hệ phân tán rắn gefitinib đánh giá in vitro và in vivo

Do đó, nghiên cău này được thực hián dé phát triển một số há phân tan ran Solid Dispersions: SD của Gef bằng cách sử dụng các chất mang khác nhau và các kỹ thuật bào chế khác nhau nham l

TRƯàNG ĐẠI HàC QUOC TA HaNG BANG

BO MÔN DƯỢC LÝ - DƯỢC LÂM SÀNG

ĐÁNH GIÁ IN VITRO VÀ IN VIVO CÔNG THỢC ĐIẬU CHA CAC Ha PHAN TAN RAN CUA GEFITINIB BANG CAC

KO THUAT KHAC NHAU

Môn: Sinh Dược Hác

Giảng Viên: Huỳnh Thể Mợ Duyên Hác Viên: Trễnh Há Nam Lễp: Thạc Sợ Dược Lý-Dược Lâm Sàng

ĐÁNH GIÁ IN VITRO VÀ IN VIVO CÔNG THỢC ĐIẬU CHẠ CÁC Hà PHAN TAN RAN CUA GEFITINIB BANG CÁC KỢ THUẬT KHÁC NHAU

Sultan Alshehri 1 , Abdullah Alanazi 1, Ehab M Elzayat 1, Mohammad A Altamimi 1 , Syed S Imam 1 , Afzal Hussain 1 , Faleh Algahtani 2 and Faiyaz Shakeel 1,*

Tóm tat: Gefitinib (Gef) la mot loai thuốc chống u kém tan trong nước, điều này làm cho khả năng hấp thu/sinh khả dụng sau khi uống của thuốc bị giảm thiêu Do đó, nghiên cău này được thực hián dé phát triển một số há phân tan ran (Solid Dispersions: SD) của Gef bằng cách sử dụng các chất mang khác nhau và các kỹ thuật bào chế khác nhau nham làm tăng khả năng hòa tan và hấp thu/ tăng sinh khả dụng qua đường uống của thuốc Công thăc của các há phân tán răn khác nhau của Gef được bào chế bằng phương pháp hợp nhất và phương pháp dùng lò vi sóng, Soluplus, Kollidone VA64 và polyethylene glycol 4000 (PEG 4000) là các chất được sử dụng làm chất mang Các há phân tán rắn sau khi báo chế được xác định đặc trưng hóa lý và đánh giá in vitro về độ hòa tan, các nghiên cău In vivo được tiến hành đề đánh giá dược động học Đánh giá

bằng phương pháp lý hóa sẽ được sử dụng đề Nhận biết sự hình thành Các há phân tán

của Gef bào chế bằng các phương pháp hợp nhất và dùng lò vi sóng Các nghiên cău về

sự hòa tan in vitro chỉ ra sự phóng thích đáng kê Gef từ tất cả các há phân tán ran so với Gef nguyên chất.Há phân tán được tối ưu hóa của Gef (S2-MW) cho thấy sự giải phóng

đáng kê của Gef (82,10%) so với Gef nguyên chất (21,23%) Há phân tán Gef được tôi

ưu hóa (S2) được đánh giá dược động học ¡n vivo so với Gef nguyên chất trên chuột Kết quả cho thấy sự cải thián đáng kế các thông số được động học khác nhau của Gef

từ há phân tán S2 được tối ưu hóa so với Gef nguyên chất Ngoài ra, kết quả của há phân tán Gef S2 còn cho thay sự cải thián đáng kê về sinh khả dụng so với Gef nguyên chất Nhìn chung, nghiên cău này gợi ý rằng há phân tán rắn-Gef được điều chế bằng phương pháp vi sóng cho thấy sự tăng cường rõ rát về khả năng hòa tan và sinh khả dụng

Từ khóa: gefitinib; phương pháp hợp nhất; phương pháp vi sóng; chất mang cao phân tử; dược động học; há phân tán rắn

1 Dat van dA

Ung thư phối được chia thành ung thư biểu mô phối té bao nhé (SCLC) va ung thư biêu mô phôi không phải tế bào nhỏ (NSCLC), trong đó loại sau chiếm 85% bánh

nhân được chân đoán ung thư phổi [1] Ung thư phôi có tỷ lá mắc cao và tỷ lá tử vong

ở nam giới cao nhất so với các loại ung thư khác [1,2] GeÑñtinib (Gef) là một TKI (chất

ăc chế tyrosine kinase trên thụ thê của yếu tố tăng trưởng biêu bì (EGFR) chọn lọc đã được Cơ quan Quản lý Thực phâm và Dược phâm Hoa Kỳ (FDA) chấp thuận đề điều trị NSCLC tai ché va di căn sau khi điều trị hóa trị liáu [3] Theo há thong phân loại dược

phâm sinh học (BCS), Gef được phân loại là thuốc nhóm BCS II có độ hòa tan thấp và

tính thắm cao Gef là một hợp chất bazơ không tan trong nước với giá trị pKa là 5,4 và 7,2, cho thay độ hòa tan phụ thuộc vào pH trong dich tiéu hoa (GI) No cé do hoa tan trong nước cực kỳ thấp và sự hấp thu qua đường uống bị hạn chế bởi tốc độ hòa tan kém Do độ hòa tan kém, chỉ khoảng 60% thuốc được hấp thu trong đường tiêu hóa

(GIT) Sinh khả dụng có thê được tăng lên đáng kế bằng cách cải thián độ hòa tan và tốc

độ hòa tan của thuốc [2,4] Kỹ thuật phân tán rắn (SD) là cách làm thành công và được

chấp nhận rộng rãi nhất để tăng cường khả năng hòa tan và giải phóng thuốc kém tan trong nước [5,6] Các SD có thê được điều chế bằng cách sử dụng các kỹ thuật khác nhau [7] Các SD cho một số lợi thế khi được dùng như chất mang phân phối thuốc, bao gồm giảm kích thước hạt thuốc tới cấp độ phân tử, tăng độ xốp, cải thián khả năng thấm

ướt và chuyên đổi dạng tinh thê của thuốc thành dạng vô định hình [7-12] Có nhiều

phương pháp xây dựng công thăc khác nhau như há phân tán rắn điều chế băng phuong pháp phun- sây khô vi hat [8], hat nano cao phân tử [9-14], hat nano lipid ran [15,16], chất mang lipid có câu trúc nano [17], nano-huyền phù [18], chất mang nano kích thích miễn dịch PEGyI hóa [19], nhữ tương nano [20], và nanolipsome [21] cua Gef da duoc nghiên cău để tăng cường khả năng hòa tan/sinh khả dụng trong liáu pháp chống ung

thư Gef là một hợp chất kém tan trong nước, sinh khả dụng đường uống kém [4] Các

há phân tán rắn được cho là làm tăng khả năng hòa tan và sinh khả dụng của các thuốc kém tan trong nước [7,8] Do đó, kỹ thuật này đã được sử dụng cho Gef Các chất mang được nghiên cău như Soluplus®, Kollidone VA64®, và polyethylene glycol 4000 (PEG 4000) đã được nghiên cău rộng rãi trong tài liáu để điều chế SD vô định hình của các loại thuốc kém tan trong nước [7,22] Do đó, các chất mang này đã được sử dụng cho Gef trong nghiên cău này Các SD hỗ trợ vi sóng của Gef chưa được nghiên cău về khả

năng hòa tan, hòa tan và tăng cường sinh khả dụng của chúng Do đó, mục đích của nghiên cău này là phát triển các SD của Gef sử dụng công nghá vi sóng so sánh với phương pháp hợp nhất truyền thống dé cải thián tốc độ hòa tan in vitro va sinh kha dung khi uống Nhiều chất mang khác nhau như Soluplus®, Kollidone VA64®, và PEG 4000

đã được sử dụng đề điều chế các há phân tán Gef

2 Nguyên liáu và phương pháp nghiên cợu

2.1 Nguyên liáu Gef(độ tỉnh khiết: 98,60%) được mua từ <Beijineg Mesochem Technology (Beijing, China)= Soluplus® va Kollidone VA64® mua từ <BASF (Ludwigshafen, Germany)= Dung mdi sac ky long hiau nang cao (HPLC) va PEG 4000

duoc mua tir <Sigma Aldrich (St Louis, MO, USA)= Cac nguyén liau khác đều đạt

chuẩn đùng trong phân tích / được phẩm và được sử dụng mà không qua bắt kỳ quá trình tinh chế nào

2.2 ĐiÁu chạ các há phân tán rắn

2.2.1 Phương pháp vi sóng Công thắc Gef-SD được bào chế bằng kỹ thuật vị sóng với lò vI sóng thông thường Soluplus, Kollidon V A64 và PEG 4000 được sử dụng

để điều chế công thăc Gef-SD theo các tý lá khác nhau được trình bày trong Bảng 1 Tỷ

lá dược chất trên polyme được chọn là 1: 4 (w/w), do đó, Gef đã được pha trộn với Soluplus + PEG 4000 và Kollidon VA64 + PEG 4000 cho tất cả các công thac Sau khi cân Gef và polyme, bột được đỗ vào một đĩa să và dùng đũa khuấy thủy tinh trộn đều cho đến khi tất cả các loại bột được hòa trộn đồng nhất Mỗi đĩa să được đặt ở giữa lò

vi sóng và năng lượng của lò vi sóng được chọn là 900 watt Lò vi sóng bắt đầu làm nóng đĩa să; că sau 30 s, viác gia nhiát bằng vi sóng được tạm dừng và tiếp tục khuấy

để trộn đều hỗn hợp nhằm đảm bảo răng tất cả các loại bột đều tiếp xúc đồng đều với năng lượng gia nhiát Đĩa să sau đó được đặt trở lại và tiếp tục quay lại lò vi sóng dé làm nóng cho đến khi tất cả các loại bột trộn đều tan chảy và tạo ra hỗn hợp đồng nhất Hỗn hợp sau đó được lấy ra khỏi lò vi sóng và để nguội ở nhiát độ phòng Sau đó, hỗn

hợp được đặt trong bình hút âm chân không có chăa kali clorua khan trong 48 h dé dao thảichất âm Sau khi làm khô, hỗn hợp được rây bằng lưới rây cỡ 325 và bột đã rây được

lưu trong hộp kín có màu hồ phách dé phân tích thêm

Bảng 1: Tỷ lá Gefitinib (Gef)-chất mang được sử dụng để điều chế há phân tán ran (SD) (w/w)

2.2.2 Phương phap hgp nhat (truyAn théng)

Phương pháp làm tan chảy cả Gef và polyme bằng cách truyền thống theo một tỷ

lá tương tự như phương pháp dùng vi sóng Sau khi trộn đều, hỗn hợp được làm nóng bằng bếp đián sau đó trộn kỹ cho đến khi tạo thành hỗn hợp đồng nhất, hỗn hợp này duoc dé nguội ở nhiát độ phòng và được rây bằng lưới rây 325 Bột điều chế xong được

cho vào bình hút 4m trong 48 giờ cho lần sử dụng sau [22] 2.3 Đặc điểm hóa lý 2.3.1

Đo nhiát lượng quét vi sai (DSC) Mỗi công thắc Gef-SD được phân tích DSC bằng cach str dung thiét bi <DSC-8000 Perkins Elmer (Waltham, MA, USA)= trong pham vi

nhiát độ 25-2500 C ở tốc độ gia nhiát 109 C/phút Các mẫu được đánh giá bằng độ lọc nito ở tốc độ khoảng 20 mL/ phút (một thiết bị lấy mẫu tự động và máy làm lạnh đã

được lắp đặt vào máy phân tích) Trọng lượng của mỗi mẫu là 3 mg và đặt có định bên

trong chảo nhôm kín Để xác định đặc tính và đánh giá các mẫu, phần mềm quản lý

Pyris (Pyris Elmer, Waltham, MA, USA)= da duoc su dung để xác định đặc tính trạng

thái rắn [22] 2.3.2 Sử dụng kính hiển vi dian tir quét (SEM) Nghién cau SEM duoc

thực hián để đánh giá sự thay đổi độ kết tinh của Gef nguyên chấtsau khi điều chế ra các

SD Các mẫn Gef (D), Gef + PEG 4000 (P), Gef + Kollidon + PEG 4000 (A2), (Gef +

sự thay đổi trong cầu trúc Nghiên cău được thực hian bằng cách sử dụng <Kính hiển vi dian tr SM 6360A, JOEL, Tokyo, Nhat Ban)= Cac mau duoc phủ một lớp vàng và quan sát dưới kính hiển vi ở độ phân giải cao để kiểm tra sự thay đổi trong hình thái học [22l 2.3.3 Quang phố Fourier Transforms Hồng ngoại (FTIR) Phân tích FTIR được thực hián bằng cách sử dụng <Phô FTIR của Perkins Elmer BX (Pekin Elmer, Marlborough, MA, USA)= trong pham vi từ 4400 đến 350 cm-1 Phé FTIR cua Gef ty

do và các SD khác nhau được giải thích để đánh giá bất kỳ tương tác liên kết nào giữa

Gef va polyme [22] 2.3.4 Nhiéu xa bét tia X (XRD) (PXRD) Ph6é PXRD cua Gef nguyên chất và Gef điều được đánh giá để kiểm tra những thay đổi trong trạng thái phân

tử của tinh thê Gef sau khi điều chế ra SD Các So sánh được thực hián giữa Gef mật độ cao và SD đã điều chế Các nghiên cău được thực hián trên <Máy đo nhiều xạ tia X

(Ultima IV, Rigaku Inc Tokyo, Japan)= với tốc độ quét 0,5/phút trong phạm vi quét 3—

600 Đỉnh đặc trưng của mỗi mẫu được đánh giá bằng cách thu thập dữ liáu bằng băc xạ đơn sắc (Cu Ka“ 1,I= 1,54 Ả), hoạt động ở đián áp 40 kV và dong dian 40 mA [22]

2.4 Nghiên cợu hòa tan trong éng nghiam (in Vitro)

Thử nghiám hòa tan trong ống nghiám được thực hián theo chuyên khảo về hòa tan cua FDA su dụng <Thiét bi hoa tan théng minh SOTAX AT MD (SOTAX AG, Basel, Thuy Si), USP 24= loai II voi cánh khuấy quay ở tốc độ 50 vòng/phút được trang

bị bộ lấy mẫu tự động Mỗi chế phâm (500 mg SD chăa 100 mg Gef) duoc cho day

trong viên nang gelatin căng và đặt trong thiết bị hòa tan Nhiát độ được đặt ở 37 + 0,59 Các nghiên cău này được thực hián trong 60 phút với môi trường hòa tan HCI 0,1N ở pH 1,5 Một lượng nhỏ 2 mL được rút ra ở năm khoảng thời gian khác nhau (5,

10, 15, 30, 45 và 60 phút) và được thay thế bằng cùng một lượng môi trường mới không

chăa thuốc cho mỗi mẫu [8] Các mẫu được lọc và ly tâm trong 5 phút tốc độ 10.000 vòng/phút và phân tích hàm lượng thuốc bằng phương pháp sắc ký lỏng hiáu năng cao (HPLC), như đã trình bày trước đây [23]

2.5 Nghiên cợu Dược đễng hác In Vivo

2.5.1 Phương pháp phân tích các điÁu kián sắc ký sinh hác

Trong nghiên cău này, phương pháp sắc ký lỏng-khối phổ/khối phổ siêu hiáu năng (UPLC-MS / MS) đã được sử dụng để xác định nồng độ Gef trong huyết tương

Viác phân tích Gef được thực hián bằng <há thống UPLC (UPLC: Waters Acduity,

Milford, MA, USA)= Các điều kián sắc ký liên quan đến viác sử dụng cột ACQUITY UPLC BEH HILIC (50 mm x 2,1 mm, 1,7 mm) với pha động của axetonitril và 0,1% axit formic (70:30, v/v) o tốc độ dòng 0,25 mL / phút sử dung imatinib làm tiêu chuẩn đánh giá bên trong [24] Các hợp chất rửa giải được dò bằng phép đo khối phô song song sử dụng <Máy dò TQ (Waters Corp., Milford, MA, USA)= được trang bị nguồn 1on hóa tia đián hoạt động ở chế độ ion hóa dương Viác định lượng được thực hián với chế độ giám sát nhiều phan ang (MRM) Viac lwa chon cac cap ion héa (m/z) được hién

thị như sau: Gef 447.23! 128,15 (điền áp hình nón 40 V, năng lượng va cham 26 V), imatinib: 494,3! 394,2 (dian thế hình nón 54 V, năng lượng va chạm 28 V) Thời gian lưu của Gef và imatinib lần lượt là 1,16 phút và 1,06 phút Thời gian chạy cho phân tích

này là 2 phút Thê tích tiêm là 5 uL Khoảng hiáu chuẩn tiêu chuẩn cho Gef là 5—200 ng

/ mL Tỷ lá xác định trong ngày và giữa các ngày lần lượt là 9,54 và 11,24% LOD và LOQ cho xét nghiám hián tại lần lượt là 5 ng/mL và 15 ng/mL

2.5.2 Thiạt kạ nghiên cợu

Các con chuột Wister khỏe mạnh (nang 180-250 g) được cung cấp tu <Trung tam Chăm sóc Động vật, Trường Cao dang Duoc, Dai hoc King Saud, Riyadh, A Rap Xé

Ut= Tắt cả các động vật đều đáp ưng các điều kián phòng thí nghiám tiêu chuẩn về nhiát

độ và độ ẩm bên cạnh viác tuân thủ nghiêm ngặt các hướng dẫn của tổ chăc cho các nghiên cău trên động vật Sự chấp thuận về đạo đăc đã được đua ra từ <Ủy ban Đạo đặc, Trường Cao đẳng Dược, Đại học King Saud, Riyadh, Ả Rập Xê-út (số phê duyát đạo đặc: KSU-SE-19-66)= để thực hián các nghiên cău dược động học in vivo Hai nhóm, mỗi nhóm sáu con chuột, được cho nhịn ăn 24 giờ trước khi sử dụng chế phẩm tương ăng Nhóm A_ được cho sử dụng công thăc huyền phù thuốc nguyên chấttrong CMC 0,3% và công thăc S2 cho nhóm B Dùng đường uống 40 mg/kg Gef cho cả hai nhóm, sau đó lay mẫu máu từ tĩnh mạch đuôi chuột vào các khoảng thời gian khác nhau (0,5,

1, 3,6, 12 và 24 giờ) [25] Các mẫu được ly tâm với tốc độ 2500 vòng/phút trong 5 phút

để tách huyết tương [13]

2.5.3 ĐiÁu cha mau

Các mẫu huyết tương được xử lý bằng phương pháp kết tủa protein [13] 0,1 mL mẫu huyết tương được kết hợp với 20 uL imatinib chuẩn nội (25 ug/mL) và 0,38 mL, metanol, sau đó được quay trong 1 phút Sau khi ly tâm ở tốc độ 15.000 vòng/phút trong

10 phat, 300 pL chat long nỗi phía trên được chuyền vào lọ đựng mẫu và 5 uL duoc bom vao UPLC/MS/MS dé phan tich dinh luong

2.5.4 Các thông sẽ dược dễng hac

Các thông số dược động học khác nhau, như nồng độ đỉnh trong huyết tương (Cmax), thời gian đạt nồng độ đỉnh (Tmax), thời gian lưu trú trung bình (MRT), dián

tích đưới đường cong (AUC), hăng số tốc độ thải trừ (Kel) và thời gian bán thai trong

huyết tương ( t1/2) của Gef được tính toán bằng phần mềm PK Solver 2.0 bằng phân tích không phân vùng

2.6 Phân Tích thếng kê

Dữ liêu thực nghiám được trình bày dưới dạng giá trị trung bình + SD Dữ liáu

được đánh giá thống kê bằng cách sử dụng <Graphpad prism (InStat 7; San Diego, CA,

USA)= voi mac ý nghĩa p <0,05

về điểm nóng chảy từ 1980 C đến 52-550 C Sự dịch chuyên pic này có thể xảy ra do sự

hòa tan hoàn toàn của Gef trong há chất mang được sử dụng Gef kết tinh chuyên sang trạng thái vô định hình sau khi hòa tan trong chất mang Trong trường hợp công thắc P

được điều chế bằng PEG 4000, pic lớn sắc nét ở 549 C đã được ghi lại, tương ăng với

nhiát độ nóng chảy của nó Các công thăc (A1 và A2) được điều chế bằng cách sử dụng

Kollidon và PEG 4000 cho thấy đỉnh thu nhiát ở 529 C; có sự khác biát nhỏ về chiều cao

đỉnh giữa cả hai công thắc Sự thay đổi chất mang dẫn đến sự khác biát về chiều cao pic của các công thắc

Hình 1 Biêu đồ đo nhiát lượng quét vi sai (DSC) cho thuốc nguyên chất (D)

và các SD khác nhau được điều chế bằng phương pháp hợp nhất

3.1.2 Phương pháp dùng vi sóng

Phố DSC của Gef nguyên chấtvà các SD khác nhau được điều chế bằng phương pháp vi sóng được trình bày trong Hình 2 Gef nguyên chấtcho thầy một đỉnh nóng chảy thu nhiát rõ nét ở 1980 C, tương ăng với điểm nóng chảy của nó Các SD AI và A2 (với

Kollidon), S2 (Soluplus) và P (PEG 4000) không cho thấy bất kỳ đỉnh nào gần đỉnh

nóng chảy của Gef Các công thắc cho thấy đỉnh nóng chảy trong khoảng 52-559 C, tương ăng với đỉnh chất mang Sự văng mặt của đỉnh Gef trong các SD có thê đo sự hòa tan hoàn toàn của Gef trong há thống chất mang được điều chế Các SD điều chế bằng phương pháp vi sóng không cho thấy bất kỳ đỉnh nào do sự phân tán phân tử của Gef trong chất mang Có sự khác biát nhỏ về chiều cao pic giữa các mẫu được điều chế bằng phương pháp hợp nhất và phương pháp vi sóng Các SD được điều chế bằng phương pháp vi sóng cho thấy các đỉnh SD ngắn hơn được điều chế với các chất mang khác nhau Những phát hián này đã chăng tỏ răng các SD được điều chế bằng phương pháp

vi sóng đã nâng cao khả năng hòa tan của thuốc bằng cách chuyên thuốc dạng tỉnh thể sang trạng thái vô định hình Các mẫu được điều chế bằng vi sóng đã hòa tan hoản toàn các thuôc kém hòa tan trong điều kián có tia vi sóng

chế (A1, A2 và S2) cho thấy sự thay đổi hình thái bề mặt Các hạt đã được chuyên đôi

một chút sang cấu trúc vô định hình Công thắc (P) được điều chế bằng PEG 4000 cho thấy những thay đối rõ rát trong cấu trúc Hạt có cấu trúc vô định hình và xốp với bề mặt thô ráp không đều Sự thay đổi hình dạng các hạt xác nhận sự hình thành SD và Gef tinh thể được hòa tan hoàn toàn trong chất mang đã sử dụng PEG 4000

Hình 3 Kính hién vi dian tử quét (SEM) hinh anh cua Gefitinib nguyén chat(Gef)

và các SD khác nhau (AI-F, A2-E, S2-F và P-F) được điều chế bằng phương pháp hợp nhất

3.2.2 Phương pháp vi sóng

Hình ảnh SEM cho Gef nguyên chấtvà các SD khác nhau được điều chế bằng

phương pháp vi sóng được trình bày trong Hình 4 Hình thái bề mặt của Gef nguyên chấtđược tìm thấy là một cấu trúc tinh thể được xác định rõ với cấu trúc dạng thấu kính sắc nét Các công thăc được chiếu xạ vi sóng (A1, A2 và S2) cho thấy những thay đổi dang kể về hình thái bề mặt Các hạt đã được chuyền đổi sang câu trúc vô định hình, điều này đã được xác nhận thêm với nghiên cău PXRD và DSC Công thăc (P) được điều chế bằng PEG 4000 cho thấy những thay đổi lớn hơn trong cấu trúc Hạt có cầu trúc vô định hình với bề mặt thô ráp không đều Sự thay đổi hình dạng của các hạt xác nhận sự hình thành SD và Gef tinh thể được hòa tan hoàn toàn trong chất mang sử dụng PEG 4000

10