàn năng. Trong đó Oct4 (cũng được họi là Pout5f1) và Nanog được xác định là những yếu tố then chốt. a. Gen Oct 4 Oct-4 còn được gọi là Pou5f1, là protein liên kết với DNA vai trò là yếu tố kích hoạt hoặc ngăn cản sự phiên mã của vài gene, đặc biệt là những gene biểu hiện trong suốt giai đoạn phát triển đầu của phôi, do đó oct-4 có vai trò quan trọng trong giai đoạn đầu phát triển và biệt hóa tế bào. Cấu trúc không gian của Oct4 http://www.ebook.edu.vn Oct4 điều hòa biểu hiện gene bằng tương tác với những yếu tố khác trong nhân, bao gồm hộp phiên mã yếu tố Sox2. Ở phôi động vật hữu nhũ thì có 2 lớp tế bào trong giai đoạn phôi 64 tế bào, lớp ngoài là lá phôi (trophetoderm) phát triển thành nhau thai vá các bộ phận khác nuôi thai, lớp trong phát triển thành phôi được gọi là ICM (inner cell mass). Những tế bào ICM có thể phân lập và nuôi cấy invitro thành tế bào gốc phôi ES (embryo stem cell). ES là những tế bào toàn năng có khả năng phát triển thành nhiều loại tế bào khác nhau tương ứng trong nhiều loại mô khác nhau của cơ thể. Và oct-4 chỉ biểu hiện trong những tế bào chưa được đánh dấu biệt hóa có nhiều tiềm năng phát triển như tế bào ES và tế bào EG (embryo germ). Oct-4 duy trì tiềm năng phát triển thành nhiều loại tế bào khác nhau cho tế bào gốc phôi, tuy nhiên khi phôi làm tổ bào tử cung, oct-4 mất đi, và các tế bào đi vào biệt hóa cho ra hơn 200 loại tế bào khác có trong cơ thể. Sự biểu hiện của ost-4 gene được duy trì trong những tế bào gốc có thể tự tái sinh, tuy nhiên, trong tế bào phát triền của nội bì và ngoại bì thì lượng oct-4 khá cao và ngược lại trong tế bào lá phôi. http://www.ebook.edu.vn Bảng so sánh hàm lượng như sau: Phôi thiếu oct-4 phát triển được tới giai đoạn blastocys nhưng bị lỗi sau khi cấy ghép. Phân tích sâu hơn cho thấy blastocys chứa tế bào lá phôi mà thiếu tế bào ICM. Đa số các phôi được tạo dòng bị lỗi đều cho thấy có sự biểu hiện của oct-4 ở cả tế bào lá phôi và tế bào TCM hoặc là thiếu vắng sự biểu hiện ở cả 2 lớp tế bào này. Mức độ cân bằng giữa Oct4 và yếu tố phiên mã Cdx2 (caudal-type homeodomain) chịu ảnh hưởng lẫn nhau. Oct4 liên quan đến thiết lập ICM, nơi mà Cdx2 cần để phát triển lá nuôi phôi. Còn lớp tề bào bên ngoài thì Oct4 lại biến mất, đồng thời Cdx2 cũng có rất hạn chế. b. Gene Sox2 Sox 2 (SRY-type high mobility group box 2) là một protein thuộc họ gồm 20 protein có cấu trúc tương tự như motif liên kết DNA box HMG. Tuy nhiên,Sox2 có vai trò quan trọng trong sự vạn năng của tế bào. Yếu tố điều hòa Sox2 trong vùng promotor của gene cũng nằm gần vị trí liên kết của gene Oct3/4 và gene Nanog. Rất nhiều gene đặc hiệu cho tế bào ES được điều hòa phiên mã bằng liên kết với Sox2 và Oct3/4. [...]... S tái l p trình ngoài nhân không phù h p d n thư ng nguy hi m n s c kh e n nh ng h u qu b t ng v t phát tri n b ng k thu t chuy n nhân Phôi t ngu n t bào chuy n nhân ph i ư c demethyl hóa và có m c methyl hóa cao trong nhân cho c trưng duy trì tính v n năng S phân chia s m b sai l ch c a phôi chuy n nhân chi m t l cao có th do thi u s dimethyl hóa này Tóm l i s tái l p trình trong quá trình chuy n nhân. .. sau khi dung h p 2 t bào v i nhau, và ư c g i là tái l p trình ti n c y ghép (preimplantation reprogramming) Quá trình này h u như liên quan tr c ti p trong t o dòng và h u h t là có nh ng khuy t i m trong quá trình phát tri n dòng trư ng thành Hai là trong su t quá trình hình thành giao t c và cái, ư c g i là tái l p trình giao t (gametogenic reprogramming), tuy nhiên trư ng h p này ch ư c nghiên c... và s phát tri n c a phôi http://www.ebook.edu.vn III TÁI L P TRÌNH NGOÀI NHÂN (EPIGENETIC) Vi c tái c u trúc chromatin cùng v i s tái l p m t chương trình bi u hi n gene m i mà c trưng theo t ng dòng t bào S c i biên bao g m methyl hóa DNA và histone t i m t s v trí, acetyl hóa, phosphoryl hóa và ubiquitine hóa Histone http://www.ebook.edu.vn Quá trình methyl hóa DNA liên quan n vi c g n 1 nhóm methyl... trình bi t hóa i u quan tr ng là không ph i t t c nh ng gene c hi u mô u có nh ng domain bivalent này, và c u trúc chromatin cơ b n trong nh ng gene này và s tái c u trúc c a nó trong s v n năng còn nh ng c trưng khác hơn n a Quá trình tái l p trình phôi t bào ng v t h u nhũ trong t o dòng x y ra vào 2 th i i m M t là ngay sau khi th tinh, hay ngay sau khi dung h p 2 t bào v i nhau, và ư c g i là tái. .. Hình v cytosine và 5-methyl cytosine Methyl hóa x y ra trong vùng chromosome giàu trình t cytosineguanosine l p l i, thư ng u 5’ c a gene Quá trình này dư ng g n như duy trì trong m i chu kỳ phân bào S thay methyl hóa này thì ph thu c t bào sinh im c tu i, ho c s b t thư ng c a t bào H u h t t t c các c i biên ngoài nhân u liên quan n s methyl hóa DNA, c th là s methyl hóa protein histone, m t protein... là histone H1, liên k t c ng hơn trong chromatin c a nh ng t bào ES bi t hóa i u này cho th y protein c u trúc liên k t l ng l o v i chromatin trong t bào v n năng, nên có kh năng tái s p x p l i c u trúc chromatin trong quá trình bi t hóa Tương t như v y, gene c hi u mô ư c cho là im l ng trong t bào chưa bi t hóa có th ít nhi u bi u hi n trong t bào ES Có m t domain bivalent v a ngăn c n histone H3-K27me3... phân chia s m b sai l ch c a phôi chuy n nhân chi m t l cao có th do thi u s dimethyl hóa này Tóm l i s tái l p trình trong quá trình chuy n nhân là m t ti n trình ph c t p c a c h th ng các tín hi u trong và ngoài t bào cũng như trong và ngoài nhân Cho oán liên quan n nay, ch m t s cơ ch ư c hi u, còn l i là nh ng d n ch c năng c a nhi u protein cũng như gene tham gia nhưng chưa ư c bi t rõ http://www.ebook.edu.vn... năng iPS (induced pluripotent stem cells) có nh ng c i m tương t như t bào g c phôi c Nanog T bào thi u Nanog s bi t hóa tùy ý trong l p n i bào nguyên th y Ngư c l i, n u bi u hi n quá s kích thích s t tái sinh cl pv iy ut ngăn ch n Cytokine leukemia (cytokine leukemia inhibitory foctor LIF), ch c năng ư c ho t hóa b i y u t phiên mã Stat3 M c dù con dư ng LIF-Stat3 có th b qua trong t bào ES ngư i,... trùng l p Sox2 – Sox2 overlapping transcrip), có 317 amino acid, 34,4 kDa Domain HMG ch a y u t phiên mã ki m soát kh năng toàn năng cũng như v n năng c a t bào Domain HMG liên k t linh DNA mà không có trình t y ut ng v i c hi u và có th làm u n cong DNA, h n ch i u hòa sau d ch mã g n vào Ph c h p theo t l Sox2:Oct4 là quan tr ng nh t trong h th ng i u hòa gene Sox2 và Oct4 th hi n ng th i r t s m trong . http://www.ebook.edu.vn TÁI LẬP TRÌNH NHÂN (NUCLEAR REPROGRAMMING) I. TÁI LẬP TRÌNH TẾ BÀO SINH DƯỠNG 1. Khái niệm Tái lập trình nhân là thuật ngữ dùng mô tả kỹ thuật cho. SOÁT QUÁ TRÌNH TÁI LẬP TRÌNH Phương pháp tách chiết tế bào (cell extract) và chuyển nhân (nuclear transfer) cho thấy có sự tổ chức lại chromatin, sự cải biên DNA và histone trong tái lập trình. của phôi. http://www.ebook.edu.vn III. TÁI LẬP TRÌNH NGOÀI NHÂN (EPIGENETIC) Việc tái cấu trúc chromatin cùng với sự tái lập một chương trình biểu hiện gene mới mà đặc trưng theo từng