Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Tạo dòng vegetative compatibility groups (VCG) cho Fusarium phân lập trên chuối bệnh vàng lá

Trong 6 mẫu nắm có 2 mau đã được kiểmtra khả năng gây bệnh và cả 2 mẫu đều có khả năng gây bệnh trên chuối, qua đó cho thay kha năng phân loại các mẫu Fusarium oxysporum gây bệnh héo vàn

; BỘ GIÁO DỤC VADAOTAOTRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

TẠO DÒNG VEGETATIVE COMPATIBILITY GROUPS

(VCG) CHO Fusarium PHAN LẬP TREN

CHUOI BENH VANG LA

Nganh hoc : CONG NGHE SINH HOCSinh viên thực hiện : NGUYÊN THỊ NGỌC AN

Mã số sinh viên : 19126003

Niên khóa : 2019-2023

TP Hồ Chí Minh, 03/2024

; BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TAOTRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

TẠO DÒNG VEGETATIVE COMPATIBILITY GROUPS

(VCG) CHO Fusarium PHAN LẬP TREN

CHUOI BENH VANG LA

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

ThS TRAN THỊ VAN NGUYEN THỊ NGỌC AN

TP Hồ Chí Minh, 03/2024

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc nhất đến với gia đình tôi Con xin cảm ơn cha mẹ

đã nuôi dưỡng, chăm sóc, quan tâm va che chở cho con dé vượt qua mọi khó khăn, thửthách trong cuộc sống và học tập Xin chân thành cảm ơn em trai đã luôn quan tâm, lo

lắng và ủng hộ chị

Con cảm ơn gia đình đã luôn đối theo, ủng hộ quá trình học tập và hoàn thiện bản

thân của con, là động lực mạnh mẽ và chỗ dựa vững chắc cho con

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Nông Lâm

TP Hồ Chí Minh cùng tất cả quý thầy cô Bộ môn Công nghệ Sinh học đã tận tình dạy

dỗ, giúp đỡ tôi trong thời gian theo học tại trường

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến PGS TS Lê Đình Đôn đã luôn quan tâm,dạy dỗ và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và thực hiện khóa luận tốt nghiệp

Tôi xin chân thành cảm ơn ThS Trần Thị Vân đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt

cho tôi những kiến thức quý báu dé tôi hoàn thành khoá luận tốt nghiệp này

Cảm ơn các anh, các bạn và các em ở cùng phòng thí nghiệm đã giúp đỡ, góp ý,

chia sẻ cùng tôi những khó khăn trong thời gian thực hiện khóa luận.

XÁC NHẬN VÀ CAM ĐOAN

Em tên Nguyễn Thi Ngọc An, MSSV: 19126003, Lớp: DH19SM, thuộc ngành Công

nghệ Sinh học Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, xin cam đoan: Đây là Khóa

luận tốt nghiệp do bản thân em trực tiếp thực hiện, các số liệu và thông tin trong nghiên

cứu là hoàn toàn trung thực và khách quan Em xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước

Hội đồng về những cam kết này

Tp Hồ Chí Minh, ngay 31 tháng 03 năm 2024

Người viet cam đoan

H

TÓM TẮT

Nghiên cứu được tiến hành nhằm xác định tinh gây bệnh và triệu chứng bệnh trên chuối

bị bệnh vàng lá của các dòng nam Fusarium oxysporum f sp cubense Đề tìm kiếm các

dòng nắm Fusarium oxysporum này, 20 mẫu củ và rễ chuối tiêu đã được thu thập từ các

vườn chuối tại các tỉnh Đồng Nai, Bình Dương, Tây Ninh và Long An Tiến hành phânlập mẫu bằng cách xử lý và phơi mẫu đã thu được 6 mẫu nam Fusarium oxysporum cómau sắc tan nam, tốc độ phát triển và kích thước bào tử khác nhau Tiến hành phục hồi

các đột biến không sử dụng NO: (đột biến nit) và phân loại các đột biến nit dựa trên sự

phát triển của chúng trên môi trường chứa nguồn nitơ khác nhau giúp tạo ra kết quả

chính xác và rõ ràng khi bat cặp các đột biến nit Tiến hành tạo dòng VegetativeCompatibility Groups (VCG) cho 6 mau nắm bang cách bắt cặp các đột biến nit nhằmxác định khả năng gây bệnh của các mẫu dựa trên sự hình thành hợp thể dị nhân Kết

quả thu được 6 mẫu nam đều có sự hình thành hợp thé dị nhân cho thấy sự tương thích

sinh dưỡng và các mẫu đều cùng một VCG Trong 6 mẫu nắm có 2 mau đã được kiểmtra khả năng gây bệnh và cả 2 mẫu đều có khả năng gây bệnh trên chuối, qua đó cho

thay kha năng phân loại các mẫu Fusarium oxysporum gây bệnh héo vàng dựa vào sự

tương thích sinh dưỡng mà không cần đến các xét nghiệm khả năng gây bệnh tốn thời

gian là một phương pháp có độ tin cậy cao.

Từ khóa: Vegetative Compatibility Groups, Fusarium oxysporum Ÿ sp cubense, đột

biến nit, hợp thé di nhân

il

The study was conducted to determine the pathogenic properties and disease symptoms

of Fusarium oxysporum f sp cubense To search for these strains of Fusarium

oxysporum fungus, 20 samples of banana tubers and roots were collected from banana gardens in Dong Nai, Binh Duong, Tay Ninh and Long An province Samples were isolated by processing and exposure, resulting in 6 Fusarium oxysporum samples with different growth rates, thallus colour, and spore sizes Performing the recovery of mutants that do not use NO3 (nit mutants) and classifying nit mutants based on their growth on media containing other nitrogen sources to get accurate and clear results when pairing nit mutants Create Vegetative Compatibility Groups (VCG) lines for 6 fungal samples by pairing nit mutants to determine the pathogenicity of the samples based on

hop thé di nhan formation The obtained results revealed that all 6 fungal samples had

heterokaryon shapes, biological compatibility and all samples have the same VCG 2 samples of 6 fungal samples were testedfor their ability to cause disease and both

samples were capable of causing disease on bananas, thereby finding the method to classify Fusarium oxysporum that causes Fusarium wilt based on vegetatively compatible without time-consuming pathogenicity tests and this is a highly reliable

method.

Từ khóa: Vegetative Compatibility Groups, Fusarium oxysporum f sp cubense, nit

mutants, heterokaryon.

IV

MỤC LỤC

Trang

TIÊN E: ee a ee eee oe ea ee iXÁC NIIẬN VÀ GAM DOAN ss ccsssecsesesicecesesscc sr senreesnrereemnseentennnesieertecemneaneaeuet ii

CE Eanrereeereerioereroo0 002 0BE021000210/070005/00000090I20000)PS0G20SG7/200B iii

MÀ E 0): lì NA Con eee ee IV

NI TT De sec essen pepe teeter rr em tec V

DANH SÁCH CHỮ VIET TẮTT 2-2+2222222E+222E+22EE+2EEE222EE2EEEESEEErerrrrrrrree Vii

se ss ae viiiDANH SÁCH CÁC HINHW cssscssscsssesssesssesssscssessseessesssecstecsseesseessesssessessssesseseseesseeess ixACEI 2 XI, l3): nec enemies |1.1 Đặt vấn đề 2- 5s s2 223221221211 11211211111111121121111112111110111212111 212112 cre |1.2 Mục tiêu đề tài -5- s22 S2212E12122121121211211211121121111121101211211122221 2121212 rre 2

1:5:.INGI,/đũ7167THWG HT saigneeintsttoibstottGEISGESPESEGNRGHSSHSESOAEREGREEBS-BISESGSHGHGHTGBIRGSGgSGSi.DS0N/00G/38R0 2CHƯƠNG 2 TONG QUAN TÀI LIBU 0o csccccscsscsssesseessessesssessessesseseeseseeseseesseeeeeees 3

2.1 GiGi thidu vé Cay in on 32.2 Một số loài nam Fusarium gây bệnh trên thực vật -cssccscrsseexee 42.3 Bệnh héo vàng trên chuối 2-22 ©2222S+222EE2EE22E22EE22E222122322212212211221 222222 5

2 Bele LEIỆUEHHẨĐDnssbseritite:01000E0597899SDIĐHOISEEEEMSISEEELESGSESRSSINSNISSSSSEAIl-SSÐt2to3430/201S93E309t285Z4 5

ee eT 6

2.3.3 Biện phap PHONG till scscececcersescreerevenwesesreessneemnenvarmenens name mene 6

2.4 So lược về nam Fusarium oxySPOrum csccscccsesscessesssesssssesssssssssssssessessesssesessseseessees 7

P ĐÀ (009.08 ƒ

2.4.1 Nam Fusarium oxysporum gây bệnh trên chuối -2-522©22222+25+ccsc2 7

Dida (1 OLOTHDI Vi CGD srspcoitigtititgtil tạìnggdH0IGNGEHGEEGUISR.UD0SRĐGGISISI09SG/.208503840/01308G13E-8H.35/G0NGGRJSTGHSHSG2.3B10 8 2.5.1 Nghiên cứu tạo dòng VCG ngoai RƯỚC - cece cece S2 S2* SE 2E ri 8 2c, Neen S00 0 détd VO WONg NUS snccnccecmmencmmnummammmnmmemees 11

CHƯƠNG 3 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP 00 -.ssssssssssesssseesseecsseeesneecneecsneeenees 123.1 Thời gian và địa điểm nghiên Ctr oo ccceceeececeeessesseesecsesseetessessesseestessees 12

KAA/)080(ìi6i 30200 11 12

N1, Nếu ft icc cnc cae aor ns 12

OR rerareserrrrrrrrrtrrortinnortotrinEiandpnstoiosdSiidpggSHiinhQ0ytnntgitperbignodtisl 123.2.3 Thiét bi va Aung CU oe i4 12

3.3 Phitone Pháp nghiện GỮU-<:sscesossssisiesiboioioLldiisiedoottoSlsePtbssbastssbftvlSukgoi điusagesJoxgiSe 12

3.3.1 Chuan bi mi trudge 4 ẢẢ 12

3.3.2 Phân lập và mô tả các mẫu Fusarium gây bệnh vàng lá -5-5252 13

3.3.2.1 Phân lập Fusarium từ các mẫu chuối bệnh vàng lá 2-5-5225: 133.3.2.2 Mô tả các mẫu Fusarium phân lập từ chuối bệnh vàng lá - 13

3.3.3 Tạo dòng VCG cho Fusarium đã phân lập được - - -c+<c<cce2 14

3.3.3.1 Phục hồi đột biến nit (phục hồi các thé đột biến không sử dụng NO2) 14

3.3.3.2 Ghép nối các đột biến nit với nhau -22 522 5222S22E+2E£2E22E22E22EZE2Ezzezxez 14

CHƯƠNG 4 KET QUA VÀ THẢO LUẬN -2 22 22+2E+2E2EE22E2EEE2EecEerree 15

#1, ECC Lee, a ees 154.2 Kết qua phân lập nắm từ các mẫu chuối - 2-2 22©222222E2EE+2E22E++£Ez+zzzz+2 164.3 Kết quả định danh hình thái 2-2-2 s2 S2S1+SE£EEEEE£EE2EEE2EE2E 2121221212221 zxe2 l64.3.1 Đặc điểm hình thái mẫu DNC1 - 2-2 ©22222222E£+2E£2EEE2EE22EE222E222Ezcrxree 174.3.2 Đặc điểm hình thái mẫu DNBI 2© 2+22+22E+2EEE2EEE2EE22EEE2EEezrErcrkret 18

4.3.3 Đặc điểm hình thái mẫu DNRI1 oo cece cee eessesesesossssessseessessseesseessesetessteeseeseees 19

4.3.4 Đặc điểm hình thái mẫu DÌNR2 - 2-2 2++222+2E+2EEE2EE+2EEE2EE+2EEEerErerrre 204.3.5 Đặc điểm hình thái mẫu TNC1 2- 2 2+22SE+EE£E22EEEE C22121 2252121212 ce, 214.3.6 Đặc điểm hình thái mẫu BIDCl -2-©22+22222E£+EE£2EEZ2EE22EE222E222Ezzrxce 224.3.7 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cay đến hình thái các mẫu nấm 234.3.8 Kết quả chủng bệnh của mẫu nắm DNC1 và TNCI 2- 225522222222 254.4 Kết quả tạo dòng VCG 2-©22- 222222 22122122212712112212211211211211211 212111 264.4.1 Nuôi cay trên môi trườn MM, BM cece cece cece ee eeeeeeesssessseeeeeceeeeees 264.4.2 Nuôi cấy trên môi trường có chứa Clorat cccccccssccsssosssecsssensccsssseesssencenncsesens T7

AAS Chọn đt DiGi tll seo gì thtoHh Bhgo GA 3i048500360101180060850030031G10081040380018060.0001055089001ag38 38

5/14 Phẩn lợi HỘI biểm HÌ ee 304.4.5 Bắt cặp các đột biến nit - 2-52-2222 21 2122E22E2EEeE.Errrrrrrrrrrrr 32

20-4 0N ĐI VI teeta ei te a tee tc Ser 35CHUONG 5 KET LUẬN VA DE NGHI o.oo .ccccccsccccssessessesecsesseseseessesvssesesseeseeeseeseeeees 37

SS reer 375.2 Để Qh oon eceececeecsessesessesssesscsvcsessssvsseesssesssssscstesesssesssssseesesessesaesessessseeseeeaeeees 37TÀI LIEU THAM KHẢO ©-2-52+22222E22E2EESEEzEerrrrrrrrrrrrrrrrr 38

VI

: Oat meal agar : Potato dextrose agar : Potato glucose agar : Spezieller Nahrstoffarmer Agar

: Vegetative Compatibility Groups

: Water agar

vu

DANH SÁCH CÁC BANG

Trang

Bang 4.1 Danh sách địa điểm và số lượng mau củ, rễ chuối đã thu thập 3Bảng 4.2 Danh sách các mẫu nam được phân lập - 2 2222222252252 l6

Bang 4.3 Đường kính tan nắm sau 6 ngày nuôi cấy trên các môi trường (mm) 24

Bảng 4.4 Hệ số biến thiên CV (%) trên các môi trường sau 6 ngày nuôi cấy 24Bảng 4.4 Tốc độ phát triển của các mẫu chuyền từ môi trường clorat sang môi trường

MM, BM sau 3 ngày nuôi cay U50 29Bang 4.6 Hệ số biến thiên CV (%) trên các môi trường sau 3 ngày nuôi cấy 30Bảng 4.7 Phân loại đột biến nit trên các môi trường chứa nguồn nitơ khác nhau 30

vill

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 4.1 Đặc điểm hình thái mẫu IDNCI_ 22-522 22S£EE+E+Ez£EzEzzEczrcee 17Hình 4.2 Đặc điểm hình thái mẫu DNBI 2 2222222E2E22E2EZEzxcce2 18Hình 4.3 Đặc điểm hình thái mẫu IDNRI_ -2- 2 22S2ES+E2Ez£E+EzEcrxrree 19Hình 4.4 Đặc điểm hình thái mẫu DNR2 2 2+ 2+S2+E£EE+EE+Ez£EzEzzEzrzrree 20Hình 4.5 Đặc điểm hình thái mẫu TNC] -2- 2 2522 22E£EE2E2Ez£E2EzZEzzccez 21Hình 4.6 Đặc điểm hình thai mẫu BC - 2-22 22+2ES22E£EE2E£Ez£E+EZEzxczee 22Hình 4.7 Đặc điểm các mẫu nam Fusarium oxysporum trên các môi trường nuôi cấy

SHUG TOBY C20" Cũ sasessxnetoronorurtarindaitlneiststrdiradirtatletnpsdiogirburisditoidiaioidimgioaosirgriigrsdiipdutiodrirsnridgkErize 23 Hình 4.8 Các triệu chứng bệnh của lá va củ sau 30 ngày chủng bệnh 25

Hình 4.9 Các mẫu nắm nuôi cấy trên MM, BM 3 - 4 ngày ở 25°C - 26Hình 4.10 Các mẫu nam nuôi cay trên môi trường chứa clorat 7 - 14 ngày ở 25°C 27Hình 4.11 Các mẫu được chuyền từ môi trường KPS sang môi trường MM, BM sau 3

LNG PAO Ca a 28

Hình 4.12 Sự bat cặp trên môi trường có NaNO; (môi trường MM) sau 21 ngày ở 25°C

Hình 4.13 Sự bắt cặp trên môi trường không có NaNO; (môi trường BM) sau 21 ngày

OS Cle ee 33

Hình 4.14 Sự bat cặp trên môi trường PGA sau 21 ngày, ở 25°C 34

1x

tan/nam, gia tri xuất khâu chuối tươi của Việt Nam dat 310,6 triệu USD, tăng 34,5% so

với năm 2021 Số liệu thống kê từ Cơ quan Hải quan Trung Quốc, 10 tháng năm 2023,

trị giá nhập khẩu chủng loại quả chuối (mã HS 0803) của Trung Quốc dat 1,46 triệu tan,

tri giá 912,4 triệu USD Giá chuối nhập khâu bình quân trong 10 tháng năm 2023 đạt623,2 USD/tan Với thế mạnh xuất khâu cao nhưng bệnh hại trên chuối lại đang là mối

de doa đối với năng suất và chất lượng của chuối gây thiệt hại nặng cho người nông dân

Theo số liệu điều tra của Chi cục Trồng trọt và Bảo vệ thực vật tỉnh Lai Châu, tính đến

tháng 7/2017 trên địa bàn huyện Phong Thổ có 1.367 ha chuối tây bị nhiễm sâu bệnhtrong đó có 1.060 ha nhiễm nhẹ đến trung bình và 307 ha nhiễm nặng dẫn đến thiệt hại

về kinh tế, giảm giá trị xuất khẩu

Các bệnh hại như bệnh đốm lá, bệnh than thư, bệnh héo rũ Panama, bệnh chun dotchuối, là các bệnh gây thiệt hại lớn đến năng suất, trong đó bệnh héo vàng (bệnh héo

rũ Panama) là mối đe dọa nghiêm trọng đối với sản lượng, ảnh hưởng trực tiếp đến năngsuất và chất lượng chuối Bệnh héo vàng trên chuối hay còn gọi là bệnh Panama trênchuối do nắm Fusarium oxysporum f sp cubense (Foc) gây ra, đây là một bệnh gây

chết cây chuối do nắm xâm nhập, phát triển và gây hại trong mạch dẫn, các cây bị bệnh

tuy có cho các chồi mọc từ thân chính nhưng các chỗi này cũng bị héo một cách nhanhchóng nên không thé dé lưu giống cho vụ sau hoặc sản xuất cây giống mới Bệnh héovàng trên chuối đã gần như xóa số ngành công nghiệp chuối Gros Michel ở Trung Mỹ

va Caribbean, vào giữa thé ky XX gây thiệt hại hơn 2 tỷ USD Bệnh héo vàng trên chuối

ảnh hưởng đến các trang trại trồng chuối tiêu ở nhiều nước trên thế giới, trong đó có cácnước trồng chuối lớn như Đài Loan, Indonesia, Malaysia, Philippines, Australia,

Jordan, Ở Trung Quốc, bệnh gây hại nghiêm trọng trên diện rộng ở tỉnh Quảng Đông,

Quảng Tây và đảo Hải Nam, đều giáp với biên giới nước ta Trong một đánh giá về tìnhtrạng bệnh héo vàng (Fusarium oxysporum f sp cubense - Foc) trên cây chuỗi già Nam

Mỹ canh tác tai Khu liên hợp nông nghiệp Snuol, thuộc tỉnh Kratie (Campuchia) giáp

với tỉnh Bình Phước nước ta, trong năm 2020 đến giữa năm 2021, bệnh đã gây thiệt hại

với 183.311 cây bị hủy tương đương khoảng 85 ha chuối bị mat trắng do bệnh héo vàng

gây ra Theo báo cáo khoa học do Trung tâm Tai nguyên Thực vật tai Hà Nội và Vườn

Bách thảo Meise của Bi công bố tháng 2-2022 đã cảnh báo: Việt Nam sẽ mắt tới 71%diện tích dat trồng chuối trong vòng 25 năm tới do tác hại của loại nam Fusarium

Phát hiện sớm các triệu chứng tại hiện trường va chan đoán nhanh trong phòng thínghiệm la một bước thiết yếu dé loại trừ va ngăn chặn sự bùng phát của bệnh hại Đề

xác định tác nhân gây bệnh, người ta thường dùng các phương pháp phân tử và xét

nghiệm độc lực học nhưng phương pháp phân tử chỉ xác định được loài, không xác định

được khả năng gây bệnh, phương pháp xét nghiệm độc lực học phải chủng bệnh lên cây

và tái phân lập tốn nhiều thời gian

Năm 1985, Puhalla và các đồng nghiệp đã chỉ ra rằng trong một quan thé vô tính,

các đòng phân lập có khả năng gây bệnh tương tự phát sinh như một phan của dòng vôtính đều phải ở trong cùng một Vegefafive compatibility groups (VCG) Xác định VCG

có thể thay thế cho các xét nghiệm độc lực học tốn thời gian và cho phép đánh giá nhanhcác quan thé chuối nhiễm bệnh héo vàng Hiện nay, bệnh héo vàng trên chuối đang xuấthiện nhiều và gây hại nghiêm trọng đến năng suất cây trồng Vì vậy, phương pháp xác

định VCG được lựa chọn giúp xác định chính xác và nhanh chóng tác nhân gây bệnh.

1.2 Mục tiêu đề tài

Tao dòng VCG cho Fusarium phân lập trên chuối bệnh vàng lá nhằm xác định khả

năng gây bệnh và triệu chứng bệnh của các dòng Fusarium oxysporum f sp cubense 1.3 Nội dung thực hiện

Phân lập và mô tả hình thái các mẫu nam Fusarium gây bệnh từ chuối bị bệnh

vàng lá.

Tao dòng nhóm tương thích sinh dưỡng (VCG) cho Fusarium đã phan lập được

từ chuối bệnh vàng lá

CHUONG 2 TONG QUAN TÀI LIEU

2.1 Giới thiệu về cây chuối

Chuối là tên gọi các loài cây thuộc chi Musa, có nguồn gốc từ vùng nhiệt

đới ở Đông Nam A và Uc Ngày nay, chuối được trồng khắp vùng nhiệt đới (Nelson,

2006) Nó được trồng chủ yếu dé lay trái cây và ở mức độ ít hơn là dé trang trí Một sốgiống chuối thường được trồng như chuối tiêu, chuối tây, chuối bom, chuối ngự Rễchuối thuộc loại rễ chùm, có rễ ngang mọc xung quanh củ chuối, và phân bố ở lớp đấtmặt, loại rễ nay sinh trưởng khỏe, phân bố rộng Rễ thang mọc ở phía dưới củ chuối cótac dụng giúp cây đứng vững Thân cây thường mọc lên cao, thang, va hơi vững, chuốibao gồm thân thật (củ chuối) và thân giả Thân thật (củ chuối) sống lâu năm, là cơ quanchủ yếu dự trữ chất dinh dưỡng đồng thời cũng là nơi để rễ, lá, mầm và cuống hoa mọc

ra, xung quanh củ chuối có nhiều mầm ngủ, sau này phát triển thành cây con Thân chuối

là thân giả chiều đài lên tới 6 — 7 m, mọc lên từ củ chuối Thân giả có hình trụ, do nhiều

bẹ lá lồng vào nhau tạo thành Quả của những cây chuối dại có nhiều hột lớn và cứng

Hầu hết loại chuối được buôn bán dé ăn thiếu hột do đã được thuần hóa lâu đời nên có

bộ nhiễm sắc thể đa bội (thường là tam bội) Cây thường mọc thành bụi và được trồngbằng cách tách rời cây non đem trồng thành bụi mới Lá chuối ra theo hình xoắn và cóthé kéo dai 2,7 m và rộng 60 cm Hoa chuối thường lưỡng tinh, đầu hoa thường ra mộthoa đực riêng, không sinh sản, còn dược gọi là bắp chuối

Khoảng 98% sản lượng chuối của thế giới được trồng ở những nước đang phát

triển Và chuối được xuất khẩu tới các nước phát triển Vào năm 2004, tổng cộng có 130

nước xuất khâu chuối Theo thông kê của Cục trồng trọt, năm 2022 cả nước có khoảng154.000 ha trồng chuối với sản lượng 2.3 triệu tắn/năm, gia tri xuất khẩu chuối tươi của

Việt Nam đạt 310,6 triệu USD, tăng 34,5% so với năm 2021 Theo Cục Bảo vệ thực vật,khối lượng xuất khẩu chuối sang Trung Quốc thực hiện kiểm dịch thực vật là trên

430.000 tấn năm 2020, 574.000 tắn năm 2021 và 591.000 tấn trong 9 tháng đầu năm

2022 Trong nửa đầu năm 2022, gia tri xuất khâu chuối đến Nga đạt hơn 1,8 triệu USD

Tại Đồng Nai, tính đến cuối năm 2022, toàn tỉnh có gần 14,2 ngàn hecta (ha), xuất khâutrên 400 ngàn tan chuối Theo báo cáo của Sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn tinhLai Châu, hết tháng 8 năm 2021, Lai Châu có gần 4.130 ha chuối, sản lượng chuối 8

tháng ước đạt 30.000 tan Huyện Phong Thổ có hơn 3.430 ha chuối và hết tháng 8 sanlượng thu hoạch xuất khâu đạt gần 30.000 tan.

2.2.Một số loài nam Fusarium gây bệnh trên thực vật

Chi Fusarium bao gồm một số loài gây bệnh thực vật có tam quan trọng về mặtkinh tế Nhiều loại cây có it nhất một bệnh liên quan đến Fusarium Một cuộc khảo sát

gan đây về danh sách bệnh hại cây trồng do Hiệp hội Phytopathological Hoa Kỳ (www

Apsnet.org/online/common/search.asp) thực hiện cho thấy hơn 81 trong số 101 loài thựcvật quan trọng về kinh tế trong danh sách có ít nhất một bệnh liên quan Fusarium (Leslie

va Summerell, 2006) Nam 1876, Bancroft lần đầu tiên mô tả bệnh Panama hay bệnh

héo rũ Fusarium ở Australia do nam Fusarium oxysporum f.sp cubense có trong đất gây

ra Năm 1990, Ploetz đã ghi nhận, bệnh hại cây Fusarium đã gây ra một số tác động lớn.Một thời kỳ gần tàn phá ngành công nghiệp chuối thương mại vào những năm 1960 dobệnh héo xanh gây ra bởi nam Fusarium oxysporum f sp cubense Simmonds (1966)coi bệnh héo Fusarium trên chuối là một trong những bệnh hại cây trồng có sức tan phácao nhất Khi số liệu của Stover (1962) được chuyên đổi sang đô la năm 2005, thiệt haitrên Gros Michel có tổng thiệt hại ít nhất 2 tỷ đô la My (Ploetz, 2005)

Năm 2002, Logrieco đã ghi nhận bệnh thối ngọn ngô, bệnh bạc đầu ở lúa mạch,

yến mach và lúa mì chủ yếu do Fusarium graminearum gây ra Bệnh bạc đầu Fusarium

là mối lo ngại lớn đối với các nhà sản xuất lúa mì vì khả năng làm giảm năng suất, nguy

cơ đe dọa an toàn thực phẩm và thức ăn chăn nuôi liên quan đến ô nhiễm độc tố nammốc trong hạt bị nhiễm bệnh (Mullen va ctv, 1997; Dweba va ctv, 2017) Bắt đầu từnăm 1993, tây bắc Minnesota, đông North Dakota, đông bắc South Dakota và namManitoba ở Canada đã bị Fusarium tan công đặc biệt nặng nề và mức độ nghiêm trọngcủa bệnh lên tới 20 đến 80% Dịch bệnh tái diễn hàng năm từ năm 1993 đến 1998 vớicác cường độ khác nhau, đặc biệt là ở đông bắc North Dakota, tây bắc Minnesota vànam Manitoba Tén thất lúa mì và lúa mạch do dich bệnh ở Hoa Kỳ trong những năm

1990 ước tính gần 3 tỷ USD Nông dan trồng lúa mì Mỹ thiệt hại hơn 500 triệu gia lúa

mì trị giá khoảng 2,5 tỷ đô la và các nhà sản xuất lúa mạch 6 Midwestern mat 400 triệu

đô la cho lúa mạch (Windels, 2000) Năm 2021, Simon đã ghi nhận nam Fusariumxyrophilum lây nhiễm và có thé gây bệnh hau hết các loại cỏ Xyris vàng từ Guyana ởNam Mỹ, tạo ra những bông hoa giả đánh lừa ong và các loài côn trùng thụ phấn khác

đến thưởng mật và phan hoa, mang bào tử nam sang các cây Xyris khác và lây nhiễm

cho chúng Tat cả các loải nam Fusarium này đều gây ra các thiệt hại nghiêm trọng trên

cây ký chủ, gây ảnh hưởng đến năng suất và tôn thất nặng nề về kinh tế trong nhiều năm.2.3 Bệnh héo vàng trên chuối

Bệnh héo vàng trên chuối hay bệnh héo rũ Panama do nam Fusarium oxysporum

f sp cubense (Foc) gây ra Đây là loại nam tôn tại trong đất với thời gian khá lâu, cóthé lên đến 30 năm, Foc nhiễm các mach dẫn gây héo và làm chết cây chuối (Stover,1962) Simmonds (1966) coi bệnh héo vàng trên chuối là một trong những bệnh hại câytrồng có sức tàn phá cao nhất Mầm bệnh đã phá hủy ngành công nghiệp trồng chuối

Gros Michel lâu đời được trồng trong các đồn điền độc canh ở Châu Mỹ và Châu Phi

gây thiệt hại nghiêm trọng về kinh tế (Ploetz, 2015) Sự bùng phát đã phát triển thànhmột trong những dịch bệnh thực vật toi tệ nhất mọi thời đại

Việc phát hiện ra chuối Cavendish kháng bệnh đã thành công trong việc dập tắtdịch bệnh héo Fusarium do Foc chủng 1 gây ra góp phan mở rộng sản xuất Cavendish

ra các vùng độc canh lớn trên thé giới Tuy nhiên, một dòng Foc mới, chủng nhiệt đới 4(TR4), tấn công các dòng vô tính Cavendish và nhiều chuối khác Foc TR4 đã bị hanchế ở Đông va một phần Đông Nam A trong hơn 20 năm, nhưng ké từ năm 2010, căn

bệnh này đã lan sang năm quốc gia khác ở Đông Nam và Nam Á (Việt Nam, Lào,

Myanmar, An Độ va Pakistan) và Trung Đông (Oman, Jordan, Lebanon va Israel) vaChâu Phi (Mozambique) (Dita va ctv, 2018) Dịch bệnh đang diễn ra ở chuối Cavendish

là do một kiểu gen duy nhất, nhóm tương thích thực vật (VCG) 01213 của Foc và đượcgọi là chủng nhiệt đới 4 (TR4) gây ra Nó đã gây ra thiệt hại đáng ké trong các khu vựcsản xuất thương mại và tự cung tự cấp của Đài Loan, Malaysia và các vùng lãnh thổphía bắc của của Úc (Su và ctv, 1986, Gerlach và ctv, 2000, Hermanto va ctv, 2009)

lá cũng bị gãy ở phần giữa phiến lá Trong vòng một hoặc hai tháng, tất cả, trừ những

5

chiếc lá non nhất, chuyên sang màu vàng, héo ta, xẹp xuống và rủ xuống, bao phủ thân

cây (giả) bằng những chiếc lá màu nâu chết Cây bệnh chết nhưng thân không ngã đồ,các bẹ ngoài bị nứt dọc, các chồi con vẫn phát triển từ thân chính nhưng sau đó cũng bịhéo rụi Cắt ngang thân gia bị bệnh sẽ thấy ở các be lá non nhất có mach dẫn nhựa đổimàu vàng bên trong, các bẹ lá già có màu nâu bên ngoài, cắt ngang thân thật (củ chuối)

có những đốm vàng, đỏ hoặc nâu Chẻ dọc phần gốc của các rễ dẫn vào củ chuối có sọc

đỏ và bốc mùi hôi Bệnh lây lan và gây hại nghiêm trọng cho các vùng trồng chuối với

tỷ lệ cây bị bệnh cao nếu không được xử lý

đã đưa ra các ghi chép về Foc TR4 được thu thập ở Việt Nam va Lào và báo cáo đầu

tiên về nó ở Myanmar Năm 2015, dịch bệnh lan sang châu Phi và đến tháng 8 năm

2019, TR4 đến Colombia, một quốc gia ở Mỹ Latinh (Karp, 2019) Chittarath và ctv, đã

có các cuộc khảo sát vào năm 2018 và năm 2020 về sự phân bố địa ly và đa dang ditruyền của nam Fusarium gây bệnh héo Fusarium trên chuối ở Lao và Việt Nam, kếtqua cho thấy bệnh héo Fusarium được tìm thấy rộng rãi ở vùng phía Bắc Lào và ViệtNam, miền Trung, miền Nam Lào và các vùng phía Nam Việt Nam Hầu hết chuốiCavendish bị nhiễm Foc TR4 được ghi nhận ở phía Bắc Lào và các tỉnh Lai Châu, HàNội, Hưng Yên, Tây Ninh, Long An, khu vực Tây Bắc của tỉnh Lào Cai, Đông Bắc củatỉnh Phú Thọ của Việt Nam (Chittarath và ctv, 2022) Bệnh có thể phát sinh và gây hại

trong bat kỳ giai đoạn sinh trưởng của cây chuối Bệnh biểu hiện rõ nhất ở giai đoạn cây

chuối ra hoa và phát triển quả non

vật liệu chuối giống bị nhiễm nắm gây bệnh héo vàng lá chuối Kiểm tra các cơ sở sản

xuất giống chuối ở địa phương dé phát hiện, tiêu hủy kịp thời các lô giống chuối bị bệnhhéo vàng (nếu có) Kiểm soát chặt chẽ việc ra vào trang trại trồng chuối; khử trùng công

cụ canh tác dé ngăn ngừa sự xâm nhập của nguồn bệnh vào trang trại trồng chuối Bên

cạnh đó, có thé thay giống chuối những nơi chuối tiêu bị bệnh héo vàng gây hai nặng có

thể chuyên sang trồng chuối tây (ít bị bệnh hơn), trồng giống chuối kháng bệnh hoặcluân canh cây chuối với cây trồng khác (chuối - mía; chuối - sắn); chuối - cây họ đậu, ) từ 2-3 năm Đào bỏ các gốc bị bệnh nặng, rải vôi hay thuốc gốc đồng dé khử đấttrước khi trồng lại Các vườn bị bệnh nặng nên ngưng canh tác, cày phơi khô 2 - 6 tháng

dé diệt nắm bệnh, không dùng chuối con ở vườn bị bệnh (Trần Danh Sửu và ctv, 2017).Ngoài ra, việc phát hiện sớm các triệu chứng bệnh tại vườn và chân đoán nhanh trongphòng thí nghiệm cũng góp phần loại trừ và ngăn chặn sự bùng phát của dịch bệnh

2.4 Sơ lược về nắm Fusarium oxysporum

2.4.1 Vị trí phan loại

Giới: Fungi, Ngành: Ascomycota, Lớp: Sordariomycetes, Bộ: Hypocreales, Họ:

Nectriaceae, Chi: Fusarium

2.4.1 NẤm Fusarium oxysporum gây bệnh trên chuối

Trên môi trường PDA, sợi nam Fusarium oxysporum có thé kết bông, thưa thớthoặc nhiều và có màu từ trắng đến tím nhạt F oxysporum thường tạo sắc tô từ tím nhạtđến tim đậm hoặc đỏ tươi trong thạch nhưng một số chủng phân lập hoàn toàn khôngtạo ra sắc tố Dai bao tử màu cam nhạt hoặc tím nhạt được tạo ra nhiều trong khối bào

tử trung tâm ở một số chủng phân lập, hầu hết các chủng phân lập đều tạo ra nhiều túibảo tử có màu nhạt hoặc vàng nhạt; tuy nhiên, ở một số chủng phân lập, bào tử có thểthưa thớt hoặc không tồn tại Đại bào tử thường là 3 vách ngăn, chiều đải từ ngắn đếntrung bình, thang đến hơi cong, vách mỏng, thường có nhiều trong túi bao tử và đôi khi

từ sợi nam trên bề mặt thạch Tiểu bao tử có hình bầu dục, hình elip hoặc hình quả than,

thường có 0 vách ngăn, thường xuất hiện nhiều trên sợi nắm Bao tử hậu được hình thành

nhiều và nhanh chóng (2 - 4 tuần đối với môi trường CLA) bởi hầu hết các chủng phânlập, thường hình thành đơn lẻ hoặc theo cặp, nhưng cũng có thể được tìm thấy trong

cụm hoặc chuỗi ngắn Có thể xuất hiện ở đầu cuối hoặc xen kẽ trong các sợi nam Trên

môi trường CLA, đại bảo tử được hình thành với màu cam nhạt, thường có nhiều túi bào

tử, có chiều dài từ ngắn đến trung bình, cong đến gần như thẳng, thành mỏng và thường

a

có 3 vách ngăn Đỉnh tế bảo ngắn và hơi móc ở một số chủng phân lập Tiểu bào tử

thường có 1 hoặc không có vách ngăn, có thể hình bầu dục, hình elip hoặc hình thận(hình quả thận) Bao tử hậu được hình thành nhiều trong sợi nam trên bề mặt thạch bởihau hết các chủng (Snyder và Hansen, 1940)

Fusarium oxysporum f sp cubense là một loại nam bệnh thực vật gây ra bệnhPanama trên chuối, còn được gọi là bệnh héo Fusarium trên chuối Các loại nam và bệnhliên quan là nguyên nhân gây ra áp lực lan rộng đối với các vùng trồng chuối, phá hủykhả năng kinh tế của một số giống chuối quan trọng về mặt thương mai Foc lây lan tại

địa phương và trong khu vực với vật liệu trồng bị nhiễm bệnh (Pegg, 2019)

Nam bệnh được mô ta lần đầu tiên ở Australia năm 1874 (Bancroft, 1876) Năm

1990, Ploetz đã ghi nhận, bệnh hại cây Fusarium đã gây ra một số tác động lớn.Fusarium oxysporum f sp cubense được phân thành 4 chủng Có ít nhất 24 nhóm tương

thích sinh dưỡng (VCG) trong các chủng khác nhau (Mostert va ctv, 2017) Chung Foc

1 gây bệnh trên các giống Gros Michel, chủng Foc 2 cũng ảnh hưởng đến các giống

chuối như chủng Foc 1 và ảnh hưởng đến các giống cây trồng Bluggoe, chủng 3 lúc đầu

được mô tả là chủng lây nhiễm Musa nhưng sau đó được ghi nhận là chỉ lây nhiễmHeliconia spp Ching 4 gây bệnh trên hầu hết các giống bao gồm Cavendish (Ploetz,2015) Ban đầu, chủng 4 được biết là chỉ ảnh hưởng đến các giống Cavendish ở vùngcận nhiệt đới, nơi nhiệt độ tương đối mát hơn được cho là làm tăng tính mẫn cảm củaCavendish ( Ploetz, 2006 ) Đến đầu những năm 1990, các giống Cavendish ở các vùngnhiệt đới của Đông Nam A bat đầu chống chọi với bệnh héo Fusarium, hình thành chủngFoc TR4 ( Ploetz, 2015 ) Ké từ đó, chủng 4 bao gồm chủng cận nhiệt đới 4 (SR4) và

chủng nhiệt đới 4 (TR4) Các VCG khác nhau được sử dụng để phân biệt giữa các chủng

cận nhiệt đới (SR4) (VCG 0120,0129,01211 và 01215) và chủng tộc nhiệt đới 4 (TR4)

(VCG 01213-01216) ( Fourie và ctv, 2011 ) Ching Foc SR4 chỉ gây nhiễm chuối

Cavendish ở vùng cận nhiệt đới, Foc TR4 ảnh hưởng đến Cavendish ở vùng nhiệt đới

và cận nhiệt đới.

2.5.Tạo dòng VCG

2.5.1 Nghiên cứu tạo dòng VCG ngoài nước

Khả năng tương thích sinh dưỡng có nghĩa là hai sợi nam có thé nối liền và hợpnhất dé tạo thành một hợp thé di nhân 6n định Những chủng có thé hình thành hợp thé

di nhân ồn định được cho là nằm trong cùng một nhóm tương thích sinh dưỡng (VCG),

§

trong khi những chủng không thé hình thành hợp thé dị nhân như vậy thì không tương

thích sinh dưỡng và nằm trong các VCG khác nhau Việc phân loại các chủng dựa trên

VCG đã được thực hiện ở Aspergillus rlidularls (Croft và Jinks, 1977) và F oxysporum

f sp apii (Puhalla, 1984) Các nghiên cứu này đều dựa vào sự bồ sung giữa các đột biếnmau cảm ứng dé chứng minh sự hình thành hợp thé dị nhân Năm 1985, Puhalla đã thực

hiện một nghiên cứu dựa trên khả năng tương thích sinh dưỡng hoặc khả năng hình

thành hợp thé di nhân dé phân loại 21 chủng F oxysporum thành 16 VCG Sự hình thànhhợp thé di nhân đã được chứng minh bang cách ghép đôi các đột biến không có kha năng

sử dung nitrat (đột biến nit), những đột biến nit này có thé được phục hồi mà không cần

xử lý đột biến từ môi trường chon lọc có chứa KCIO: Ưu điểm của các đột biến nit sovới các đột biến màu là có thé được phục hồi dé dàng mà không cần xử lý đột biến

Phương pháp chủng bệnh truyền thống thường tốn thời gian và mang tính chủ quan thì

các đột biến nit có thé được thực hiện dé dang trong phòng thí nghiệm và mang tính

chính xác cao (Puhalla, 1985).

Năm 1986, Correll và cộng sự đã thực hiện nghiên cứu để xác định Fusariumoxysporum f sp apii dựa trên kích thước khuẩn lạc, độc lực và kha năng tương thíchsinh dưỡng Fusarium oxysporum đã được phân lập từ rễ cây cần tây có triệu chứngbệnh héo vàng và từ rễ cây không có triệu chứng dé kiểm tra khả năng tương thích sinh

dưỡng giữa các đột biến nit Các mẫu nam được nuôi cấy trên môi trường khoai tây

sucrose chứa 1,5 % Kali Clorat (môi trường KPS) dé tạo đột bién Clorat sau đó chuyêncác đột biến Clorat sang môi trường MM chứa NaNO; làm nguồn nitơ duy nhất dé thuhồi đột biến nit Thí nghiệm đã đưa ra các kết luận có thé xác định chính xác 197 trong

số 199 mau Fusarium oxysporum phân lập được dựa trên việc sử dụng khả năng tươngthích sinh dưỡng và kích thước khuẩn lạc mà không cần đến các xét nghiệm khả năng

gây bệnh tốn thời gian Năm 1987, Correll và ctv đã thực hiện nghiên cứu về các đột

biến không sử dung nitrat của Fusarium oxysporum và việc sử dụng chúng trong các thửnghiệm tương thích sinh dưỡng, hơn 1300 đột biến không sử dụng nitrat (nit) đã đượcphục hồi từ bảy chủng nam Fusarium oxysporum nuôi cay trên hai môi trường thạchkhoai tây và môi trường tối thiếu, bổ sung 1,5% Kali clorate Correll và cộng sự đã chorằng khả năng tương thích sinh dưỡng là một công cụ hữu ich dé xác định tính đa dang

giữa các chủng Fusarium oxysporum.

Năm 1988, ba mươi hai chủng Verticillium albo-atrum được phan lập từ các vật

chủ khác nhau ở nhiều vùng địa lý đã được thực hiện xét nghiệm khả năng gây bệnh vàkhả năng tương thích sinh dưỡng, nghiên cứu đã chỉ ra rằng đột biến nit thể hiện sự pháttriển thưa thớt trên môi trường nitrat, nhưng khi sợi nắm của các thể đột biến tương thích

gặp nhau, chúng hợp nhất và hình thành sợi nắm hợp thé dị nhân khác biệt và phát triển

nhanh chóng, do các đột biến của con đường đồng hóa nitơ được bổ sung (Correll va

ctv, 1988) Năm 1988, Katan và Kantan đã thử nghiệm khả năng tương thích sinh dưỡng

của 12 mẫu nam Fusarium oxysporum ƒsp vasinfectum chủng 3 được thu thập từ năm

địa điểm ở hai vùng Israel dé phân nhóm Fusarium oxysporum ƒsp vasinfectum từ mô

và vùng rễ của cây.

Năm 1991, Joaquim và Rowe đã thực hiện một nghiên cứu trên 187 chủng namVerticillium dahliae hoang đã được phân lập từ cây khoai tây va đất của 22 cánh đồngkhoai tây ở Ohio Các chủng đã được xếp vào các nhóm tương thích sinh dưỡng dựatrên các đột biến bé sung không sử dụng nittrat được tạo ra trên môi trường chứa Clorat

Joaquim và Rowe đã chỉ ra rằng các dòng phân lập tương thích sinh dưỡng với nhau

được cho là thành viên của cùng một nhóm tương thích sinh dưỡng Năm 1993, Leslie

đã chỉ ra rằng khả năng tương thích sinh dưỡng dé cập đến khả năng sợi nam của haichủng nam riêng lẻ hợp nhất với nhau và hình thành các hợp thé dị nhân ồn định Sự bồ

sung g1ữa các thể đột biến nit khác nhau được biểu thị bằng sự phát triển của sợi nắm

dày đặc trong vùng tiếp xúc giữa hai khuẩn lạc đột biến (hợp thể đị nhân) sao cho haichủng phân lập thuộc cùng một nhóm tương thích sinh dưỡng Ở nam thiếu giai đoạnhữu tinh, khả năng tương thích sinh dưỡng có thé đóng vai trò là phương tiện quan trong

dé trao đôi gen và tạo ra sự đa dang di truyền mới (Leslie, 1993).

Sử dụng phương pháp được phát triển bởi Puhalla (1985) và được cải tiến bởiCorrell và ctv (1987), các đột biến trao đổi chất có thể được tạo ra cho mỗi chủng phân

lập và bắt cặp trên môi trường dinh dưỡng cụ thé Sự hình thành hợp thể dị nhân sau đó

có thé dé dàng được ghi nhận bang dòng tăng trưởng hợp thé dị nhân dày đặc, đủ chatdinh dưỡng, phát triển ở nơi tiếp xúc của hai khối cấy Trong một số mầm bệnh nam

thực vật, các dòng phân lập thuộc một VCG đã được chứng minh là có sự tương đồng

di truyền cao hơn đáng kế so với các dòng VCG khác nhau (Chang va ctv, 2014)

10

2.5.2 Nghiên cứu tạo dòng VCG trong nước

Năm 1997, Mai Văn Trị va ctv đã phân tích 08 mẫu bệnh trên chuối Xiêm (chuối

Tây) từ 6 huyện của 4 tỉnh miền Nam Việt Nam sử dụng phương pháp phân tích tươngthích sinh đưỡng chỉ ra nam Fusarium oxysporum gây bệnh thuộc chủng 1 Đỗ Năng

Vịnh và ctv (2001) đã phân tích 42 mẫu chuối thu thập từ 11 huyện ở 7 tỉnh (Hà Nội,

Hà Tây, Hưng Yên, Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Bắc Ninh và Thừa Thiên Huế) bằng phươngpháp tương thích sinh dưỡng cũng kết luận nam Fusarium oxysporum gây bệnh héo

vàng ở nước ta cũng thuộc chung 1 Việc tao dòng nhóm tương thích sinh dưỡng sé giúp

loại bỏ các chủng dại khi nuôi cấy trên môi trường chứa Clorat dựa vào sự nhạy cảmcủa chúng khi nuôi cấy trên môi trường này Khi có một mẫu nam Fusarium oxysporum

đã được xác định chính xác khả năng gây bệnh, việc tạo dòng VCG giúp xác định một

cách nhanh chóng và chính xác khả năng gây bệnh của các mẫu nam Fusarium

oxysporum phan lập được ma không cần phải thực hiện các xét nghiệm độc lực học và

tái phân lập tốn thời gian

ll

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài thực hiện từ tháng 8/2023 cho đến hết thang 11/2023 tại phòng Chan Đoán

Bệnh Cây, Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nông

Hóa chat phân lập: Môi trường Water agar (WA), Potato glucose agar (PGA).Hóa chất định danh: Môi trường Potato glucose agar (PGA), Spezieller

Nahrstoffarmer Agar (SNA), Oat meat agar (OMA), Carnation Leaf-Piece Agar (CLA).

Hóa chat phục hồi đột biến nit: Môi trường MM, môi trường KMM, môi trường

KPS, Ethanol 70”, Ethanol 96”.

Hóa chat phân loại đột biến nit! MM, HM, NM

Hoa chất ghép nồi đột biến nit: môi trường MM, BM, PGA

3.2.3 Thiết bị và dụng cụ

Một số thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu: Tủ cấy vô trùng, nồi hấp, lò visóng, tủ sấy, tủ mát, tủ ủ, bếp điện, cân điện tử, kính hiển vi

Dụng cụ: ống nghiệm, đĩa petri, que cấy, dao cấy

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Chuẩn bị môi trường

Môi trường WA: Chuẩn bị 20 g agar thêm vào | L nước cất Môi trường PGA:chuẩn bị 200 g khoai tây đã gọt vỏ, rửa sạch, sau đó cắt nhỏ cho vao nôi nấu với 1 Lnước cất khoảng 30 — 45 phút rồi lọc lấy nước, bé sung 20 g agar và 20 g glucose vàodịch chiết khoai tây Môi trường SNA (1 L nước cất: KH›POa, 1g; KNO3, 1g;

MgSOa.7H2O, 0,5 g; KCl, 0,5 g; D-glucose, 0,2 g; D-sucrose, 0,2 g; agar, 20 g Môi

trường OMA (1 L nước cat): bột yến mach, 50 g; agar, 20 g Môi trường CLA: lá cam

chướng vô trùng; agar, 20 g hòa tan trong 1 L nước cat và hấp khử trùng

12

Môi trường BM (1 L nước cất): KH¿:PO¿, 1 g; MgSO4.7H20, 0,5 g; KCI, 0,5 g;

dung dich nguyên tố vi lượng vô trùng, 0,2 mL; Agar, 20 g Dung dịch nguyên tố vilượng chứa các thành phan sau ( 95 mL nước cat): axit xitric, 5 g; ZnSOx.7H:O, 5 g;

FeSOu,.7H›O, 4,75 g; Fe(NH4)2(SO4)2.6H20, 1 g; CuSO4.5H20, 250 mg; MnSOq4.H20,

50 mg; H3BO3, 50 mg; NaaMoOa.2H2O, 50mg

Môi trường MM: Môi trường này được tao ra bằng cách thêm 2 g/L NaNO; và 30g/L sucrose vào môi trường cơ bản trước khi hap tiệt trùng Môi trường HM: môi trường

MM được thay đổi NaNO bằng 0,2 g/L hypoxanthin Môi trường NM: môi trường MM

được thay đổi NaNO; bằng 0,5 g/L NaNO

Môi trường KPS: chuẩn bị 200 g khoai tây đã gọt vỏ, sau đó cắt nhỏ cho vào nồi

va nấu với 1 L nước cất khoảng 30 — 45 phút Phan chất long sau đó được lọc qua hailớp vải thưa và bổ sung 20 g sucrose, 15 g KCIO3 và 20 g agar Tất cả môi trường đượchấp tiệt trùng ở 121°C, 1,2 atm trong 20 phút

3.3.2 Phân lập và mô tả các mẫu Fusarium gây bệnh vàng lá

3.3.2.1 Phân lập Fusarium từ các mẫu chuối bệnh vàng lá

Thu thập các mẫu chuối bệnh vàng lá ở Đồng Nai, Bình Dương, Tây Ninh và Long

An, ghi địa chỉ, ngày lấy mẫu, mẫu được cho vào các túi zip đã khử trùng đặt trongthùng xốp và di chuyền về phòng thí nghiệm

Phân lập các mẫu nắm bằng môi trường WA: rửa sạch mẫu dưới vòi nước, sau đócắt phần mô tiếp giáp giữa mô bệnh và mô khỏe, khử trùng bằng cồn 70” trong 30 giây.Rửa lai bang nước cat hap vô trùng 3 lần và phơi khô trong tủ cay vô trùng 15 — 20 phút.Cay vào đĩa môi trường thạch WA và ủ ở 25°C trong 2 - 3 ngày Các mẫu sau khi ủ đượccấy chuyền sang môi trường PGA đề làm thuần

3.3.2.2 Mô tả các mẫu Fusarium phân lập từ chuối bệnh vàng lá

Đối với đặc điểm về hình thái đại thể sau khi phân lập và làm thuần được tiến hànhquan sát và mô tả các đặc điểm gồm tốc độ phát triển, hình dáng, cách mọc, mau sắcmặt trên và mặt dưới tản nam Dé quan sát hình thái vi thé, một lam kính vô trùng đượcđặt lên trên tờ giấy đã được làm âm bằng nước vô trùng Môi trường PGA được cho vào

trong đĩa petri có đường kính 10 em Khi môi trường PGA đông cứng, cắt thành nhiều

mảnh có kích thước 1 cm? Đặt một mảnh môi trường này lên trên lam kính vô trùng.

Dùng que cấy lây một ít nắm đặt cạnh ria của mảnh agar Đặt lamen lên trên mảnh agar,

sau 3 — 4 ngày tiến hành quan sát các đặc điểm hình thái sợi nắm, dai bảo tử, tiêu bao tử

13

va đo kích thước, ghi lại hình ảnh Quan sát các đặc điểm hình thái đại thể và vi thé, ghinhận tốc độ phát triển (mm) trên các môi trường PGA, SNA, OMA và CLA của các mẫunam sau 6 ngày nuôi cấy ở 25 °C, xác định các đặc điểm đặc trưng của Fusarium

oxysporum khi nuôi cấy trên các môi trường này

3.3.3 Tạo dong VCG cho Fusarium đã phan lập được

Các mẫu nam sau khi phân loại theo chủng dựa trên hình thái đại thé, hình thái vithé và các đặc điểm đặc trưng khi nuôi cấy trên các môi trường PGA, SNA, OMA vàCLA được phục hồi các đột biến nit phương pháp được phát triển bởi Puhalla năm 1985

sau đó thực hiện theo phương pháp cải tiến của Correll năm 1987, tiễn hành phân loại

các đột biến nit trên các môi trường có chứa nguồn nitơ khác nhau và ghép nối các độtbiến nit Mỗi chủng là một nghiệm thức, mỗi nghiệm thức gồm 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp

lại là 1 đĩa petri nuôi cấy trên môi trường MM Mẫu đối chứng nuôi cấy trên môi trường

BM, PGA gồm 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại là 1 dia petri

3.3.3.1 Phục hồi đột biến nit (phục hồi các thể đột biến không sử dụng NO:)

Mỗi chủng Fusarium oxysporum lần lượt được nuôi cây trên môi trường MM, BM

ủ ở 25°C và theo dõi trong 3 - 4 ngày Cắt bốn khối sợi nấm nhỏ đặt cách đều nhau trên

dia môi trường chứa clorat (môi trường KPS), ủ ở 25°C trong 15 ngày Chọn các đột

biến Clorat chuyền sang môi trường MM, BM sau đó ủ ở 25°C trong 3 - 4 ngày sau đóchọn các đột biến nit dựa vào màu sắc, cách mọc và tốc độ phát triển (mm) của hệ sợinam Phân loại các chủng nam đột biến nit trên môi trường MM, HM, NM dựa trên cáchmọc của hệ sợi nam

3.3.3.2 Ghép nối các đột biến nit với nhau

Các dòng đột biến được bắt cặp với nhau gồm 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại gồm 1đĩa petri Các loại đột biến nit khác nhau được chọn từ mỗi chủng phân lập được ghépnối với nhau Xác định kha năng tương thích sinh duéng dựa trên đặc điểm hệ sợi namchỗ tiếp xúc giữa đột biến nit] và đột biến nitM

Mẫu đối chứng trên môi trường BM sau khi tạo đột biến Clorat được bắt cặp trênmôi trường BM Mau trên môi trường PGA được bắt cặp trực tiếp, không phục hồi độtbiến nit

Ghi nhận đặc điểm của hệ sợi nắm và khả năng tương thích sinh dưỡng Xử lý sốliệu bằng phần mềm excel và phân tích ANOVA 1 yếu tố bằng phần mềm Minitab 16

14

CHƯƠNG 4 KET QUA VÀ THẢO LUẬN

4.1 Kết quả thu thập mẫu chuối

Tổng cộng 20 mẫu củ và rễ chuối tiêu đã thu thập tại các vườn chuối ở các tỉnh

Long An, Đồng Nai, Bình Dương và Tây Ninh Trong đó ở Đồng Nai có 2 mẫu củ chuối

được lấy khi cây đang trong giai đoạn có buồng, 2 mẫu củ chuối và 2 mẫu rễ chuối đượclây khi cây chưa có buồng, cả 4 cây có triệu chứng toàn bộ lá bị héo vàng Bình Dương

có 2 mẫu củ chuối được lay khi cây chưa có buông Tây Ninh có 4 mẫu củ chuối đượclây khi cây chưa có buồng Long An có 4 mẫu củ chuối và 4 mẫu rễ chuối được lấy khicây chưa có buồng

Bảng 4.1 Danh sách địa điểm và số lượng mẫu củ, rễ chuối đã thu thập

Địa điểm lay Giai đoạn Triệu , Kí hiệu

STT + ; Ky chu Sô lượng +

mau sinh trưởng chứng mâu

2 Đồng Nai Có buồng cây héo Củ chuối 2 DNB

vang

: ĐỀ TS” Chưa có Lá héo RE chuối 5 _—

ong Nai budng tông ê chuôi

4.2 Kết qua phân lập nam từ các mẫu chuối

Bang 4.2 Danh sách các mẫu nam được phân lập

STT Địa điểm lây mẫu Ký chủ Kí hiệu mẫu nam

1 Đồng Nai Củ chuối DNCI

2 Đồng Nai Củ chuối DNBI

3 Đồng Nai Rễ chuối DNRI

4 Đồng Nai Rễ chuối DNR2

5 Bình Dương Củ chuối BDCI

6 Tây Ninh Củ chuối TNCI

Trên môi trường PGA, các mẫu nam có hình tròn, tản nắm mọc nhô cao, màu sắc

tản nắm có màu trắng, cam nhạt và tím nhạt Hình thái sợi nắm dưới kính hiển vi có

dạng thang, mỏng và có vách ngăn Dai bao tử có dang thang đến hơi cong, có 3 đến 5vách ngăn (thường có 3 vách ngăn), vách ngăn mỏng, xuất hiện nhiều ở túi bảo tử và

trên sợi nắm Tiểu bào tử có hình bầu dục hoặc hình oval, không có hoặc có một vách

ngăn, xuất hiện nhiều trên sợi nắm Bảo tử hậu hình thành ở dạng đơn lẻ, theo cặp và có

cả chuỗi ngắn, có vách ngăn dày, xuất hiện ở đầu sợi nam hoặc mọc xen kẽ trong sợi

nắm, xuất hiện nhiều sau 3 - 4 tuần nuôi cấy.

4.3.Kết quả định danh hình thái

Dựa vào các đặc điểm hình dạng, màu sắc, cách phát triển tản nấm trên môi trườngPGA ở nhiệt độ 25°C trong thời gian từ 7 - 21 ngày, các đặc điểm về sợi nam, đại bao

tử, tiểu bào tử và bao tử chống chịu được quan sát và mô tả

16

4.3.1 Đặc điểm hình thái mẫu DNC1

Hình 4.1 Đặc điểm hình thái mẫu DNCI a - b: mặt trên và

mặt dưới tản nam sau 7 ngày cay trên môi trường PGA, c: sợi nấm, d: bào tử hậu, e: đại bào tử và tiêu bào tu Scale bar = 25 yum.

Mẫu nam DNCI với tan nắm tròn, sợi nắm mọc nhô cao, mặt trên và mặt dưới có

phần ria màu trắng, gần tâm có màu tím nhạt, đạt đường kính 90 mm sau 8 ngày Đại

bao tử có dạng thắng đến hơi cong, có 3 - 5 vách ngăn (thường có 3 vách ngăn), có váchngăn mỏng, xuất hiện nhiều ở túi bao tử, kích thước 22,4 - 39,7 x 2,9 - 4,0 um (trung

bình 28,0 + 4,2 x 3,5 + 0,3 um, n = 30) Tiểu bao tử hình bầu dục hoặc hình oval, không

có hoặc có một vách ngăn, mọc nhiều trên sợi nam, kích thước 5,0 - 8,9 x 2,3 - 3,4 um(trung bình 6,5 + 1,0 x 2,8 + 0,3 um, n = 30) Bào tử hau có hình tron hoặc hình oval,hình thành dạng don lẻ, theo cặp hoặc hoặc có thể được tìm thấy trong cụm, chuỗi ngắn,

xuất hiện ở đầu sợi nắm hoặc mọc xen kẽ trong sợi nắm, hình thành nhiều và nhanhchóng trên môi trường CLA (2 - 4 tuần), kích thước 5,2 - 12,0 x 5,0 - 11,9 um (trung

bình 8,9 + 1,7 x 8,1 + 1,8 um, n = 30) Các đặc điểm hình thái của mẫu DNCI phù hợp

với đặc điểm hình thái của Fusarium oxysporum (Snyder & Hansen, 1940)

17

4.3.2 Đặc điểm hình thái mẫu DNB1

Hình 4.2 Đặc điểm hình thái mẫu DNBI a - b: mặt rên và

mặt dưới tản nam sau 7 ngày cay trên môi trường PGA, c: sợi nám, d: bào tử hậu, e: đại bào tử và tiêu bào tu Scale bar = 25 um.

Mẫu nam DNBI với tản nam tròn, soi nam mọc nhô cao, mặt trên và mặt dưới có

mau trang, đạt đường kính 90 mm sau 7 ngày Đại bào tử hình lưỡi liềm, có 3 - 5 vách

ngăn (thường có 3 vách ngăn), vách ngăn mỏng, xuất hiện nhiều ở túi bào tử, kích thước

24,1 - 35,2 x 2,9 - 6,0 um (trung bình 29,2 + 2,8 x 4,5 + 0,7 um, n = 30) Tiểu bao tử cóhình bầu dục hoặc hình oval, không có hoặc có một vách ngăn, kích thước đồng đều,mọc nhiều trên sợi nam, kích thước 4.4 - 9,0 x 2,0 - 2,5 um (trung bình 6,7 + 1,2 x 3,0

+0,4 um, n = 30) Bao tử hậu có hình tròn hoặc hình oval, có vách dày, hình thành dạng

đơn lẻ, theo cặp, hoặc có thê được tìm thấy trong cụm, chuỗi ngắn, xuất hiện ở đầu sợinam hoặc mọc xen kẽ trong SỢI nam, hinh thanh nhiéu va nhanh chóng trên môi trường

CLA(2-4 tuần), kích thước 4,2 - 11,3 x 4,2 - 9,4 um (trung bình 6,9 + 1,6 x 6,5 + 1,3

um, n = 30) Các đặc điểm hình thái của mẫu DNBI phù hợp với đặc điểm hình thái của

Fusarium oxysporum (Snyder & Hansen, 1940).

18

4.3.3 Đặc điểm hình thái mẫu DNR1

Mẫu nam DNRI với tản nam tròn, sợi nam mọc nhô cao, mặt trên và mặt dưới cómàu trang, gan tâm có màu cam nhạt, đạt đường kính 90 mm sau 8 ngày Dai bao tử có

dạng từ thắng đến hơi cong, có 3 - 5 vách ngăn (thường có 3 vách ngăn), vách ngăn

mỏng, xuất hiện nhiều ở túi bào tử, kích thước 19,7 - 41,1 x 3,3 - 6,0 um (trung bình32,4 + 3,9 x 4,6 + 0,7 um, n = 30) Tiểu bào tử hình bau dục hoặc hình oval, không có

hoặc có một vách ngăn, mọc nhiều trên sợi nam, kích thước 4,3 - 10,0 x 2,3 - 3,5 um(trung bình 6,3 + 1,3 x 2,9 + 0,3 um, n = 30) Bào tử hau có hình tròn hoặc hình oval,hình thành dạng đơn lẻ, cũng có thé được tìm thấy trong cụm hoặc chuỗi ngắn, xuất hiện

ở đầu sợi nắm hoặc mọc xen kẽ trong sợi nắm, kích thước 5,0 - 10,4 x 4,2 - 10,2 um

(trung bình 8,1 + 1,2 x 7,3 + 1,5 um, n = 30) Cac đặc điểm hình thái của mau DNR1

phù hợp với đặc điểm hình thái của Fusarium oxysporum (Snyder & Hansen, 1940)

19

4.3.4 Đặc điểm hình thái mẫu DNR2

Hình 4.4 Đặc điểm hình thái mẫu DNR2 a - b: mặt trên và

mặt dưới tản nam sau 7 ngày cay trên môi trường PGA, c: sợi nám, đ: bào tử hậu, e: đại bào tử và tiêu bào tử Scale bar = 25 ym.

Mẫu nam DNR2 với tản nam tròn, sợi nam mọc nhô cao, mặt trên và mặt dưới có

mau trắng, đạt đường kính 90 mm sau 8 ngày Dai bao tử có dạng thang đến hơi cong,

có 3 - 5 vách ngăn (thường có 3 vách ngăn), vách ngăn mỏng, xuất hiện nhiều ở túi bào

tử, kích thước 33,0 - 43,7 x 3,0 - 4,6 um (trung bình 38,3 + 3,2 x 3,9 + 0,5 um, n = 30).

Tiểu bào tử có hình bầu dục hoặc hình oval, không có hoặc có một vách ngăn kích thướcđồng đều, mọc nhiều trên sợi nam, kích thước 5,2 - 10,0 x 2,1 - 3,5 um (trung bình 7,4+ 1,0 x 3,0 + 0,3 um, n = 30) Bào tử hậu có hình tròn hoặc hình oval, có vách dày, hình

thành dạng đơn lẻ, theo cặp hoặc có thể được tìm thấy trong cụm, chuỗi ngắn, xuất hiện

ở đầu sợi nắm hoặc mọc xen kẽ trong sợi nắm, hình thành nhiều và nhanh trên môi

trường CLA (2 - 4 tuần), kích thước 6,6 - 11,1 x 5,5 - 11,1 um (trung bình 8,2 + 1,1 x

7,4 + 1,2 um, n = 30) Các đặc điểm hình thái của mẫu DNR2 phù hợp với đặc điểm

hình thái của Fusarium oxysporum (Snyder & Hansen, 1940).

20

4.3.5.Đặc điểm hình thái mẫu TNC1

Hình 4.5 Đặc điểm hình thái mẫu TNCI a - b: mặt trén và mặt

dưới tản nam sau 7 ngày cay trên môi trường PGA, c: sợi nam, đ: bào tử hậu, e: đại bào tử và tiêu bào tử Scale bar = 25 um.

Mẫu nam TNCI với tan nam tròn, sợi nắm mọc nhô cao, mặt trên và mặt đưới có

màu trang, đạt đường kính 90 mm sau 8 ngày Đại bào tử có dang từ thang đến hơi cong,

có 3 - 5 vách ngăn (thường có 3 vách ngăn), vách ngăn mỏng, xuất hiện nhiều ở túi bào

tử, kích thước 31,7 - 41,8 x 3,6 - 4,6 um (trung bình 35,4 + 2,6 x 4,1 + 0,3 um, n = 30).

Tiểu bào tử hình bầu dục hoặc hình oval, không có hoặc có một vách ngăn, kích thướcđồng đều, mọc nhiều trên sợi nam, kích thước 6,2 - 8,5 x 2,8 - 3,5 wm (trung bình 7,2 +0,6 x 3,3 + 0,2 um, n = 30) Bào tử hậu có hình trong hoặc hình oval, có vách dày, hìnhthành dạng đơn lẻ, theo cặp hoặc có thể được tìm thấy trong cụm, chuỗi ngắn, xuất hiện

ở đầu sợi nắm hoặc mọc xen kẽ trong soi nam, hình thành nhiều và nhanh trên môi

trường CLA (2 - 4 tuần), kích thước 4,2 - 14,9 x 3,9 - 11,5 pm (trung bình 8,8 + 2,3 x

8,0 + 1,8 um, n = 30) Các đặc điểm hình thái của mẫu TNCI phù hợp với đặc điểm

hình thái của Fusarium oxysporum (Snyder & Hansen, 1940).

21