Nghiên cứu công nghệ sản xuất tinh bột kháng tiêu hoá loại RS3 từ nguyên liệu gạo bằng thủy phân enzyme kết hợp xử lý nhiệt ẩm

Nghiên cứu công nghệ sản xuất tinh bột kháng tiêu hoá loại RS3 từ nguyên liệu gạo bằng thủy phân enzyme kết hợp xử lý nhiệt ẩmNghiên cứu công nghệ sản xuất tinh bột kháng tiêu hoá loại RS3 từ nguyên liệu gạo bằng thủy phân enzyme kết hợp xử lý nhiệt ẩmNghiên cứu công nghệ sản xuất tinh bột kháng tiêu hoá loại RS3 từ nguyên liệu gạo bằng thủy phân enzyme kết hợp xử lý nhiệt ẩmNghiên cứu công nghệ sản xuất tinh bột kháng tiêu hoá loại RS3 từ nguyên liệu gạo bằng thủy phân enzyme kết hợp xử lý nhiệt ẩmNghiên cứu công nghệ sản xuất tinh bột kháng tiêu hoá loại RS3 từ nguyên liệu gạo bằng thủy phân enzyme kết hợp xử lý nhiệt ẩmNghiên cứu công nghệ sản xuất tinh bột kháng tiêu hoá loại RS3 từ nguyên liệu gạo bằng thủy phân enzyme kết hợp xử lý nhiệt ẩmNghiên cứu công nghệ sản xuất tinh bột kháng tiêu hoá loại RS3 từ nguyên liệu gạo bằng thủy phân enzyme kết hợp xử lý nhiệt ẩmNghiên cứu công nghệ sản xuất tinh bột kháng tiêu hoá loại RS3 từ nguyên liệu gạo bằng thủy phân enzyme kết hợp xử lý nhiệt ẩmNghiên cứu công nghệ sản xuất tinh bột kháng tiêu hoá loại RS3 từ nguyên liệu gạo bằng thủy phân enzyme kết hợp xử lý nhiệt ẩmNghiên cứu công nghệ sản xuất tinh bột kháng tiêu hoá loại RS3 từ nguyên liệu gạo bằng thủy phân enzyme kết hợp xử lý nhiệt ẩmNghiên cứu công nghệ sản xuất tinh bột kháng tiêu hoá loại RS3 từ nguyên liệu gạo bằng thủy phân enzyme kết hợp xử lý nhiệt ẩmNghiên cứu công nghệ sản xuất tinh bột kháng tiêu hoá loại RS3 từ nguyên liệu gạo bằng thủy phân enzyme kết hợp xử lý nhiệt ẩmNghiên cứu công nghệ sản xuất tinh bột kháng tiêu hoá loại RS3 từ nguyên liệu gạo bằng thủy phân enzyme kết hợp xử lý nhiệt ẩmNghiên cứu công nghệ sản xuất tinh bột kháng tiêu hoá loại RS3 từ nguyên liệu gạo bằng thủy phân enzyme kết hợp xử lý nhiệt ẩmNghiên cứu công nghệ sản xuất tinh bột kháng tiêu hoá loại RS3 từ nguyên liệu gạo bằng thủy phân enzyme kết hợp xử lý nhiệt ẩmNghiên cứu công nghệ sản xuất tinh bột kháng tiêu hoá loại RS3 từ nguyên liệu gạo bằng thủy phân enzyme kết hợp xử lý nhiệt ẩmNghiên cứu công nghệ sản xuất tinh bột kháng tiêu hoá loại RS3 từ nguyên liệu gạo bằng thủy phân enzyme kết hợp xử lý nhiệt ẩmNghiên cứu công nghệ sản xuất tinh bột kháng tiêu hoá loại RS3 từ nguyên liệu gạo bằng thủy phân enzyme kết hợp xử lý nhiệt ẩmNghiên cứu công nghệ sản xuất tinh bột kháng tiêu hoá loại RS3 từ nguyên liệu gạo bằng thủy phân enzyme kết hợp xử lý nhiệt ẩmNghiên cứu công nghệ sản xuất tinh bột kháng tiêu hoá loại RS3 từ nguyên liệu gạo bằng thủy phân enzyme kết hợp xử lý nhiệt ẩmNghiên cứu công nghệ sản xuất tinh bột kháng tiêu hoá loại RS3 từ nguyên liệu gạo bằng thủy phân enzyme kết hợp xử lý nhiệt ẩmNghiên cứu công nghệ sản xuất tinh bột kháng tiêu hoá loại RS3 từ nguyên liệu gạo bằng thủy phân enzyme kết hợp xử lý nhiệt ẩmNghiên cứu công nghệ sản xuất tinh bột kháng tiêu hoá loại RS3 từ nguyên liệu gạo bằng thủy phân enzyme kết hợp xử lý nhiệt ẩmNghiên cứu công nghệ sản xuất tinh bột kháng tiêu hoá loại RS3 từ nguyên liệu gạo bằng thủy phân enzyme kết hợp xử lý nhiệt ẩmNghiên cứu công nghệ sản xuất tinh bột kháng tiêu hoá loại RS3 từ nguyên liệu gạo bằng thủy phân enzyme kết hợp xử lý nhiệt ẩm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

VIỆN CƠ ĐIỆN NÔNG NGHIỆP VÀ CÔNG NGHỆ SAU THU HOẠCH

==========================================

PHẠM CAO THĂNG

NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT TINH BỘT KHÁNG TIÊU HOÁ LOẠI RS3

TỪ NGUYÊN LIỆU GẠO BẰNG ENZYME KẾT HỢP XỬ LÝ NHIỆT ẨM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT

Chuyên ngành: Công nghệ sau thu hoạch

Mã số: 954.01.04

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ

HÀ NỘI - 2024

Công trình được hoàn thành tại VIỆN CƠ ĐIỆN NÔNG NGHIỆP VÀ CÔNG NGHỆ SAU THU HOẠCH

Người hướng dẫn khoa học:

1 PGS.TS Nguyễn Duy Lâm

2 PGS.TS Phạm Anh Tuấn

Phản biện 1: PGS.TS Bùi Quang Thuật

Phản biện 2: PGS.TS Nguyễn Thị Minh Tú

Phản biện 3: PGS.TS Đồng Văn Quyền

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Viện họp tại:

vào lúc giờ ngày tháng năm 2024

Có thể tìm hiểu Luận án tại thư viện:

- Thư viện Quốc gia Việt Nam

- Thư viện

Tùy thuộc vào nguồn gốc tinh bột và phương pháp biến tính mà các đặc tính cấu trúc, tính chất chức năng và hàm lượng tinh bột kháng tiêu hoá loại RS3 (hàm lượng RS3) cũng khác nhau Do vậy, việc nghiên cứu tìm ra những nguyên liệu có hiệu quả để sản xuất tinh bột kháng tiêu hoá là cần thiết Gạo có nhiều lợi thế để sản xuất tinh bột RS3 do hàm lượng tinh bột cao, cấu trúc hạt phức tạp với các phân nhánh và liên kết hydro giữa các chuỗi glucose Điều này thuận lợi cho quá trình biến đổi thành tinh bột kháng tiêu hoá, đặc biệt là RS3 Việc sử dụng gạo còn làm tăng giá trị sản phẩm và cải thiện tính chấp nhận của người tiêu dùng

Các phương pháp sản xuất RS hiện nay chủ yếu sử dụng phương pháp biến đổi vật lý và hóa học Tại Việt Nam, nghiên cứu sản xuất tinh bột kháng tiêu hóa ngày càng được quan tâm Các nghiên cứu bước đầu được thực hiện trên các nguyên liệu như đậu xanh, khoai lang, khoai môn, gạo, chuối với các phương pháp biến đổi khác nhau Việc phát triển các công nghệ tiên tiến, thân thiện với môi trường đang là chủ đề được nhiều nhà khoa học trong và ngoài nước quan tâm

Xuất phát từ xu hướng phát triển và nhu cầu thị trường, từ năm 2016 Bộ Nông nghiệp và Phát

triển nông thôn đã phê duyệt thực hiện đề tài “Nghiên cứu sản xuất tinh bột từ gạo tấm làm nguyên liệu cho chế biến thực phẩm”, chủ nhiệm là PGS.TS Nguyễn Duy Lâm và Nghiên cứu sinh là thành

viên tham gia chính, chủ trì các nội dung có liên quan đến hướng nghiên cứu phát triển của đề tài

Luận án “Nghiên cứu công nghệ sản xuất tinh bột kháng tiêu hoá loại RS3 từ nguyên liệu gạo bằng thủy phân enzyme kết hợp xử lý nhiệt ẩm”

2 Mục tiêu

Xây dựng được quy trình công nghệ sản xuất tinh bột RS3 từ nguồn nguyên liệu gạo phổ biến tại Việt Nam bằng phương pháp thủy phân enzyme kết hợp xử lý nhiệt ẩm để tạo ra sản phẩm tinh bột RS3 đảm bảo chất lượng, ATTP và có khả năng ứng dụng ở quy mô công nghiệp

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

3.1 Ý nghĩa khoa học

Đã xây dựng được quy trình công nghệ sản xuất tinh bột kháng tiêu hoá loại RS3 từ nguyên liệu gạo IR50404 bằng quá trình tiền xử lý thủy phân enzyme pullulanase kết hợp kỹ thuật hấp nhiệt/làm nguội 3 chu kỳ

Công trình nghiên cứu của luận án góp phần bổ sung bộ cơ sở dữ liệu khoa học về quy trình công nghệ sản xuất tinh bột kháng tiêu hoá loại RS3 Luận án là tài liệu tham khảo có giá trị đối với các nhà khoa học, các nghiên cứu sinh, doanh nghiệp sản xuất chế biến thuộc lĩnh vực nghiên cứu về tinh bột nói chung và tinh bột kháng tiêu hoá RS3 nói riêng Trong đó, các thông số của quá trình công nghệ được thiết lập có hệ thống từ yếu tố nguyên liệu gạo đến sơ chế, tiền xử lý và biến tính thoái hóa tinh bột tạo tinh bột RS3 đảm bảo tính kế thừa, phát triển, logic và khoa học

3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả của đề tài luận án góp phần đa dạng hóa sản phẩm, nâng cao chất lượng và gia tăng giá trị sản phẩm gạo Việt Nam

Bước đầu tinh bột RS3 được tạo ra từ nguyên liệu gạo IR50404 có thể mở rộng cho một số giống lúa gạo có tiềm năng đã được lựa chọn Sản phẩm tinh bột RS3 đảm bảo tiêu chuẩn chất lượng và ATTP là nguồn thực phẩm chức năng và phụ gia thực phẩm phục vụ cho ngành công nghệ chế biến góp phần bảo vệ sức khỏe, nâng cao chất lượng cuộc sống con người và cộng đồng

4 Đóng góp mới của luận án

Đã lựa chọn giống lúa IR50404 là thích hợp cho sản xuất tinh bột RS3 (hàm lượng amylose cao (29,14%), khả năng hình thành RS3 cao (8,39%), độ nhớt thấp (5020 cP), độ kết tinh cao (42,1%)

và là giống lúa trồng rất phổ biến ở Nam bộ và Nam Trung bộ Việt Nam

Đã xác định được giải pháp công nghệ thích hợp để sản xuất tinh bột RS3 từ tinh bột gạo giống lúa IR50404, sử dụng enzyme pullulanase tiền thủy phân tinh bột gạo kết hợp kỹ thuật hấp nhiệt/làm nguội theo chu kỳ với các thông số công nghệ tối ưu: Hàm lượng tinh bột/nước 15%,

pH 5,5 với nồng độ enzyme 2,2 %, nhiệt độ 54,4oC, thời gian thủy phân 10,4 giờ Tiếp theo dịch tinh bột được hấp nhiệt/làm nguội 3 chu kỳ tương ứng nhiệt độ hấp 130oC trong thời gian 60 phút

và làm nguội xuống 4oC, lưu trữ sau 18 giờ trước khi tinh chế làm sạch, thu hồi sản phẩm tinh bột RS3 Sản phẩm thu được có hàm lượng RS3 đạt 47,4 ± 0,66%; hàm lượng đường khử đạt 14,18 ± 0,15%; độ hòa tan 68,31 ± 0,27%; độ trương nở 2,11 ± 0,04 %; tỷ lệ thu hồi 88,5 ± 1,2%, hàm lượng amylose 49,78 ± 0,88%; độ thủy phân 8,91 ± 0,18 %; độ trùng hợp 235 ± 4,8

Đã đề xuất được quy trình công nghệ sản xuất tinh bột RS3 từ tinh bột gạo giống lúa IR50404 bằng tiền xử lý thủy phân enzyme pullulanase kết hợp kỹ thuật hấp nhiệt/làm nguội 3 chu kỳ, đảm bảo độ tin cậy trong điều kiện ứng dụng quy mô công nghiệp

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung về tinh bột

1.1.1 Cấu trúc và thành phần của tinh bột

Tinh bột là một polysaccharide cấu thành từ các đơn vị α-glucopyranose, có công thức hóa học (C6H10O5)n

Tinh bột gồm hai loại chuỗi polymer: amylose và amylopectin Amylose có cấu trúc tuyến tính với các liên kết α-1,4-glycosidic, trong khi amylopectin có cấu trúc phân nhánh với các liên kết α-1,4-glycosidic và α-1,6-glycosidic

1.1.2 Tính chất chức năng của tinh bột

Tinh bột có nhiều đặc tính chức năng và ứng dụng khác nhau trong y sinh và công nghiệp Do cấu trúc phân tử và phân nhánh nên tinh bột ít tan trong nước, ít hấp thụ nước và dầu, liên kết tốt với iốt,

có độ nhớt cao, độ trương nở và hồ hóa tốt, tạo màng mỏng và ổn định trong điều kiện đông lạnh-rã đông Tinh bột chịu được nhiệt độ và áp suất vừa phải nhưng lại nhạy cảm với quá trình thủy phân bằng axit và enzym Để cải thiện tính chất chức năng, tinh bột có thể được biến đổi bằng các phương pháp vật lý và hóa học

1.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến cấu trúc và tính chất của tinh bột

Tinh bột nhạy cảm với pH, nhiệt độ, áp suất cao, ánh sáng, bức xạ, ứng suất cơ học và siêu âm Gia nhiệt trong nước sẽ chuyển tinh bột vô định hình thành dạng tinh thể, gây ra hiện tượng hồ hóa Tương tác với nước và dầu phá vỡ liên kết amylose-amylopectin, gây mất kết tinh và trương nở Đông lạnh sau khi hồ hóa làm tăng độ bền và độ cứng của tinh bột

3 Các yếu tố hóa học ảnh hưởng đến cấu trúc và chức năng của tinh bột bao gồm các chất oxy hóa, dẫn xuất hydroxy hoặc carboxy của hydrocarbon, liên kết ngang có tính axit và bazơ, polyme tổng hợp và một số phân tử cation Tinh bột còn bị ảnh hưởng bởi quá trình thủy phân bằng axit và enzyme dẫn đến sự phân hủy amylose và amylopectin, từ đó làm thay đổi hình thái và tính chất bề mặt của hạt Những yếu tố này cải thiện chất lượng chức năng của tinh bột cho các ứng dụng thực phẩm và công nghiệp

1.2 Biến tính tinh bột

Sơ đồ tổng hợp phương pháp biến tính tinh bột phổ biến theo cơ chế vật lý và hóa học (Hình 1.1)

Hình 1.1 Tổng hợp các phương pháp biến tính tinh bột bằng vật lý và hóa học

1.2.1 Biến tính tinh bột bằng phương pháp vật lý

Biến đổi vật lý của tinh bột bao gồm những thay đổi về hình thái và cấu trúc dưới tác động của các yếu tố như độ ẩm, nghiền, nhiệt độ, áp suất, pH, bức xạ, sóng siêu âm Những thay đổi này ảnh hưởng đến kích thước hạt, tính chất bề mặt, độ hòa tan, độ trương nở, độ bám dính và quá trình hồ hóa của tinh bột Các kỹ thuật biến đổi bao gồm xử lý nhiệt, chiếu xạ, vi sóng, áp suất cao Những biến đổi này nhằm cải thiện chất lượng và tính phù hợp của tinh bột

1.2.2 Biến tính tinh bột bằng phương pháp hoá học

Biến đổi hóa học của tinh bột liên quan đến việc thay đổi các tính chất hóa lý bằng cách thêm các nhóm hóa học mới mà không thay đổi hình dạng và kích thước của phân tử Các vị trí chính để biến đổi là ba nhóm hydroxyl trên mỗi đơn vị glucose Các phương pháp biến đổi bao gồm oxy hóa, ete hóa, este hóa, cation hóa nhằm cải thiện tính chất vật lý và chức năng của tinh bột, làm cho nó có ứng dụng quan trọng trong ngành dệt may, giấy, mỹ phẩm, và công nghiệp thực phẩm

1.3 Tinh bột kháng tiêu hóa

1.3.1 Đặc điểm của tinh bột theo thuộc tính tiêu hóa

Tinh bột có thể được chia thành ba loại dựa trên tốc độ và mức độ tiêu hóa: Tinh bột tiêu hoá nhanh (RDS), tinh bột tiêu hoá chậm (SDS) và tinh bột kháng (RS)

1.3.2 Cấu trúc và phân loại tinh bột kháng tiêu hóa (RS)

1.3.2.1 Cấu trúc của tinh bột kháng tiêu hóa

Tinh bột kháng tiêu hoá có cấu trúc gồm các phân tử mạch thẳng chứa α-1,4-D-glucan, chủ yếu được hình thành từ sự thoái hoá amylose (Hình 1.2)

Hình 1.2 Mô phỏng cấu trúc của các loại tinh bột kháng tiêu hóa

1.3.2.2 Phân loại tinh bột kháng tiêu hóa

Tinh bột kháng tiêu hóa được phân thành 5 loại: R1 (Không tiêu hóa do các rào cản từ thành tế bào và mạng lưới protein); RS2 (Hạt tinh bột tự nhiên, không tiêu hóa do cấu trúc tinh thể chặt chẽ); RS3 (Tinh bột biến tính vật lý, hình thành khi tinh bột được gia nhiệt và làm nguội, có tính bền nhiệt cao); RS4 (Tinh bột biến đổi hóa học, tiêu hóa bị giảm do các quá trình hóa học như ete hóa và liên kết chéo); RS5 (Tinh bột kháng tiêu hóa do liên kết giữa amylose và lipid, tạo cấu trúc xoắn đơn cản trở quá trình thủy phân bằng enzyme)

1.3.3 Cơ chế hình thành tinh bột kháng tiêu hóa (RS3)

1.3.3.1 Nguyên tắc chung

Các phương pháp sản xuất tinh bột RS3 thường bắt đầu bằng quá trình thủy phân enzyme, tiếp theo là các quá trình xử lý nhiệt như ủ nhiệt, nhiệt ẩm và hấp nhiệt

1.3.3.2 Cơ chế tác động của enzyme đến cấu trúc và chức năng của tinh bột

Hình 1.3 Cơ chế tác động của enzyme đến cấu trúc để cải thiện chức năng của tinh bột

Các enzyme biến đổi tinh bột được phân loại thành Glycosyl hydrolase (EC 3.2.1.X), xúc tác quá trình thủy phân hoặc sắp xếp lại các liên kết glycosidic, và Glycosyl transferase (EC 2.4.XY), xúc tác cho sự hình thành các liên kết glycosidic mới mà không phân cắt các liên kết hiện có (Hình 1.3) Hình 1.4 biểu thị sự hoạt động của một số enzyme chính vào quá trình thuỷ phân tinh bột

Hình 1.4 Sơ đồ hoạt động của các enzyme thủy phân tinh bột

Có 4 loại enzyme chính tham gia vào quá trình thuỷ phân tinh bột là: α-amylase cắt liên kết glycosidic trong tinh bột và glycogen; β-amylase có khả năng cắt các liên kết α-1,4-glycosidic từ đầu không khử của polysaccharide; Glucoamylase cắt các liên kết α-1,4-glycosidic từ đầu không khử và α-1,6-glycosidic trong tinh bột và glycogen để giải phóng glucose; Pullulanase thuộc nhóm enzyme

α-1,4-5 khử nhánh, là enzyme đặc hiệu cắt các liên kết α-1,6-glycosidic trong tinh bột và các polysaccharide

khác như pullulan Enzyme pullulanase phá vỡ các nhánh amylopectin, tạo thành các chuỗi amylose

dài hơn, tạo điều kiện cho quá trình kết tinh lại của tinh bột thành cấu trúc RS3 sau khi làm nguội, từ

đó làm tăng hàm lượng RS3 trong sản phẩm cuối cùng

1.3.3.3 Sự hình thành tinh thể và cơ chế tạo tinh bột RS3

Khi hỗn hợp dịch tinh bột - nước bị thoái hóa, sẽ thu được một hệ polyme kết tinh một phần Quá

trình thoái hóa tinh bột là sự kết tinh trong mạng lưới vô định hình, gồm ba bước: Tạo mầm (hình

thành các nhân tinh thể); Phát triển (tinh thể tăng trưởng từ các nhân); Trưởng thành (tinh thể tiếp tục

tăng trưởng chậm hoặc đạt kích thước ổn định)

Hình 1.5 Sự phụ thuộc vào nhiệt độ của tốc độ tạo mầm, phát triển mạng tinh thể và

kết tinh tổng thể của các polyme kết tinh từng phần

Hình 1.5 cho thấy, tỷ lệ kết tinh tinh bột phụ thuộc vào nhiệt độ Tỷ lệ tạo mầm bằng 0 ở nhiệt độ

nóng chảy (Tm) và tăng khi nhiệt độ giảm Dưới nhiệt độ chuyển thủy tinh (Tg), tỷ lệ tạo mầm

không đáng kể do hệ thống đóng băng Tốc độ phát triển tinh thể là 0 tại T < Tg và tăng khi nhiệt độ

tăng Tốc độ trưởng thành phụ thuộc rất ít vào nhiệt độ và chủ yếu vào tốc độ tạo mầm và phát triển

tinh thể Hiệu suất của tinh bột kháng tiêu hoá phụ thuộc vào thời gian lưu trữ và nhiệt độ sau khi

hấp nhiệt Sự tạo mầm tinh thể ở nhiệt độ thấp, lớn hơn Tg và sự phát triển tinh thể ở nhiệt độ cao,

thấp hơn Tm

1.4 Tổng quan các công trình nghiên cứu về sản xuất tinh bột RS3

1.4.1 Tổng hợp các công nghệ biến tính tinh bột bằng phương pháp vật lý

Tổng hợp 24 tài liệu tham khảo về nghiên cứu biến tính tinh bột bằng phương pháp vật lý cho thấy

đây là một phương pháp phổ biến trong sản xuất RS Quá trình này bao gồm việc đun nóng tinh bột ở

nhiệt độ cao kết hợp với độ ẩm thích hợp để thúc đẩy sự tái tinh thể hóa của các phân tử tinh bột Khi

làm nguội, các phân tử tinh bột sắp xếp lại theo một trật tự mới, tạo thành cấu trúc phức tạp hơn mà

enzyme tiêu hóa khó có thể phân giải Các kỹ thuật trong biến tính tinh bột bằng phương pháp vật lý

bao gồm: Xử lý nhiệt, xay xát (nghiền), áp suất cao, chiếu xạ, sóng siêu âm

1.4.2 Công nghệ thủy phân enzyme trong sản xuất tinh bột RS3

Enzyme đóng vai trò quan trọng trong việc phân cắt các liên kết glycosidic của tinh bột Tổng

hợp từ 14 tài liệu tham khảo cho thấy, enzyme pullulanase được sử dụng chủ yếu, có vai trò quan

trọng trong việc phá vỡ các liên kết phân nhánh α-1,6-glycosidic trong amylopectin, tạo điều kiện

thuận lợi cho quá trình tái kết tinh và sản xuất tinh bột RS3 Các thông số công nghệ chính của quá

trình thuỷ phân là: nhiệt độ 50 - 60oC, thời gian từ vài giờ đến 24 giờ, pH 4,5 - 6,0, cơ chất 10-30%

1.4.3 Công nghệ xử lý nhiệt trong sản xuất tinh bột RS3

Tổng hợp 25 tài liệu tham khảo (trong đó có những tài liệu được cập nhật đến năm 2024) về vấn

đề nghiên cứu cho thấy, hai phương pháp xử lý nhiệt được sử dụng chủ yếu trong sản xuất tinh bột

RS3 là nhiệt ẩm và hấp nhiệt/làm nguội, trong đó xử lý hấp nhiệt/làm nguội có nhiều ưu điểm như:

Khi hấp nhiệt, các hạt tinh bột trương nở và bị phá vỡ, làm giải phóng các phân tử amylose và

amylopectin, tạo điều kiện cho việc tái kết tinh Quá trình làm nguội sau đó giúp các phân tử

amylose và amylopectin tái kết tinh thành các cấu trúc ổn định, hình thành tinh bột RS3 Như vậy, phương pháp hấp nhiệt/làm nguội không chỉ giúp tăng hàm lượng RS3 trong sản phẩm cuối cùng mà còn nâng cao các đặc tính chức năng, làm cho sản phẩm trở nên phù hợp và có giá trị cao trong các ứng dụng thực phẩm và dược phẩm Các thông số công nghệ chính của quá trình hấp nhiệt/làm nguội là: nhiệt độ hấp nhiệt từ 100 - 140oC, thời gian hấp nhiệt từ 15 - 60 phút, nhiệt độ làm nguội từ -20 đến 70oC, thời gian làm nguội từ 18 - 24 giờ

1.4.4 Công nghệ làm sạch và thu hồi tinh bột RS3

Tổng hợp các nghiên cứu cho thấy, phương pháp hiệu quả để tinh chế và làm sạch tinh bột RS3là rửa và ly tâm nhiều lần với dung môi như nước và ethanol để loại bỏ enzyme và tạp chất, đảm bảo tinh bột kháng tiêu hoá có độ tinh khiết cao

1.5 Nguyên liệu sản xuất tinh bột kháng tiêu hóa

RS có thể được sản xuất từ nhiều loại nguyên liệu khác nhau, mỗi loại có đặc điểm và lợi ích riêng Các nguyên liệu phổ biến bao gồm gạo, khoai tây, ngô, chuối xanh, đậu nành, sắn và lúa mì Trong đó gạo là nguồn nguyên liệu có hàm lượng amylose cao và dễ dàng chuyển hóa thành RS3

1.6 Tình hình nghiên cứu công nghệ sản xuất tinh bột RS3 tại Việt Nam

Tổng hợp 09 tài liệu nghiên cứu về sản xuất tinh bột kháng tiêu hoá có liên quan đến nội dung nghiên cứu của đề tài luận án

1.7 Tổng hợp luận giải những vấn đề cần nghiên cứu

Yếu tố nguyên liệu: Lựa chọn gạo làm nguyên liệu để sản xuất tinh bột kháng tiêu hóa Cần phân tích lựa chọn được giống gạo thích hợp với các tiêu chí về hàm lượng tinh bột, hàm lượng amylose, hàm lượng RS3 trong tinh bột cao nhằm nâng cao hiệu quả quá trình sản xuất

Để sản xuất tinh bột RS3 chất lượng cao, ATTP, dùng làm thực phẩm chức năng và phụ gia thực phẩm, ưu tiên sử dụng phương pháp vật lý và sinh học Các giải pháp kỹ thuật được lựa chọn là: Tiền

xử lý thuỷ phân bằng enzyme: Lựa chọn pullulanase để thủy phân tinh bột, tối ưu hóa các yếu tố: hàm lượng cơ chất, pH, nồng độ enzyme, nhiệt độ, thời gian; Biến tính thoái hóa: Xử lý nhiệt (hấp nhiệt/làm nguội theo chu kỳ) sau thủy phân, tối ưu hóa nhiệt độ hấp nhiệt, thời gian hấp nhiệt, nhiệt

độ làm nguội, thời gian lưu trữ; Dự đoán miền nhiệt độ hấp nhiệt (sự phát triển tinh thể), nhiệt độ làm nguội (sự tạo mầm tinh thể) và miền nhiệt độ kết tinh tổng thể; Tối ưu hóa: Phân tích kết quả thực nghiệm, lập kế hoạch thực nghiệm đa yếu tố để tối ưu hóa quy trình sản xuất RS3

Tiến hành sản xuất thử nghiệm ở quy mô pilot làm cơ sở hoàn thiện và đề xuất quy trình công nghệ theo định hướng ứng dụng

Chương 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu

Thu thập 19 giống lúa có hàm lượng amylose cao TB gạo sử dụng trong các thí nghiệm chứa các thành phần chính sau: carbohydrate tổng > 90%; protein < 1,5%; lipid < 0,05%, độ ẩm < 10%

2.1.2 Hóa chất và thiết bị sử dụng

Hóa chất và thiết bị sử dụng trong đề tài luận án là các loại chuyên dụng cho các phân tích và thí nghiệm liên quan đến quá trình thủy phân enzyme và các phương pháp biến tính thoái hóa tinh bột

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu

2.2.1.1 Chuẩn bị bột gạo: Mẫu được nghiền và rây để có bột mịn (250 µm)

2.2.1.2 Chuẩn bị tinh bột gạo: Mẫu được xử lý kiềm để tách protein, sau đó sấy và nghiền ở nhiệt độ

< 75oC đến độ ẩm < 10%

7

2.2.2 Phương pháp công nghệ

Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu công nghệ sản xuất tinh bột kháng tiêu hóa loại RS3

2.2.3 Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

2.2.3.1 Phương pháp thực nghiệm xác định ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình tiền xử lý tinh

bột gạo bằng thủy phân enzyme pullulanase

a Nhóm thí nghiệm 1: Khảo sát đánh giá hiệu quả quá trình thủy phân bằng emzyme pullulanase

từ nguyên liệu tinh bột hồ hóa và thoái hóa đến khả năng tạo tinh bột RS3

- Chuẩn bị mẫu hồ hóa và thoái hóa tinh bột: Cân 25 g tinh bột gạo vào bình nón 250 ml → bổ

sung nước với nồng độ tinh bột 20% (w/w) → khuấy đều trên bếp từ gia nhiệt đến 70°C, 30 phút

→ hấp nhiệt ở 130°C, 30 phút → để nguội ở nhiệt độ phòng → lưu trữ ở 4°C trong 18 giờ Các

mẫu tinh bột hồ hóa hoặc thoái hóa chuẩn bị cho các thí nghiệm

- Chuẩn bị mẫu tinh bột thủy phân enzyme: Tiến hành với mẫu tinh bột ngay sau khi hồ hóa hoặc

sau khi thoái hóa → sử dụng enzym pullulanase nồng độ 1,5% → thủy phân với nồng độ tinh bột

15% (w/w), pH 5, nhiệt độ 55°C, thời gian 12 giờ → bất hoạt enzyme bằng hấp nhiệt 130°C

trong 30 phút

- Tiến hành 03 thí nghiệm (TN1.1, TN1.2, TN1.3) tương ứng tinh bột thoái hóa (TBTH), tinh bột

hồ hóa và thủy phần enzyme pullulanase (TBHH + Enzyme), tinh bột thoái hóa và thủy phần

enzyme pullulanase (TBTH + Enzyme), lặp lại 3 lần Mẫu sau khi thủy phân được ly tâm ở tốc

độ 3.000 vòng/phút, 20 phút Sấy khô theo hai giai đoạn ở 60oC trong 24 giờ và 75oC trong 12

giờ Nghiền và rây đạt bột mịn (<150 µm) rồi xác định hàm lượng và tỷ lệ thu hồi tinh bột RS3

b Nhóm thí nghiệm 2: Thực nghiệm đơn yếu tố xác định điều kiện tiền xử lý tinh bột gạo bằng thủy

phân enzyme pullulanase

Nguồn nguyên liệu từ các giống lúa Việt Nam

Phân tích đánh giá lựa chọn

(Thành phần hóa học, cấu trúc tinh bột)

Sản xuất thử nghiệm RS3 quy mô Pilot Khảo sát và thực nghiệm đơn yếu tố xác định chế độ công nghệ tiền thuỷ phân bằng enzyme pullulanase đến hàm lượng RS3

(Hàm lượng tinh bột, pH, nhiệt độ, thời gian và nồng độ enzyme)

Thực nghiệm đơn yếu tố xác định chế độ công nghệ hấp nhiệt/làm nguội đến hàm lượng RS3

(Nhiệt độ, thời gian hấp nhiệt và chu kỳ hấp nhiệt/làm nguội; Nhiệt độ làm

nguội và thời gian lưu trữ)

Thực nghiệm đa yếu tố và Tối ưu hoá quá trình tiền thuỷ phân bằng enzyme kết hợp hấp nhiệt/làm nguội theo chu kỳ để

tạo tinh bột kháng tiêu hoá RS3

Chuẩn bị mẫu tinh bột cho quá trình thực nghiệm

Sản phẩm tinh bột kháng tiêu hoá RS3

- Tiến hành 05 thí nghiệm (TN2.1, TN2.2, TN2.3, TN2.4, TN2.5) (Nhóm thí nghiệm 1):

TN 2.1: Ảnh hưởng của hàm lượng tinh bột đến khả năng tạo RS3: Tiến hành 5 thí nghiệm với hàm lượng tinh bột/nước (5, 10, 15, 20, 25%, w/w), thí nghiệm lặp lại 3 lần, điều kiện thuỷ phân: 25g tinh bột gạo/mẫu, pH 5, 55oC, 12 giờ, nồng độ enzyme pullulanase/cơ chất 1,5% (1,5 NPUN/g) Bất hoạt enzyme và thoái hóađể thu hồi và định lượng tinh bột RS3

TN 2.2: Ảnh hưởng của pH đến khả năng tạo RS3: Tiến hành 5 thí nghiệm với pH (4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0), thí nghiệm lặp lại 3 lần, điều kiện thí nghiệm với hàm lượng cơ chất được xác định từ

TN 2.1 và các thông số còn lại theo TN2.1

TN 2.3: Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân đến khả năng tạo RS3: Tiến hành 5 thí nghiệm với nhiệt độ (45, 50, 55, 60 và 65oC), thí nghiệm lặp lại 3 lần, điều kiện thí nghiệm với hàm lượng cơ chất tinh bột được xác định từ TN2.1 và pH từ TN2.2, các thông số còn lại theo như TN2.1

TN 2.4: Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến khả năng tạo RS3: Tiến hành 5 thí nghiệm với thời gian (0, 4, 10, 16 và 20 giờ), thí nghiệm lặp lại 3 lần, điều kiện thí nghiệm với hàm lượng cơ chất tinh bột được xác định từ TN2.1, pH từ TN2.2, nhiệt độ từ TN2.3 và các thông số còn lại theo như TN2.1

TN 2.5: Ảnh hưởng của nồng độ enzyme pullulanase đến khả năng tạo RS3: Tiến hành 6 thí nghiệm với nồng độ enzyme/cơ chất (0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 và 3,0%) tương ứng nồng độ enzyme (5, 10, 15, 20, 25 và 30 NPUN/g tinh bột), thí nghiệm lặp lại 3 lần, điều kiện thí nghiệm với hàm lượng tinh bột được xác định từ TN2.1, pH từ TN2.2, nhiệt độ từ TN2.3, thời gian thủy phân TN2.4

2.2.3.2 Phương pháp thực nghiệm xác định ảnh hưởng của các yếu tố trong quá trình hấp nhiệt/làm nguội đến hàm lượng RS3

a Nhóm thí nghiệm 3: Thực nghiệm xác định ảnh hưởng của nhiệt độ, thời gian và chu kỳ hấp nhiệt

đến khả năng tạo RS3

Tiến hành 3 nhóm thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ, thời gian và chu kỳ hấp nhiệt/làm nguội, trong đó chế độ làm nguội của tất cả các thí nghiệm được cố định (nhiệt độ 30oC, thời gian lưu ủ nhiệt 12 giờ) tương ứng ký hiệu và miền khảo sát sau:

TN3.1: Thực nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ hấp nhiệt đến khả năng tạo RS3 với 4 mức nhiệt độ (121oC, 130oC, 134oC, 140oC) Thực hiện với 1 chu kỳ và thời gian hấp nhiệt 30 phút

TN3.2: Thực nghiệm ảnh hưởng của thời gian hấp nhiệt đến khả năng tạo RS3 với 4 mức thời gian (30, 60, 90 và 120 phút) Thực hiện với 1 chu kỳ và nhiệt độ từ kết quả thí nghiệm TN3.1 TN3.3: Thực nghiệm ảnh hưởng của chu kỳ hấp nhiệt đến khả năng tạo RS3 với 4 mức chu kỳ hấp (1, 2, 3, 4), thực hiện với mức nhiệt độ và thời gian từ kết quả (TN3.1, TN3.2)

Điều kiện chung của 3 nhóm thí nghiệm: Các mẫu ở cùng điều kiện các mẫu tinh bột đã tiền xử

lý bằng enzyme pullulanase với các thông số công nghệ đã được lựa chọn từ thực nghiệm (kết

quả TN2.1, TN2.2, TN2.3, TN2.4, TN2.5)

b Nhóm thí nghiệm 4: Thực nghiệm xác định nhiệt độ và thời gian lưu ủ nhiệt sau làm nguội đến

hàm lượng RS3

Tiến hành 2 nhóm thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ, thời gian lưu ủ nhiệt sau làm nguội Thông

số công nghệ của quá trình hấp nhiệt (nhiệt độ, thời gian, chu kỳ) trước quá trình làm nguội được kế thừa từ kết quả thực nghiệm (TN3.1, TN3.2 TN3.3), tương ứng:

TN4.1: Thực nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ làm nguội đến khả năng tạo RS3 với 6 mức nhiệt

độ (2oC, 4oC, 6oC, 30oC, 40oC, 50oC) Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần với cùng thời gian lưu nhiệt sau làm nguội là 12 giờ

TN4.2: Thực nghiệm ảnh hưởng của thời gian lưu ủ nhiệt sau làm nguội đến hàm lượng RS3 với

4 mức thời gian (6 giờ, 12 giờ, 18 giờ, 24 giờ) Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần với cùng nhiệt

độ làm nguội đã được xác định từ thực nghiệm (TN4.1)

Tối ưu hóa bằng phương pháp chập mục tiêu sử dụng phần mềm Design-Expert version 7.1 theo thuật toán “Hàm mong đợi” được đưa ra bởi Deringer và Suich

2.2.4 Phương pháp sản xuất thử nghiệm tinh bột RS3 quy mô pilot

Tiến hành 03 thí nghiệm, với khối lượng 3 kg nguyên liệu tinh bột/mẻ; RS3 được sản xuất ở chế

độ tối ưu, lấy mẫu phân tích các chỉ tiêu gồm: hàm lượng tinh bột RS3, độ hòa tan, độ trương nở… Đồng thời, phân tích cấu trúc bằng phổ nhiễu xạ tia X và quan sát hình thái hạt tinh bột sau biến tính bằng hình ảnh SEM

2.2.5 Phương pháp phân tích

2.2.5.1 Phương pháp phân tích hóa học: Các chỉ tiêu hoá học được phân tích theo TCVN

4328-2:2011; TCVN 9935:2013; TCVN 5716-2:2008 ; Các chỉ tiêu vi sinh được phân tích theo TCVN 4884-1:2015; TCVN 11039-6:2015; TCVN 11039-8:2015; TCVN 6848:2007…; Các chỉ tiêu về dư lượng kim loại nặng được phân tích theo TCVN 7601:2007; TCVN 7603:2007, TCVN 7602:2007; TCVN 7604:2007…

Xác định hàm lượng RS3 theo phương pháp AOAC Method 985.29: Sử dụng bộ kit của Megazyme với 3 loại enzyme kèm theo Trong đó, α-amylase và amyloglucosidase để thủy phân thành phần tinh bột tiêu hóa thành các phần hòa tan, protease để thủy phân 2 enzyme đã nêu Tiến hành kết tủa bằng cồn và rửa để loại bỏ những thành phần hòa tan Sản phẩm cuối được xác định hàm lượng tro và hàm lượng protein để hiệu chỉnh kết quả

2.2.5.2 Phương pháp phân tích hóa lý

+ Xác định độ độ hòa tan của tinh bột: Theo phương pháp của Phạm Văn Hùng và cs (2016):

Độ hòa tan (%) = [Khối lượng tinh bột hòa tan sau sấy (g) / Khối lượng mẫu ban đầu (g)] x 100

Độ trương nở (%) = [Khối lượng phần tủa (g) / Khối lượng mẫu ban đầu (g)] x 100

+ Mức độ thủy phân của tinh bột sau khi thủy phân enzyme xác định theo Pongjanta và cs (2009) :

DH (%) = {[%RDS/%TSm] x 100}

Trong đó: %RDS là hàm lượng đường khử sau thuỷ phân (%); %TS là hàm lượng đường tổng số sau thuỷ phân (%)

+ Xác định đặc tính bột nhào bằng đo độ nhớt nhanh RVA theo AACC 61 - 02

2.2.6 Phương pháp phân tích cấu trúc và hình thái tinh bột

Xác định hình thái, cấu trúc tinh bột bằng phân tích SEM, phổ nhiễu xạ tia X và phổ hồng ngoại FT-IR

2.2.7 Phương pháp tinh chế bằng enzyme

Theo Chiu và cs (1994), Pomeranz và cs (1990): Thủy phân tinh bột bằng enzyme Termamyl SC sau đó tráng rửa tinh bột bằng nước nóng và ly tâm 3 lần

2.2.8 Xác định tỷ lệ thu hồi và hiệu suất thu hồi tinh bột kháng tiêu hoá

Tỷ lệ thu hồi (%) là tỷ số giữa khối lượng sản phẩm giàu tinh bột kháng tiêu hoá trên tổng khối lượng tinh bột nguyên liệu ban đầu, tính theo % khối lượng khô Hiệu suất thu nhận tinh bột kháng tiêu hoá (%) được tính bằng cách nhân hàm lượng tinh bột kháng tiêu hoá với tỷ lệ thu hồi

2.2.9 Phương pháp thống kê và xử lý số liệu

Số liệu thực nghiệm được phân tích theo ANOVA đơn yếu tố và biểu thị là giá trị trung bình Duncan’s test được sử dụng để kiểm định sự khác nhau có ý nghĩa của các giá trị trung bình Sử dụng phần mềm SPSS ver 16.0

Xử lý số liệu thực nghiệm đa yếu tố và tối ưu hóa bằng phần mềm Design-Expert 7.1

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Kết quả nghiên cứu phân tích và lựa chọn nguyên liệu thích hợp để sản xuất tinh bột kháng tiêu hóa

3.1.1 Đặc tính thành phần bột gạo của các loại giống lúa khảo sát

Bảng 3.1 thể hiện kết quả phân tích một số thành phần quan trọng trong 19 giống lúa đã thu thập

Bảng 3.1 Đặc tính thành phần bột gạo của các loại giống lúa khảo sát

Tự nhiên Thoái hóa

Các giá trị có chữ cái khác nhau trong cùng một cột là khác nhau có ý nghĩa (p<0,05)

Quan sát Bảng 3.1 cho thấy, có 8 giống có hàm lượng amylose cao trên 26%, đó là: Gia Lộc 301 (26,34%), IR50404 (26,42%), TBRI (26.72%), Gia Lộc 601 (27,89%), Gia Lộc 501 (28,02%), Gia Lộc 107 (28,78%), 13/2 (29,12%) và giống lúa Q5 (29,23%)

Kết quả xử lý thoái hóa (hấp nhiệt) của bột gạo 8 giống lúa này được thể hiện trong Hình 3.1

Hình 3.1 Hàm lượng RS3 và amylose trong bột gạo

của 8 giống lúa có hàm lượng amylose cao nhất

Hình 3.2 Hàm lượng RS3 và amylose trong tinh bột

gạo của 4 giống lúa

11 Hình 3.1 cho thấy, hàm lượng RS3 của bột gạo khi xử lý thoái hóa đều tăng, đạt từ 4,36 đến

6,71% (so với 1,09% - 2,76% ở bột gạo tự nhiên) Cũng giống như bột gạo tự nhiên, các giống lúa có

hàm lượng RS3 cao nhất trong bột gạo thoái hoá không phải là những giống có hàm lượng amylose

cao nhất Điều này chứng tỏ đối với bột gạo, không đủ bằng chứng để nhận định có quan hệ tỷ lệ

thuận giữa hàm lượng amylose và hàm lượng RS3 Để tiếp tục nghiên cứu, đề tài đã chọn 4 giống lúa

có hàm lượng RS3 cao nhất trong mẫu bột gạo thoái hoá từ 8 giống lúa trên để phân tích trên mẫu

tinh bột gạo, các giống lúa được chọn là: Gia Lộc 601 (6,71%), Q5 (6,28%), IR50404 (5,87%) và

Gia Lộc 501 (5,23%)

3.1.2 Đặc tính thành phần tinh bột gạo tự nhiên và xử lý thoái hóa của một số giống lúa

Hình 3.2 cho thấy, khi hàm lượng amylose tăng dần từ giống Gia Lộc 501 đến giống Gia Lộc 601

thì hàm lượng RS3 đều tăng ở cả mẫu tinh bột tự nhiên và thoái hoá Mặt khác, dựa trên các hàm

biểu diễn sự liên quan giữa hàm lượng RS3 và hàm lượng amylose (y1 = 0,2926x + 1,8393 với R² =

0,9463 và y2 = 0,5851x + 5,7653 với R² = 0,9454) cho thấy có sự tương quan chặt chẽ giữa hàm

lượng RS3 với hàm lượng amylose trong các mẫu tinh bột gạo tự nhiên cũng như tinh bột gạo xử lý

thoái hóa

Từ 4 giống lúa trên, lựa chọn 3 giống có hàm lượng amylose và RS3 cao nhất trong mẫu tinh bột

để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo, đó là các giống Gia Lộc 601, Q5 và IR50404

3.1.3 Các đặc trưng RVA của tinh bột gạo

Bảng 3.2 cho thấy, độ nhớt của các mẫu tinh bột phụ thuộc vào giống gạo và giảm dần theo thứ

tự: Q5 (5882 cP) > Gia Lộc 601 (5592 cP) > IR50404 (5020 cP)

Bảng 3.2 Các thông số RVA của tinh bột gạo các giống lúa

Tinh bột gạo

Độ nhớt đỉnh PV (cP)

Độ nhớt Breakdown (cP)

Độ nhớt đáy TV (cP)

Độ nhớt setback (cP)

Độ nhớt cuối FV (cP)

Nhiệt độ

hồ hóa PT ( o C)

Gia Lộc 601 3313d 218f 3095c 2279b 5592c 86,95a

Các giá trị có chữ cái khác nhau trong cùng một cột là khác nhau có ý nghĩa (p<0,05)

Việc IR50404 có độ nhớt thấp nhất trong 3 giống trên là một yếu tố quan trọng đối với việc lựa

chọn làm nguyên liệu cho sản xuất RS3 Độ nhớt thấp giúp tinh bột gạo dễ dàng gelatin hóa ở nhiệt

độ cao, tạo điều kiện thuận lợi cho việc chuyển đổi từ tinh bột thường sang tinh bột RS3 Ngoài ra,

độ nhớt thấp còn giúp cho các enzyme thủy phân tiếp cận và tương tác hiệu quả hơn với các phân tử

tinh bột, dẫn đến việc chuyển đổi nhanh và hiệu quả từ tinh bột thường thành tinh bột RS3 Như vậy

cùng với các kết quả tại mục 3.1.1 và 3.1.2, giống lúa IR50404 là phù hợp nhất cho mục đích nghiên

cứu vì có hàm lượng amylose và RS3 cao đồng thời có độ nhớt thấp

3.1.4 Đặc điểm hình thái hạt tinh bột - hình ảnh SEM của tinh bột gạo giống IR50404

Hình thái tinh bột gạo giống IR50404 được thể hiện trên Hình 3.3

Hình 3.3 Hình thái tinh bột gạo giống IR50404

(B1: Tinh bột tự nhiên; B2: Tinh bột thoái hóa, phóng đại 2500 lần;

B3: Tinh bột thoái hóa, phóng đại 6000 lần)