điều chế genipin từ geniposide trong hạt dành dành bằng phản ứng thủy phân với xúc tác enzym cellulase

Cho đến nay, nhiều nhà nghiên cứu đã khẳng định rằng cây dành dành sở hữu nhiều hoạt tính dược lý, chẳng hạn như tác động tích cực đến hệ thống tim mạch và tiêu hóa, hoạt tính chống oxi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGÀNH CÔNG NGHỆ KỸ THUẬT HÓA HỌC

ĐIỀU CHẾ GENIPIN TỪ GENIPOSIDE TRONG HẠT DÀNH DÀNH BẰNG PHẢN ỨNG THỦY PHÂN VỚI XÚC TÁC ENZYME CELLULASE

GVHD: PGS.TS VÕ THỊ NGÀ

PGS.TS, NGUYỄN VINH TIẾN SVTH: ĐOÀN THỊ MINH THẢO

SKL011840

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT TP HỒ CHÍ MINH

- -

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

ĐIỀU CHẾ GENIPIN TỪ GENIPOSIDE TRONG HẠT DÀNH DÀNH BẰNG PHẢN

ỨNG THỦY PHÂN VỚI XÚC TÁC

LỜI CẢM ƠN

“Nếu tôi nhìn được xa hơn người khác, đó là nhờ đứng trên vai những người khổng lồ” là một trong những trích dẫn nổi tiếng của Isaac Newton (năm 1676) mà tôi tâm đắc nhất Nó có nghĩa là những thành tựu của các học giả ngày nay được xây dựng dựa trên những thành tựu cống hiến của các thế hệ trước Thật vậy, để hoàn thành và đạt được kết quả hiện tại đều được xây dựng trên những ý tưởng trước đó Ngoài ra, nhờ vào sự tin tưởng và hỗ trợ đáng kể của mọi người xung quanh đã khuyến khích, tạo động lực cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu

Vì vậy, đầu tiên tôi muốn bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến các giáo viên trực tiếp hướng dẫn tôi, PGS.TS Võ Thị Ngà và PGS.TS Nguyễn Vinh Tiến, những người đã tận tình hướng dẫn và chia sẻ kiến thức chuyên môn và kinh nghiệm giảng dạy để tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Tôi cũng muốn cảm ơntất cả các giảng viên phụ trách Khoa Công nghệ Hóa học và Thực phẩm, và Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Thành phố Hồ Chí Minh đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu và trân trọng cảm ơn cô Nguyễn Thị Mỹ Lệ đã hỗ trợ các dụng cụ, trang thiết bị, cơ sở vật chất tốt nhất tại phòng thí nghiệm để hoàn thành luận văn Ngoài ra, tôi cũng muốn tri ân đến những người đã giúp tôi bằng cách cung cấp dữ liệu, địa chỉ và thông tin cần thiết cho nghiên cứu của tôi

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn động viên, hỗ trợ và yêu thương tôi trong suốt quá trình nghiên cứu khó khăn này

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan toàn bộ nội dung được trình bày trong khoá luận tốt nghiệp này đã được tiến hành đầy đủ, chính xác và trung thực và là do chính tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Võ Thị Ngà và PGS.TS Nguyễn Vinh Tiến Tất cả các thông tin, số liệu và kết quả nghiên cứu trong khoá luận đều được nêu rõ và minh bạch Trong quá trình viết bài có tham khảo một số tài liệu có nguồn gốc rõ ràng, được trích dẫn chính xác và đầy đủ theo quy định Qua đó, tôi mong muốn nghiên cứu này được công nhận và đóng góp tích cực vào sự phát triển của ngành khoa học cũng như xã hội

Tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm về lời cam đoan này

TP Hồ Chí Minh, 31 tháng 07 năm 2023

Sinh viên thực hiện

Đoàn Thị Minh Thảo

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN I LỜI CAM ĐOAN II DANH MỤC BẢNG VI DANH MỤC HÌNH VII DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT IX TÓM TẮT KHÓA LUẬN XI MỞ ĐẦU XII

TỔNG QUAN 1

1.1 Tổng quan về cây dành dành (Gardenia jasminoides Ellis) 1

1.1.1 Giới thiệu chung 1

1.3.3 Hoạt tính lưu thông khí huyết 12

1.3.4 Cải thiện độ nhạy insulin và điều trị đái tháo đường 13

1.3.5 Ảnh hưởng đến bệnh Alzheimer (AD) và Parkinson (PD) 13

1.4 Tổng quan về các phương pháp điều chế genipin 13

1.4.1 Phương pháp thủy phân 13

1.4.2 Lựa chọn enzyme thủy phân 15

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 16

2.1 Nội dung nghiên cứu 16

2.2 Đối tượng nghiên cứu 17

2.3 Hóa chất và thiết bị 17

2.4 Phương pháp điều chế geniposide thô 17

2.5 Phương pháp phân lập geniposide và điều chế genipin 17

2.6 Phương pháp xác định cấu trúc và định danh 18

2.7 Điều chế geniposide thô từ bột hạt dành dành 20

2.8 Khảo sát ảnh hưởng của pH đến quá trình chiết bằng n-butanol 21

2.9 Chiết geniposide bằng n-butanol 21

2.10 Loại bỏ sắc tố bằng than hạt hoạt tính 22

2.11 Điều chế genipin từ geniposide bằng phản ứng thủy phân với xúc tác enzyme cellulase 23

3.1 Điều chế và tinh sạch geniposide từ bột hạt dành dành 30

3.1.1 Khảo sát ảnh hưởng của pH đến quá trình chiết bằng n-butanol 30

3.1.2 Khảo sát quy trình tinh sạch geniposide 32

3.1.3 Xác định cấu trúc geniposide 34

3.2 Điều chế genipin từ geniposide 37

3.2.1 Khảo sát quy trình điều chế và tinh sạch genipin 37

3.2.2 Xác định cấu trúc genipin 39

3.3 Điều chế genipin trực tiếp từ bột hạt dành dành 42

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Các monoterpenoid được phân lập từ hạt dành dành 6

Bảng 1.2 Một số thông số cơ bản của geniposide 10

Bảng 1.3 Một số thông số cơ bản của genipin 11

Bảng 1.4 Ưu và nhược điểm của 2 phương pháp điều chế genipin 14

Bảng 2.1 Hóa chất sử dụng 18

Bảng 2.2 Thiết bị và dụng cụ sử dụng 19

Bảng 2.3 Các thông số SKC sephadex LH-20 quá trình tinh sạch genipin 25

Bảng 3.1 Dữ liệu phổ 1H NMR của geniposide so sánh với bài báo đã được công bố 35

Bảng 3.2 Dữ liệu phổ 1H NMR (DMSO-d6) so sánh giữa genipin được điều chế và genipin đã được công bố 40

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cây dành dành (Gardenia jasminoides Ellis) 3

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của (+)-(7S,8R,8’R)-lyoniresinol sinapoyl)glucopyranoside 5

9-O-β-D-(6’’-O-trans-Hình 1.3 Crocin và các dẫn xuất của nó trong hạt dành dành 5

Hình 1.4 Các iridoid được phân lập từ hạt dành dành 8

Hình 1.5 Cấu trúc hóa học của geniposide 9

Hình 1.6 Cấu trúc hóa học của genipin 10

Hình 1.7 Thủy phân geniposide thành genipin 11

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình nghiên cứu 16

Hình 2.2 Sơ đồ quy trình chiết geniposide từ bột hạt dành dành trong nước 20

Hình 2.3 Sơ đồ quy trình chiết geniposide bằng n-butanol 22

Hình 2.4 Loại bỏ sắc tố dịch chiết bằng than hoạt tính 23

Hình 2.5 Điều chế genipin từ geniposide bằng phản ứng thủy phân với xúc tác enzyme cellulase 24

Hình 2.6 Kết quả TLC geniposide với hệ dung môi giải ly được khảo sát 26

Hình 2.7 Kết quả TLC genipin với hệ dung môi được khảo sát 26

Hình 2.8 Điều chế genipin bằng phản ứng thủy phân trực tiếp từ bột nguyên liệu 27

Hình 3.1 Sơ đồ tổng quát quy trình điều chế genipin 29

Hình 3.2 Độ hấp thu của geniposide ở các giá trị pH kiềm khác nhau trong quá trình chiết bằng n-butanol 30

Hình 3.3 TLC geniposide thô trong môi trường cơ bản và môi trường pH = 11 (A) trước và (B) sau khi nhúng thuốc thử hiện vết vanilin/H2SO4 10% sau đó hơ nóng 31

Hình 3.4 TLC geniposide trong quá trình chiết bằng n-butanol 32

Hình 3.5 TLC geniposide trước và sau công đoạn loại màu bằng than hoạt tính 33

Hình 3.6 Cao geniposide phân lập từ cây dành dành 34

Hình 3.7 TLC mẫu geniposide với hệ dung môi giải ly EtOAc-IPA-H2O (8:1,5:0,5) 34

Hình 3.8 Phổ 1H NMR (DMSO-d 6) của geniposide phân lập 36

Hình 3.9 Phổ 1H NMR (CDCl3) của geniposide đã được công bố [72] 36

Hình 3.10 TLC chuyển hóa geniposide thành genipin với hệ dung môi giải ly (A)

EtOAc-IPA-H2O (8:1,5:0,5) và (B) CHCl3-EtOAc-formic acid (7:2:1) 38

Hình 3.11 TLC mẫu genipin với hệ dung môi giải ly CHCl3-EtOAc-H2O (7:2:1) 38

Hình 3.12 Cao genipin điều chế từ geniposide 39

Hình 3.13 Phổ 1H NMR (DMSO-d 6) của genipin 41

Hình 3.14 Phổ 1H NMR (DMSO-d 6) của genipin đã được công bố [73] 41

Hình 3.15 TLC chuyển hóa geniposide thành genipin với hệ dung môi giải ly EtOAc- H2O (8:1,5:0,5) 42

Ký hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt

Mũi đơn/mũi đôi/mũi đôi đôi/mũi đôi ba/mũi

ba/mũi ba đôi/mũi đa/mũi bốn

Ghi chú: Tên các hợp chất, nhóm thế, chức hoá học được viết theo nguyên bản Tiếng Anh

để đảm bảo tính thống nhất và chính xác

TÓM TẮT KHÓA LUẬN

Cây dành dành (Gardenia jasminoides Ellis) nổi tiếng không chỉ như một nguồn cung cấp

chất tạo màu tự nhiên tuyệt vời mà còn là cây thuốc quan trọng được sử dụng trong y học cổ truyền để điều trị các bệnh khác nhau, chẳng hạn như hạ hỏa, thanh nhiệt giải độc, hoạt huyết thông kinh Nó cũng đã được công bố là loại thực vật đa năng đầu tiên được sử dụng cho thực phẩm chức năng và y tế ở Trung Quốc Trong những thập kỷ gần đây, càng có nhiều nghiên cứu khoa học chủ yếu tập trung vào các thành phần hóa học, hoạt tính dược lý, cơ chế hoạt động và tính an toàn Cho đến nay, nhiều nhà nghiên cứu đã khẳng định rằng cây dành dành sở hữu nhiều hoạt tính dược lý, chẳng hạn như tác động tích cực đến hệ thống tim mạch và tiêu hóa, hoạt tính chống oxi hóa, hoạt tính chống trầm cảm, hoạt tính chống viêm và tác dụng bảo vệ hệ thần kinh,…

Sau khi thu hoạch, hạt dành dành được loại bỏ các phần bị sâu bệnh, rửa sạch, phơi và sấy khô rồi xay nhuyễn thành bột để sử dụng làm nguyên liệu cho nghiên cứu

Khóa luận tốt nghiệp này được tập trung nghiên cứu và xây dựng quy trình hiệu quả và tiết kiệm thời gian, chi phí để điều chế genipin tinh khiết từ geniposide có trong hạt dành dành bằng phản ứng thủy phân với xúc tác cellulase

Các phương pháp được sử dụng trong nghiên cứu bao gồm: phương pháp chiết (chiết nóng rắn-lỏng và chiết hai pha lỏng-lỏng), phương pháp thủy phân kết hợp sắc ký cột sephadex LH-20 và sắc kí lớp mỏng để tiến hành phân lập hợp chất tinh khiết Cấu trúc hoá học của các hợp chất đã phân lập được xác định bằng phương pháp phổcộng hưởng từ hạt nhân NMR Sử dụng các phần mềm xử lý và dự đoán phổ như MestReNova, ChemDraw đối chiếu với tài liệu tham khảo để xác định cấu trúc các chất phân lập

Kết quả quá trình nghiên cứu và khảo sát, đã phân lập geniposide và điều chế genipin tinh khiết

MỞ ĐẦU

Geniposide và genipin là hai hợp chất tự nhiên được tìm thấy trong cây dành dành

(Gardenia jasminoides Ellis) Genipin là một aglycone có nguồn gốc từ geniposide đã được

nghiên cứu và chứng minh có nhiều hoạt tính sinh học quan trọng, bao gồm kháng viêm, kháng vi khuẩn, kháng ung thư và chống oxi hóa được áp dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như dược phẩm, thực phẩm và công nghệ mỹ phẩm

Ngoài việc thể hiện nhiều tác dụng dược lý, genipin đã trở thành một hợp chất đầy hứa hẹn được sử dụng như một chất tạo liên kết ngangdo nó có khả năng phản ứng với các nhóm amine bậc một trong các vật liệu sinh học để tạo ra hợp chất dị vòng Khi lượng genipin tăng lên, mức độ liên kết ngang của vật liệu sinh học và genipin tăng lên dẫn đến giảm độ trương nở và khả năng thấm ướt, cho phép nó hình thành mạng lưới với các polymer sinh học quan trọng, ví dụ như gelatin và chitosan được áp dụng cho kỹ thuật mô và chất mang thuốc để tăng cường vận chuyển Khả năng liên kết ngang của genipin có thể so sánh với các tác nhân liên kết ngang hóa học như glutaraldehyde, nhưng có độc tính tế bào thấp và tạo thành các sản phẩm liên kết ngang ổn định và tương thích sinh học.Hơn nữa, là một tiền chất tham gia phản ứng tạo chất màu tốt trong ngành công nghiệp thực phẩm, cụ thể genipin có phản ứng với các amino acid để tạo thành sắc tố màu xanh lam ổn định nhiệt, an toàn và ăn được Do có nhiều ứng dụng khác nhau nên nhu cầu về genipin rất lớn; tuy nhiên, hàm lượng genipin trong cây dành dành khá thấp; trong khi geniposide có hàm lượng cao hơn Vì vậy, các phương pháp điều chế genipin tinh khiết từ nguồn gốc thực vật đã trở thành một hướng nghiên cứu tiềm năng và hứa hẹn trong lĩnh vực y học và công nghệ sinh học Trong đó, một quy trình điều chế hiệu quả, khả thi và thân thiện với môi trường hơn đã được đề ra thông qua các phương pháp như chiết và sử dụng công nghệ sinh học Dựa trên các nghiên cứu đã công bố trong và ngoài nước, với tinh thần ham học hỏi tôi đã chọn đề tài “Điều chế genipin từ geniposide trong hạt dành dành bằng phản ứng thủy phân với xúc tác enzyme cellulase”, nhằm mục đích khảo sát phương pháp điều chế genipin tinh khiết và cung cấp thông tin cho các nghiên cứu về phân lập hợp chất thiên nhiên từ cây dành dành Từ đó nâng cao giá trị của cây dành dành trong việc nghiên cứu và ứng dụng các hoạt tính sinh học của các hợp chất này, giúp cải thiện sức khỏe con người

TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về cây dành dành (Gardenia jasminoides Ellis)

1.1.1 Giới thiệu chung

Cây dành dành (Gardenia jasminoides Ellis), thường được gọi là cây Chi tử, là một loại

cây bụi thường xanh thuộc họ Rubiaceae có nguồn gốc từ một số vùng thuộc Đông Nam Á như Việt Nam, Đài Loan, Nhật Bản, Myanmar và Ấn Độ và được trồng nhiều ở Trung Quốc Nó mọc ở nhiều vùng ôn đới và cận nhiệt đới [1] [2] Quả khô của cây được liệt kê là nguyên liệu thô trong Dược điển Trung Quốc và Nhật Bản, phổ biến với tên gọi là “Zhizi” ở Trung Quốc, “Sanshishi” ở Nhật Bản và “Cape Jasmine” ở Hàn Quốc [3]

Các bộ phận của cây dành dành (Gardenia jasminoides Ellis) có thể được sử dụng là hạt,

lá, hoa và rễ Lá chứa saponin, flavonoid, polyphenol và tinh dầu Hạt có chứa iridoid glycoside và crocin Ở Trung Quốc, những bông hoa được sử dụng như một chất tăng hương vị trong lá trà Hạt có thể ăn được và có thể được sử dụng làm chất tạo màu vàng tự nhiên trong thực phẩm như nghệ [4] Hợp chất crocetin chứa trong hạt theo truyền thống được sử dụng làm gia vị, màu thực phẩm và thuốc thảo dược [5]

Hạt của loại cây này còn có nhiều hoạt tính sinh học khác nhau Theo truyền thống, hạt dành dành được sử dụng trong công thức y học dân gian để điều trị các bệnh khác nhau, chẳng hạn như trị đái tháo đường, chống viêm, thanh nhiệt giải độc, máu huyết tiêu ứ, hoạt huyết thông kinh, trị đái tháo đường, chống viêm, chống trầm cảm, đặc tính chống oxy hóa và cải thiện chất lượng giấc ngủ [2] Nó cũng đã được tuyên bố là thực vật đa năng đầu tiên được sử dụng cho chức năng thực phẩm và y tế ở Trung Quốc [1], [3]

Thành phần hóa học trong cây dành dành phát huy một số hoạt tính sinh học nhất định cả

in vitro và in vivo Trong số đó, iridoid glycoside và sắc tố màu vàng thường được coi là

thành phần hoạt tính sinh học chính và đặc trưng Nghiên cứu gần đây cho thấy chiết xuất từ cây dành dành có hoạt tính chống trầm cảm [6] và các đặc tính dược lý khác nhau Hơn nữa, geniposide và genipin là những hợp chất iridoid quan trọng nhất được phân lập từ cây dành dành Là hoạt chất chiếm ưu thế với hoạt tính dược lý, genipin cũng là một tác nhân

liên kết ngang sinh học nổi bật Sắc tố màu vàng cũng đã được sử dụng rộng rãi như một loại thuốc nhuộm tự nhiên Do đó, cây dành dành đã được áp dụng cho nhiều lĩnh vực khác nhau, bao gồm công nghiệp thực phẩm, công nghiệp dệt may và công nghiệp hóa chất, bên cạnh việc sử dụng thuốc chủ yếu [3]

1.1.2 Đặc điểm thực vật cây dành dành

Cây dành dành (Gardenia jasminoides Ellis) là một loại cây thân thảo hàng năm thân thẳng

có nhiều nhánh, những bông hoa lớn và lá dày Thân cây có thể đạt chiều cao khoảng 1-2 mét với rễ cọc [7], [8] Lá hình bầu dục, dày, nhẵn bóng ở mặt trên Hoa đơn tính, cuống ngắn, màu trắng, mọc ra từ đầu cành, to tương tự như hoa hồng trắng có tán hình tròn và xếp thành một bông đơn độc, có mùi thơm Lá cây tươi tốt quanh năm, thường mọc đối nhau hoặc mọc thành vòng 3 lá Mùa hoa từ tháng 3 đến tháng 5, mùa quả tháng 8 đến tháng 10 Hình dạng của hạt hình bầu dục, vỏ mỏng, có màu vàng đỏ khi chín muộn vào cuối thu, thịt quả màu vàng cam, hạt nhiều, dẹt, chứa sắc tố màu vàng và có nhiều hạt Hạt dành dành khô dùng làm thuốc [4].Hình ảnh cây dành dành được trình bày ở Hình 1.1

1.2 Thành phần hóa học

1.2.1 Các thành phần dễ bay hơi

Các hợp chất dễ bay hơi chính trong cây dành dành là acid béo, ketone, adehyde, ester, rượu và các dẫn xuất thơm [6], [9] Do nhiệt độ và thời gian thực hiện khác nhau, tinh dầu từ hạt dành dành chứa các hợp chất dễ bay hơi với hàm lượng và tỷ lệ khác nhau Ngoài ra, còn có các thành phần không ổn định như trường hợp iridoid có thể chuyển hóa một phần thành các thành phần dễ bay hơi trong quá trình xử lý ở nhiệt độ cao [6]

Sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) là kỹ thuật chính được sử dụng để xác định các thành phần dễ bay hơi từ cây dành dành [6], [10] Nghiên cứu chỉ ra rằng tinh dầu từ hạt dành dành được chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn CO2, trong đó 16 thành phần chính của chiết xuất đã được phân tích bởi GC-MS Myristic acid (15,3%) có hàm lượng tương đối cao nhất, trong khi thấp nhất là caproic acid (0,24%) [11] Trong những năm gần đây, với các kỹ thuật khai thác hiện đại có sẵn, nhiều nghiên cứu về việc khai thác cây dành dành để tìm ra phương pháp chiết tối ưu

Hình 1.1 Cây dành dành (Gardenia jasminoides Ellis)

(Nguồn: Sưu tầm)

1.2.2 Crocin và các dẫn xuất

Crocin là một nhóm các sản phẩm tự nhiên có nguồn gốc từ carotenoid xuất hiện trong hạt dành dành và nghệ tây từ lâu đã được sử dụng như một loại thuốc thảo dược truyền thống

và chất tạo màu tự nhiên [12], [13] Crocin và các dẫn xuất của nó trong hạt dành dành [14]

được đề cập trong Hình 1.3

Nghệ tây là nguồn crocin tự nhiên chính (crocetin ester), là các dẫn xuất carotene hòa tan trong nước cấu thành với hàm lượng chung nằm trong khoảng 16–28% trong nhụy hoa khô [15] Vì sự hiếm có và giá nghệ tây cao, việc tìm kiếm các nguồn thay thế, tức là phụ phẩm nông nghiệp có giá trị tiềm năng cực kỳ cao.Trong số tất cả các dẫn xuất của crocetin, crocin là hợp chất chính đại diện cho màu của hạt dành dành [16] Là một sắc tố màu, độc tính của crocin thấp không thể phát hiện được, thân thiện với môi trường và ổn định về mặt hóa học so với nhiều sắc tố thực phẩm tự nhiên khác [17] Nó có vai trò như một chất chống oxy hóa, màu thực phẩm và chất chuyển hóa thực vật Nghiên cứu cho thấy ethanol (EtOH) được chọn làm dung môi vì tính an toàn trong tiêu dùng của con người và ít gây hại đến môi trường [18] Hạt dành dành được chiết bằng phương pháp chiết đồng nhất trong dung dịch nước EtOH 50o với tỷ lệ nguyên liệu và dung môi là (1:15), kích thước hạt nguyên liệu là 1,7mm, thời gian chiết xuất là 41 giây [19] Hiệu suất chiết của sắc tố màu vàng lớn hơn 50% khi sử dụng hệ thống chiết có sự hỗ trợ của vi sóng so với khi sử dụng phương pháp chiết tiêu chuẩn [20] Nồng độ EtOH 50o trong nước có lợi cho việc tăng năng suất chiết, điều này được cho là do thành phần đường phân cực và nhiều nhóm OH tạo liên kết hydro với nước tốt nên dung môi EtOH cần bổ sung nước để dễ tan crocin vì vậy nồng độ EtOH quá cao không có lợi cho việc chiết crocin

1.2.3 Hợp chất phenolic

Một số phenolic acid đã được xác định trong hạt dành dành, chẳng hạn như caffeoyl-4-O-(3-hydroxy-3-methyl)gluta-roylquinic acid; 3,5-di-O-caffeoylquinic acid; 4-

3,5-di-O-O-sinapoyl-5-O-caffeoyl-quinic acid [21] và chlorogenic acid [22] và một lignin glucoside

mới, (+)-(7S,8R,8’R)-lyoniresinol 9-O-β-D-(6’’-O-trans-sinapoyl)glucopyranoside được

đề cập ở Hình 1.2 Các hợp chất phenolic được sử dụng để điều trị các bệnh viêm nhiễm

và đau [23] Phương pháp bề mặt đáp ứng được sử dụng để tối ưu hóa các thông số chiết hợp chất phenolic từ hạt dành dành Ảnh hưởng của ba biến số độc lập, cụ thể là nồng độ EtOH (°), nhiệt độ (°C) và thời gian (phút) đến hàm lượng phenolic tổng Kết quả nghiên cứu cho

thấy điều kiện tối ưu được xác định là ở nồng độ EtOH 51,8 o, nhiệt độ 72,9 °C và thời gian 34,6 phút với hiệu suất tối đa của tổng hợp hàm lượng phenolic tổng là 24,86 mg/g bột khô [24]

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của (+)-(7S,8R,8’R)-lyoniresinol 9-O-β-D

-(6’’-O-trans-sinapoyl)glucopyranoside

Hình 1.3 Crocin và các dẫn xuất của nó trong hạt dành dành

Bảng 1.1: Các monoterpenoid được phân lập từ hạt dành dành STT Monoterpenoid TLTK STT Monoterpenoid TLTK

1.2.4.1 Iridoid và iridoid glycoside

Iridoid và iridoid glycoside là thành phần thực vật đặc trưng của hạt dành dành với hàm lượng cao Các iridoid và iridiod glycoside bao gồm genipin, geniposide và gardenoside,

10-acetylgeniposide, genipin-1-O-gentiobioside, geniposidic acid, gardoside và

shanzhiside [21] Chúng có nhiều đặc tính dược lý và tác dụng tăng cường sức khỏe, bao gồm chống trầm cảm [31], trị đái tháo đường [32], cũng như tiềm năng bảo vệ chống lại tổn thương gan apoptosis do lipopolysaccharide (LPS) gây ra [33]

Một nghiên cứu đã định lượng hàm lượng geniposide, gardenoside, geniposidic acid và chlorogenic acid lần lượt là 56,37±26,24 𝜇g/mg, 49,57±18,78 𝜇g/mg, 3,15±3,27 𝜇g/mg và 0,69±0,39 𝜇g/mg được đo trong 68 mẫu hạt dành dành từ các vùng khác nhau ở Trung Quốc và Hàn Quốc [34] Trong hạt dành dành, geniposide là hợp chất iridoid chiếm hàm lượng cao nhất Các nhóm thế khác nhau trên khung vòng tạo ra một số dẫn xuất iridoid Dựa trên các kỹ thuật hiện đại, tổng cộng hơn hơn 30 hợp chất chứa iridoid được phân lập từ hạt

dành dành [35], [36], [37] được đề cập trong Hình 1.4, bao gồm geniposide, genipin và

hydroxygenipin, nhiều dẫn xuất geniposide và hydroxygeniposide, gardoside, gardenoside,

shanzhisideg G, dẫn xuất methyl ester của nó và gardenal

Hầu hết các phương pháp chiết dung môi đều yêu cầu gia nhiệt Các thông số chiết dung môi tối ưu của hạt dành dành là 51,3% hỗn hợp EtOH/nước với nhiệt độ chiết là 70,4 oC trong 28,6 phút Trong điều kiện này, sản lượng geniposide và phenolic tổng lần lượt là

Hình 1.4 Các iridoid được phân lập từ hạt dành dành

10,9% và 2,5% [37] Nhiều kỹ thuật chiết xuất tiên tiến đã được giới thiệu trong những năm gần đây bao gồm chiết có sự hỗ trợ của siêu âm và vi sóng Khai thác siêu âm được thực hiện bằng cách khai thác dung môi hỗ trợ siêu âm và với kỹ thuật này, điều kiện tối ưu để thu được sản lượng geniposide là tỷ lệ rắn:lỏng 1:30 ở nhiệt độ 70oC trong 30 phút, hiệu suất geniposide là 4,1% [12]

1.2.4.2 Geniposide

Geniposide, một iridoid glucoside, là một trong những thành phần hoạt tính sinh học chính

trong quả chín khô của cây dành dành [38], chiếm tỉ lệ tối đa lên đến 5,6% trong hạt dành dành [39] Cấu trúc của geniposide được phát hiện vào những năm 1960, được đề cập ở

Hình 1.5

Hình 1.5 Cấu trúc hóa học của geniposide

Geniposide, không màu, phản ứng với các amino acid (glycine, lysine, phenylalanine) để cung cấp sắc tố màu xanh, ổn định nhiệt, ánh sáng và pH Một số thông số cơ bản của

geniposide được đề cập ở Bảng 1.2

Chiết xuất geniposide ban đầu từ hạt cây dành dành khô nghiền thành bột bằng CHCl3 và MeOH Sau đó, sử dụng phương pháp sắc ký cột và kết tinh lại trong acetone, thu được geniposide tinh khiết [40] Nhiều cải tiến về việc phân lập geniposide từ hạt dành như phương pháp gạn trong nước, được sử dụng ở Trung Quốc để thu hồi geniposide, tránh sử dụng các dung môi hữu cơ [41]

Để xác định và định danh rõ cấu trúc, geniposide được phân tích bằng HPLC, UV-Vis, NMR và xác định điểm nóng chảy để làm sáng tỏ cấu trúc Điểm nóng chảy nó là 163,5 - 164,3 °C, max= 239 nm [42]

Bảng 1.2 Một số thông số cơ bản của geniposide

nước, MeOH và EtOH

1.2.4.3 Genipin

Genipin là một aglycone có nguồn gốc từ geniposide, một iridoid glycoside chiếm tỉ lệ rất nhỏ, 0,17% trong hạt dành dành [39] Vào đầu những năm 1960, Djerassi và đồng nghiệp đã xác định cấu trúc của sản phẩm tự nhiên này và đặt tên là “genipin”.[43]

Hình 1.6 Cấu trúc hóa học của genipin

Mặc dù bản thân genipin không màu, nhưng nó có màu xanh lam do phản ứng với các amino acid bậc 1 và các chất thủy phân protein Vì vậy, genipin được coi là tiền chất tạo màu xanh tự nhiên thích hợp cho các sản phẩm thực phẩm Cấu trúc hóa học và một số

thông số cơ bản của genipin được đề cập trong Hình 1.6 và Bảng 1.3

Bảng 1.3 Một số thông số cơ bản của genipin

môi hữu cơ như ethyl actetate (EtOAc) Hầu hết các nghiên cứu trước đây được công bố đều bao gồm các bước điều chế và tinh chế dẫn đến tăng độ tinh khiết của sản phẩm mong muốn Khi geniposide được phân lập, tiến

hành quá trình thủy phân geniposide để thu được genipin, enzyme được sử dụng là

β-glucosidase hoặc cellulase Trong phản ứng này (Hình 1.7), gốc đường của geniposide

được giải phóng, tạo thành genipin [44] Các bước tinh chế genipin có tầm quan trọng rất lớn vì chúng ảnh hưởng tới chất lượng và giá thành của sản phẩm cuối cùng

Hình 1.7 Thủy phân geniposide thành genipin

Ngoài ra, enzyme cellulase có khả năng phá vỡ thành vách tế bào thực vật đã được báo cáo bởiWinotapun và các cộng sự [40] sử dụng để tăng cường giải phóng glucoside và chuyển đổi geniposide thành genipin Đây được cho là một bước tiềm năng để điều chế trực tiếp genipin từ nguồn nguyên liệu thô ban đầu

Cấu trúc của genipin đã được làm rõ qua NMR, MS và đánh giá độ tinh khiết bằng HPLC [45]

1.3 Hoạt tính sinh học

Dữ liệu mới liên quan đến hoạt tính sinh học cho thấy genipin có hoạt tính chống viêm [46], chống ung thư [47], chống huyết khối [48], kháng khuẩn [49], chữa viêm dạ dày [50], chữa bệnh tiểu đường [51], ức chế độc tính thần kinh [52], và tác dụng giống thuốc chống trầm

cảm [53] và bảo vệ thần kinh Quan trọng nhất, các nghiên cứu in vitro và in vivo chỉ ra

rằng nó không gây độc cho các tế bào bình thường Do đó, genipin hứa hẹn là một tác nhân chống ung thư hiệu quả và là một loại tác nhân có khả năng tạo liên kết ngang mạnh có thể được sử dụng để phát triển các loại thuốc mới và hiệu quả [54]

1.3.1 Hoạt tính chống viêm

Genipin làm giảm các phản ứng viêm cấp tính trong nhiều mô hình động vật bị viêm Một nghiên cứu cho thấy genipin ức chế phản ứng viêm cấp tính trong phù chân chuột do

carrageenan gây ra và mô hình phù nề tai chuột do dầu croton [55]

Cả genipin và geniposide đều có hoạt tính chống viêm Tuy nhiên, genipin có hoạt tính chống viêm mạnh hơn geniposide [55]

1.3.3 Hoạt tính lưu thông khí huyết

Một nghiên cứu cho thấy geniposide và genipin đã kéo dài đáng kể thời gian cần thiết để làm tắc huyết khối gây ra bởi phản ứng quang hóa trong động mạch đùi của chuột Cả 2

đều có tác dụng chống huyết khối in vivo [32]

Tuy nhiên hoạt tính lưu thông khí huyết của genipin mạnh hơn geniposide vì geniposide chuyển hóa thành genipin trong cơ thể nên genipin góp phần chủ yếu vào hiệu quả chống huyết khối [57]

1.3.4 Cải thiện độ nhạy insulin và điều trị đái tháo đường

Kháng insulin dẫn đến bệnh tiểu đường loại 2 Do đó, cải thiện độ nhạy insulin được coi là một chiến lược khả thi và có giá trị để điều trị bệnh đái tháo đường loại 2 [58] Là một phân tử đơn lẻ, genipin được báo cáo là cải thiện tình trạng kháng insulin liên quan đến tuổi tác thông qua việc giảm tình trạng oxy hóa ở gan và rối loạn chức năng ty thể và suy giảm tín hiệu insulin [59]

1.3.5 Ảnh hưởng đến bệnh Alzheimer (AD) và Parkinson (PD)

Các bệnh thoái hóa thần kinh trung ương, chẳng hạn như bệnh AD và PD, là một trong những vấn đề sức khỏe lớn nhất trên toàn thế giới Hiện tại, không có cách chữa trị cho những bệnh này Các nghiên cứu dược động học cho thấy genipin là một trong những thành phần hiệu quả chính của cây dành dành sở hữu một loạt các đặc tính dược lý quan trọng, chẳng hạn như tác dụng chống viêm, bảo vệ thần kinh, kích thích thần kinh, trị đái tháo đường và chống trầm cảm Do đó, genipin cho thấy tiềm năng điều trị các bệnh thoái hóa thần kinh trung ương [60]

1.4 Tổng quan về các phương pháp điều chế genipin

1.4.1 Phương pháp thủy phân

Mặc dù có nhiều phương pháp khác nhau để phân lập genipin từ hạt dành dành, nhưng do hàm lượng genipin trong hạt dành dành rất thấp và phân lập quy mô lớn nên genipin được điều chế chủ yếu bằng phương pháp vi sinh, thủy phân geniposide thành aglycone genipin bởi enzyme [61], [62] Có hai phương pháp chủ yếu để điều chế genipin là thủy phân trực tiếp bằng enzyme [63] và chuyển hóa vi sinh vật [64]

Phương pháp thủy phân trực tiếp bằng enzyme: Đây là phương pháp sử dụng enzyme để thủy phân một chất đầu (thường là geniposide) thành sản phẩm cuối (genipin) trong môi

trường nước Enzyme được sử dụng thường là β-glucosidase hoặc cellulase và quá trình

này không yêu cầu vi sinh vật và có thể xảy ra trong môi trường hoá học thuần túy tùy thuộc vào hệ sử dụng

Chuyển hóa vi sinh vật: Phương pháp này sử dụng các vi sinh vật như vi khuẩn hoặc nấm có khả năng chuyển hóa geniposide thành genipin Các vi sinh vật này sản xuất các enzyme

(như β-glucosidase) có thể thủy phân geniposide thành genipin Quá trình chuyển hóa diễn

ra thông qua các phản ứng sinh hóa trong vi sinh vật

Từ những ưu và nhược điểm của 2 phương pháp trên (Bảng 1.4), phương pháp chuyển hóa

vi sinh vật có chi phí thấp hơn, dễ sản xuất hàng loạt hơn so với phương pháp thủy phân trực tiếp bằng enzyme nhưng năng suất thấp hơn do phản ứng giữa genipin và các amino acid trong dịch lên men [65] Kết luận, phương pháp được sử dụng trong nghiên cứu này để điều chế genipin là thủy phân trực tiếp bằng enzyme

Bảng 1.4 Ưu và nhược điểm của 2 phương pháp điều chế genipin

Ưu điểm Nhược điểm Phương pháp thủy

Chuyển hóa vi sinh vật

Chi phí thấp và cótiềm năng hoạt động trên quy mô công

nghiệp

-Năng suất thấp -Phụ thuộc vào khả năng và sự ổn định của vi sinh vật được sử dụng Vì vậy, cần đảm bảo điều kiện tối ưu cho vi sinh vật để hoạt động một cách hiệu quả

Hiện nay, phương pháp này bắt đầu từ quá trình chiết geniposide từ cây dành dành bằng dung môi hữu cơ Sau một loạt các quy trình tinh chế, geniposide tinh khiết sẽ được thủy

phân bởi enzyme thành genipin [38], [66] Tuy nhiên, trong các phương pháp này, geniposide hoặc enzyme tinh khiết cần phải được tinh chế hoặc mua, vì vậy từ những nghiên cứu trước đây phương pháp dựa trên quy trình không liên tục trong đó quá trình chiết và tinh chế geniposide tách biệt với quá trình thủy phân geniposide thành genipin [67]

1.4.2 Lựa chọn enzyme thủy phân

Hầu hết các nghiên cứu trong điều chế genipin đã sử dụng cellulase, pectinase,

β-glucosidase để thủy phân và phá vỡ các thành phần của thành vách tế bào thực vật (cellulose, pectinase, pectin) để giải phóng các hoạt chất ra ngoài [67]

Cấu trúc geniposide có nhóm β-glucose, khi thuỷ phân cắt gốc này đi sẽ tạo được genipin nên có thể dùng β-glucosidase để thực hiện phản ứng thủy phân Cellulase là một hệ thống

enzyme đa thành phần bao gồm exoglucanase, endoglucanase và β-glucosidase Exoglucanase thủy phân cellulose tinh thể để giải phóng cellobiose; endoglucanase tấn

công cellulose vô định hình và một số oligomer chuỗi ngắn và β-glucosidase thủy phân cellobiose thành glucose Do đó, cellulase đóng vai trò kép là thủy phân β-glucose và phá

vỡ thành vách tế bào của geniposide [68]

Cả β-glucosidase và cellulase đều là ứng cử viên sáng giá trong việc hỗ trợ điều chế genipin; tuy nhiên, cellulase rẻ hơn β-glucosidase [69] và nó xúc tác hiệu quả việc loại bỏ gốc đường

khỏi geniposide với hiệu suất trên 90% trong các thí nghiệm sơ bộ [40] Từ đó đưa ra kết luận, enzyme cellulase được chọn để điều chế genipin trong đề tài nghiên

cứu này Thủy phân geniposide thành genipin [40] được đề cập ở Hình 1.7

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 2.1 Nội dung nghiên cứu

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình nghiên cứu

Quy trình nghiên cứu (hình 2.1) chia làm 5 giai đoạn:

➢ Giai đoạn 1: Tìm hiểu tổng quan

Tìm hiểu tổng quan về cây dành dành (Gardenia jasminoides Ellis), thành phần hóa học,

hoạt tính sinh học và các phương pháp phân lập hợp chất thiên nhiên, định danh cấu trúc ➢ Giai đoạn 2: Điều chế geniposide thô

Sử dụng phương pháp chiết nóng rắn – lỏng với dung môi nước Loại bớt dung môi thu hồi dịch chiết geniposide chuẩn bị cho giai đoạn tinh chế

➢ Giai đoạn 3: Tinh sạch geniposide

Dịch chiết geniposide thu được ở giai đoạn 2 được xử lý bằng sodium carbonate và được

chiết xuất bằng hệ 2 pha lỏng – lỏng (n-butanol : nước) nhiều lần Sau đó tiến hành loại

màu và loại dung môi thu được cao geniposide ➢ Giai đoạn 4: Điều chế genipin

Geniposide tinh sạch được sử dụng làm nguyên liệu thô và thực hiện phản ứng thủy phân với xúc tác cellulase có sự hỗ trợ của dung dịch đệm acid citric – NaOH Dịch thủy phân sau đó được chiết xuất bằng EtOAc và loại dung môi thu được genipin

➢ Giai đoạn 5: Tinh sạch genipin

Sử dụng phương pháp SKC gel sephadex LH-20 để tinh sạch genipin