vi tảo (tt) pot

Vietsciences- Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Hoài Hà Cách tiến hành cụ thể: 1. Biến tính ADN (theo hai cách trình bày ở trên). A. Biến tính với glycerol: ADN: 0.5 – 0.3 mg (thể tích tối đa 7 ml). Đệm biến tính plasmid: 5 ml. Primer: 1 ml. Nước cất dẫn đến: 13 ml. Trộn đều, ủ trong 5 phút ở 90 – 100 o C, làm lạnh nhanh trên đá. Bổ sung thêm đệm phản ứng: 2 ml để đạt được tổng thể tích là 15 ml. B. Biến tính với kiềm (không cần kết tủa với ethanol). Thành phần phản ứng gồm: ADN: 0.5 - 3mg (thể tích tối đa là 8ml) NaOH 1M: 2 ml. Primer: 1 ml. Nước cất dẫn đến: 11 ml. Trộn đều, giữ trong 10 phút tại 37 o C, làm lạnh nhanh trên đá. Điều quan trọng trong phương pháp này là bước trung hòa phải được thực hiện chính xác với HCL. Sau đó bổ sung HCL 1M : 2 ml. Đệm phản ứng plasmid: 2 ml. Tổng thể tích là: 15 ml. 2. Bắt cặp mồi vào sợi khuôn: Giữ hỗn dịch ADN và mồi ở 37 o C trong 10 phút, sau đó giữ trên đá lạnh (mẫu chỉ nên dùng trong vòng 4 giờ). 3. Chuẩn bị tube chứa hỗn dịch kết thúc chuỗi: Trong khi thực hiện bước bắt cặp sợi khuôn và sợi mồi, tiến thành hút 2,5 ml hỗn dịch kết thúc chuỗi cho từng loại (ddA, ddC, ddG, ddT) cho vào từng tube riêng biệt. Đậy nắp, để trên đá để dùng cho các bước 5 và 7. 4. Pha loãng dịch đánh dấu: Pha loãng dịch đánh dấu 5 lần với nước và giữ trên đá. Không nên pha loãng dịch đánh dấu khi muốn đọc đoạn ở xa mồi. Dịch đánh dấu: 2 ml Nước: 8 ml Tổng số: 10 ml. 5. Làm ấm các mẫu đá chuẩn bị trong bước 3: Bốn mẫu được chuẩn bị trong bước 3 lần lượt là ACGT được ủ ở 37 o C trong 1 phút. 6. Phản ứng đánh dấu (kể từ bước này thì mọi đầu côn và pipét sẽ thực hiện với hóa chất phóng xạ, do đó cần phải có các biện pháp bảo vệ và đeo găng tay). Bổ sung lần lượt các thành phần sau vào 15 ml hỗn dịch bắt cặp đã được chuẩn bị trong bước 1. DTT 0.1M : 1 ml Dịch đánh dấu (bước 4): 2 ml Hóa chất phóng xạ: S 35 (P 33 , P 32 ): 0.5 ml Enzym T7 sequenase cho plasmid: 2 ml Tổng thể tích : 20.5 ml (Thể tích này sẽ được chia ra 4 phần trong bước 7) Trộn đều (tránh bọt), ủ hỗn dịch tại nhiệt độ phòng 2 -5 phút (đối với plasmid làm biến tính trong glycerol thì ủ 5-10 phút tại nhiệt độ phòng hoặc 5 phút tại 37 o C). Thường bổ sung hỗn dịch T7 sequenase cho plasmid cuối cùng, sau khi các thành phần khác đã được bổ sung. Không bao giờ bổ sung hỗn dịch T7 sequenase cho plasmid vào hỗn dịch đánh dấu, DTT hay hỗn dịch khác không phải là đệm. Chú ý: Nếu trong trường hợp chất phóng xạ S 35 để quá lâu thì có thể tăng lượng lên 2 ml cho mỗi phản ứng, sau đó giảm lượng nước tương ứng. 7. Phản ứng kết thúc chuỗi: a. Lấy 4,5 ml hỗn dịch thu được từ bước 6 cho vào thành trên của 4 tube kết thúc chuỗi đã được làm ấm ở bước 5 (A, C, G, T). Đậy nắp lại và li tâm nhanh để trộn đều, tiếp tục ủ trong 5 phút tại 37 o C (có thể kéo dài tới 30 phút). Nếu thấy cần thiết thì có thể li tâm nhanh để thu lấy hỗn dịch trước khi tiến hành phản ứng đánh dấu. b. Tại thời điểm cuối của 5 phút, bổ sung 4 ml hỗn dịch dừng phản ứng vào thành trên của các tube và đóng nắp nhanh. Như vậy có thể dừng phản ứng tại thời gian thích hợp bằng cách li tâm để dịch dừng phản ứng đi xuống hỗn dịch phản ứng. c. Ngay lập tức li tâm để dịch dừng phản ứng đi xuống hỗn dịch phản ứng, sau bước này phản ứng đánh dấu đã hoàn tất và mẫu có thể được giữ ở 4 o C để sử dụng trong ngày hôm sau. d. Xử lý ở nhiệt độ 75 o C cho các mẫu khoảng 2-3 phút ngay trước khi tra mẫu lên gel, với các mẫu chứa glycerol thì việc lên mẫu dễ dàng với đầu côn vàng. e. Lên khoảng 2-3 ml mẫu cho mỗi giếng trên gel giải trình tự. Nên đưa một lượng đồng mẫu trên các giếng. Cách tốt nhất để lên mẫu không bị bọt là hút 3 ml mẫu nhưng khi tra chỉ dùng 2 ml là đủ. . Vietsciences- Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Hoài Hà Cách tiến hành cụ thể: 1. Biến tính ADN (theo. 75 o C cho các mẫu khoảng 2-3 phút ngay trước khi tra mẫu lên gel, với các mẫu chứa glycerol thì vi c lên mẫu dễ dàng với đầu côn vàng. e. Lên khoảng 2-3 ml mẫu cho mỗi giếng trên gel giải trình