Hình 1.2 Tôm bị bệnh EHP1.2 Bệnh EHP 1.2.1 Khái niệm EHP là bệnh do ký sinh trùng Enterocytozoon hepatopenaei viết tắt là EHP gây ra cho tôm, còn được gọi là bệnh vi bào tử trùng, sống t
TỔNG QUAN
B ỆNH WSSV
Virus hội chứng đốm trắng (WSSV) gây tử vong hàng loạt trên tôm sú (P monodon) và tôm thẻ chân trắng (P vannamei), với tỷ lệ tử vong 80-100% chỉ trong vài ngày Triệu chứng điển hình là các đốm trắng trên vỏ tôm Phát hiện sớm WSSV rất quan trọng để quản lý dịch bệnh và giảm thiệt hại kinh tế.
Bệnh đốm trắng ở tôm (WSSV) gây triệu chứng hoạt động kém, ăn đột ngột rồi bỏ ăn, bơi lờ đờ và nổi đầu Tôm nhiễm bệnh xuất hiện nhiều đốm trắng ở giáp đầu ngực, đốt bụng 5-6 và lan rộng khắp thân, đôi khi kèm theo thân đỏ Sau 3-10 ngày, tôm chết hàng loạt với tỷ lệ cao.
Hình 1.2 Tôm bị bệnh EHP
B ỆNH EHP
Bệnh EHP do ký sinh trùng *Enterocytozoon hepatopenaei* (EHP) gây ra, tấn công tuyến gan tụy tôm, dẫn đến chậm lớn, vỏ mềm, và tôm chuyển màu trắng sữa hoặc đục.
Tỷ lệ tử vong không cao tôm vẫn ăn bình thường nhưng không phát triển Điều này làm giảm giá trị của tôm và tăng chi phí đầu tư.
Tôm nhiễm EHP có biểu hiện da mỏng, thịt trắng nhạt như tôm bị sốc, mắt đen và ruột, cơ thể chuyển màu đen.
EHP gây tổn thương ống dẫn trong tuyến gan tụy tôm, khiến tế bào bong tróc, suy giảm khả năng tiêu hóa thức ăn, dẫn đến tôm kém ăn và chậm lớn.
B ỆNH EMS
Tôm nuôi dễ nhiễm bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND/EMS) do vi khuẩn *Vibrio parahaemolyticus*, gây tổn thương gan tụy và gây chết sớm.
Hình 1.3 Tôm bị bệnh EMS
Bệnh hoại tử gan tụy (AHP) ở tôm thường bùng phát vào mùa mưa, đặc biệt khi thời tiết thay đổi đột ngột Mưa lớn, kết hợp với mật độ nuôi thâm canh cao và dư thừa thức ăn gây tích tụ phospho, làm gia tăng nguy cơ AHP trên tôm thẻ chân trắng.
- Tôm bệnh bơi lờ đờ, bỏ ăn, tấp mé bờ, tôm đã phát bệnh rớt đáy rất nhanh.
- Gan tụy tôm mềm nhũn, teo lại hoặc sưng to, màu nhạt.
- Có trường hợp gan tôm chai sạn, màu sẫm, không còn các giọt dầu.
- Tôm bị mềm vỏ, ruột ít hoặc trong ruột tôm không có thức ăn.
V I KHUẨN V IBRIO PARAHEMOLYTICUS
Vibrio Parahaemolyticus*, vi khuẩn Gram âm hình que, kích thước 0.3-0.5 x 1.4-2.6 μm, là tác nhân chính gây bệnh hoại tử gan tụy cấp (EMS) trên tôm.
Vi khuẩn Vibrio Parahaemolyticus tấn công tôm theo hai giai đoạn
Hình 1.4 Cơ chế gây bệnh
- Giai đoạn đầu Vibrio parahaemolyticus nhiễm phage tiết ra độc tố làm tôm yếu, mất sức đề kháng.
Đợt tấn công thứ hai của vi khuẩn gây ra độc tố, làm suy giảm chức năng gan tụy, dẫn đến hoại tử mô và chết hàng loạt tôm.
Vi khuẩn Vibrio Parahaemolyticus gây bệnh đường ruột, tiết độc tố làm gan cá sưng hoặc teo, dẫn đến tỷ lệ chết cao (90-100%) trong ao nuôi.
Tôm kém phát triển về kích thước và thường chết đáy.
Sức ăn của tôm giảm, bơi lờ đờ, tấp mé, quay đảo sau đó là chết rải rác.
Biểu hiện của gan thường thấy như sưng to, mềm nhũn, đổi màu Có số trường hợp gan bị teo nhỏ và dai.
Tôm có khi bị phân trắng kéo dài.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
V ẬT LIỆU
5.Buồng chụp điện di 12 Mẫu thịt chân tôm
P HƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
- Kit điện di gel agarose
Lưu ý Tùy vào loại vi khuẩn , virus bộ kit sẽ khác ở bộ kit PCR.
2.2.1 Bộ kit TopPURE HIGHPURE VIRAL EXTRACTION KIT
Hình 2.1 Bộ kit tinh sạch genome a Thành phần
- Solution 1 (Alkaline I ) Glucose , Tris-HCL, EDTA.
Mục đích Làm yếu thành tế bào.
- Solution 2 (Alkaline II ) NaOH và SDS.
Mục đích Hủy thành tế bào.
- Solution 3 ( Wash Solution ) Phải bổ sung Ethanol vào trong lần đầu sử dụng và label.
Mục đích Thu DNA mm, giảm ái lực giữa silica và DNA b Cách sử dụng
Bước 1 Thu và bảo quản mẫu
- Đối với tôm thuơng phẩm lấy mang, chân bơi, gan tụy, bao tử, đường ruột (lượng mẫu không quá 0.5 g).
- Đối với tôm bố mẹ lấy mẫu phân hoặc một phần gốc chân bơi (lương mẫu không quá 0.5 g).
Để đảm bảo chất lượng mẫu, cần lấy mẫu tôm khi còn sống và bảo quản ngay trong cồn 95% (tỉ lệ cồn gấp 3 lần thể tích mẫu) nếu chưa tách chiết Mẫu được lưu giữ ở 4-25°C trong 1 tuần, cần thay cồn định kỳ nếu bảo quản lâu hơn.
Bước 2 Tách chiết DNA/RNA
- Đối với mẫu tôm ngâm trong cồn Lấy mẫu tôm ra khỏi cồn và làm khô trên giấy thâm.
- Lấy một lượng mẫu không quá 0.5g cho vào tube 1.5 mL Thêm vào 250 μL Solution
1 Nghiền mẫu bằng chày nghiền mẫu.
- Cho thêm 250 μL Solution 2 vào, tiếp tục nghiền đến khi mẫu đồng nhất hoàn toàn.
Thêm 500 μL Solution 3 (có ethanol) vào mẫu, vortex kỹ Ly tâm 13.000 rpm, 4°C, 1 phút Chuyển 500 μL dịch nổi sang cột silica, ly tâm lại ở cùng điều kiện Loại bỏ dịch lỏng thừa, giữ lại cột.
Đặt lại cột vào tube 2 mL cũ Rửa với 500 μL dung dịch 3, ly tâm 13.000 rpm ở 4°C trong 1 phút, loại bỏ phần chất lỏng Đối với mẫu gan, tủy xương hoặc phân, lặp lại bước rửa này thêm một lần.
Hình 2.2 Hướng dẫn sử dụng bộ kit tinh sạch genome
Chuyển mẫu sang tube 1.5 mL Thêm 50 μL Solution 4, ủ 2 phút ở nhiệt độ phòng, ly tâm 13.000 rpm, 4°C, 1 phút để thu DNA/RNA.
- DNA/RNA thu được có thể được sử dụng ngay hoặc lưu trữ ở -20°C.
2.2.2 Bộ kit TopSPEC WEEV PCR KIT a Thành phần
+ WEEV PCR mix WSSV / EMS / EHP / Vibrio parahemolyticus Gồm
- dNTP - Fp và Rp đặc hiệu cho
- Taq polymerase - Fp và Rp đặc hiệu cho
- PCR buffer - Fp và Rp đặc hiệu cho
- Fp và Rp đặc hiệu cho EHP
+ Chứng âm b Cách sử dụng Qui trình thực hiện.
Bước 1 Tách chiết DNA/RNA
Bộ kit tách chiết virus TopPURE® Highpure (EXS-021) được khuyên dùng để tách chiết DNA/RNA virus từ mẫu tôm, kết hợp hiệu quả với bộ TopSPEC® WEEV PCR KIT Thực hiện theo hướng dẫn sử dụng để lấy, bảo quản mẫu và tách chiết DNA/RNA.
Bước 2 Thực hiện phản ứng PCR
- Lấy số lượng mẫu cần thiết ống WEEV PCR mix Rã đông ống ở nhiệt độ phòng (15-25 0 C ), sau đó spindown để tòan bộ chất lỏng di chuyển xuống đáy.
- Hút 5 μL DNA mẫu, chứng âm tách chiết, chứng dương cho vào các tube
WEEV PCR mix đã chuẩn bị ở trên.
+ Mỗi lần chạy nên có ít nhất 1 chứng âm tách chiết, 1 chứng dương và 1 chứng âm PCR.
+ Chuẩn bị phản ứng theo thứ tự sau Chứng âm, chứng âm tách chiết, mẫu và chứng dương
+ Đóng nắp PCR và spindown để chất lỏng di chuyển xuống đáy trước khi đặt vào máy.
- Cài đặt chương trình nhiệt cho PCR
Hình 2.4 Hướng dẫn sử dụng bộ kit PCR
Hình 2.5 Bộ kit điện di
Thành phần TAE 50X và bột agarose.
P HÂN TÍCH KẾT QUẢ
- Đối chứng dương ( Positive control ) Thí nghiệm bắt buộc thành công ( Sử dụng thuốc kháng sinh đã được chứng nhận ).
- Đối chứng âm ( Negative control ) Thí nghiệm bắt buộc thất bại ( Thay mẫu bằng dung môi ).
- Chứng âm tách chiết ( Mẫu đối chứng ) Làm song song với mẫu tôm , không được chứa mẫu cần xác định.
- Đối chứng nội ( Internal control ) dùng để kiểm soát thí nghiệm , gồm
PCR mix bổ sung cặp mồi đặc hiệu cho genome tôm, khuếch đại gen tôm (102 bp) để xác nhận chất lượng mẫu.
+ Đưa từ ngoài vào Fp và Rp khuếch đại một DNA bất kỳ đưa vào mix
- Khi đó Mix PCR gồm
+ Fp & Rp khuếch đại 1 DNA bất kỳ
+ Fp & Rp đặc hiệu cho EHP
+ Fp & Rp đặc hiệu cho MSSV
+ Fp & Rp đặc hiệu cho EMS
+ Fp & Rp đặc hiệu cho Vibrio parahemolyticus
+ Fp & Rp đặc hiệu cho tôm
- Sau khi điện di hòan tất, kết quả điện di được đọc trên bàn đèn UV hoặc máy đọc gel sử dụng đèn UV.
- Thang DNA 100bp sử dụng gồm 10 vạch từ 100 đến 1000 bp.
- Kết quả dự kiến như sau
+ Mẫu dương tính với WSSV xuất hiện band kích thước 526bp (giữa vạch 500bp và 600p ).
+ Mẫu dương tính với Vibrio parahemolyticus xuất hiện band kích thước 438bp (giữa vạch 400bp và 600p ).
+ Mẫu dương tính với EMS xuất hiện band kích thước 316bp (giữa vạch 200bp và 300p ).
+ Mẫu dương tính với EHP xuất hiện band kích thước 177bp (gần ngay dưới 200bp ).
+ Chứng nội xuất hiện band với kích thuớc 102bp.
Chú ý Vạch mở phía dưới vạch 100bp là vạch mồi còn thừa lại sau phản ứng.
V.parahemolytic us EMS EHP IC Kết luận
(526 bp) (438bp) (316 bp) (177bp ) (102 bp)
Mẫu dương tính với cả
Mẫu dương tính với WSSV
Mẫu dương tính với V.parahemolyticus
Table 1.1 Bảng phân tích kết quả
Sự cố Nguyên nhân Khắc phục
Không xuất hiện vạch nào ở tất cả các giếng, kể cả chứng dương
1 Cài đặt sai chương trình PCR
2 Thiết bị PCR gặp sự cố
3 Hóa chất của kit không được bảo quản theo đúng chỉ định
1 Kiểm tra lại chương trình chạy PCR
2 Kiểm tra lại hoạt động của thiết bị PCR
3 Kiểm tra lại điều kiện bảo quản và hạn sử dụng của kit
Chứng dương bình thường, mẫu xét nghiệm không cho vạch DNA , kể cả vạch của đối chứng nội
1 Hàm lượng DNA thu được quá cao
2 Có chất ức chế trong mẫu
1 Pha loãng 10 lần dịch DNA và thực hiện lại phản ứng PCR
2 Bổ sung một lượng nhỏ chứng dương mục tiêu vào mẫu tách chiết Nếu kết quả vẫn âm tính thì kết luận có chất ức chế tronng mẫu Tiến hành tách chiết lại hoặc xử lý như cách 1.
Xuất hiện vạch DNA trong chứng âm , chứng âm tách chiết
1 Micropipet bị nhiễm DNA mục tiêu hoặc sản phẩm PCR.
2 Hoá chất PCR bị nhiễm DNA mục tiêu hoặc sản phẩm PCR.
3 Môi trường làm việc bị nhiễm DNA mục tiêu hoặc sản phẩm PCR.
1 Vệ sinh hoặc thay micropipet mới , sử dụng filter tip
2 Sử dụng hóa chất PCR khác
3 Yêu cầu bộ phận kỹ thuật đến vệ sinh môi trường làm việc.
Table 1.2 Bảng xử lý sự cố
KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
Q UY TRÌNH THỰC HIỆN
Thực hành theo các bước trong tờ hướng dẫn sử dụng bộ kit TopSPEC WEEV PCR KIT.
Lấy 1 mẫu chân bơi tôm tầm 0.5 g cho vào eppendorf 1.5 mL, label vào eppendorf, thêm 1 eppendorf làm ống đối chứng, các bước làm tương tự nhưng không có mẫu chân bơi tôm).
Thờm vào 250 àl Solution 1 Nghiền mẫu bằng chày nghiền mẫu.
Thờm 250 àl Solution 2 vào, tiếp tục nghiền đến khi mẫu đồng nhất hoàn toàn.
Thờm 500 àl Solution 3 vào, vortex đều
Ly tâm 13000 rpm 4 0 C trong 1 phút.
Hỳt 500 àl dịch nổi, hỳt phớa trờn phần dịch nổi hạ đầu tuýp theo bề mặt dịch
Bơm sang cột silica đặt sẵn trong tube
Chú ý Chỉ hút phần dịch, hạn chế đụng đầu tip vào thịt để tránh nhiễm.
Ly tâm 13000 rpm 4 0 C trong 1 phút,
Hình 3.5 Nghiền mẫu hoàn toàn
Bảo quản mẫu ở eppendorf 1.5 mL ở -
3.1.2 Làm chứng âm tách chiết
Dùng eppendorf 1.5 mL lable thực hiện quy trình tương tự như các bước trên nhưng không cho mẫu vào.
3.1.3 Thực hiện phản ứng PCR
Chuẩn bị 4 ống eppendorf lable như sau
- NCTC (Chứng âm tách chiết)
- MT (DNA mẫu chân bơi tôm)
Bước 2 Hút và bơm mẫu
Hỳt vào mỗi eppendorf 20 àL dd
WVVS PCR MIX ( cung cấp sẵn )
Hỳt 5 àL mẫu tương ứng cho vào từng eppendorf
- NCP ( 5 àL nước + 20 àL MIX )
- MT ( 5 àL mẫu tụm + 20 àL
- PC ( 5 àL PC + 20 àL MIX )
Hình 3.13 Hút từng mẫu vào từng đối chứng
Bước 3 Hoàn thiện mẫu Đóng nắp tapping và spindown tất cả các eppendorf.
Hình 3.14 Tiến hành spindown các mẫu Bước 4 Chạy PCR với chu trình nhiệt như sau
Hình 3.15 Tiến hành chạy PCR
Hình 3.16 Kết quả chiếu máy UV
3.1.4 Tiến hành điện di kiểm tra kết quả
Chuẩn bị bộ điện di và loading mẫu vào gel theo thứ tự Ladder, NCP, NCTC, MT, PC.
Ladder 5 àL dung dịch Ladder và 1 àL GelRed Đối chứng õm PCR 5 àL nước cất và 1 àL GelRed Đối chứng õm tỏch chiết 5 àL dung dịch mẫu đối chứng và 1 àL
GelRed Mẫu chõn bơi của tụm 5 àL dung dịch chứa DNA mẫu và 1 àL
GelRed Đối chứng dương PC 5 àL dung dịch chứa DNA của WSSV và
Chạy điện di với hiệu điện thế 100V trong 20 phút Sau 20 phút, nhẹ nhàng lấy gel ra và cho vào máy chiếu UV để đọc kết quả.
Hình 3.17 Kết quả trên máy chiếu UV 3.2 Biện luận kết quả
Trong hình là các band chạy điện di đại diện cho từng mẫu lần lượt từ trái qua phải là Ladder, NCP, NCTC, MT, PC.
Phân tích kết quả điện di cho thấy không phát hiện các vạch DNA tương ứng với WSSV, Vibrio parahemolyticus, EMS và EHP (526 bp và 200 bp) ở mẫu tôm Do đó, mẫu tôm được xét nghiệm không nhiễm các tác nhân gây bệnh này.
Kết quả xét nghiệm cho thấy mẫu hai chứng âm không nhiễm, không có vạch ngang tương ứng với MT và PC ở NCP và NCTC Chỉ xuất hiện các vạch mờ nhạt phía dưới với kích thước band nhất định.
102 bp là mồi thừa sau phản ứng.
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Kết quả multiplex PCR cho thấy mẫu tôm không nhiễm bệnh đốm trắng và bệnh còi Phương pháp này, sử dụng bộ kit sinh học phân tử, nhanh chóng và hiệu quả hơn so với phương pháp truyền thống.
Bộ kit sinh học phân tử: công nghệ tiết kiệm thời gian, chính xác cao, dễ sử dụng, mở ra tiềm năng to lớn cho khoa học và kinh tế.
Bộ kit chẩn đoán bệnh tôm cần được tuyên truyền rộng rãi và áp dụng tại các trại nuôi để phát hiện bệnh kịp thời, giúp xử lý nhanh chóng và hiệu quả.
Hình ảnh minh họa trong hướng dẫn sử dụng bộ kit sinh học phân tử giúp nông dân hiểu rõ và sử dụng hiệu quả hơn.