ngô quốc đạt tổng hợp và thử hoạt tính sinh học của một số acid hydroxamic mới mang dị vòng triazol và quinazolin 43h on

Thử hoạt tính sinh học của các dẫn chất tổng hợp được .... Đặc điểm chung trong cấu trúc hóa học của các chất này đều là dẫn chất của acid hydroxamic, từ đó có thể thấy được tiềm năng củ

HISTON DEACETYLASE

Giới thiệu về histon deacetylase

Histon acetyltransferase (HAT) và histon deacetylase (HDAC) là hai nhóm enym giữ cân bằng cho mức độ acetyl hóa – deacetyl hóa của histon [38] HAT xúc tác cho quá trình acetyl hóa nhóm ε–NH3 + của lysin ở đuôi histon làm trung hòa điện tích dương Khi đó ái lực của đầu N ở đuôi histon với nhóm phosphat tích điện âm của ADN bị giảm đáng kể làm cho nhiễm sắc thể tháo xoắn và quá trình phiên mã được diễn ra Ngược lại, HDAC xúc tác cho quá trình deacetyl hóa lysin, làm cho đầu N ở đuôi histon tích điện dương, nhiễm sắc thể đóng xoắn và gây ức chế quá trình phiên mã [29]

Hình 1.1 Quá trình acetyl hóa và deacetyl histon xúc tác bởi HAT và HDAC

Khi có bất thường enzym HAT hoặc HDAC hoạt động quá mức, làm giảm quá trình acetyl hóa histon sẽ gây ra những bất thường trong quá trình phiên mã dẫn tới những thay đổi trong điều hòa biểu hiện gen, đặc biệt là các gen quan trọng có chức năng trong hoạt động sống của tế bào như tăng sinh tế bào, điều hòa chu trình tế bào và apoptosis [38] Ngoài ra, HAT và HDAC còn tham gia vào quá trình acetyl hóa không chỉ các protein nhiễm sắc thể mà còn có các protein không chứa histon bao gồm các protein ức chế khối u (p53, RUNX3), các chất trung gian truyền tín hiệu (STAT3, β- catenin) Cụ thể p53 – gen ức chế khối u, khi acetyl hóa gây ra hiện tượng apoptosis của tế bào và quá trình tự thực để loại bỏ các tế bào bất thường Do vậy, khi có những bất thường làm giảm quá trình acetyl hóa, nó sẽ ảnh hưởng đến chức năng hoạt động của p53, gây ức chế p53, góp phần sự hình thành và phát triển tế bào ung thư [29].

Phân loại

Cho đến nay các nhà khoa học đã tìm thấy 18 loại enzym HDAC ở người và chia thành 4 nhóm dựa trên tính tương đồng của chúng với protein nấm men [12, 17, 24, 39]:

 Nhóm I có sự tương đồng với protein Rpd3 của nấm men, bao gồm các HDAC1, HDAC2, HDAC3 và HDAC8 Vị trí phân bố chủ yếu được tìm thấy ở nhân tế bào

 Nhóm II có sự tương đồng với protein Hda1 của nấm men, gồm hai phân nhóm:

 Phân nhóm IIa: bao gồm HDAC4, HDAC5, HDAC7, HDAC9 được tìm thấy ở nhân tế bào và tế bào chất

 Phân nhóm IIb: bao gồm HDAC6, HDAC10 được tìm thấy ở tế bào chất

 Nhóm III có sự tương đồng với protein Sir2 của nấm men còn dược gọi là sirtuin, bao gồm các sirtuin 1-7 (SIRT1-7) được tìm thấy ở cả nhân tế bào, bào tương và ty thể

 Nhóm IV chỉ có một loại duy nhất là HDAC11 Vị trí phân bố chủ yếu được tìm thấy ở nhân tế bào

Trong đó HDAC nhóm I, II, IV được gọi là các HDAC cổ điển, hoạt động phụ thuộc vào coenzym Zn 2+ Còn HDAC nhóm III hay còn gọi là các sirtuin hoạt động phụ thuộc vào NAD + , các sirtuin này có coenzym khác với các HDAC cổ điển, không nhạy cảm với sự ức chế của các HDACi [18] Do vậy đề tài tập trung thảo luận về các HDAC hoạt động phụ thuộc vào Zn 2+

Bảng 1.1 Phân loại các enzym HDAC

Họ Nhóm Protein ở nấm men

Protein ở người Vị trí phân bố

HDAC hoạt động phụ thuộc Zn 2+

Nhân tế bào/ tế bào chất

IV HDAC11 Nhân tế bào

III Sir2 SIRT1-7 Nhân tế bào/

Cấu trúc trung tâm hoạt động của HDAC

Cấu trúc trung tâm hoạt động của HDAC được xác định bằng phương pháp kết tinh tạo tinh thể và chụp tia X [40] Nhìn chung, các HDAC đều có cấu trúc trung tâm hoạt động tương tự nhau, bao gồm 2 phần chính là kênh enzym và túi chứa ion Zn 2+ :

Hình 1.2 Sơ đồ biểu diễn liên kết phối tử tại trung tâm hoạt động của HDAC8 với sự mặt của chất ức chế SAHA [1, 43]

Kênh enzym HDAC có cấu trúc hẹp, hình ống do các acid amin thân dầu tạo thành Cấu trúc này linh hoạt, phù hợp với nhiều cơ chất nhưng gây khó khăn cho quá trình phát triển thuốc ức chế chọn lọc Việc xác định các chất ức chế có hiệu quả cao cần dựa trên dữ liệu về cấu trúc và tính linh hoạt riêng biệt của từng loại HDAC khác nhau.

 Túi chứa coenzym Zn 2+ : nằm ở đáy kênh enzym, phần trung tâm của vùng này là ion Zn 2+ tạo ba liên kết phối trí bao gồm liên kết với hai nguyên tử oxy của nhóm carboxylat của Asp178 và Asp267 và nguyên tử nitơ của His180 Trong phản ứng deacetyl hóa, ion Zn 2+ sẽ có thêm hai liên kết phối trí nữa với nguyên tử oxy của nhóm carbonyl của acetyl lysin và với một phân tử nước Khi có mặt của các chất ức chế HDAC, hai liên kết trên của ion Zn 2+ sẽ lần lượt được thay thế bởi hai nguyên tử oxy của nhóm carbonyl và nhóm hydroxyl của nhóm chức acid hydroxamic [40]

1.1.3.1 Cơ chế xúc tác của HDAC

Năm 2008, Dowling và cộng sự đã đưa ra đề xuất và cơ chế xúc tác như sau Đầu tiên, His143 hoạt động như một base, khử proton của phân tử nước liên kết với Zn 2+ tạo ra ion OH  đóng vai trò tác nhân ái nhân tiếp tục tấn công vào nhóm carbonyl của N- acetyl-lysin, làm tăng tính ái nhân nguyên tử oxy nhóm carbonyl Sau đó, một hợp chất trung gian carbon tứ diện được hình thành và ổn định nhờ liên kết phối trí với ion Zn 2+ kết hợp cùng liên kết hydro với Tyr306, His143, His142 Cuối cùng, His143 chuyển một proton vào nguyên tử nitơ của lysin tạo thành chức amin của sản phẩm [14, 16]

Hình 1.3 Cơ chế xúc tác của HDAC8

CÁC CHẤT ỨC CHẾ HISTON DEACETYLASE

Giới thiệu về các chất ức chế histon deacetylase

Như đã trình bày ở trên, HDAC tham giá quá trình deacetyl hóa histon và có liên quan tới sự hình thành và phát triển khối u Các thuốc ức chế HDAC ra đời nhằm tăng khả năng acetyl hóa histon, thúc đẩy quá trình phiên mã các gen ức chế khối u Hiện nay, nhiều chất ức chế HDAC (HDACi) đang được phát triển và nghiên cứu trên thế giới và cả trong nước, trong số đó có một số thuốc đã được FDA phê duyệt để điều trị các bệnh ung thư khác nhau [7] Đây là các chất có tác dụng tại đích điều trị ung thư hiệu quả.

Phân loại

Các HDACi có nhiều cách phân loại, về cơ bản thì có ba cách: dựa trên cấu trúc hóa học, nguồn gốc và tính chọn lọc với từng loại HDAC:

 Phân loại dựa trên cấu trúc hóa học [32]

Các chất ức chế Histone deacetylase (HDACi) được phân loại thành bốn nhóm chính, trong đó nhóm dẫn xuất acid hydroxamic được nghiên cứu rộng rãi và thành công nhất về mặt lâm sàng Bốn trong số năm loại thuốc được FDA chấp thuận: vorinostat, belinostat, panobinostat và givinostat đều có cấu trúc của acid hydroxamic Do đó, bài viết này chủ yếu đề cập đến các HDACi có cấu trúc acid hydroxamic.

Hình 1.4 Phân loại các HDAC theo cấu trúc

 Phân loại dựa trên nguồn gốc [33]:

 Các HDACi có nguồn gốc tự nhiên: depsipeptid (FK-228), apicidin, trichostatin A (TSA), natri butyrat…

 Các HDACi có nguồn gốc tổng hợp: vorinostat, belinostat, panobinostat…

 Phân loại dựa trên tính chọn lọc với từng loại HDAC [30]

 Các HDACi không chọn lọc: vorinostat, belinostat, panobinostat là ba thuốc đều không có tính chọn lọc

 Các HDACi chọn lọc: romidepsin là thuốc duy nhất hiện nay được FDA phê duyệt có tính chọc lọc trên HDAC nhóm I Bên cạnh đó, đặc tính chọn lọc của các HDACi có thể thấy được ở bảng 1.2

Bảng 1.2 Pha thử nghiệm lâm sàng của một số chất ức chế HDAC [30]

Phân loại HDACi Tính chọn lọc Thử nghiệm lâm sàng

Vorinostat (nhóm I, II và IV) được FDA chấp thuận vào năm 2006 Belinostat (nhóm I, II và IV) được FDA chấp thuận vào năm 2014 Panobinostat (nhóm I, II và IV) được FDA chấp thuận vào năm 2015 Givinostat (nhóm I, II) được FDA chấp thuận vào năm 2024 Resminostat (nhóm I, II) vẫn đang trong giai đoạn thử nghiệm lâm sàng giai đoạn II.

Pracinostat Nhóm I, II và IV Thử nghiệm pha II Abexinostat Nhóm I, II Thử nghiệm pha I

Entinostat Nhóm I Thử nghiệm pha I và II Mocetinostat Nhóm I và IV Thử nghiệm pha I và II Tacedinalin Nhóm I Thử nghiệm pha II và III

Peptid vòng Romidepsin Nhóm I FDA phê duyệt năm 2009 và 2011

Acid valproic Nhóm I, II Thử nghiệm pha I và II Phenylbutyrat Nhóm I, II Thử nghiệm pha I và II

Cấu trúc chung của các chất ức chế histon deacetylase

Dựa trên mô hình pharmacophore (cấu trúc mang dược tính) đầu tiên, các chất HDACi có cấu trúc chung gồm 3 phần: vùng nhận diện bề mặt (capping group – CAP), vùng cầu nối (linker) và vùng gắn kẽm (zinc-binding group – ZBG) [5]

 Vùng CAP có vai trò tương tác với các acid amin trên bề mặt kênh enzym, giúp các chất ức chế HDAC nhận diện bề mặt Trình tự acid amin trên bề mặt kênh enzym của các HDAC khác nhau có tính đa dạng hơn các vùng khác Đây chính là đặc điểm giúp phân biệt các HDAC với nhau và đồng thời cũng giúp các nhà nghiên cứu phát triển các chất HDACi chọn lọc [18] Cụ thể:

 Vùng linker có vai trò kết nối vùng ZBG với phần còn lại của khung pharmacophore, có vai trò trong tương tác với kênh enzym kỵ nước hình ống được hình thành bởi hai acid amin Phe152 và Phe208 Vùng linker thường là nhóm vinyl, aryl hoặc chuỗi nguyên tử carbon, tối ưu nhất thường là 6 carbon [18]

 Vùng ZBG có vai trò tương tác với coenzym Zn 2+ ở dưới đáy của kênh enzym Bên cạnh đó, cấu trúc hóa học của vùng này cũng là tiêu chí để phân loại các HDACi khác nhau: acid hydroxamic, thiol, acid carboxylic…[18]

Ngoài ra, có thể có thêm nhóm liên kết CU theo mô hình pharmacophore mở rộng Nhóm CU là nhóm liên kết giữa nhóm CAP và cùng cầu nối Việc thêm nhóm CU có thể tương tác với acid amin ở rìa kênh enzym, do có thể mang đến những cơ hội khám phá những chất ức chế HDAC mạnh hơn và chọn lọc hơn [11]

Hình 1.5 Cấu trúc một số chất ức chế HDAC [22]

DỊ VÒNG TRIAZOL VÀ PHẢN ỨNG CLICK

Đặc điểm chung của dị vòng 1,2,3-triazol

1.3.1.1 Tính chất lý hóa của dị vòng 1,2,3-triazol

Khung triazol là một dị vòng năm cạnh chứa ba nitơ và có thể dễ dàng tổng hợp được thông qua phản ứng Click [26] Cấu trúc của 1,2,3-triazol được sử dụng như một bộ khung để tổng hợp nhiều dẫn chất mới liên quan đến nhiều hoạt tính sinh học đa dạng như chống ung thư, chống lao, kháng nấm, kháng khuẩn, kháng virus [13]

Sơ đồ 1.1 Phản ứng Click tổng hợp dị vòng 1,2,3-triazol

Vòng 1,2,3-triazol là vòng thơm nên có thể có tương tác xếp chồng - với các vòng thơm khác như phenyl Bên cạnh đó, vòng triazol cũng có thể hình thành liên kết hydro hoặc tạo phức hợp với các ion kim loại nhờ các cặp điện tử tự do trên hai nguyên tử nitơ ở vị trí số 2 và số 3 Cùng với đó, vòng triazol có momen lưỡng cực lớn làm phân cực liên kết C–H ở carbon số 5, hình thành nên liên kết hydro Cho nên, việc kết hợp khung triazol vào cấu trúc các chất mới có thể cải thiện tính tan nhờ có khả năng tạo nhiều loại liên kết khác nhau Ngoài ra, nó cũng tương đối trơ với nhiều phản ứng hóa sinh khác nhau trong cơ thể người [21] Chính vì vậy, vòng triazol có khả năng tương tác tốt với các mục tiêu sinh học, đóng vai trò quan trọng trong việc nghiên cứu và phát triển thuốc mới [26]

1.3.1.2 Hoạt tính của dị vòng 1,2,3-triazol

Vòng 1,2,3-triazol được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực phát triển thuốc Nhiều hợp chất dựa trên cấu trúc này đã vượt qua các giai đoạn thử nghiệm lâm sàng và được chấp thuận sử dụng trên thị trường Vòng triazol sở hữu đa dạng hoạt tính sinh học gồm chống ung thư, lao, nấm, vi khuẩn, sốt rét và động kinh.

Có thể kể đến một số thuốc như rufinamid đang được sử dụng như một thuốc chống co giật để điều trị các rối loạn co giật như hội chứng Lennox Gastaut; tazobactam có tác dụng ức chế β-lactamase vi khuẩn; carboxyamidotriazol đang được thử nghiệm lâm sàng điều trị bệnh ung thư thể rắn [25]

Hình 1.6 Một số chất mang khung triazol có hoạt tính sinh học

Phản ứng Click tổng hợp dị vòng triazol

1.3.2.1 Giới thiệu về phản ứng Click

Năm 2001, Sharpless K.B và cộng sự lần đầu đưa ra khái niệm về phản ứng Click Phản ứng Click dùng để tổng hợp các hợp chất hữu cơ thông qua liên kết dị hợp tử C–X–C được mô tả là những phản ứng xảy ra rất mạnh, có hiệu suất và tính chọn lọc cao Ngoài ra, điều kiện của phản ứng khá đơn giản, không nhạy cảm với oxy hoặc nước, có thể dùng dung môi trơ sẵn có hoặc dung môi xanh như nước Quá trình tinh chế cũng đơn giản như phương pháp kết tinh hoặc chưng cất mà không cần sử dụng phương pháp sắc ký cột [21, 27]

Phản ứng Click được chia thành 4 loại như sau [25]:

 Phản ứng cộng vòng, gồm phản ứng cộng vòng 1,3 lưỡng cực Huisgen và phản ứng Diels–Alder

 Phản ứng thế ái nhân bao gồm phản ứng mở vòng ái nhân của các hợp chất dị vòng như aziridin, epoxid

 Phản ứng ngưng tự carbonyl, ví dụ: phản ứng tổng hợp ure, thiourea, dị vòng thơm, hydrazon, oxim ether, amid

 Phản ứng cộng hợp vào liên kết bội C–C, chủ yếu là phản ứng cộng hợp Michael giữa amin-alken, thiol-alken và thiol-alkyn Đề tài đã lựa chọn thực hiện phản ứng cộng vòng Huisgen để tổng hợp ra dẫn chất của 1,2,3-triazol Tuy nhiên, khi thực hiện phản ứng Huisgen cổ điển mà không dùng chất xúc tác thì sẽ diễn ra chậm, phải tiến hành ở nhiệt độ cao Bên cạnh đó, phản ứng này xảy ra không chọn lọc, tạo hỗn hợp sản phẩm gồm hai đồng phân 1,4-triazol và 1,5- triazol [25] Sau đó, việc sử dụng xúc tác CuAAC được phát hiện đồng thời bởi hai nhóm nghiên cứu của Sharpless K.B [27] và Meldal M [42] Khi sử dụng xúc tác CuAAC, phản ứng sẽ xảy ra nhanh hơn, hiệu suất đạt được cao hơn và có tính chọn lọc tạo ra sản phẩm 1,4-triazol cũng tốt hơn [25] Do đó, chúng tôi đã sử dụng xúc tác CuAAC để đóng vòng giữa azid và alkyn

1.3.2.2 Cơ chế của phản ứng Click

Năm 2006, Maarseveen và cộng sự đã giải thích cơ chế sử dụng xúc tác CuAAC Chu trình của phản ứng bắt đầu bằng việc hình thành phức hợp Cu-alkyn Tiếp đến là sự khử proton liên kết C–H của alkyn tạo thành phức hợp đồng acetylid Phức hợp đồng acetylid này tồn tại ở trạng thái cân bằng giữa dạng monomer và dạng dimer Sau đó, một ion đồng của phức hợp dimer sẽ kết hợp với đầu nitơ tự do của azid và kích hoạt đầu nitơ còn lại tấn công vào carbon của alkyn tạo thành vòng chứa đồng Tiếp theo, vòng kim loại trải qua quá trình co vòng nhờ sự tương tác của cặp điện tử tự do trên nitơ azid với liên kết đôi C=Cu tạo hợp chất trung gian đồng triazolid Cuối cùng, chất trung gian này sẽ bị proton hóa tạo thành 1,4-triazol và hoàn trả chất xúc tác CuAAC [6, 25]

Sơ đồ 1.2 Cơ chế của phản ứng Click có xúc tác CuAAC [46]

KHUNG QUINAZOLIN VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG UNG THƯ

Khung quinazolin

Quinazolin là một hợp nhất dị vòng chứa nitơ, tùy thuộc vào vị trí của nguyên tử nitơ trong hệ thống vòng dị vòng mà có bốn dạng đồng phân khác nhau bao gồm quinazolin, quinoxalin, cinnolin và phthalazin Khi gắn nhóm carbonyl trên vòng pyrimidin của quinazolin sẽ tạo ra quinazolinon [4] Dựa vào số lượng và vị trí của nhóm carbonyl mà khung cấu trúc này được chia làm 3 loại quinazolin-2(1H)-on, quinazolin-4(3H)-on và quinazolin-2,4(1H,3H)-dion [3, 4]

Trong số đó, quinazolin và quinazolinon là hai dị vòng nitơ quan trọng trong nghiên cứu và phát triển các thuốc có hoạt tính sinh học đa dạng Các tác dụng này gồm kháng ung thư, diệt vi khuẩn, chống co giật, diệt ký sinh trùng, chống tăng huyết áp, kháng viêm, kháng virus, ức chế α-glucosidase, ức chế dihydrofolat reductase, ức chế phosphoryl hóa tế bào [4, 28] Dựa trên cấu trúc khung quinazolin/quinazolinon đã có nhiều loại thuốc được sử dụng trên lâm sàng như gefitinib dùng điều trị ung thư, prazocin điều trị tăng huyết áp, methaqualon có tác dụng an thần, proquazon là thuốc chống viêm non-steroid, albaconazol dùng chống nấm… [4]

Hình 1.8 Một số chất mang khung quinazolin/quinazolinon có hoạt tính sinh học

Hoạt tính kháng ung thư của các dẫn chất mang khung quinazolin

Kể từ khi phát hiện ra gefitinib có tác dụng điều trị ung thư dựa trên khả năng ức chế tyrosine kinase của thụ thể EGFR, nhiều dẫn chất của quinazolin đã được tổng hợp và nghiên cứu hướng tới hoạt tính kháng ung thư [31] Chính vì vậy, các nhà nghiên cứu đã phát hiện ra một số hướng tác dụng của dẫn chất quinazolin trong điều trị ung thư như chất ức chế tyrosin kinase, chất ức chế serin-threonin kinase, chất ức chế histon deacetylase [31, 36] Tác dụng của các dẫn chất quinazolin trên một số đích cụ thể được trình bày trong phần dưới đây

1.4.2.1 Tác dụng ức chế tyrosin kinase

Tyrosin kinase (TK) là một enzyme có chức năng chuyển một nhóm phosphat từ ATP sang nhóm hydroxyl của tyrosin Quá trình phosphoryl hóa này là một cơ chế quan trọng trong việc truyền tín hiệu trong một tế bào và điều chỉnh hoạt động của tế bào, chẳng hạn như sự phát triển tế bào, sự tăng sinh tế bào, sự biệt hóa và apoptosis [35]

Các tyrosine kinase (TK) được chia thành hai nhóm chính: thụ thể TK (RTK) và không thụ thể TK RTK gồm EGFR, VEGFR, PDGFR, MET trong khi TK không thụ thể bao gồm Src, Abl, Janus kinase Ở trạng thái bình thường, hoạt động của RTK được cân bằng bởi các enzyme tyrosine kinase và tyrosine phosphatase Khi sự cân bằng này bị phá vỡ, quá trình phosphoryl hóa gia tăng, dẫn đến tăng sinh tế bào không kiểm soát - một bước quan trọng trong quá trình phát triển ung thư.

Năm 2022, Mortazavi và cộng sự đã tổng hợp được 2 dẫn chất mang khung quinazolinon TQ1, TQ2 và đã đánh giá được tác dụng chống tăng sinh trên dòng tế bào ung thư phổi EBC-1 Kết quả cho thấy cả 2 dẫn chất đều thể hiện tác dụng ức chế tăng sinh vừa phải trên dòng tế bào EBC-1 với giá trị IC50 lần lượt là 8,61,9 M và 18,05,6

M tốt hơn so với chất dương chứng cabozantinib (IC50 = 59,22,0 M) Bên cạnh đó

TQ1 còn được đánh giá là có khả năng ức chế MET kinase, VEGFR3, FGFR1 Những kết quả này cho thấy, hợp chất TQ1 là chất ức chế RTK đa mục tiêu đầy hứa hẹn [34]

Hình 1.9 Cấu trúc hóa học của hợp chất TQ1 và TQ2 mang khung quinazolinon 1.4.2.2 Tác dụng ức chế histon deacetylase

Năm 2018, Chen và cộng sự đã thiết kế và tiến hành tổng hợp được 58 dẫn xuất mang khung quinazolin Trong số đó, hai hợp chất TQ3 và TQ4 có khả năng ức chế kép HDAC1 và HDAC6 Hai hợp chất này không chỉ thể hiện tính chọn lọc tốt hơn các HDAC khác mà còn có khả năng acetyl hóa tubulin và histon H3 trong tế bào Hela Hợp chất TQ3 có giá trị IC50 lần lượt là 31 nM và 16 nM trên HDAC1 và HDAC6, còn hợp chất TQ4 có giá trị IC50 lần lượt là 37 nM và 25 nM tương ứng với HDAC1 và HDAC6 Ngoài ra, cả hai chất đều thể hiện hoạt tính chống tăng sinh mạnh mẽ trên các dòng tế bào khối u khác nhau trong ống nghiệm với giá trị IC50 < 40 nM, đặc biệt đối với tế bào khối u huyết học U266 và RPMI8336 với IC50 < 1 nM, kết quả được đánh giá có hoạt tính tốt hơn SAHA Hơn nữa, chất TQ3 còn cho thấy sự ức chế tăng trưởng khối u đáng kể trong mô hình xenoragft với dòng tế bào MCF-7 kháng adriamycin mà không thấy sự thay đổi rõ ràng nào vể trọng lượng cơ thể và hành vi bất thường nào của chuột Có thể thấy hợp chất TQ3 mang khung quinazolin là chất ức chế HDAC mạnh và có tiềm năng trong điều trị bệnh ung thư vú kháng adriamycin [10]

Hình 1.10 Cấu trúc hóa học của hợp chất TQ3 và TQ4 mang khung quinazolin

HƯỚNG NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI

Trong số các thuốc ức chế HDAC được FDA phê duyệt để điều trị ung thư, vorinostat (SAHA) có chứa hợp phần N-hydroxyheptanamid đóng vai trò làm vùng liên kết và nhóm gắn kẽm Bên cạnh đó, với kết quả của những nghiên cứu trên, khung cấu trúc quinazolinon có tiềm năng trong việc nghiên cứu phát triển các thuốc điều trị ung thư Ngoài ra, dị vòng 1,2,3-triazol cũng được biết đến là một dị vòng có nhiều hoạt tính sinh học cùng với khả năng tương tác tốt với các mục tiêu phân tử Trên cơ sở đó, khóa luận đã thiết kế dãy các chất bằng cách sử dụng dị vòng 1,2,3-triazol làm nhóm CU liên kết giữa hợp phần N-hydroxyheptanamid của SAHA với nhóm nhận diện bề mặt mang khung cấu trúc quinazolin-4(3H)-on Từ đó tiến hành tổng hợp được để đánh giá hoạt tính kháng tế bào ung thư và tác dụng ức chế enym HDAC với mong muốn tìm kiếm được các dẫn chất có tác dụng sinh học tốt

Hình 1.11 Thiết kế cấu trúc các chất

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, NỘI DUNG

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

NGUYÊN LIỆU

Các dung môi, hóa chất dùng cho tổng hợp hóa học đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích Analytical Reagent – AR, được đặt mua từ các công ty như Sigma – Aldrich, Merck Các hóa chất này đều được sử dụng trực tiếp, không trải qua thêm bất kỳ quá trình tinh chế nào Bao gồm:

 Acid 2-aminobenzoic và 5 dẫn chất của nó:

Các dung môi, hóa chất khác như: aceton, methanol, acetonitril, ethyl acetat, dicloromethan, nước cất, KI, K2CO3, CuI, NaOH, Na2SO4, Na2CO3, NaHCO3.

TRANG THIẾT BỊ

 Cân phân tích, cân kỹ thuật Shimadzu

 Các dụng cụ thủy tinh: bình cầu đáy tròn dung tích 50 ml và 100 ml có nút mài, bình nón, bình chiết, phễu thủy tinh, pipet, đũa thủy tinh, ống đong, cốc có mỏ các loại, sinh hàn hồi lưu

 Máy khuấy từ gia nhiệt IKA-RTC, máy cất quay chân không Buchi R-200

 Bình chạy sắc ký lớp mỏng Camag, bản mỏng silicagel 60 F254 (Merck) để chạy sắc ký lớp mỏng và đèn tử ngoại VILBER LOURMAT bước sóng 254 nm và 365 nm

 Máy siêu âm, tủ lạnh, tủ sấy Memmert

 Máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện Electrothermal digital

 Máy đo phổ hồng ngoại Shimadzu FTIR Affinity  1S, đặt tại khoa Hóa học – trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội

 Máy đo phổ khối lượng Agilent 6530 Accurate – Mass QTOF LC/MS (United States)  Viện Hóa Sinh biển  Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

 Máy cộng hưởng từ Bruker AV – 500 MHz, đặt tại khoa Hóa học – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội.

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Hóa học

 Tổng hợp hóa học 6 dẫn chất:

 7-(4-((4-Oxoquinazolin-3(4H)-yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)-N- hydroxyheptanamid (VIIa)

 7-(4-((6-Methyl-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)-N- hydroxyheptanamid (VIIb)

 7-(4-((6-Cloro-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)-N- hydroxyheptanamid (VIIc)

 7-(4-((6-Fluoro-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)-N- hydroxyheptanamid (VIId)

 7-(4-((6-Bromo-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)-N- hydroxyheptanamid (VIIe)

 7-(4-((6-Iodo-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)-N- hydroxyheptanamid (VIIf)

 Kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng và nhiệt độ nóng chảy

 Khẳng định cấu trúc chất tổng hợp được bằng phổ IR, MS, 1 H-NMR, 13 C-NMR.

Thử hoạt tính sinh học của các dẫn chất tổng hợp được

 Đánh giá hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro trên ba dòng tế bào gồm:

 Tế bào ung thư đại tràng (SW620)

 Tế bào ung thư vú (MDA-MB-231)

 Tế bào nguyên bào sợi phổi ở thai nhi (MRC-5)

 Đánh giá hoạt tính ức chế enzym HDAC.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Hóa học

Dựa trên các nguyên tắc và phương pháp cơ bản của hóa học hữu cơ để tiến hành tổng hợp các chất theo thiết kế Các phản ứng sử dụng:

 Phản ứng ngưng tụ tạo vòng quinazolin từ các dẫn chất acid 2-aminobenzoic và formamid [19]

 Phản ứng N-akyl hóa dẫn chất quinazolin-4(3H)-on với tác nhân là propargyl bromid [41]

 Phản ứng azid hóa từ muối natri azid và ethyl 7-bromoheptanoat

 Phản ứng Click tạo vòng 1,2,3-triazol [42]

 Phản ứng acid hydroxamic hóa bằng tác nhân hydroxylamin hydroclorid [8]

Theo dõi quá trình phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng (TLC)

2.4.1.2 Kiểm tra độ tinh khiết

Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng 2 phương pháp:

 Sử dụng sắc ký lớp mỏng

 Đo nhiệt độ nóng chảy

Các hợp chất sau khi tổng hợp, tinh chế và đánh giá sơ bộ là tinh khiết sẽ được xác định cấu trúc bằng các phương pháp phổ: phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ( 1 H-NMR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân đồng vị carbon-

 Phổ hồng ngoại (IR): được ghi bằng máy Shimadzu FTIR Affinity-1S, với kỹ thuật viên nén KBr Mẫu sau khi sấy khô ở dạng rắn được phân tán trong KBr đã sấy khô với tỷ lệ 1:200, sử dụng áp lực cao nén hỗn hợp thành dạng film mỏng, đồng thời hút chân không để loại bỏ hơi ẩm Quét phổ trong vùng 4000 - 400 cm -1 và ghi ở độ phân giải 4 cm -1

Máy khối phổ Agilent 6530 Accurate-Mass QTOF LC/MS tại Viện Hóa Sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam được sử dụng để thực hiện phép đo phổ khối lượng (MS) bằng phương pháp ion hóa phun bụi điện từ (ESI) và dung môi là MeOH trong chế độ ESI(+)-HR-MS.

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) và carbon (13C-NMR) được ghi trên máy Bruker AV-500 Tần số cộng hưởng của phổ 1H-NMR là 500 MHz, còn 13C-NMR là 125 MHz Giá trị độ dịch chuyển hóa học (δ) được biểu thị bằng đơn vị phần triệu (ppm) so với mốc chuẩn tetramethylsilan (TMS), nhiệt độ đo phổ là khoảng 300 K và dung môi sử dụng là DMSO-d6.

Thử hoạt tính sinh học

2.4.2.1 Đánh giá hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro Đánh giá hoạt tính kháng tế bào ung thư (thử độc tính tế bào) in vitro được thực hiện tại Khoa Dược, Trường Đại học Chungbuk, Cheongju, Hàn Quốc theo phương pháp SRB và giá trị IC50 được tính theo phương pháp Probit

Dòng tế bào thử nghiệm sử dụng: hai dòng tế bào ung thư và một dòng tế bào thường bao gồm:

 SW620: tế bào ung thư đại tràng người

 MDA-MB-231: tế bào ung thư vú của người

 MRC-5: tế bào nguyên bào sợi phổi ở thai nhi

Các dòng tế bào được lấy từ ngân hàng tế bào của Viện nghiên cứu sinh học và công nghệ sinh học Hàn Quốc (KRIBB) và được nuôi cấy trong môi trường DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) bổ sung: L-glutamin, penicillin/ streptomycin,

Chất đối chiếu dương tính: 2 chất chứng dương bao gồm:

Xác định giá trị mật độ quang (OD) khi lượng sulforhodamin B (SRB) liên kết với protein trong tế bào sau khi chúng đã được chiết ra trong môi trường kiềm nhẹ Giá trị

OD này tỷ lệ thuận với lượng SRB kết hợp với phân tử protein Do đó, khi lượng tế bào tăng lên đồng nghĩa với lượng protein cũng tăng lên, giá trị OD cũng tăng theo [44]

Các tế bào ở pha logarit được trypsin hóa và phân tán vào hỗn dịch đơn tế bào trong môi trường DMEM được bổ sung 5% FBS và điều chỉnh đến nồng độ 3x10 4 tế bào/ml, sau đó chia đều vào các giếng của đĩa 96 giếng, mỗi giếng 180 l Các đĩa sau đó được ủ ở 37℃ trong điều kiện 5% CO2

Sau 24 giờ ủ, các chất đã tổng hợp được được chuẩn bị trong 20 l môi trường DMEM bổ sung 5% FBS từ dung dịch gốc trong dimethyl sulfoxid (DMSO) rồi được thêm vào các đĩa ở nhiều nồng độ khác nhau, các đĩa này sau đó được ủ thêm 48 giờ Tất cả các mẫu được chuẩn bị sao cho nồng độ cuối cùng của DMSO là nhỏ hơn 0,1%

Cố định tế bào và nhuộm màu

Các tế bào được cố định bằng những lớp mỏng 50 l dung dịch tricloroacetic 50% lạnh lên trên môi trường nuôi cấy trong mỗi đĩa và được ủ ở 4℃ trong 1h để tế bào tự tái tạo, rồi sau đó rửa 5 lần với nước cất, loại bỏ phần nước dư

Các đĩa được để khô trong không khí và được nhuộm với sulforhodamin B (SRB) 0,04% trong acid acetic 1% Thời gian nhuộm là 30 phút rồi rửa bằng acid acetic 1% để loại thuốc nhuộm tự do, không kết dính Loại bỏ hết acid acetic còn dư và để các đĩa khô ngoài không khí Đo độ hấp thụ màu

Các đĩa sau khi được để khô ở nhiệt độ phòng, phần thuốc nhuộm còn dính lại sẽ được hòa tan bằng 100 ml dung dịch chứa 10 mM Trizma-base không đệm (pH = 10,5), đồng thời đặt đĩa trong máy lắc trong 10 phút Độ hấp thụ được đọc bằng thiết bị ELISA ở bước sóng 510 nm

Giá trị IC50 là nồng độ của mẫu thử mà ở đó độ hấp thụ giảm đi 50% so với nhóm chứng (mẫu trắng là giếng chỉ thêm môi trường nuôi cấy) Giá trị này được tính bằng phần mềm GraphPad Prism 5.0 (GraphPad, San Diego, CA, Hoa Kỳ) theo phương pháp Probits

2.4.2.2 Đánh giá tác dụng ức chế enzym histon deacetylase

Nguyên tắc: Đánh giá tác dụng ức chế enzym HDAC trên hỗn hợp HDAC tổng tách từ tế bào Hela được thực hiện bằng phương pháp huỳnh quang với bộ Fluorogenic HDAC Assay Kit (Enzo Life Sciences Inc.) theo hướng dẫn của nhà sản xuất Các HDAC ở đây có tác dụng xúc tác cho quá trình phân cắt nhóm acetyl từ acetyllysin trong protein được biến tính Trong phép thử này, các phân tử thuốc nhuộm huỳnh quang được gắn vào một peptid có chứa acetyllysin cùng với các peptid có tác dụng làm tắt huỳnh quang Sau khi xử lý các peptid với các HDAC, phản ứng được trộn lẫn với một dung dịch riêng của nhà sản xuất nhằm phát hiện các peptid có chứa lysin bị cắt nhóm acetyl Nếu lysin bị cắt nhóm acetyl bởi HDAC, dung dịch này sẽ giải phóng thuốc nhuộm có phát huỳnh quang do đó khả năng huỳnh quang sẽ đánh giá được hoạt tính của enzym HDAC [45] Thành phần của kit định lượng HDAC bao gồm: HDAC tổng chiết từ tế bào Hela, cơ chất phát quang HDAC, chất khai triển định lượng HDAC (HDAC Assay Developer) (2x), trichostatin A, dung dịch đệm HDAC buffer

Bước 1: Chuẩn bị mẫu thử

Trước khi tiến hành đánh giá tác dụng ức chế HDAC, các mẫu thử nghiệm dạng bột được hòa tan trong dimethyl sulfoxid (DMSO) để tạo dung dịch gốc nồng độ 10mg/ml Các dung dịch gốc sau đó được pha loãng bằng môi trường DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) không có huyết thanh để tạo các dung dịch ở nồng độ 0,01; 0,03; 0,1; 0,3 àg/ml Nồng độ DMSO cuối cựng khụng vượt quỏ 0,1% và mẫu đối chứng DMSO được thêm vào một nhóm lỗ thử để có nồng độ DMSO đúng bằng nồng độ DMSO ở các lỗ có mẫu thử Thêm lần lượt các chất sau vào trong các giếng thử:

+ Dung dịch gốc của nhà sản xuất: 5 àl cơ chất phỏt huỳnh quang HDAC Fluorogenic (200 àM)

+ 30 àl dung dịch đệm HDAC Assay Buffer

Chuẩn bị 5 ml dung dịch chứa các chất cần đánh giá (chất ức chế) theo phương án nghiên cứu Đối với giếng chứa chất chứng dương (Positive Control) và mẫu trắng (Blank), bổ sung 5 ml dung dịch tương tự không chứa chất ức chế, được gọi là đệm ức chế (Inhibitor Buffer) Thêm 5 ml dung dịch pha loãng Trichostatin A (20 µM) vào giếng chứng ức chế (Inhibitor Control).

+ 5 ml HDAC Assay Buffer vào các giếng trắng (Blank)

+ Bắt đầu phản ứng bằng cỏch thờm 5 àl enzym HDAC pha loóng (1 ng/àl) vào các giếng chứng dương (Positive Control), giếng các chất cần đánh giá (Test Inhibitor) và giếng chất chứng ức chế (Inhibitor Control) Ủ ở 37ºC trong 30 phút

Thờm 50 àl HDAC Assay Developer (2x) vào mỗi giếng Ủ đĩa ở nhiệt độ phòng trong 15 phút

Bước 3: Đọc kết quả Đọc kết quả của mẫu trong máy đo hấp thụ huỳnh quang VICTOR (PerkinElmer, Waltham, MA, USA), có khả năng kích thích ở bước sóng trong khoảng 360 nm và phát hiện bước sóng phát ra trong khoảng 460 nm (độ hấp thụ được đo 2 lần ở mỗi bước sóng) Giá trị của giếng trắng (Blank) được trừ khỏi tất cả các giá trị khác Kết quả độ hấp thụ (của 2 lần thí nghiệm) được đưa vào phần mềm excel tính toán để thu được phần trăm trung bình mẫu thử gắn với HDAC Giá trị IC50 được tính bằng GraphPad Prism 5.0 (Phần mềm GraphPad, San Diego, CA, Hoa Kỳ) bằng phương pháp xây dựng đường cong biểu thị quan hệ giữa phần trăm tế bào sống và logarit của nồng độ chất thử Độ lệch chuẩn tương đối không quá 10%

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

HÓA HỌC

TỔNG QUAN

1.1.1 Giới thiệu về histon deacetylase

Histon acetyltransferase (HAT) và histon deacetylase (HDAC) là hai nhóm enym giữ cân bằng cho mức độ acetyl hóa – deacetyl hóa của histon [38] HAT xúc tác cho quá trình acetyl hóa nhóm ε–NH3 + của lysin ở đuôi histon làm trung hòa điện tích dương Khi đó ái lực của đầu N ở đuôi histon với nhóm phosphat tích điện âm của ADN bị giảm đáng kể làm cho nhiễm sắc thể tháo xoắn và quá trình phiên mã được diễn ra Ngược lại, HDAC xúc tác cho quá trình deacetyl hóa lysin, làm cho đầu N ở đuôi histon tích điện dương, nhiễm sắc thể đóng xoắn và gây ức chế quá trình phiên mã [29]

Hình 1.1 Quá trình acetyl hóa và deacetyl histon xúc tác bởi HAT và HDAC

Các bất thường trong hoạt động của enzyme HAT hoặc HDAC, dẫn đến giảm quá trình acetyl hóa histon, sẽ gây ra những thay đổi trong điều hòa biểu hiện gen Điều này đặc biệt ảnh hưởng đến các gen quan trọng liên quan đến hoạt động sống của tế bào như tăng sinh tế bào, điều hòa chu trình tế bào và apoptosis Ngoài ra, HAT và HDAC còn tham gia vào quá trình acetyl hóa protein không chứa histon, bao gồm protein ức chế khối u (p53, RUNX3) và các chất trung gian truyền tín hiệu (STAT3, β-catenin) Sự acetyl hóa p53 thúc đẩy quá trình apoptosis và tự thực để loại bỏ tế bào bất thường Tuy nhiên, khi quá trình acetyl hóa giảm, chức năng của p53 bị ảnh hưởng, dẫn đến ức chế p53 và góp phần vào sự hình thành và phát triển tế bào ung thư.