Khóa luận tốt nghiệp Nông học: Thiết lập quy trình nhân giống cây bạc hà lục in vitro (Mentha spicata L.)

253.2 Thí nghiệm 2: Khao sát sự anh hưởng của nồng độ BA đến sự tao chồi của đốt thancay bac hale 7 ĐIỆN cman aneurin 293.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của cường độ ánh sáng va sự t

TRUONG ĐẠI HỌC NONG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA NONG HOC

KHOA LUAN TOT NGHIEP

THIET LAP QUY TRINH NHAN GIONG

CAY BAC HA LUC IN VITRO

THIẾT LẬP QUY TRÌNH NHÂN GIÓNG

CAY BAC HÀ LUC IN VITRO

(Mentha spicata L.)

Tac gia

LE KIEU PHI YEN

Khóa luận được dé trình dé đáp ứng yêu cầu

cấp bằng kỹ sư ngành Nông học

Hướng dẫn khoa học

TS PHAM MINH DUY

Thanh phố Hồ Chí MinhTháng 08/2023

LỜI CÁM ƠN

Con xin thành kính khắc ghi công ơn Cha Mẹ đã sinh thành nuôi dưỡng và dạy

dỗ con nên người, anh chị em trong gia đình đã hết lòng yêu thương và động viên, tạođiều kiện thuận lợi cho con có ngày hôm nay

Xin gửi lời tri ân đến TS Phạm Minh Duy, giảng viên Bộ môn Sinh lý Sinh hoá,Khoa Nông học, Trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh đã tận tình hướng dẫncho em suốt quá trình học tập và thực hiện khoá luận tốt nghiệp

Xin gửi lời tri ân đến TS Bùi Minh Trí, trưởng bộ môn Sinh lý Sinh hoá, khoaNông học, Trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh và anh chị hiện đang hoạt độngtại phòng nuôi cay mô, khu thực nghiệm bộ môn Sinh lý — Sinh hóa Dai học Nông Lam

Thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện tốt nhất giúp em trong thời gian hoàn thành

khoá luận.

Xin chân thành cảm ơn:

Ban giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh

Ban chủ nhiệm khoa, các Thầy Cô khoa Nông học Trường Đại học Nông Lâm

Tp Hồ Chí Minh đã truyền đạt cho tôi những kiến thức bồ ích trong suốt thời gian học

tập tại trường.

Các thầy cô trong bộ môn Sinh lý Sinh hoá đã tạo điều kiện cho tôi trong thời

gian thực hiện đề tài

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến các bạn Thanh Thương, Quỳnh Chị, ThànhThông, Minh Kha, Quyền Cước cùng các bạn sinh viên lớp DH19NHB đã động viên và

hỗ trợ tôi trong suốt quá trình thực hiện khoá luận tốt nghiệp này

Tp Hồ Chí Minh, tháng 08 năm 2023

Sinh viên thực hiện

Lê Kiều Phi Yến

TÓM TẮT

Đề tài nghiên cứu “Thiết lập quy trình nhân giống cây bạc hà lục in vitro (Menthaspicata L.)” đã được tiến hành tại phòng thực nghiệm nuôi cấy mô thuộc khu thựcnghiệm Bộ môn Sinh lý — Sinh hoá, Khoa Nông học, Trường Đại học Nông Lam Thanhphó Hồ Chi Minh tháng 2 năm 2023 đến thang 8 năm 2023 Nhằm xác định nồng độ vàthời gian khử trùng thích hợp cho hạt cây bạc hà lục, xác định nồng độ BA thích hợp đểnhân nhanh va phát triển chồi, xác định cường độ ánh sáng và sự trạo đối khí của bịchnuôi cây đến sự tăng trưởng của cây bạc hà lục in vitro Các thí nghiệm được bồ trí theokiểu khối hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố, hai yếu tô và kiểu lô phụ ba lần lặp lại

Kết quả thu được như sau:

Thời gian khử trùng 5 phút với nồng độ NaOCl 2,5% phù hợp dé vào mẫu hạtbac ha lục Tỷ lệ thấp, nhiễm khuẩn và nhiễm nam giữa các nghiệm thức lần lượt trongkhoảng 0,0-3,8% và 6,7-13,3%.

Xác định được môi trường MS + 7 g-L! argar + 20 g-L! đường có bé sung nồng

độ BA 1,5 mg-L 1 thích hợp cho quá trình nhân chéi của cây bạc hà lục nhất với số chồitrung bình 6,2 chồi/cây

Xác định được cường độ ánh sáng 150 umol-m 2-s 1 và loại bịch nuôi cấy có 2

lỗ trao đổi khí phù hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của cây bạc hà lục, với chiềucao trung bình 44,7 mm/cây, chiều dài rễ trung bình đạt 66,1 mm/cây

MỤC LỤC

Trang Trang ta ooo 1LẦN CAM 0S qunagnggaanthagngdabitioiiatiigtndiagilGG01460/4G1003030303 01 4200S)S8018H0868000000 010000 ii

1 | eeeeveaeaaeeseaesrrndtrtrotrrhioonoipeotito foosiiaA03ig50000005000050090008 iiiHANH SÁCH CAC CHỦ VIET TAT vcreensnncosicaenonncanimanimeneninncenl viDANH SÁCH CAC BANG ccssssssssssssssssassnssassssensenscassassasensensenssasesscscsesssenseseenensess viiDANH SÁCH CAC HINH ANH cccsssssssesssssssssssssnscosessessesecassssssescssssscsecsecsscsses viii

| ` 1Đặt vấn đề s21 2 21221211212112112121121112112111112111211111112112111121111112112111 212tr 1sao: Ắ Ô 2

Giới bạn | a 2Chương 1 TONG QUAN TÀI LLIỆU 5-5<5< 5< 5<£Ss£Sse£e££ee£seEsereersersers 31.1 Giới thiệu về cây bạc hà lục - 2 2+222222E22EEEzEzrrrrrrrrrrrrrrrrre.31.2 Một số nghiên cứu trong và ngoài nước về Chi Ä⁄en]a -2 -2 52555+- 81.3 Giới thiệu về nuôi cay mô và tế bào thực vật 2 SE E221 12111112121 1x xe 9Chương 2 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 152.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài 25-52522221 2122121211121 xe 152: Nat TSW this HÌỂ Ĩ out bgthbbistbistliosgbiliSlkGsNGEIGGIXESAGG-LESAEISGSEDHSIRBISRSBUN8903400038 5001008 152.3 MGi trurOng MUG! CAY 1 HHẶHẬÂĂẬH,,H 162:3.Phương phầp nghicn CWiesscssesesmenmemmmsnve rence 172.5 XU ly 0 8n 24Chương 3 KET QUA VÀ THẢO LUAN cesssssssssssssssesssssssssasssscsassssssacsassacsacsssceass 25

3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ natri hypochlorite và thời gian khử trùng thíchhop cho hat cay 001400 253.2 Thí nghiệm 2: Khao sát sự anh hưởng của nồng độ BA đến sự tao chồi của đốt thancay bac hale 7 ĐIỆN cman aneurin 293.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của cường độ ánh sáng va sự trạo đôi khí củabịch nuôi cấy đến sự tăng trưởng của cây bạc hà lục int vifro 36KẾT LUẬN VA DIE NGGHỊ, -ccsecdzczmerrurerrtrgrdecrgerrderetsrrazrmroceer 47TÀI LIEU THAM KHHẢO - 2 5< 22 ©s©S*£Es£EeeEEeErseErerrereerrerserrsrrsere 48

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIET TAT

ANOVA Analysis of variance

BA 6—Benzylaminopurine, Benzyl andenine

CDAS Cuong d6 anh sang

CHL Chlorophyll

Ctv Cong tac vién

LLL Lan lap lai

MS Murashige and Skoog

RA Rosmarinic acid

TP Hồ Chí Minh Thành phố Hồ Chi Minh

DANH SÁCH CÁC BANG

TrangBảng 2 1 Thanh phần các nguyên tố trong môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962)

sao se SRR NE a RR RO a em RR EER RE RR SE RR RT Ee EE 16

Bang 2 2 Thiết kế thí nghiệm] - 2-2222 2222S22EE22E22EE22E22E12232221221211221 21.2222 18Bằng 3 3 Thiếkế thí nghiệm È SẰ SH” 0900 nhe HH ểgggonig 20Bảng 2 4 Thiết kế thí nghiệm 3 222222 SSSSSEE2EE2E2E2E2252232222212212232212222 22 2 22

Bang 3.1 Bang tong hợp kết qua ảnh hưởng của nồng độ natri hypochlorite (NaOCl) và

thời gian khử trùng đến tỷ lệ nhiễm của hạt cây bạc hà lục 2-22-2522 26Bang 3.2 Bảng tổng hợp kết qua ảnh hưởng của nồng độ NaOCl và thời gian khử trùngđến khả năng nảy mam, chiêu cao cây, chiều dai rễ và số lá của hạt cây bạc hà lục .28Bang 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ BA đến chiều cao chi và số lá của cây bạc hà lục tạithời điểm 28 ngày sau cấy -2+- +22 22122122112211211211221121121121121121211 1c cre 34

Bang 3.4 Ảnh hưởng của các mức cường độ ánh sáng và số lỗ trao đổi khí khác nhau

đên các chỉ tiêu sinh trưởng của cây bạc hà lục nuôi cây -c+-c+cc+ccee Al

Bang 3.5 Ham lượng caroten, chlorophyll a, b, a + b và tỉ lệ chlorophyll a/b của cây bạc

hà lục nuôi cay dưới các điêu kiện thời gian chiêu sáng va sô lân trao đôi khí khác nhau

DANH SÁCH CÁC HÌNH ANH

Trang

Hình 1.1 Cây bạc hà lục - - - Gà HH HH TT TH gu TH Tu TH gi HH 3Hình 1.2 Vị trí phân bố bạc hà lục (Mentha spicata) trên Thế Giới 2-2: 4Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2-©22SS2EE2EE£EEE2EEEEE2E1271221221 22.22 cEe 18Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2 - 2-2 S+SS+EE£2E£EEEEEEEEE2121712371221.2122.2XeC 20Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 3 2-72 S2+SS2SE+SE£EE2EE22E22E22E2212212232222222 2222 95Hình 3.1 Cây bạc hà lục được vào mẫu ở các nồng độ NaOCl và thời gian khác nhaungay tht v0 0) 54HA HẬHà, 25Hinh 3.2 Dién tién tỷ lệ nảy mam của hạt bạc hà lục được khử trùng với các nồng độ

er thối tant KhiáGtTTHBÌHSssssssssezsseszszrisotoiodiidodggraosegoii2M6gi024:50i00.0800s001019:830003/000040:4300miL3ngdiSHRgi.e pH]Hình 3.3 Cây bac ha lục nuôi cay in vitro dưới các nồng độ BA khác nhau tại ngày thứJun 4444:114 29Hình 3.4 Khối lượng tươi và khô của cụm chồi bạc hà lục nuôi cay trên môi trườngđược bồ sung các nồng độ BA khác nhau - 22 2©2222222EE2EE22E£2EE22EZ2222Z2222xee 30Hình 3.5 Khối lượng tươi và khô cụm chéi bạc hà lục nuôi cay trên môi trường được

bổ sung các nồng độ BA khác nhau -2222222222Ev2EEetrrrrrserrrerrrersrcrrrrrrcc 3 Ï

Hình 3.6 Khôi lượng tươi và khô mô sẹo của cây bạc hà lục nuôi cây trên môi

trườngđược bồ sung các nồng độ BA khác nhau 2- 22 5225szcsscsscseccecc.-c.-32Hình 3.7 Diễn tiến sự phát sinh chỗồi của cây bạc hà lục ở các nồng độ BA khác nhau

Hình 3.8 Cây bạc hà lục nuôi cấy trong bịch không có và có 2 lỗ trao đối khí vào ngày

Hinh 3.9 Cây bạc hà lục nuôi cây ở điêu kiện cường độ ánh sáng và bịch nuôi cây có

lỗ trao đổi khí khác nhau vào ngày thứ 28 sau cấy, 2-©-2222+22z22++zxzzxze 37

Hình 3.10 Khối lượng tươi và khô của thân lá cây bạc hà lục dưới ảnh hưởng của

cường độ ánh sáng và số lỗ trao đổi khí khác nhau 2: 22©2222222Sz22z+222222zz2 38Hình 3.11 Khối lượng tươi và khô của rễ cây bạc ha lục dưới ảnh hưởng của cường độSrih sáng vã số 16 trao đối khí kháp TÍHHM,.«.seseoseeeieiinoEELESdlLLS018u2u0000051)-000080/kg60 39Hình PHL 1 Bố trí thí nghiệm 1 và 3 2-2 522SE+2E£EE2EE2EE22E22E2232232222222222 2262 52

Hình PHL 2 Hạt giống cây bạc hà lục -2- 2-52 222S22E22E2SE22E+ZEZEZEzEzxzxezsez 52

Hình PHL 3 Vào mẫu hạt bạc hà lục - ¿2-2-2222 2SE2E2E£E£E2EE2E2E2E2122125212121 22c 33

Hình PHL 5 Máy đo cường độ ánh sáng TES—1339P 22 2222222222222z222zz 53Hình PHL 4 Hạ đèn, quấn giấy bạc đều chỉnh cường độ ánh sáng 2 53

GIỚI THIỆU

Đặt vấn đề

Việt Nam có một hệ sinh thái phong phú và đa dạng, có tiềm năng to lớn về tài

nguyên cây thuốc Đây cũng là điều kiện thuận lợi để phát triển nguồn dược liệu, cung

cấp nguyên liệu cho sản xuất thuốc trong nước Tuy nhiên, cho đến nay, nguồn đượcliệu nước ta vẫn phải phụ thuộc rất nhiều vào nguồn nguyên liệu nhập khâu mà chưaphát huy được hết những tiềm năng thảo được tự nhiên Đặc biệt là các loại được liệu

có hàm lượng chat đặc thù cao, cho phép dé dàng chiết xuất thành dược chat tinh khiếtphục vụ cho y học.

Bạc hà lục (Mentha spicata L.) thuộc họ Lamiaceae, là một loại thảo mộc được

sử dung lâu đời, an toàn cho con người, có nhiều được tính và dược chất đã được chứngminh Khác với các giống bạc hà khác như M x piperita, M arvensis, giéng phố biếnhiện nay, thành phần hoá học bao gồm nhiều hợp chất như menthone, menthyl acetate,menthofuran, v.v Với bac hà lục đặc biệt chứa hàm lượng rất cao các được chất đặc thùnhư carvone, rosmarinic acid (RA), là những chất có các được tính quan trọng đã đượcchứng minh, cho phép dé dàng chiết xuất thành được chất tinh khiết phục vụ cho y họchơn các loài được trồng phổ biến hiện nay như M x piperita, M arvensis, do đó có tiềmnăng lớn trong việc dùng dé chiết xuất và sản xuất các hợp chất tinh khiết nay cho y

học Đặc biệt, theo nghiên cứu của Shekarchi và ctv (2012), cho thấy, trong số các loài

thực vật được phân tích thuộc các chi khác nhau của họ Lamiaceae, hàm lượng RA nhiều

nhất được tìm thấy ở loài thuộc chi Mentha, tat cả các loài thuộc chi Mentha đều chứa

RA với nồng độ đáng kể (19,3 — 58,5 mg-g ~), trong đó ở cây bạc hà lục cho thấy lượng

RA cao nhất

Tuy nhiên, tại Việt Nam, việc nghiên cứu và đưa vào sản xuất đại trà cây bạc hàlục vẫn chưa được tiến hành Bac hà thường được nhân giống bằng cách giâm thân, giâmcành với hệ sô nhân giông không cao, tôn nhiêu thời gian va mau chong thoái hoá sau

một số vụ trồng Với những ưu điểm của phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật

là có thé tạo ra các cây giống đồng nhất, có chất lượng tốt với số lượng lớn trong thời

gian ngắn Nhằm hướng đến mục tiêu đưa bạc hà lục vào sản xuất tại Việt Nam, cần

thiết lập quy trình vi nhân giống hiệu quả cao dé cung cấp lượng lớn cây con cho sảnxuất Do đó dé tài “Thiết lập quy trình nhân giống cây bạc hà lục (Mentha spicata L.) invitro” đã được thực hiện.

Pha chế hoá chất đúng nồng độ và liều lượng

Bồ trí thí nghiệm đúng qui cách thí nghiệm sinh học

Bồ trí thí nghiệm và thu thập số liệu đúng thời gian, đảm bảo tính khách quan.Tạo được cây bac hà lục in vitro hoàn chỉnh, sinh trưởng tốt

Giới hạn đề tài

Đề tài chỉ thực hiện vô mẫu hạt cây bạc hà lục sản xuất bởi công ty Cheongnong(Hàn Quốc); nuôi cay cây bạc hà lục in vitro ở giai đoạn nhân chồi, nuôi cấy cây trongbịch nuôi cấy với các mức cường độ ánh sáng ở giai đoạn sinh trưởng tại phòng nuôicay mô, khu thực nghiệm bộ môn Sinh lý - Sinh hóa Đại học Nông Lâm Thành phố HồChí Minh từ tháng 02 đến tháng 08 năm 2023

Chương 1

TỎNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về cây bạc hà lục

1.1.1 Phan loại cay bạc hà lục

Bạc hà lục có tên khoa học là Mentha spicata L (2n = 48)

Tên thông thường: Mint, spearmint.

Tên tiếng Việt: Bạc hà lục

Bạc hà lục là cha mẹ của nhiều loài bạc hà như Mentha x gracilis là giéng lai của M.arvensis x M spicata, Mentha gracilis là giỗng lai giữa M spicata và M arvensis bảndia (Field Mint), v.v Ngoài ra, M piperita, một giống bạc ha phé biến được trồng daitrà hiện nay cũng là giống lai nhân tạo được trồng trọt của M spicata x M Aquas(Gleason và Henry A, 1963; Kartesz và John T, 1994).

1.1.2 Nguồn gốc và phân bố

1.1.2.1 Nguồn gốc

Bac hà lục được cho là bắt nguồn từ lai giữa cây M longifolia và M suaveolens,

sau đó đa bội hóa tạo 2n (Harley và Brighton, 1977).

Tuy nhiên gan đây có nghiên cứu cho rằng M spicata tiến hóa tự nhiên và có họhàng gan với M suaveolens và M Ilongifolia (V Gobert va ctv, 2002)

1.1.2.2 Phân bố

Đây là loại thảo mộc một loại cây cực kỳ linh hoạt, có khả năng phát triển ở nhiềuvùng khí hậu khác nhau trên thế giới

Bạc hà lục đã được đề cập trong cuốn Species Plantarum của Linneaus vào năm

1753 Cây được báo cáo là mọc trên bờ sông và gần suối, Canada đến Pennsylvania’(Pursh, 1814), và được nhập tịch rộng rãi ở vùng Đông Bắc vào năm 1848 (Grey, 1848)

Nó hiện được tìm thấy trên khắp Bắc Mỹ ôn đới trong môi trường sống ẩm ướt (Fernald,1950; Gleason và Cronquist, 1991) Mentha spicata L phô biến ở thung lũng sông

Hudson và lưu vực Great Lakes (Mills va ctv, 1993; Mills và ctv, 1997).

Cây mọc tự nhiên ngoài môi trường ở châu Au, Trung Nam-Trung, Dong NamTrung Quốc, v.v Và được du nhập vào các nước thuộc vùng Bắc Mỹ, Argentina, cácnước Bắc Phi, v.v

: Cây mọc tự nhiên 8: Cây được du nhập

Hình 1.2 Vị trí phân bố bạc hà lục (Mentha spicata) trên Thế Giới

(Plant of the World online ,2023)

1.1.3 Đặc điểm thực vật của cây bạc hà lục

1.1.3.1 Đặc điểm hình thái

Lá xếp đối xứng, có dạng hình trứng hoặc hình mũi mác, mép lá có răng cưakhông đều, đỉnh nhọn Chiều dải lá từ 1 — 6 em, chiều rộng 3 — 17 mm Mặt trên củamỗi lá có màu xanh vừa và nhẫn; nó có vẻ ngoài nhăn nheo vì các vết lõm dọc theo cácđường gân của nó Mặt dưới của mỗi lá có màu xanh lục nhạt đến trung bình và chủ yếu

là gần như không có lông Lá được gắn vào thân cây bang một cuống lá gần như khôngtồn tại (không cuống) 0 — 2 mm

Cây có mùi thơm dễ chịu, màu xanh lục Thân cao 30 — 60 em, mọc thang, hinh

tứ giác.

Hoa mọc thành chùm dày đặc ở nách lá phía ngọn cảnh, dai khoảng 2 — 15 cm.Đài hoa hình chuông có nhiều tuyến, hoặc có lông mao hình tuyến Hoa màu trắng hoặchồng nhạt, dai va rộng 2,5 — 3 mm Quả hạch màu nâu sam Ra hoa từ tháng 6 đến tháng

10 (Montana PlantLife, 2014).

Rễ bạc hà có cấu tạo từ thân ngầm dưới đất Phân bó lớp đất từ 30 — 40 cm, phânnhánh như rễ phụ Từ các đốt thân ngầm mọc thân kí sinh Thân ngầm không chứa tinhdầu Khi bộ phận kí sinh tàn lụi, thân ngầm vẫn sống qua mùa đông Mùa xuân âm áp

thân ngầm tiếp tục phát triển thành bộ rễ và cho cây bạc hà mới (Chu Thị Thơm, 2006).

1.1.3.2 Đặc điểm sinh thái

Bạc hà lục là cây lâu năm, phát triển mạnh dưới ánh nắng mặt trời đầy đủ, trongđất âm thoát nước tốt Bạc hà lục phát triển tốt nhất ở những vùng đất giàu dinh dưỡng,

am ướt đưới ánh nắng mặt trời đầy đủ đến một phan bóng ram và có thể thích nghi vớinhiều loại đất, ngoại trừ những loại đất khô Cây phát triển tốt trên cát, đất sét và đất 4mdọc theo các cạnh của con lạch, công và dam lay

1.1.4 Thanh phần hợp chat hoá học trong bạc ha lục

Cũng giống như các loại bạc hà khác, có 2 nhóm hợp chất chính là tinh dau (vớithành phần chính là terpene) và hợp chất phenol

Thành phần chính trong tinh dau bạc hà lục là carvone, chiếm 67,1 % (Rodrigo

Scherer va ctv, 2013), 68,4 % (Kokkini và ctv, 1995) với các mẫu thu thập ở Hy Lap,

76,65 % trong các mẫu thu thập ở Ấn Độ (Chauhan và ctv, 2010) và 48,4 % (Sarer và

ctv, 2011) với các mẫu thu thập ở Thổ Nhĩ Ki

Theo nghiên cứu thành phan hoá học của tinh dầu bằng phân tích sắc kí/phối khổcủa Kuen Woo Park và ctv (2011) cho thay hop chat chinh vé mat dinh luong cua bac

ha lục là -Carvone (33 %), tiếp theo là R-(+)-limonene (11,7 %) va B-phellandrene

(18,4%).

Cac thanh phan quan trong khac trong tinh dau cua bac ha luc bao g6m muurolene(2,29 %), myrcene (2,08 %), beta-caryophyllene (1,76 %), beta-bourbonene (1,18 %) va trans-dihidrocarvone (1,03 %).

Năm 2003, Dorman va ctv đã báo cáo rằng tổng hàm lượng phenolic trong cácloại Mentha khác nhau vào khoảng 128 — 230 mg-LTM chiết xuất tinh theo axit gallictương đương Các hợp chất phenolic chính được tìm thấy trong chiết xuất của bạc hà lụcgồm eriocitrin, luteolin, axit rosmarinic, và axit caffeic Trong đó axit rosmarinic (RA)

là hợp chất có các hoạt tính sinh học quan trọng, có ý nghĩa trong ngành y học

1.1.5 Giá trị sử dụng của cây bạc hà lục

M.Mahboubi và G.Haghi (2008) đã kiểm tra tác dụng kháng khuẩn của tinh dầu

M spicata bằng phương pháp vi pha loãng trong nước dùng và phương pháp khuếch tánđĩa và báo cáo rằng tinh dau có hoạt tính kháng khuẩn cao đối với S aureus, 1.monocytogenes, B cereus va E coli.

Tinh dau bac hà luc là một chat tạo hương được sử dung trong việc pha chế kẹocao su, mỹ phẩm và kem đánh răng (Lawrence, 2006)

Tinh dầu của bạc hà lục cho thấy hoạt động diệt côn trùng và gây đột biến mạnh(Franzios va ctv, 1997).

Bac ha lục có chứa rosmarinic acid (RA), một este của axit caffeic va va axit dihydroxypheny] lactic, lần đầu tiên được phan lập từ lá cây Rosmarinus officinalis L

3,4-và sau đó được tìm thấy ở các loài khác thuộc họ Labiatae 3,4-và Boraginaceae (Wang H 3,4-vàctv, 2008) Các nghiên cứu khác nhau đã chỉ ra rằng hoạt tính chống oxy hóa của RAnhiều hơn vitamine E (Peterson M và Simmond MS, 2003) hoặc Trolox (Lin Y1 và ctv,

2003) RA có những đặc tính thú vị dẫn đến một loạt các ứng dụng từ chất bảo quảnthực phẩm đến mỹ phẩm (Liu GT va ctv, 1992), can thiệp vào quá trình sinh ung thưthông qua nhiều cách khác nhau, bao gồm tăng sinh tế bào khối u, sự chết tế bào, di căn

và viêm (Hooker CW và ctv, 2001) Ngoài ra, được báo cáo là có hoạt tính chống HIV(Chen et al., 1999) Mặt khác, RA còn phát huy tác dụng kháng khuẩn, chống viêm,chống oxy hóa mạnh mẽ và thậm chí là chống trầm cảm, chống lão hóa Đánh giá trêncung cấp một cái nhìn tổng quan về các hoạt động chống ung thư của RA và cân nhắctiềm năng điều trị của nó đối với nhiều loại bệnh

Bạc hà lục được khảo sát thé hiện hoạt tính chống oxy hóa tốt được đánh giá bởikhả năng thu dọn gốc tự do DPPH, tây trắng -carotene trong hệ thống axit linoleic và

ức chế quá trình oxy hóa axit linoleic Hoạt động kháng khuẩn của dầu bạc hà và các

thành phần chính của nó ( cis -carveol và carvone) được theo sau bởi các xét nghiệm

khuếch tán đĩa và nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) chống lại bốn chủng vi khuẩn:Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus subtilis , và Pasturella multocida vanam loai vi khuan gay bénh nam: Aspergillus niger, Mucor mucedo, Fusarium solani,Botryodiplodia theobromae , va Rhizopus solani, tat cả các vi sinh vat được thử nghiệmđều bị anh hưởng mạnh mẽ cho thấy kha năng khang khuan đáng kể của bac hà lục

Hàm lượng carovone cao có ý nghĩa trong ngành y học, có tác dụng ức chế sựbiến đôi của C albicans từ dạng cầu khuẩn thành dang sợi, có liên quan đến kha nănggây bệnh của C albicans (McGe-ady, Wansley & Logan, 2002) C albicans là mộttrong những mam bệnh phô biến nhất ở người, gây ra nhiều loại bệnh nhiễm trùng cóthể đe dọa đến tính mạng ở những người bị suy giảm khả năng miễn dịch, đặc biệt ởbệnh nhân AIDS.

Ngoài ra, bạc hà lục là một loại thảo mộc lâu năm và được trồng thương mại trêntoàn thé giới Lá tươi và khô từ cây bạc hà được sử dụng dé làm trả và chất tạo mùi thơm(Ali-Shtayeh và ctv, 2019) Điều trị các chất tiêu hóa, hô hap, hôi miệng, tiêu độc, chống

co thắt, lợi tiểu và an than Các phương thức bảo chế khác nhau (thuốc sắc, cồn và viên

nén) của bạc hà đã được sử dụng dé điều trị chứng rối loạn đầy hơi trong y học cổ truyền

Iran (Mahboubi, 2021) Trong các bai thuốc truyền thống của Iran, lá bạc hà lục được

sử dụng đề tăng cường dạ dày và hữu ích cho các triệu chứng khó tiêu (Babaeian và ctv,

1.2 Một số nghiên cứu trong và ngoài nước về chi Mentha

1.2.1 Một số nghiên cứu ngoài nước

Theo Xia Li va ctv (1999), các quy trình và thành phan môi trường dé tái sinhcây bạc hà lục (Mentha spicata L.), các mẫu lay từ phần gốc của lá ở đưới cùng của chỗồi

có phản ứng nhanh nhất, với tần suất tái sinh lên tới 100% và lớn hơn chín chồi trên mỗi

mẫu Tần suất cao nhất của mô phân sinh và mô sẹo hình thái được bắt đầu từ các mẫucấy được nuôi cấy trên môi trường cơ bản chứa muối Murashige và Skoog (MS), được

bô sung 4 mg thidiazuron (TDZ) mỗi lít và nước dừa 25% (thé tich/thé tích) (CW) trong

10 đến 14 ngày trong bóng tối

Theo Babu Ram Paudel và Bijaya Pant (2008), Các chéi của Mentha spicata L.mọc tự nhiên được nuôi cay trên môi trường Murashige Skoog (MS) có bố sung hai

hormone sinh trưởng napthalene acetic acid (NAA) va benzyl amino purine (BAP) ở các

nồng độ và sự kết hợp khác nhau Một số lượng lớn các chồi đa bội đã được quan sáttrên môi trường MS bổ sung NAA (0,5 ppm) va BAP (1 ppm) trong vòng tám tuần nuôicấy Sự hình thành rễ lan rộng được quan sát thấy trên môi trường MS bồ sung riêng 1ppm NAA.

Năm 2008, Raja va ctv đã nghiên cứu trên mẫu đoạn thân bạc hà mang chỗi bênkhi được nuôi cấy trong môi trường MS bồ sung 3 mg-LTM BA cho hệ số nhân chồi đạt

42 chồi mẫu sau 6 tuần nuôi cấy trên giống bạc hà Mentha vinds L

Đoạn thân bạc ha Mentha arvensis L được Rashmi (2014) nuôi cây trên môi

trường MS có bé sung 2 mg-L! BA và 0,4 mg-L! NAA đạt 32 chồi với thời gian 8 tuầnnuôi cây.

Năm 2010, nghiên cứu của Trần Lê Trúc Hà và ctv đã tạo mô sẹo tốt nhất trênmôi trường MS có bồ sung 0,25 mg-L~! BA và 0,5 mg-LTM! NAA, cho hệ số tái sinh chồicao tử mô sẹo 3 tuần tuổi trên môi trường MS có bổ sung 0,2 mg-L BA và tạo rễ tốttrên môi trưởng MS có bồ sung 0,4 mg-L!NAA

Năm 2013, Maity va ctv, nghiên cứu nhân giống invitro thông qua nuôi cay môsẹo ở mẫu đoạn thân bạc hà Mentha arvensis L., nghiên cứu cho thấy môi trường MS

kết hợp 0,5 mg-L! BA và 0,2 mg-L NAA đối với sự hình thành mô sẹo và góp phan

cho sự hình thành phôi sau này với 88 % mẫu mô sẹo được cảm ứng.

1.2.2 Một số nghiên cứu trong nước

Hiện nay, các kĩ thuật nhân nhanh giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy

mô đã đạt nhiều thành tựu trên nhiều loài thực vật Tuy nhiên ở cây bạc hà lục vẫn cònhạn chế

Cây bạc hà Pháp (Mentha pipertta) được nhập vào Việt Nam từ năm 1996 vàđược trồng ở Hà Nội Năm đầu tiên cây được trồng bằng hạt và từ năm thứ hai trồngbằng cành Hàng năm, trồng cây vào tháng 2 — 3 và thu hoạch hoa vào tháng 6 Cây bạc

hà Nga cũng được trồng ở Sa Pa (Lào Cai) Cả 2 mẫu tinh dầu bạc hà được phân tíchbằng GC/RI, GC/MS và 13C - NMR Tổng cộng, xác định được 39 hợp chat, 28 hợpchất trong mẫu đầu và 31 trong mẫu thứ hai (Nguyễn Thị Phương Thảo và ctv, 2003)

Theo Bùi Thị Hồng Gam (2012), trong thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng củanồng độ BA đến sự nhân chồi kết quả cho thay nồng độ BA ảnh hưởng khá rõ lên khánăng nhân chdi và chiều cao chối ở bạc hà Mentha arvensis với nồng độ 0,5 mg:L”! BA

đã cho hiệu quả nhân chồi cao hơn đối chứng ở các nồng độ 1.0 mg-L, 1.5 mg L va2.5 mg-L! cho hệ số nhân chồi tương đồng nhau khoảng 3 — 4 chồi mẫu, môi trường

MS có bồ sung 2.0 mg-L! BA có số 6 chồi mẫu cao nhất

1.3 Giới thiệu về nuôi cấy mô và tế bào thực vật

1.3.1 Khái niệm

Nuôi cấy mô tế bảo thực vật là phương pháp nuôi cấy in vitro mô hoặc tế bào đã

tách rời ra khỏi cơ thé thực vật trong môi trường thích hop dé chúng trở lại trạng thái

chưa phân chia tế bào và biệt hoá thành mô, cơ quan, phát triển thành cây con mới Tat

cả mọi tế bào của một cơ thé thực vật đều có tính toàn năng, nghĩa là chứa bộ gen y hệtnhau, do đó tất cả các tế bảo của một cơ thể đều có khả năng tổng hợp những loại protein-enzym giống nhau và nếu tế bào được nuôi dưỡng trong môi trường thích hợp đều cóthê phát triển thành cây nguyên vẹn đặc trưng giống hệt cây ban đầu và ra hoa, kết quả

bình thường (Nguyễn Quang Thạch, 2009)

1.3.2 Chất điều hoà sinh trưởng trong nuôi cay mô

Chất điều hòa sinh trưởng thực vật (plant growth regulators, PGR) là thành phầnquan trọng trong nuôi cấy mô, có vai trò quang trọng trong phát sinh hình thái thực vật

in vitro Hiệu quả tác động của chất điều hoà sinh trưởng phụ thuộc vao loại va nồng độ

sử dụng trong nuôi cấy (Vũ Văn Vũ và ctv, 2006)

Chat điều hoà sinh trưởng được sản xuất tự nhiên bởi thực vật kiểm soát các chứcnăng bình thường của thực vật, chăng hạn như sự phát triển của rễ, đậu và rụng quả,tăng trưởng và các quá trình phát triển khác Có năm nhóm chất điều hoà sinh trưởngnội sinh chính: auxin, cytokinin, gibberellin, axit abscisic và ethylene Hầu hết các nhómnày có nhiều vai trò trong quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật và được sửdụng để điều khiến thực vật trong nuôi cấy mô Trong đó auxin và Cytokinin được sửdụng nhiều nhất

H-indole-3-và mục đích sử dụng mà môi trường nuôi cấy được bồ sung loại auxin khác nhau Cácauxin 2,4-D được sử dụng rộng rãi cho sự phát triển của mô seo (callus), IAA, NAA vaIBA được sử dung dé kích thích ra rễ

Tỷ lệ giữ nồng độ auxin và cytokinin trong nuôi cấy mô ảnh hưởng đến sự phátsinh hình thái của thực vật (tạo chồi và tạo rễ), khi nồng độ auxin cao hơn cytokinin thìkích thích sự ra rễ, ngược lại khi nồng độ auxin thấp hon cytokinin thì kích thích hìnhthành chổi (N guyén Đức Lượng và ctv, 2006) NAA có tác dụng ra rễ mạnh hơn so với

các auxin khác (Nguyễn Đức Thành,2000).

6-là cytokinin tự nhiên, con BA và Kinetin 6-là các cytokinin nhân tao (Nguyễn Minh Chon,

2004).

Những nghiên cứu của Skoog cho thay ty lệ auxin/cytokinin lớn hơn | thích hophình thành rễ và nhỏ hơn 1 sẽ kích thích hình thành chồi Nếu tỷ lệ đạt mức cân bằng thì

tạo điều kiện cho phát sinh mô sẹo (Nguyễn Đức Thành, 2000)

1.3.3 Các bước chính trong nuôi cấy mô tế bào:

Theo Nguyễn Văn Ấy (2015) nuôi cây mô gồm 3 giai đoạn:

Giai đoạn 1: Chuẩn bị cây làm vật liệu gốc

Chon cây mẹ dé lay mẫu thường là cây ưu việt, khỏe mạnh, đảm bảo sạch bệnh

và có giá trị kinh tế cao Chọn cơ quan để lấy mẫu thường là chéi non, đoạn thân, đoạnthân cả chồi ngủ, hoa non, lá non, v.v Mô được chọn dé nuôi cây mô là các mô có khánăng tái sinh cao, sạch bệnh, giữ được các đặc tính sinh học quý của cây mẹ va ôn định.Tùy vào điều kiện mà giai đoạn này có thé kéo dai từ 3 — 6 tháng

Giai đoạn 2: Khử trùng mẫu (nuôi cấy khởi động)

Là giai đoạn khử trùng đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro Trong nuôi cây mô, khửtrùng mẫu cấy là rất quan trọng nhằm đảm bảo mẫu cấy không bị nhiễm khuẩn, tỷ lệsống cao, mẫu tồn tại va sinh trường tốt Thông thường sử dụng phương pháp nhiệt, lọc,hóa chất, v.v dé khử trùng mẫu cây

Giai đoạn 3: Nhân nhanh chồi

Đây là giai đoạn quan trọng trong nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi

cay mô va tế bao thực vật nhằm mục dich tăng sinh khối thể nhân giống Vật liệu nuôi

cây là các thé chéi, môi trường nuôi cấy thường giống môi trường tạo thể chồi, đôi khi

nồng độ chất sinh trưởng giảm thấp cho phù hợp với quá trình nhân giống kéo dài Điềukiện nuôi cấy thích hợp giúp cho quá trình tăng sinh diễn ra nhanh.

Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh

Đây là giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh có day đủ lá, thân, rễ dé chuẩn bị chuyển

ra vườn ươm Cây con phải khỏe mạnh đề nâng cao sức sống khi ra môi trường binhthường Các chất có tác dụng tạo chối được loại bỏ, thay vào đó là các chất kích thíchquá trình tạo rễ Điều kiện nuôi cấy khác với điều kiện tự nhiên bên ngoài, đây là mộtbước làm thích nghỉ trước khi tach ra khỏi điều kiện in vitro Sự ra rễ phụ thuộc vàonhiều yếu tố như hàm lượng auxin n6i/ngoai sinh, tỷ lệ C/N, ánh sáng, sự trẻ hóa của

mẫu, kiểu di truyền.

Giai đoạn 5: Thích ứng cây in vitro ngoài điêu kiện tự nhiên

Dé đưa cây từ ống nghiệm ra vườn ươm với tỷ lệ sống cao, cây sinh trưởng tốtcần đảm bảo một số yêu cầu về tiêu chuẩn hình thái nhất định như số lá, số rễ, chiều caocây Cây con đã ra rễ được lay khỏi ống nghiệm, rửa sạch agar và được đặt trong chậunơi có bóng râm, độ âm cao, cường độ chiếu sáng thấp Sau khoảng 2 tuần, cây đã bắtđầu thích nghi với điều kiện bên ngoai, lúc này có thé tăng cường độ chiếu sáng và hạ

am độ

1.3.4 Anh hưởng của hoạt động quang hợp đối với cây nuôi cấy in vitro

Hoạt động quang hợp kém của cây con nuôi cấy in vitro được coi là một trongnhững yếu tố hạn chế chính đối với việc cải thiện hiệu quả vi nhân giống và thành côngtrong quá trình thích nghi Quang hợp của cây con nuôi cấy mô thay đổi và bị ảnh hưởngbởi nhiều yếu tố Sự khác biệt lớn về hoạt động quang hợp có thê được giải thích mộtphan là do khó đo lường sự trao đổi khí Chúng cũng có thé được giải thích bằng cácloại và kích cỡ mẫu cay khác nhau và theo giai đoạn tăng trưởng Cuối cùng, các điềukiện môi trường như CO? và Or nồng độ, chất lượng ánh sáng và sự hiện diện của đườngngoại sinh trong môi trường sẽ có tác động sâu sắc đến khả năng quang hợp (Y.Desjardins, 1995).

1.3.4.1 Anh hưởng của ánh sáng đối với cây in vitro

Cây được nuôi cấy trong môi trường có năng lượng sẵn là đường nên ít phụ thuộc

vào quá trình quang hợp Tuy nhiên nhiều nghiên cứu cho thấy ánh sáng vẫn có vai tròquan trọng trong phản ứng phát sinh hình thái cây nuôi cây mô, đặc biệt ảnh sáng lànhân tố quan trọng tham gia trực tiếp vào quá trình quang hợp và có vai trò quyết địnhđến quá trình quang hợp, đặc biệt ánh sáng đỏ và xanh của quang phổ trông thấy ảnhhưởng đến việc nuôi cấy in vitro (Dương Tan Nhựt, 2007).

Coumae và ctv (1992), đã nhận thấy được sự gia tăng hàm lượng protein và hoạtđộng của enzyme Rubisco khi cây con khoai tây được nuôi cây trong điều kiện ánh sángcao và sự sinh trưởng của cây dip lai tương đồng với sự phát triển của quang hợp biếndưỡng carbon Mặc dù đòi hỏi về ánh sáng của cây in vitro thì thấp hơn trong điều kiện

in vitro, nhưng thời gian chiếu sáng cường độ chiếu sáng và chất lượng quang phổ ratquan trọng cho sự điều hòa của quá trình quang phát sinh hình thái mẫu nuôi mô nuôicây (Ziv, 1991) Hasegawa và ctv (1973) đã thu được số lượng cây măng tây cao nhấtdưới điều kiện 1000 lux (13,5 umol-m 2-s ”) Hunter và ctv (1983) ghi nhận sự sống sót

và sinh trưởng tối ưu của mẫu cây dâu tây tại điều kiện chiếu sáng 4.000 lux (54umol-m 2s”), đạt được sự sinh trưởng và phát triển tôi đa trong điều kiện 6000 lux (81umol-m 2-s”) và hình thành rễ và phát triển tốt nhất trong điều kiện 7.000 lux (94,5umol-m2-s") Cường độ ánh sáng thấp (1.000 đến 3.000 lux) (13,5 đến 40,5umol-m 7-s"') cần thiết cho việc nhân chối và gia tăng sự ra rễ ở cây Zzalea (Economou

và Read, 1986) và cường độ cao hơn (7.000 đến 10.000 lux) (94,5 đến 135 mol-m 7-s"})được đề nghị cho việc ra rễ (Murashige, 1977)

Trong nhân giống in vitro, ánh sáng được sử dụng thường là ánh sáng đèn huỳnhquang vì tiện dụng, cho ánh sáng trắng phù hợp với sự quang hợp của cây, tiết kiệmnăng lượng và ít tạo nhiệt Tuy nhiên chỉ phí năng lượng cho ánh sáng vẫn khá tốn kém,

do đó ánh sáng trong nhân giống in vitro thường yếu (cường độ ánh sáng thường chỉ vào

khoảng 30 — 50 tmol-m Z-s }) và làm giới hạn khả năng quang hợp và sinh trưởng của

cây, nhất là néu nhân giống in vitro theo lỗi quang tự dưỡng Dé tăng cường hiệu quả sửdụng ánh sáng, có thé sử dụng các tam phản chiếu (giấy trắng hoặc tắm nhôm xungquanh các bóng đèn với hệ số phản chiếu 80 — 90%) dé phản chiếu ánh sáng, cũng như

sử dụng những bình nuôi cấy và nắp làm bằng chất liệu truyền sáng tốt hơn như

polypropylene (khả năng truyền sáng 85%) và polycarbonate (khả năng truyền sáng

64%) (Kozai va Kubota, 2005).

Sự phân phối phổ của ánh sáng (spectral distribution of light), thời gian chiếusáng (photoperiod) và hướng chiếu sáng cũng đóng vai trò quan trong trong sự tăngtrưởng của thực vật nuôi cấy mô Thời gian chiếu sáng dường như không ảnh hưởng đếnviệc tạo hình dạng của mô mà chính cường độ ánh sáng nhận được là quan trọng Trongthực tế phần lớn các phòng nuôi cấy có thời gian chiếu sáng từ 16 đến 18 gid/ngay Cóthể để ánh sáng liên tục, điều này sẽ cho phép gia tăng sự tăng trưởng của mô

1.3.4.2 Ảnh hưởng nồng độ CO; đối với cây in vitro

Nông độ CO2 là một yếu tô quan trọng khác kiềm hãm hoạt động quang hợp củacây in vitro Theo Kozai va Kubota (2005b), nồng độ CO2 thường giảm một cách rõ rệttrong giai đoạn chiếu sáng khi nuôi cấy các cây hay mô có khả năng quang hợp trongcác bình kín Điều này khang định cây nuôi cấy in vitro hoàn toàn có khả năng quanghop, và nồng độ CO> thấp mới là yếu tô chính ức chế sự quang hợp và tăng trưởng củacây in vitro Dé nâng cao nồng độ CO> trong bình nuôi, cần tăng nồng độ CO> trongphòng nuôi cấy, hoặc tăng sự trao đổi khí bên trong và bên ngoài bình bằng các loại bình

có lỗ thông khí, gia tăng tốc độ dòng khí bên ngoài bình hoặc dùng bơm khí trực tiếp

Chương 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài

Đề tài được thực hiện từ tháng 2 năm 2023 đến thang 8 năm 2023 tại phòng thựcnghiệm nuôi cấy mô thuộc khu thực nghiệm Bộ môn Sinh lý - Sinh hoá, Khoa Nônghọc, Trường Đại học Nông Lâm Thành phó Hồ Chí Minh

- Binh tam giác dung tích 250 mL

- Chai thuỷ tinh hình trụ dung tích 100 mL

- Bich nuôi cay mô polypropylene chịu nhiệt kích thước 8 x 12 x 18 em (dai xrộng x cao), không có lỗ trao đôi khí hoặc có 2 lỗ trao đồi khí (đường kính 3 em)

dán mang lọc khí hepa (kích thước lỗ lọc 0,3 um)

- Ong đong dung tích 50 mL, 100 mL và 1000 mL

- Kéo, dao cấy, đĩa, đèn cồn, bao tay.

Các thiết bị sử dụng trong thí nghiệm

- Bong dén LED 1,2m, công suat 40w (Rang Dong, Viét Nam)

- N6i hấp Tomy SS- 325 (Nhat)

- Tucdy vô trùng (Việt Nam)

- Máy đo pH HI98118 (Hana, Romania)

- _ Cân điện tử 4 số lẻ EJ-323A (Nhật)

- _ Điện thoại chụp ảnh

- Máy đo cường độ ánh sáng TES-1339P (TES Electrical Electronic Corp., Dai Loan).

- Máy đo mật độ quang (UV-2602, USA)

Các hoá chất sử dụng trong thí nghiệm

- Natri hypochlorite (Javel) 10 % (Select, Việt Nam)

- Tween 80 (Sigma Aldrich, My)

- 6-benzyle amino purine (BA) (Duchefa Biochemie, Hà Lan)

Cén 96° (Viét Nam)

2.3 Môi trường nuôi cấy

- _ Môi trường nuôi cấy cơ bản dùng trong thí nghiệm là môi trường MS (Murashige

và Skoog, 1962).

- Môi trường được bé sung 20 g-L” sucrose và 7 g-L”! agar Ngoài ra, chất điềuhoà sinh trưởng được bổ sung vào môi trường với các nồng độ tuỳ theo mục đích của thi

nghiệm

- _ Môi trường trước khi hấp được điều chỉnh pH về 5,8

- _ Môi trường được hấp khử trùng ở 121°C, 1 atm và 20 phút

Bang 2.1 Thanh phan các nguyên tố trong môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962)

Thanh phan (g-L~!) Néng độ (g-L")

NH4NO3 1650KNO3 1900

CuSOx.5H2O 0,025CoCh.6H20 0,025

Myo-inositol 100

Vitamin Thiamine HCI 0,1

Pyridoxine HCl 0,5Nicotine acid 0,5

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ natri hypochlorite và thời gian khử trùngthích hợp cho hạt cay bạc hà lục

Bang 2.2 Nồng độ NaOCl và thời gian khử trùng sử dụng trong thí nghiệm 1

Ty lệ pha loãng Nông độ NaOCl Tên nghiệm thức Tavel (%, v/v) Thời gian (phút)

Hinh 2.1 So dé bé tri thi nghiém 1

Quy mô thí nghiệm

mL Tween 80, với thời gian thay đổi theo từng nghiệm thức Sau đó rửa mẫu 3 lần vớinước đã hấp khử trùng (5 phut/lan) Sau khi khử trùng xong, cấy hạt vào các chai thuỷtinh dung tích 50 mL chứa 15 mL môi trường MS (7 hat/chai) đã hấp khử trùng Chaisau khi cay được dat trên giản nuôi cay theo so dé bé tri thi nghiém (khoang cach gitracác chai là 3 cm) dưới cường độ ánh sáng 100 + 5 pmol-mTM®-s"! và thời gian chiếu sáng

12 h/ngày Các chai thủy tỉnh được để bao quanh các chai thí nghiệm với khoảng cáchtương tự dé hạn chế hiệu ứng rìa Hạt được nuôi và theo dõi đến ngày thứ 42 sau khicấy

Chỉ tiêu và cách thức theo dõi

Chỉ tiêu nảy mầm được đo hằng ngày trong 3 tuần đầu tiên, sau đó đo hằng tuần trongcác tuần tiếp theo:

- Ty lệ nảy mầm (%) = (Số hạt nay mam/téng số hat ban dau) x 100

Các chỉ tiêu tỷ lệ nhiễm và tăng trưởng: Lấy 1 lần vào ngày kết thúc thí nghiệm:

- Ty lệ mẫu nhiễm nam (%) = (Số mẫu nhiễm nam/téng số mẫu cấy ban dau) x 100

- _ Tỷ lệ mẫu nhiễm khuẩn (%)= (Số mẫu nhiễm khuẩn/tông số mẫu cay ban dau) 100

- Chiéu cao cây (mm/cây nảy mam): được tinh từ gốc tới đỉnh ngọn

- _ Chiều dai rễ (mm/cây nảy mam): đo chiều dai từ gốc rễ đến chop rễ của rễ dai nhất

- Số lá thật (lá/cây nảy mầm): đếm số lá mở trên cây

2.4.2 Thí nghiệm 2: Khao sát sự ảnh hưởng của nồng độ BA đến sự tạo chồi củađốt thân cây bạc hà lục in vitro

Bảng 2.3 Các nồng độ BA sử dụng trong thí nghiệm 2

Tên nghiệm thức Nong độ BA (mg-L)

B-0 0,0 B-0,5 0,5 B-1 1,0 B-1,5 1,5 B-2 2,0

So dé bé tri thi nghiém 2

(khoảng cách giữa các chai là 1 cm) dưới cường độ ánh sáng 100 + 5 umol-m ”-s Ì và

thời gian chiếu sáng 12 h/ngày Các chai thủy tỉnh được để bao quanh các chai thínghiệm với khoảng cách tương tự dé hạn chế hiệu ứng ria Đốt thân được nuôi và theodõi đến ngày thứ 28 sau khi cấy

2.4.2.5 Chỉ tiêu và phương pháp theo dõi

Chỉ tiêu số chéi được theo đõi mỗi ngày trong 3 tuần đầu tiên, theo dõi hàng tuần trongcác tuần tiếp theo:

- Số chồi/mẫu (chồi/cây): tính tất cả các chồi lớn hơn 2 mm

Các chỉ tiêu tăng trưởng: Do | lần vào ngày kết thúc thí nghiệm:

- Chiều cao của chồi cao nhất (mm/cây): dùng thước đo chiều dài từ gốc chéi tới

đỉnh ngọn của chôi cao nhât

- Số lá mở/chồi (lá/cây): đếm số lá mở trên cây

- Khối lượng tươi cụm chéi (mg/cụm chồi): cân khối lượng của cụm chéi

- Khôi lượng khô cụm choi (mg/cum choi): cân khôi lượng khô của cụm choi

sau khi sấy dưới 70°C đến khi khối lượng không đổi

- Khối lượng tươi mô sẹo (mg/cụm chéi): cân khối lượng mô sẹo của cây

- Khôi lượng khô mô sẹo (mg/cụm chôi): cân khôi lượng mô sẹo khô của cụm

cây tương tự chỉ tiêu khối lượng cụm chéi khô

- Khối lượng tươi trung bình của chồi (mg/chéi):

khối lượng tươi cụm chồi — khối lượng tươi mô sẹo

số chồi

- Khối lượng tươi trung bình của chỗồi (mg/chồi):

khối lượng khô cụm chồi — khối lượng khô mô sẹo

số chồi

2.4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của cường độ ánh sang và sự trao đỗi khí

của bịch nuôi cây đên sự tăng trưởng của cây bạc hà lục in vitro

(umol:m ?-s”)

L2-50 50L2-100 Có 2 lỗ trao đổi khí 100L2-150 150 L0-50 50L0-100 Không có lỗ trao đôi khí 100L0-150 150

Các đót thân của cây bạc ha lục in vitro đồng đều có 1 cặp lá mở và chiều dai 1,5

cm được cấy vào các bịch nuôi cay mô chịu nhiệt kích thước 8 x 12 x 18 em (dai x rộng

x cao), không có lỗ trao đổi khí hoặc có 2 lỗ trao đổi khí (đường kính 3 cm) dán mànglọc khí hepa (kích thước lỗ lọc 0,3 wm) (6 đốt thân/bịch) chứa 50 mL môi trường đãđược hấp khử trùng Các bịch thí nghiệm được đặt vào giàn nuôi cấy theo sơ đồ bồ tríthí nghiệm (khoảng cách giữa các bich là 1 cm) dưới cường độ ánh sáng tùy theo nghiệmthức 50, 100 hoặc 150 umol-m 2s” và thời gian chiếu sáng 12 h/ngay Các bịch môitrường được đề bao quanh các chai thí nghiệm với khoảng cách tương tự đề hạn chế hiệuứng ria Đốt thân được nuôi và theo déi đến ngày thứ 42 sau khi cấy

2.4.3.5 Chỉ tiêu và phương pháp theo dõi

Các chỉ tiêu tăng trưởng: Do 1 lần vào ngày kết thúc thí nghiệm:

- Các chỉ tiêu số lá, số chéi, chiều dài rễ, chiều cao cây tương tự thí nghiệm 1

- Đường kính thân (mm/cây) được do ở gốc thân lớn nhất nhờ thước đo đường kínhthân

- Khối lượng tươi thân lá (mg/cây): khối lượng thân lá của cây

-_ Khối lượng khô thân lá (mg/cây): khối lượng thân lá của cây sau khi say

- Khối lượng tươi rễ (mg/cây): khối lượng thân lá của cây

- Khối lượng khô rễ (mg/cây): khối lượng thân lá của cây sau khi sấy

- Hàm lượng carotenoid, chlorophyll a, b, chlorophyll a + b (mg/g khối lượng khôlá) và ti lệ chlorophyll a/b: tính theo phương pháp của Wellburn (1983).

Mỗi nghiệm thức cắt ra 3 mẫu lá/lần lặp lại, mỗi mẫu 25 mg (khơng lay cuống)

và nghiền nhuyễn Cho mẫu lá vào ống nghiệm với 5 mL Aceton 80% Day kinống nghiệm và đặt trong tối ở nhiệt độ phịng trong 24 giờ Sau 24 giờ, tiền hành

đo mật độ quang của từng ống nghiệm ở 3 bước sĩng 646 nm (Asa3) và 663 nm(Aø46) và 470nm (A470) bằng máy đo quang phơ Các cây đã lay lá tiến hành demsay khơ và cân khối lượng khơ dé tiễn hành so sánh, tuyến tinh bằng biểu đồscatter dé tìm được khối lượng lá nếu dem đi sấy Hàm lượng Chlorophyll a, b vàcarotenoid được tính theo cơng thức:

Chl a: Ca = 12,21A6ø3 — 2,81 A646

Chl b: Cp =20,13 Acie — 5,03 Aces

Carotenoid: Cx+c= (1000A470 — 3,27Ca —104Cp)/198

Hàm lượng Chlorophyll a + b = Chl a + Chl b

Ty lệ Chlorophyll a/b = Chl a/Chl b

Ham lượng chlorophyll va carotenoid (mg/g lá khơ) được tính bang cách lay cáckết quả trên nhân cho thé tích dich chiết (5 mL) chia cho khối lượng khơ của 25

mg lá của từng nghiệm thức Khối lượng khơ của 25 mg lá được tính bằng cáchhồi quy tuyến tính từ khối lượng khơ thân lá của mỗi nghiệm thức

2.5 Xử lý số liệu

Số liệu được tính tốn và vẽ biéu đồ bằng phần mềm Excel 2010 Kết quả đượcphân tích phương sai (ANOVA) và trắc nghiệm phân hang Duncan test (trên 5 nghiệm

thức) hay LSD test (dưới 5 nghiệm thức) bằng phần mềm R ở mức ý nghĩa 0,01 hoặc

0,05 Ở thí nghiệm 1, chỉ tiêu về tỷ lệ nhiễm được thống kê bằng Scheirer-Ray-Haretest, phân hạng bằng Dumn test

Chương 3 KET QUA VÀ THẢO LUẬN

3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ natri hypochlorite và thời gian khử trùng thíchhợp cho hạt cay bạc ha lục

Kết quả thu được sau 42 ngày nuôi cấy cho thấy ảnh hưởng của các nồng độ và thờigian khử trùng lên hạt cây bạc hà lục tương đương nhau, không có sự khác biệt về mặtthống kê (Hình 3.1) Tỷ lệ nhiễm khuẩn và nhiễm nắm giữa các nghiệm thức lần lượtdao động trong khoảng 0,0-3,8% và 6,7-13,3%, sự khác biệt không có ý nghĩa về mặtthống kê giữa các nghiệm thức

Hình 3.1 Cây bạc hà lục được vào mẫu ở các nồng độ NaOCl và thời gian khácnhau ngày thứ 42 sau cấy

Bang 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ natri hypochlorite (NaOCl) và thời gian khử trùngđến tỷ lệ nhiễm của hạt cây bạc hà lục

Nông độ " Tên nghiệm Thời gian Tỷ lệmâầu nhiém Tỷ lệ bình nhiễm

'*: khác biệt không có ý nghĩa

Tỷ lệ nhiễm là yếu tố quan trọng đối với quy trình khử trùng mẫu, tuy nhiên nồng

độ chất khử trùng quá cao hay thời gian khử trùng lâu có thê gây ảnh hưởng xấu đến tếbảo thực vật Vì thế, theo dõi các yếu tố sinh trưởng của cây là rất cần thiết dé xác định

quy trình khử trùng mẫu phù hợp.

Tỷ lệ nảy mầm được theo dõi trong suốt 42 ngày sau cấy (hàng ngày trong 3 tuầnđầu tiên và hàng tuần trong 3 tuần tiếp theo), cho thấy số hạt nảy mầm giữa các nghiệmthức khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê Đối với các hạt có kích thước nhỏ, tỷ

lệ nội nhũ thấp, hàm lượng dinh dưỡng dự trữ ít, dẫn đến khả năng nảy mầm tương đối

thấp Bên cạnh đó, với các hạt có tinh dầu sẽ dé bị o xi hoá ảnh hưởng đến sức sống của

phôi, hat mat sức nảy mam Ở thí nghiệm nay cho thấy tỷ lệ nay mam của hạt bạc ha lụcgiữa các nghiệm thức dao động trong khoảng 41 — 45,8% (Hình 3.1, Hình 3.2) là tương

đối cao, cho thấy ở nồng độ vào thời gian khử trùng cao không gây ảnh hưởng đến sứcnảy mâm của hạt.

Ngày sau cấy

Hình 3.2 Diễn tiến tỷ lệ nảy mam của hạt bạc hà lục được khử trùng với các nồng độ

và thời gian khác nhau.

Các chỉ tiêu chiều cao cây, chiều dài rễ và số lá dao động lần lượt trong khoảng

32,23 — 35,89 mm/cây, 19,31 — 21,57 mm/cây va 7,51 — 7,67 lá/cây ở ngày thứ 42 sau

cấy Sự khác biệt giữa các nghiệm thức ở các nồng độ NaOCl và thời gian khử trùngkhác nhau không có ý nghĩa về mặt thống kê (Hình 3.1, Bảng 3.2) Tương tự với tỷ lệnảy mầm, khi tăng nồng độ và thời gian khử trùng không gây ảnh hưởng xấu đến sinhtrưởng của cây.

Bang 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ NaOCl va thời gian khử trùng đến kha năng nảymâm, chiêu cao cây, chiêu dài ré va sô lá của hạt cây bạc hà lục.

Tên nghiệm 4 i at x2 Chiều a rễ a l

(phút) (%, v/v) mấy) (mm/cay) (la/cay)

Thoi gian (A) 0,2" lót 0,2"

Ftinh Nông độ NaOCl (B) 01 04 01

A *D 10-0) 0,04"° „m

CV (%) 19,3 16,9 7,8

"*: khác biệt không có ý nghĩa

Kết quả thí nghiệm cho thấy, khi thay đổi nồng độ NaOCl và thời gian khử trùngkhác nhau, tỷ lệ nhiễm giữa các nghiệm thức là không đáng ké Cho thấy nguồn mau lànguồn mẫu sạch Đồng thời khi tăng nồng độ và thời gian khử trùng cao hơn không gây

ảnh hưởng xâu đên sinh trưởng và phat triên của cây Do đó, vê van dé chi phi và thời

gian nồng độ NaOCl 2,5% với thời gian 5 phút là thích hợp cho quy trình nhân giống

cây bạc ha lục Trong sản xuất, tuỳ theo nguồn gốc và độ sạch của nguôn mẫu, có thé

tăng nồng độ và thời gian khử trùng cho quy trình

3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ BA đến sự tạo chồi của đốtthan cay bạc hà lục im vitro

Việc bồ sung các mức nồng độ BA khác nhau có khác biệt rất rõ rệt đối với sự phátsinh chồi và sinh trưởng của cây bạc hà lục in vitro Kết quả được ghi nhận trong 28

Hình 3.3 Cây bạc hà lục nuôi cấy in vitro dưới cac nong độ BA khác nhau tại ngày thứ

28 sau cay

3.2.1 Ảnh hưởng của nồng độ BA đến khối lượng tươi, khối lượng khô của cụmchôi, choi và mô sẹo của cay bạc ha lục in vitro

Kết quả ở Hình 3.4 cho thấy sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê đối với

khối lượng tươi cụm chổi giữa các nghiệm thức Khối lượng tươi cụm chồi ở nghiệm

thức có bổ sung nồng độ BA 1,5 mg-L” cao nhất với 261 mg/cum chéi Nghiệm thức

không bồ sung BA cho khối lượng cây thấp nhất là 109 mg/cum chéi (Hình 3.4)

Sự khác biệt về khối lượng khô cụm chồi rất có ý nghĩa về mặt thống kê giữa các

nghiệm thức Nghiệm thức có bồ sung 1,5 mg-L~! BA cho khối lượng cao nhất với 21,4mg/cụm chồi Nghiệm thức không bổ sung BA cho khối lượng thấp nhất với 8 mg/cụmchéi (Hình 3.4)

Trong cùng một màu cột, các số có cùng ký tự đi kèm thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê.

Hình 3.4 Khối lượng tươi và khô của cụm chồi bạc hà lục nuôi cấy trên môi trườngđược bổ sung các nồng độ BA khác nhau

Khi tăng nồng độ BA sự khác biệt giữa các nghiệm thức được thê hiện rõ rệt ởkhối lượng chéi Cho thấy, nghiệm thức bổ sung 1,5 mg.L' cho khối lượng chồi cao

nhất (46,9 meg/chéi), sự khác biệt rat có ý nghĩa về mặt thống kê đối với các nghiệm thức

còn lại Nghiệm thức B-0 (không bồ sung chat điều hoa sinh trưởng BA) cho khối lượngchéi thấp nhất (15,0 mg/chéi) (Hình 3.5)

Khối lượng chỗi khô cũng cho thay ở nghiệm thức bổ sung nồng độ BA 1,5 mg.L!cho khối lượng chồi cao nhất (3,1 mg/chéi) tuy sự khác biệt không có ý nghĩa về mặtthông kê so với nghiệm thức b6 sung nồng độ BA 2,0 mg.L!, nhưng khác biệt rat có ýnghĩa về mặt thống kê đối với các nghiệm thức còn lại Khối lượng chồi của nghiệmthức bổ sung nồng độ BA 1,5 mg.L gấp 3,0 lần nghiệm thức không bổ sung BA(nghiệm thức có khối lượng chéi thấp nhất với 1,1 mg/chồi) (Hình 3.5)