TỔNG QUAN
TỔNG QUAN CÔNG NGHỆ NANO
1.1.1 Khái quát về công nghệ và vật liệu nano
Sự ra đời của công nghệ và vật liệu nano đã trở thành một bước đột phá mạnh mẽ, thúc đẩy sự quan tâm và nghiên cứu của các nhà khoa học hiện nay Công nghệ nano được xem là một trong những công nghệ tiên tiến có tiềm năng cách mạng hóa một loạt các lĩnh vực khác nhau với phạm vi ứng dụng rộng rãi
Công nghệ nano có thể được định nghĩa một cách đơn giản là công nghệ ở quy mô một phần tỷ mét Về mặt khoa học, công nghệ nano được sử dụng để mô tả quá trình thiết kế, tổng hợp và ứng dụng các vật liệu, thiết bị và hệ thống với các đặc tính mới được cải thiện đáng kể cũng như các hiện tượng và quá trình được kích hoạt, điều khiển ở quy mô nano [1, 2]
Cho đến nay, vẫn chưa có một định nghĩa thống nhất cho thuật ngữ “vật liệu nano” Tuy nhiên, có thể khái quát vật liệu nano là những vật liệu mà trong cấu trúc của các thành phần cấu tạo nên chúng phải có ít nhất một chiều nằm trong phạm vi nanomet Ở kích thước đủ nhỏ để so sánh với kích thước tới hạn của nhiều tính chất hóa lý, vật liệu nano có sự giao thoa giữa tính chất lượng tử của nguyên tử và tính chất khối của vật liệu, nhờ đó chúng xuất hiện những đặc tính khác biệt đáng kể so với kích thước thông thường [2]
1.1.2 Tính chất cơ bản của vật liệu nano
Những thay đổi về tính chất của vật liệu nano khiến chúng hoạt động khác biệt so với vật liệu khối và nguyên tử là do sự gia tăng diện tích bề mặt và sự chi phối của các hiệu ứng lượng tử Những yếu tố này ảnh hưởng đến khả năng phản ứng hóa học của vật liệu, cũng như các đặc tính cơ học, quang học, điện học và từ tính của chúng
Khi đưa vật liệu về kích thước nano, diện tích bề mặt và năng lượng bề mặt tăng lên đáng kể Cùng với đó, số lượng hạt trên một đơn vị khối lượng cao dẫn đến tăng
3 khả năng bám dính và tương tác hóa học Ở khối lượng 0,3 μg, một vi hạt cacbon có đường kính 60 μm và diện tích bề mặt 0,01 mm 2 , nhưng khi ở cấu trúc nano với mỗi hạt có đường kính 60 nm thì có đến khoảng 1 tỷ hạt với tổng diện tích bề mặt thu được là 11,3 mm 2 Tỷ số giữa diện tích bề mặt trên thể tích của một hạt có đường kính 60 nm lớn hơn 1000 lần so với một hạt có đường kính 60 μm nên khả năng phản ứng có thể được tăng cường lên khoảng 1000 lần [3]
Khi đưa về kích thước nhỏ, vật liệu thể hiện các tính chất từ, quang, điện đặc biệt và nhờ đó có thể ứng dụng trong nhiều liệu pháp chữa bệnh hay chuẩn đoán, ghi nhận hình ảnh Đồng không trong suốt ở cấp độ vĩ mô trở nên trong suốt trong khi bạch kim trơ trở thành chất xúc tác ở cấp độ nano Mặt khác, nhôm dễ bắt lửa và silicon trở thành chất dẫn điện, vàng chuyển dần sang màu đỏ và khả năng xúc tác gia tăng đáng kể khi kích thước giảm dần về nano [1]
1.1.3 Nguyên lý tạo hệ nano
Hai nguyên lý cơ bản được sử dụng để tạo hệ nano là top – down và bottom – up Trên nền tảng của hai nguyên lý, có thể tiến hành nhiều phương pháp và kỹ thuật để tổng hợp vật liệu có cấu trúc nanomet
Theo nguyên lý bottom – up, cấu trúc nano được hình thành bằng cách tập hợp, lắp ghép và phát triển từ các nguyên tử hay phân tử Quá trình này có thể được điều khiển thông qua các phản ứng hóa học, phương pháp vật lý hoặc kết hợp cả hai phương pháp có điều kiện dựa trên tính chất của nguyên liệu ban đầu [1] Nhược điểm của nguyên lý bottom – up là khó điều khiển, khó khống chế tốc độ kết tinh và quá trình tạo mầm nên có thể tạo hạt ở kích thước lớn Hơn nữa, dung môi sử dụng có thể gây độc cho mẫu Vì vậy, phương pháp này đòi hỏi phải kiểm soát chặt chẽ quá trình, tránh sử dụng các dung môi hữu cơ để hòa tan mẫu cũng như các vấn đề về dư lượng dung môi Các phương pháp được phát triển dựa trên nguyên lý bottom – up chủ yếu là kết tinh và lỏng siêu tới hạn
Nguyên lý top – down dựa trên việc sử dụng kỹ thuật bẻ gãy, lực cắt hoặc khắc để phá vỡ cấu trúc vật liệu khối về kích thước nano Các kỹ thuật được sử dụng phổ biến theo nguyên lý top – down là nghiền, siêu âm và đồng hóa
Phương pháp nghiền sử dụng năng lượng cơ học để phá vỡ vật lý các hạt thô thành các hạt mịn với kích thước nhỏ hơn Quá trình giảm kích thước vật liệu dựa trên lực cắt năng lượng cao và sự va chạm của hạt trong quá trình chuyển động bên trong buồng nghiền Nghiền có thể áp dụng cho các loại vật liệu kém hòa tan trong cả môi trường nước và môi trường hữu cơ cũng như tính linh hoạt cao trong việc xử lý số lượng lớn vật liệu Tuy nhiên, phương pháp này tốn nhiều thời gian, một phần nhỏ của hạt có thể nằm ở vùng kích thước lớn nếu không được kiểm soát chặt chẽ, đồng thời dễ bị nhiễm bẩn bởi vật liệu nghiền do sự ăn mòn trong thời gian dài [4]
Sóng siêu âm được chiếu xạ qua môi trường lỏng ở cường độ cao tạo ra một chu trình nén – giãn nở xen kẽ Trong chu kỳ áp suất thấp, sóng siêu âm tạo ra các bong bóng chân không nhỏ hoặc các khoảng trống chứa khí phân tán lơ lửng trong chất lỏng Khi các bong bóng đạt đến thể tích mà chúng không thể hấp thu năng lượng được nữa, chúng sẽ nhanh chóng sụp đổ tại chu kỳ áp suất cao và tạo ra làn sóng xung kích Tại đây, các hạt bị giảm kích thước bởi các lực xâm thực, hay còn gọi là hiện tượng cavitation [5] Phương pháp này được sử dụng phổ biến trong phòng thí nghiệm, khả năng đưa hạt về kích thước nhỏ tốt nhờ hệ số truyền khối cao Tuy nhiên, quá trình siêu âm có khả năng phân hủy nước thành các gốc tự do làm oxy hóa các hoạt chất có trong dung dịch
Máy đồng hóa rotor – stator gồm một rotor chuyển động với tốc độ gradient cao đặt gần một stator (cố định) tạo ra một lực cắt rất lớn để chia nhỏ các hạt Khoảng cách giữa rotor và stator cũng ảnh hưởng đến khả năng nén ép và kiểm soát kích
Máy đồng hóa rotor - stator nổi bật với những đặc điểm như tốc độ cao, lực cắt lớn và công suất mạnh mẽ Tuy nhiên, khả năng đồng nhất của máy受到 giới hạn bởi độ nhớt và tính chất cơ học của vật liệu.
1.1.4 Xu hướng kết hợp công nghệ nano và các hợp chất tự nhiên
1.1.4.1 Xu hướng sử dụng các hợp chất tự nhiên
Từ thời xa xưa, con người đã tận dụng các loài thảo dược làm phương tiện phòng chống và chữa lành bệnh tật Với sự phát triển của y học, nhiều hợp chất có nguồn gốc thiên nhiên và hoạt tính sinh học như flavonoid, alkaloid hay steroid đã được phát hiện và ứng dụng rộng rãi.
HỢP CHẤT MANGIFERIN
1.2.1 Khái quát về hợp chất mangiferin
Mangiferin là một hợp chất được tìm thấy trong nhiều loại thực vật khác nhau và thường xuất hiện dưới dạng glycoside, bao gồm thực vật thuộc họ Gentianaceae (như Canscora decussata), chi Swertia (như Swertia chirata, Swertia punicea), chi Salacia (như Salacia hainanensis, Salacia oblonga),… Trong số đó, các bộ phận của cây xoài chứa hàm lượng mangiferin đáng kể [14, 15] Hiện nay, mangiferin có thể được chiết xuất từ tự nhiên, đáng chú ý là sử dụng dược liệu lá xoài và lá dó bầu, ngoài ra còn được thu nhận bằng cách tổng hợp hóa học hoặc sinh tổng hợp [15]
1.2.2 Tính chất hóa học của mangiferin
Cấu trúc của mangiferin lần đầu tiên được làm sáng tỏ vào năm 1960 thông qua phân tích nhiễu xạ tia X và phổ cộng hưởng từ hạt nhân Mangiferin còn được gọi là alpizarin hoặc quinomine, một loại tinh thể màu vàng nhạt, thuộc nhóm các hợp chất hữu cơ của xanthone – một dạng của polyphenol Mangiferin cũng là hợp chất C- glycosyl, trong đó phần aglycone là gốc phenolic 1,3,6,7-tetrahydroxyxanthen-9-one liên kết với -D-glucosyl thông qua liên kết glycoside tại cacbon ở vị trí số 2 Khả năng bắt gốc tự do của mangiferin được cho là nhờ cấu trúc xanthonoid với sự hiện diện của nhiều nhóm -OH gắn trên vòng thơm Cùng với đó, mangiferin cũng có đặc tính chelate hóa sắt và ngăn chặn việc tạo ra gốc hydroxyl trong các phản ứng kiểu Fenton [14, 16]
Mangiferin có độ hòa tan rất kém trong nước, chỉ đạt mức 0,11 mg/mL ở 30°C [17] Liu và các cộng sự đã báo cáo rằng sự hấp thụ mangiferin qua đường uống ở chuột khá thấp với sinh khả dụng chỉ đạt 1,2%, đồng thời nồng độ tối đa trong huyết tương thu được tương đối kém và không nhất quán (715,04 ± 600,14 ng/mL sau 0,72 giờ uống) Tính ưa béo của mangiferin kém cũng dẫn đến tính thấm qua màng ruột và khả năng hấp thu qua đường uống thấp [18, 19]
Bảng 1.1 Tính chất của mangiferin
1,3,6,7-tetrahydroxy-2-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy- 6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]-9H-xanthen-9-one
Tên khoa học 2-C--D-glucopyranosyl-1,3,6,7-tetrahydroxyxanthone
Khối lượng phân tử 422,35 g/mol Điểm nóng chảy 271 o C Độ hòa tan Tan rất kém trong nước (0,11 mg/mL)
1.2.3 Tác dụng dược lý của mangiferin
Nghiên cứu về dược lý chỉ ra mangiferin có tác dụng tích cực lên hệ thần kinh trung ương, hô hấp và tim mạch Ngoài ra, mangiferin còn có nhiều đặc tính ưu việt đối với sức khỏe nhờ nhiều hoạt tính dược lý khác nhau, bao gồm kháng khuẩn, kháng viêm, kháng virus, chống ung thư, chống tiểu đường, chống oxy hóa, điều hòa miễn dịch, bảo vệ gan, giảm đau…
Một nghiên cứu đã chứng minh rằng mangiferin có tác dụng kháng khuẩn in vivo đối với các tác nhân gây bệnh nha chu, bao gồm vi khuẩn Prevotella intermedia và Porphyromonas gingivalis Hơn nữa, khi kết hợp với polyethylene glycol-400, mangiferin còn cho thấy hiệu quả kháng khuẩn cao hơn.
(PEG-400) cũng thể hiện hoạt tính kháng khuẩn vượt trội khi chống lại 7 loài vi khuẩn
10 và 5 loài nấm khác nhau (Bacillus pumilus, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus,
Staphylococcus citreus, Escherichia coli, Thermoascus aurantiacus, Trichoderma reesei, Klebsiella pneumoniae, Salmonella agona, Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus flavus và Aspergillus fumigatus) Trong đó, mangiferin cho thấy hiệu quả kháng vi khuẩn Gram (+) tốt hơn Gram (-), đặc biệt là loài Bacillus pumilus [21]
Somani và các cộng sự chứng minh mangiferin ức chế MMP-9 và TNF-α, cải thiện tình trạng viêm đại tràng do DSS Szandruk và cộng sự cũng cho thấy mangiferin giảm hoạt động của SOD, TNF-α, IL-17 và MDA ở chuột bị viêm đại tràng do TNBS Ngoài ra, mangiferin có lợi cho các bệnh tiểu đường, tổn thương gan, tim mạch và các bệnh liên quan đến viêm khác ở mô hình động vật nhờ tác dụng chống viêm của chúng.
Tác dụng kháng virus Herpes simplex 1 (HSV-1) của mangiferin và đồng phân isomangiferin được chứng minh thông qua kỹ thuật nuôi cấy mô với tỷ lệ giảm tái tạo màng virus tương ứng là 56,8% và 69,5% [25] Bên cạnh đó, nghiên cứu in vitro về tác dụng của mangiferin đối với virus Herpes simplex 2 (HSV-2) cho thấy chúng có khả năng ức chế giai đoạn đầu quá trình nhân lên của HSV-2 bằng cách phá vỡ sự tái tạo màng virus trên trên tế bào HeLa ở giá trị EC50 1,7 g/mL [26] Mangiferin cũng được xem là một hợp chất tiềm năng trong việc kiểm soát sự lây nhiễm của poliovirus – tác nhân gây ra bệnh bại liệt – tại giá trị IC50 là 53,5 μg/mL [27]
Hoạt tính kháng oxy hóa
Mangiferin chứng minh đặc tính kháng oxy hóa mạnh dựa trên các nghiên cứu sử dụng phương pháp DPPH hay phương pháp năng lực khử Fe 3+ Chiết xuất mangiferin bằng dung môi methanol trên lá Bombax ceiba có giá trị EC50 là 5,8 μg/mL (DPPH) và thể hiện tác dụng bảo vệ gan trước những tổn thương do carbon
Mangiferin thể hiện hoạt tính chống oxy hóa mạnh thông qua việc trung hòa các gốc tự do in vivo Nghiên cứu trên nhũ tương nước/acid linoleic cho thấy mangiferin ức chế hiệu quả các gốc hydroxyl, đạt 84,3% ở 37°C và 79,8% ở 80°C Hoạt tính này cao hơn cả quercetine, một chất chống oxy hóa mạnh được biết đến.
Việc sử dụng mangiferin đã làm tăng khả năng chịu đựng của các tế bào hồng cầu trước những tấn công của các gốc tự do Đồng thời, mangiferin còn ngăn ngừa sự suy giảm GTP và tổng số nucleotides, cũng như sự tổn thương tế bào do H2O2 gây ra [30] Nghiên cứu của A Vyas và các cộng sự cho thấy cơ chế chống oxy hóa của mangiferin dường như được thực hiện trung gian thông qua việc bắt các gốc tự do, ức chế quá trình peroxy hóa lipid cũng như điều chỉnh điện thế màng ti thể [16]
Hoạt tính chống ung thư
Nghiên cứu của Rajendran và cộng sự đã giải thích mối liên hệ độc đáo giữa tác dụng chống oxy hóa đến khả năng ngăn ngừa ung thư của mangiferin Bổ sung 100 ppm mangiferin giúp tăng cường các enzym giải độc và giảm tổn thương DNA khi xác định bằng phương pháp điện di đơn bào Hơn nữa, các liên kết chéo DNA– protein ở động vật mang bệnh ung thư phổi cũng được điều chỉnh so với mức ban đầu [31]
Guha và các cộng sự cũng đã đánh giá hiệu quả của mangiferin đối với tác dụng chống lại khối u, điều hòa miễn dịch và khả năng chống HIV Trong đó, mangiferin thể hiện tính chất nổi bật trong việc ức chế sự phát triển của u xơ cổ chướng, giảm độc tính tế bào khối u tại lá lách và sự di căn đến phúc mạc ở chuột [16]
Hỗ trợ điều trị các bệnh lý về gan
Mangiferin bảo vệ các tế bào gan khỏi những tổn thương bằng cách tạo phức với Fe 3+ và trung hòa các tác nhân gốc tự do Khả năng tạo phức với Fe 3+ của mangiferin đã được chứng minh như một cơ chế chính để bảo vệ ty thể gan chuột chống lại quá trình peroxy hóa lipid của ty thể gây ra bởi Fe 2+ - citrate [32]
Hoạt tính chống tiểu đường
Mangiferin được chứng minh có khả năng hạ đường huyết bằng cách điều chỉnh sự chuyển hóa glucose, cải thiện tình trạng kháng insulin Đồng thời, việc sử dụng
12 mangiferin làm giảm quá trình tổng hợp cholesterol cũng như ức chế yếu tố hoại tử khối u alpha (TNF) và sự tổng hợp oxit nitric cảm ứng (iNOS), do đó được sử dụng trong điều trị bệnh tiểu đường tuýp 2 [33]
TỔNG QUAN VỀ LÁ DÓ BẦU
Các nghiên cứu về phân lập thành phần hoạt chất trong lá dó bầu cho thấy chúng có chứa hàm lượng mangiferin tương đối cao Điều này cho thấy lá dó bầu là một trong những nguồn dược liệu tiềm năng để khai thác và tinh chế mangiferin bên cạnh mục đích lấy “trầm” như hiện nay
1.3.1 Khái quát về cây dó bầu
Cây dó bầu (Aquilaria crassna Pierre ex Lecomte) hay còn được gọi với tên dó trầm, trầm dó, trầm hương, … là một trong 4 loài dó có khả năng sinh trầm trong thân cây được trồng nhiều tại Việt Nam, bên cạnh dó gạch (Aquilaria bailloni), dó bà nà (Aquilaria banaensis) và dó quả nhăn (Aquilaria rugosa) Nhờ khả năng tạo trầm và kì nam hiệu quả cao nên phần lớn diện tích trồng trầm trên phạm vi cả nước chủ yếu là loại dó bầu [35] Phân loại khoa học về cây dó bầu được trình bày trong Bảng 1.3
Bảng 1.3 Hệ thống phân loại cây dó bầu [36]
Hệ thống phân loại (Taxonomy)
Phân lớp Rosanae Loài A.crassna
Tên khoa học Aquilaria crassna Pierre ex Lecomte
Tên thương mai Agarwood, Eagle Wood
1.3.2 Đặc điểm hình thái cây dó bầu
Dó bầu là loài thực vật ưa sáng, phân bố rải rác ở các khu rừng nhiệt đới, thường gặp tại độ cao từ 50 – 1200 m Đây là cây gỗ thường xanh, có chiều cao trung bình từ 15 – 25 m và đường kính thân từ 40 cm trở lên Vỏ ngoài cây dó bầu khá mỏng, thường mang màu nâu xám, có nhiều vết nứt dọc và dễ bong ra khỏi thân Cây có đặc điểm là cành non thường phủ lớp lông mềm màu vàng xám, tán lá tương đối thưa.
Hình 1.1 Các bộ phận của cây dó bầu
Lá dó bầu mọc đơn, xếp so le, thường có hình ngọn giáo hoặc hình bầu dục với chóp lá nhọn và thon hẹp ở phần cuống Mặt trên của lá có màu xanh nhẵn bóng, mặt dưới màu nhạt hơn và có lông mịn, dài cỡ 8 – 15 cm, rộng 4 – 6 cm Cuống lá dài từ
4 – 5 mm và có lớp lông mỏng
Thông thường, cây dó bầu bắt đầu ra hoa và kết trái sau khoảng 4 – 5 năm tuổi tùy vào điều kiện thời tiết của mỗi vùng miền Hoa dó bầu nhỏ, mọc thành cụm hình tán ở nách lá gần đầu cành non, màu trắng tro Quả dó bầu giống hình trứng ngược, dài 3 – 5 cm và có nhiều lông Khi chín, quả thường mở thành hai mảnh, có từ một đến hai hạt màu nâu đen với phần vỏ ngoài cùng hóa gỗ cứng và bên trong mềm chứa nhiều dầu [36, 37] Tại Việt Nam, trước đây cây dó bầu thường mọc hoang ở những vùng núi thuộc tỉnh Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Bình, Quảng Trị, … Do trầm tạo ra có giá trị kinh tế cao nên diện tích trồng dó bầu đã bị khai thác bừa bãi dẫn đến có tên trong Sách Đỏ Việt Nam (1996) với mức độ đánh giá “đang nguy cấp” (Bậc E) [37] Khoảng vài năm gần đây, phong trào trồng dó bầu trở nên phổ biến và phát triển mạnh mẽ, lan rộng khắp khu vực miền Trung, Đông Nam Bộ và Tây Nguyên Để cây dó bầu đủ độ trưởng thành và trầm hương hình thành có chất lượng tốt đòi hỏi thời gian sinh trưởng tương đối lâu, từ 10 năm trở lên Nhằm tối đa hóa lợi ích kinh tế trong thời gian trồng cây dó bầu và tận dụng nguồn nguyên liệu phế phẩm, cần phải nghiên cứu công dụng và tiềm năng phát triển của các bộ phận khác, điển hình là lá cây
1.3.3 Thành phần hóa học của lá dó bầu
Bảng 1.4 Thống kê thành phần hóa học trong cây dó bầu
Nhóm chức Thành phần chính
5-hydroxy-6-methoxy-2-(2-phenylethyl) chromone, 6- methoxy-2-[2-(3-methoxy-4- hydroxyphenyl)ethyl]chromone, 6-hydroxy-2-[2-(4-hydroxyphenyl) ethyl] chromone
Acid phenolic Acid p-hydroxybenzoic, acid vanillic, acid isovanillic, methylparaben, acid syringic, acid protocatechuic
Ergosterol, β-sitosterol, β-sitostenone, stigmasterol, β- daucosterol
N- hexadecanoic acid, acid nonanoic, acid pentadecanoic, 1,2,3-propanetriol, monoacetate, acid 9,12,15- octadecatrienoic, dodecyl acrylate, 1-tetradecanol
Aquilarisinin, aquilarinoside, aquilarinenside, iriflophenone 2- O-α-L-rhamnopyranoside, iriflophenone 3-C-β-D-glucoside, iriflophenone 3-C-β-d-glucoside
Xanthonoid Aquilarixanthone, mangiferin, neomangiferin, homomangiferin, isomangiferin
Apigenin -7, 4'-dimethyl ether, genkwanin 5-O--primevoside, hydroxygenkwanin, luteolin, luteolin-7,3',4'-methyl ether, luteolin-7, 4'-dimethyl ether, 5-hydroxy-4’,7- dimethoxyflavonoid, 5,3’-dihydroxy-7,4’-dimethoxyflavone, delphinidin-3-glucoside, hypolaetin 5-O-β-D- glucuronopyranoside, epicatechin gallate, epigallocatechin gallate, vitexin
Terpenoid Phytol, squalene, friedelan-3-one, epifriedelanol, friedelin
Tetracosane, docosane, dodecane, 9-hexacosene, octacosane, z-14-nonacosane, 1-bromodocosane, heptadecane, heneicosane, 1-hexacosene, triacontane
17 Bên cạnh mangiferin, nhiều thành phần hóa học khác trong lá dó bầu cũng được tập trung nghiên cứu và xác định, bao gồm các nhóm chức 2-(2-phenylethyl) chromone, acid phenolic, steroid, acid béo, benzophenone, xanthonoid, flavonoid, terpenoid và alkane [38, 39] Trong đó, iriflophenone 3,5-C-β-D-diglucoside, iriflophenone 3-C-β-D-glucoside, genkwanin 5-O--primevoside và mangiferin là những hoạt chất có hàm lượng tương đối cao và mang những hoạt tính sinh học vô cùng nổi trội [40]
1.3.4 Ứng dụng của lá dó bầu
Theo truyền thống, lá dó bầu được sử dụng trong trà thảo mộc để hỗ trợ tim mạch và hệ tuần hoàn máu Các nghiên cứu về lá dó bầu cho thấy chiết xuất của chúng chứa nhiều thành phần có tác dụng kháng viêm, kháng khuẩn, chống oxy hóa, điều hòa huyết áp cũng như đặc tính nhuận tràng và bảo vệ thần kinh Trong đó, 4 thành phần chính thể hiện những hoạt tính sinh học khác nhau Nhờ vậy, dịch chiết từ lá dó bầu có khả năng mang đến những tác dụng hiệu quả hơn so với việc sử dụng từng hợp chất đơn lẻ Đồng thời, chiết xuất từ lá dó bầu cũng đã được nghiên cứu về độc tính cấp tính qua đường miệng ở chuột và được chứng minh là an toàn [4]
EakkalukWongwad và cộng sự đã tiến hành đánh giá hoạt tính chiết xuất lá dó bầu được thu hái từ nhiều nơi ở Thái Lan Chiết xuất từ lá non lần lượt bằng dung môi ethanol 70% và nước thể hiện các đặc tính chống đường hóa tốt với nồng độ IC50 lần lượt đạt 5,21 ± 0,54 μg/mL và 9,00 ± 1,38μg/mL khi so sánh với chất chuẩn aminoguanidine (9,69 ± 0,75 μg/mL) thông qua xét nghiệm albumin-fructose huyết thanh bò Ngoài ra, chiết xuất lá dó bầu trong nước còn thể hiện khả năng ức chế interleukin-1α (IL-1α) và interleukin-8 (IL-8) mạnh, trong khi chiết xuất từ ethanolic 70% cho thấy sự ức chế IL-1α và NO Kết quả nghiên cứu đã chứng minh chiết xuất từ lá non của A crassna có khả năng kháng viêm tốt, nhờ đó mở ra triển vọng ứng dụng trong ngành mỹ phẩm [41]
Mặc dù vậy, độ hòa tan kém khiến các ứng dụng từ chiết xuất lá dó bầu trong lĩnh vực thực phẩm chức năng và mỹ phẩm trong nước cho đến nay vẫn còn hạn chế
CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN
1.4.1 Phương pháp phân lập, tinh chế mangiferin
Mangiferin, với vô số hoạt tính dược lý và ứng dụng đa dạng, đã thu hút sự chú ý rộng rãi Nghiên cứu tập trung vào việc phát triển các phương pháp chiết xuất và phân lập hiệu quả từ nhiều nguồn thực vật với mục tiêu tối ưu hóa sản lượng để khai thác tối đa tiềm năng của mangiferin.
Năm 2017, O.R Alara và các cộng sự đã nghiên cứu tối ưu hóa qui trình chiết xuất mangiferin từ quả Phaleria macrocarpa bằng phương pháp chiết cận tới hạn với dung môi là nước Hàm lượng mangiferin tối ưu thu được là 38,71 mg/g tại điều kiện nhiệt độ chiết tối ưu 105 o C trong thời gian 6 giờ [42]
Năm 2019, Lerma-Torres cùng các cộng sự đã tiến hành đánh giá ảnh hưởng của các phương pháp chiết xuất khác nhau đến hàm lượng mangiferin trong lá xoài
Ataulfo và Autochthonous ở Mexico Các phương pháp được sử dụng bao gồm ngâm dầm, chiết Soxhlet, siêu âm và sử dụng vi sóng với hệ dung môi ethanol: nước (tỷ lệ 8:2 v/v) Kết quả nghiên cứu cho thấy quá trình chiết xuất được hỗ trợ bởi sóng siêu âm cho hiệu quả cao nhất, hàm lượng mangiferin thu được là 1,45 mg/g lá khô khi thực hiện ở qui mô lớn [43]
Cũng trong cùng năm, K Anbalagan và cộng sự đã tiến hành khảo sát sự ảnh hưởng của các loại dung môi và điều kiện chiết đến khả năng thu hồi mangiferin từ lá xoài Mangifera indica Quá trình sử dụng phương pháp ngâm dầm 2 lần với các dung môi lần lượt là hexane, ethyl acetate, acetone và ethanol Kết quả nghiên cứu cho thấy năng suất thu hồi mangiferin đạt 24,09% với điều kiện chiết tối ưu là sử dụng dung môi ethanol, thời gian chiết 6 giờ ở 70 o C và tỷ lệ mẫu: dung môi là 1:15 (g/g) [44] Ở Việt Nam, quá trình phổ biến dùng để tinh chế hoạt chất trong dịch chiết từ thực vật là sử dụng dung môi có độ phân cực khác nhau Tuy nhiên, phương pháp truyền thống này thường tiêu tốn nhiều dung môi, thời gian chiết lâu dẫn đến kém khả thi về mặt kinh tế, đồng thời hiệu quả tinh sạch còn chưa cao
Do đó, nhu cầu phát triển một kỹ thuật đơn giản nhưng hiệu quả và thân thiện với môi trường để tinh chế các sản phẩm tự nhiên như mangiferin ngày càng cao Hấp phụ và giải hấp phụ trên nhựa macroporous đã được chứng minh là một kỹ thuật hiệu quả nhờ các đặc tính vốn có của chúng như khả năng hấp phụ cao, tính tiện lợi, chi phí vận hành thấp Ngoài ra, phương pháp này tiêu thụ dung môi thấp hơn và không có dư lượng hóa chất trong sản phẩm, đồng thời dễ dàng tái sinh chất hấp phụ Ngày càng nhiều nghiên cứu thành công trong việc ứng dụng nhựa hấp phụ để làm giàu nhiều loại hợp chất khác nhau, bao gồm polyphenol, glycoside và carotenoid từ thực vật Ngoài ra, để cải thiện độ phân giải của quá trình phân tách, việc kết hợp nhựa hấp phụ với sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) cũng được sử dụng
Trong nghiên cứu năm 2016, Sihui Nian và các cộng sự đã sử dụng nhựa hấp phụ macroporous để tinh chế 4 hợp chất xanthone và saponin steroid có hoạt tính sinh học, bao gồm neomangiferin và mangiferin Các hợp chất chiết xuất thô từ thảo dược Anemarrhenae Rhizome được phân đoạn bằng polyamide T60-100, sau đó tinh chế bằng nhựa macroporous HPD400 Với quy trình tối ưu hóa, họ thu được 2,31 g neomangiferin và 4,10 g mangiferin từ 1 kg nguyên liệu thô, đạt độ tinh khiết lần lượt là 90,0% và 92,15% Kết quả này chứng minh rằng sắc ký cột kết hợp với polyamide và nhựa hấp phụ macroporous là giải pháp xanh và hiệu quả để tinh chế các thành phần có hoạt tính sinh học từ thực vật ở quy mô lớn.
1.4.2 Tạo hệ phân tán nano mangiferin
Trước những thách thức về độ hòa tan và sinh khả dụng kém, một vài nghiên cứu đã cố gắng nâng cao sinh khả dụng qua đường uống của mangiferin bằng cách xây dựng công thức phân tán mangiferin dạng rắn, tạo phức với β-cyclodextrin, phospholipid hay sử dụng kỹ thuật sấy phun Tuy nhiên, các phương pháp này đạt hiệu quả chưa cao trong việc khắc phục hoàn toàn các vấn đề về khả năng hòa tan, tính ưa béo và cuối cùng là sinh khả dụng của mangiferin [46]
Gần đây, với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ nano, một vài nghiên cứu đã tiến hành thử nghiệm bao bọc và đưa mangiferin về kích thước nano Năm 2018, Rohini Samadarsi và cộng sự đã nghiên cứu tạo hệ nano mangiferin chiết xuất từ
Curcuma amada được bao bọc bởi β-lactoglobulin (β-LG) bằng phương pháp de- solvate hóa Thông qua kỹ thuật tán xạ ánh sáng động (DLS), kích thước trung bình và thế zeta của hạt nano lần lượt được xác định là 31,89 ± 10 nm và -30,0 ± 0,2 mV Các nghiên cứu ở đường tiêu hóa cũng chứng minh độ bền của các hạt nano trước tác động của enzyme pepsin trong dịch dạ dày tốt hơn so với enzyme pancreatin ở tụy
Sự giải phóng mangiferin được quan sát thấy trong dịch ruột là khoảng 80% trong 8 giờ Thử nghiệm DPPH cũng cho thấy việc bao bọc nano mangiferin vẫn giữ được đặc tính chống oxy hóa [47]
Năm 2019, Razura-Carmona FF và các cộng sự phát triển nghiên cứu tạo hạt nano mangiferin được bao bọc bằng poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) thông qua phương pháp làm bay hơi dung môi trong nhũ tương với kích thước hạt trung bình là 176,7 ± 1,021 nm, hiệu suất bao bọc mangiferin đạt khoảng 55% Đồng thời, nghiên cứu cho thấy quá trình bao bọc đã bảo vệ mangiferin trước sự phân hủy trong dạ dày (1,5 giờ) và không can thiệp vào sự trao đổi chất của các tế bào khỏe mạnh cũng như các hoạt động sinh học của chúng [48]
Công nghệ nano đang mở ra nhiều tiềm năng trong việc bào chế các hệ phân tán cao chiết lá dó bầu và mangiferin Tuy nhiên, nghiên cứu ứng dụng công nghệ này vào lĩnh vực này còn hạn chế Do đó, nghiên cứu này bertujuan xây dựng quy trình tạo các hệ phân tán từ chiết xuất lá dó bầu, tạo tiền đề cho các ứng dụng trong dược phẩm và mỹ phẩm.
THỰC NGHIỆM
MỤC TIÊU VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Lá dó bầu chứa thành phần hóa học và hoạt tính sinh học nổi trội, ứng dụng tiềm năng trong dược phẩm và chăm sóc cá nhân, đồng thời là nguồn phân lập hoạt chất mangiferin Tuy nhiên, đặc tính kém tan trong nước và thẩm thấu thấp hạn chế ứng dụng Công nghệ nano được xem là giải pháp để tăng độ hòa tan và cải thiện sinh khả dụng của cao lá dó bầu và mangiferin.
Do vậy, nghiên cứu tiến hành khảo sát quá trình tạo một số hệ phân tán từ cao chiết và chế phẩm lá dó bầu Đồng thời so sánh hiệu quả và hoạt tính của các hệ phân tán so với hệ phân tán đi từ mangiferin trên thị trường, từ đó định hướng ứng dụng trong sản phẩm chăm sóc cá nhân cũng như thử nghiệm đưa hệ phân tán về dạng bột.
NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Để đáp ứng được mục tiêu đặt ra, nội dung nghiên cứu sẽ bao gồm:
− Chuẩn bị cao chiết, tiến hành nâng cao hàm lượng mangiferin từ cao chiết
− Đánh giá tính chất cao chiết, chế phẩm lá dó bầu và mangiferin tinh khiết
− Nghiên cứu tạo hệ phân tán cao chiết lá dó bầu, hệ phân tán chế phẩm lá dó bầu và hệ phân tán mangiferin
− Đánh giá tính chất, độ hòa tan và hoạt tính sinh học của các hệ huyền phù
− Thử nghiệm đưa các hệ phân tán về dạng bột sấy phun
− So sánh, đánh giá tính chất trên các sản phẩn thu được và kết luận
NGUYÊN LIỆU VÀ THIẾT BỊ SỬ DỤNG
Nguyên liệu chính bao gồm lá dó bầu được thu hoạch vào tháng 11 tại Bình Phước Sau đó, lá dó bầu được tiền xử lý bằng cách rửa sạch, loại bỏ lá bệnh, sâu rầy và phơi khô để chuẩn bị cho giai đoạn xử lý tiếp theo
Mangiferin 95% được mua từ công ty Shaanxi Yuantai Biological Technology Co., Ltd
Bảng 2.1 Hóa chất sử dụng và nguồn gốc
STT Tên hóa chất Nguồn gốc
15 Thuốc thử Folin-Ciocalteau Đức
Bảng 2.2 Các dụng cụ và thiết bị sử dụng
Bình cầu và bẫy cô quay Cân 4 số Satorius CPA224S
Cánh khuấy Máy cô quay chân không
Nhiệt kế Thiết bị lọc chân không
Cốc thuỷ tinh Bể siêu âm
Bình định mức Máy đo độ ẩm Satorius MA35 Ống nhỏ giọt Máy đo UV-Vis Helios Epsilon
Micro pipette Máy đồng hóa FJ – 200
Pipette Thiết bị LDS Horiba LA – 950V2
Burette Máy đồng hóa tốc độ cao FSH-2A
Phễu lọc Máy đo SEM JSM-IT100 InTouchScope™
Lọ thủy tinh Máy đo pH Lab 850 Schott Instrument Đầu lọc syringe 0,45 m Máy đo màu Konica Minolta CR – 400
Máy sấy phun LabPlant SD – 05 Thiết bị HPLC Agilent 1260 Infinity
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4.1 Đánh giá tính chất ngoại quan của mẫu
2.4.1.1 Xác định độ ẩm Độ ẩm của mẫu được xác định bằng máy đo độ ẩm Satorius MA35 tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Hữu cơ Một lượng mẫu vừa đủ được trải đều trên một đĩa nhôm và được đặt vào buồng mẫu để tiến hành đo Độ ẩm của mẫu sẽ được tính dựa trên sự chênh lệch khối lượng giữa mẫu ban đầu và mẫu khô sau khi đã loại bỏ hoàn toàn ẩm
24 bằng phương pháp nhiệt Tiến hành đo độ ẩm 3 lần và lấy giá trị trung bình Giá trị độ ẩm được tính theo công thức:
Trong đó: 𝑤̅: độ ẩm trung bình của nguyên liệu (%) n: số lần đo
𝑤 𝑖 : độ ẩm của nguyên liệu tại lần thí nghiệm thứ i (%)
Kích thước màu mẫu được đo bằng phương pháp đo phản xạ bề mặt, dựa trên không gian màu CIE LCh, sử dụng máy Konica Minolta CR - 400 tại phòng thí nghiệm Bộ môn Hữu cơ Hệ thống đơn vị đo được sử dụng bao gồm:
• Trục L đặc trưng cho độ sáng của màu sắc, được thể hiện từ màu đen tuyệt đối (L=0) đến màu trắng tuyệt đối (L0)
• Trục C đại diện cho độ bão hòa màu, có giá trị thay đổi từ 0% (màu xám) tương ứng vị trí hoàn toàn không bão hòa đến 100%
• Trục h đại diện cho sắc màu và được biểu diễn trên vòng tròn màu theo chiều ngược chiều kim đồng hồ, tương ứng từ góc 0 o (màu đỏ) sang 90 o (màu vàng),
180 o (màu xanh lục) đến 270 o (màu xanh dương) và quay lại 0 o Ở dạng dung dịch, mẫu sẽ được chứa trong cuvette còn ở dạng bột thì mẫu được đặt vào giữa 2 lam kính thuỷ tinh Đặt đầu dò lên bề mặt cuvet hay lam kính có chứa mẫu, tiến hành đo 3 lần và lấy kết quả trung bình Sự biến thiên màu sắc được tính bằng công thức sau: ∆𝐸 = √(∆𝐿) 2 + (∆𝐶) 2 + (∆ℎ) 2 (2)
E sẽ cho biết khoảng cách hình học của hai màu trong một hệ thống
2.4.2 Định lượng các hoạt chất trong mẫu
2.4.2.1 Xác định hàm lượng mangiferin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Thiết bị sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) Agilent 1260 Infinity theo mô hình sắc kí pha đảo được sử dụng để xác định hàm lượng mangiferin
Bảng 2.3 Thiết bị và thông số thiết lập HPLC
Cột pha tĩnh C18 (150 mmì4,6 mm, 5 àm)
Dung dịch nước pH 3,0 và acetonitrile với tỉ lệ 85:15 (v/v) Nước sử dụng có pH 3,0 được điều chỉnh bằng dung dịch acid orthophosphoric
Tốc độ dòng 0,9 mL/phút Đầu dò Diod array detector (DAD) tại bước sóng 256 nm
Chuẩn bị: Các dụng cụ chứa mẫu phải được rửa sạch và ngâm trong EtOH trong 24 giờ nhằm tránh lẫn tạp chất Dung môi dùng làm pha động được khử bọt khoảng 15 phút trong bể siêu âm trước khi sử dụng Các dung dịch chất chuẩn, dung dịch mẫu được lọc bằng đầu lọc 450 nm trước khi được tiêm vào máy HPLC.
Xây dựng đường chuẩn: Hòa tan chất chuẩn mangiferin (5 mg) bằng 50 mL MeOH thu được dung dịch gốc Dung dịch sau đó được pha loãng thành các nồng độ tương ứng 5, 10, 15, 20, 25, 30 ppm bằng dung môi MeOH Mỗi nồng độ được chuẩn bị 3 mẫu (n=3) Tiến hành đo mẫu bằng phương pháp HPLC dựa trên các thông số thiết lập ở Bảng 2.3 Đo mẫu: Tiến hành chuẩn bị và thực hiện mẫu tương tự như chất chuẩn Hàm lượng xanthone được xác định theo phương trình đường chuẩn như sau:
Trong đó: C – Nồng độ mangiferin trong mẫu (ppm)
2.4.2.2 Xác định hàm lượng xanthone bằng phản ứng tạo phức với AlCl 3 (UV-
Thuốc thử AlCl3 tạo phức bền với C-4 nhóm ketone, C-3 và C-5 nhóm hydroxyl của flavon và flavonol tạo thành phức màu xanh lá đặc trưng có độ hấp thu cực đại tại 410 nm Ngoài ra, AlCl3 còn tạo ra phức acid không bền với nhóm ortho- dihydroxyl gắn trên vòng A- và B- đặc trưng của nhóm flavonoids
Các dụng cụ thí nghiệm tiếp xúc với dung dịch phản ứng được rửa sạch và ngâm trong dung dịch EDTA 5% trong 24 giờ trước phản ứng
Thuốc thử AlCl3 10% (m/v): Hòa tan 1 g AlCl3 khan trong 10 mL nước cất
Dung dịch potassium acetate 0,03 M: Hòa tan 294 mg bột potassium acetate khan trong 100 mL nước cất
Dung dịch chuẩn mangiferin nồng độ 2.000 µg/mL được pha chế bằng cách hòa tan 20 mg mangiferin vào 10 mL EtOH để tạo dung dịch gốc Sau đó, dung dịch gốc được pha loãng thành các dung dịch chuẩn có nồng độ lần lượt là 20, 40, 60, 80 và 100 µg/mL Mỗi nồng độ được chuẩn bị riêng biệt để đảm bảo độ chính xác trong phân tích.
Cho lần lượt 1,5 mL EtOH và 0,1 mL dung dịch AlCl3 10% vào 0,5 mL dung dịch mangiferin Sau 5 phút, thêm 3 mL dung dịch potassium acetate 0,03M Để yên phản ứng ở nhiệt độ phòng trong 30 phút, rồi đo độ hấp thu ở bước sóng 410 nm Đo mẫu: Thực hiện chuẩn bị dung dịch mẫu và phản ứng tương tự như đối với dung dịch chuẩn Hàm lượng xanthone được xác định theo phương trình đường chuẩn.
Trong đó: C – Nồng độ xanthone trong mẫu (ppm)
A – Độ hấp thu tại bước sóng 410 nm
2.4.2.3 Xác định hàm lượng polyphenol bằng phản ứng màu Folin-Ciocalteu
Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol dựa trên phản ứng khử hỗn hợp heteropolyphosphotungsat – molypdat bằng hợp chất phenol trong môi trường kiềm tạo ra dung dịch màu xanh lam có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 760 nm Đo độ hấp thu ở bước sóng 760 nm kết hợp đồ thị đường chuẩn với chất chuẩn là acid gallic sẽ tính được hàm lượng các hợp chất phenolic có trong mẫu phân tích Quá trình được thực hiện dựa trên phương pháp TCVN 9745 – 1:2013
Dung dịch chuẩn acid gallic nồng độ 1000 àg/mL: Hũa tan 0,1 g acid gallic khan và định mức đến 100 mL Dùng pipet chuyển các thể tích dung dịch chuẩn acid gallic và pha loóng thành cỏc nồng độ tương ứng 10, 20, 30, 40, 50 àg/mL, mỗi nồng độ ba mẫu (n=3)
Cho 2,500 mL thuốc thử Folin – Ciocalteau 10% vào 0,5 mL dung dịch acid gallic ở các nồng độ khác nhau đã định sẵn, đồng nhất bằng bể lắc siêu âm trong 5 phút ở nhiệt độ phòng Hỗn hợp trên được thêm 2 mL dung dịch Na2CO3 7,5%, sau đó cho phản ứng ở nhiệt độ phòng trong 60 phút và tiến hành đo mật độ quang ở bước sóng λ = 760 nm Đo mẫu: Chuẩn bị dung dịch mẫu và thực hiện phản ứng tương tự như chất chuẩn
Hàm lượng polyphenol được xác định theo phương trình đường chuẩn như sau:
Trong đó: C – Nồng độ polyphenol trong mẫu (ppm)
A – Độ hấp thu tại bước sóng 760 nm
2.4.3 Phân tích hình thái và kích thước hạt nano
2.4.3.1 Xác định phân bố kích thước hạt bằng phương pháp LDS
Kích thước trung bình và sự phân bố kích thước hạt thường được xác định bằng phương pháp phổ nhiễu xạ laser (LDS) sử dụng máy đo phổ nhiễu xạ laser LDS Horiba Phân tích phổ nhiễu xạ laser là một kỹ thuật có thể xác định kích thước và phân bố kích thước hạt trong hệ phân tán bằng cách đo mẫu tán xạ laser.
LA – 950V2 tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Hữu cơ Hệ thống sử dụng 2 nguồn sáng
28 để kiểm soát sự tương tác của mẫu với ánh sáng, trong đó diode phát quang màu xanh dũ được cỏc hạt nhỏ đến kớch thước 0,01 àm và tia laser màu đỏ cú thể dũ được cỏc hạt có kích thước đến 3 mm
Khi chạy qua chùm tia laser, do sự chuyển động ngẫu nhiên của các hạt trong hệ phân tán và kích thước khác nhau của chúng mà ánh sáng sẽ va đập với các hạt và tán xạ ở các góc độ khác nhau Dựa vào đó, kích thước hạt trung bình sẽ được tính toán theo thuyết Mie
2.4.3.2 Xác định hình thái hạt bằng phương pháp SEM
NỘI DUNG THỰC NGHIỆM
2.5.1 Chuẩn bị và đánh giá nguyên liệu
Quy trình chuẩn bị cao chiết và chế phẩm được thể hiện trong Hình 2.1
Hình 2.1 Qui trình điều chế cao chiết và chế phẩm
Lá dó bầu sau khi thu hoạch được rửa sạch để loại bỏ tạp chất, sau đó tiến hành sấy khô bằng không khí nóng ở 50 o C cho đến khi độ ẩm trong nguyên liệu thấp hơn
32 12% Nghiền lá dó bầu khô đến độ mịn từ 1 – 2 mm và lưu trữ trong túi kín kèm gói silica gel hút ẩm, không tiếp xúc với ánh sáng mặt trời trực tiếp
Bột lá dó bầu tiếp tục được chiết nóng với ethanol 60 o , mỗi mẫu 50 g bột khô được chiết 3 lần, mỗi lần 1 giờ tại nhiệt độ 70 o C Tỷ lệ giữa khối lượng bột khô và thể tích dung môi được sử dụng là 1:10 (g/mL) Sau đó, thực hiện lọc chân không thu được dịch chiết ethanol và bã Toàn bộ dịch trích ly được cô quay áp suất kém để loại bỏ dung môi Cao chiết được bảo quản lạnh trong điều kiện kín khí để tăng thời gian lưu trữ Hiệu suất thu cao tổng được tính theo công thức:
Trong đó: H: hiệu suất thu cao tổng (%)
𝑚 𝑐𝑎𝑜 : khối lượng cao thu được sau quá trình chiết (g)
𝑚 𝑛𝑙𝑘 : khối lượng nguyên liệu khô đem chiết (g)
Tiếp tục thực hiện quá trình nâng cao hàm lượng mangiferin trong cao chiết dựa trên phương pháp hấp phụ - rửa giải Nhựa hấp phụ HDP300 được hoạt hóa bằng cách ngâm 24 giờ trong ethanol 98% và rửa lại bằng nước cất nhiều lần trước khi sử dụng Sau đó, cho nhựa hấp phụ vào erlene chứa dịch mẫu ở nồng độ 20 g/L, bịt kín miệng bình để tránh bay hơi dung môi Erlene được lắc với tốc độ 150 rpm ở nhiệt độ phòng trong thời gian 3 giờ Sau quá trình hấp phụ, hỗn hợp nhựa được tách ra khỏi erlene để tiến hành nạp cột (ứ12mmì150mm) Trước tiờn, dựng nước cất rửa cột để loại bỏ tạp chất còn sót lại trên hỗn hợp nhựa Sau đó, tiến hành rửa giải 3 lần bằng dung môi ethanol 60 o , mỗi lần sử dụng 6 mL dung môi Điều kiện hấp phụ - rửa giải được tóm tắt trong Bảng 2.4 Hiệu suất hấp phụ và rửa giải được tính theo công thức:
Trong đó: 𝑚 𝑜 : hàm lượng mangiferin trong dịch trước hấp phụ (mg)
𝑚 𝑖 : hàm lượng mangiferin trong dịch sau hấp phụ (mg)
𝑚 𝑑 : hàm lượng mangiferin trong dịch rửa giải (mg)
Bảng 2.4 Điều kiện thực hiện quá trình hấp phụ - rửa giải bằng nhựa hấp phụ
Quá trình hấp phụ Quá trình rửa giải
Khối lượng nhựa 3 g Nồng độ ethanol rửa giải 60 o
Nồng độ dịch mẫu 20 g/L Tốc độ rửa giải 2 mL/phút
Tốc độ lắc 150 rpm Số lần rửa giải 3 lần
Thời gian 3 giờ Thể tích dung môi rửa giải 6 mL/lần
Tiếp tục cô quay loại bỏ dung môi dịch rửa giải thu được bột chế phẩm có hàm lượng mangiferin cao hơn nhiều sao với cao chiết ban đầu
Đánh giá ngoại quan, xác định hàm lượng hoạt chất sinh học (polyphenol, xanthone, mangiferin) và khả năng chống oxy hóa bằng phương pháp ABTS là các bước quan trọng để đánh giá chất lượng của cao chiết lá dó bầu và mangiferin.
2.5.2 Nghiên cứu qui trình tạo hệ phân tán
Tiến hành nghiên cứu điều kiện thích hợp để tạo các hệ phân tán, bao gồm:
• Hệ phân tán cao chiết lá dó bầu
• Hệ phân tán chế phẩm lá dó bầu
• Hệ phân tán mangiferin từ thị trường
Sử dụng phương pháp đồng hóa tốc độ cao rotor – stator để đưa mẫu về kích thước nhỏ Các hệ khảo sát được phân tán trong nước dưới sự có mặt của chất hoạt động bề mặt Sau đó, tiến hành quá trình đồng hóa bằng máy đồng hóa FSH-2A
Hình 2.2 Qui trình tạo hệ phân tán
34 Các yếu tố hàm lượng chất hoạt động bề mặt được sử dụng, thời gian, tốc độ đồng hóa và nồng độ mẫu sử dụng sẽ tác động đến kích thước hạt phân tán cũng như độ bền hệ Vì vậy, chúng được khảo sát luân phiên để đánh giá khả năng ảnh hưởng đến kích thước của các hệ huyền phù
• Đối với hệ phân tán cao chiết:
Khảo sát ảnh hưởng của loại hoạt động bề mặt: Thực hiện quá trình tạo hệ phân tán cao chiết ở nồng độ 2 g/L dưới sự hỗ trợ của một số loại HĐBM bao gồm lecithin, tween 80, SLS với tỷ lệ cao chiết: HĐBM là 1:1 (g/g), thời gian và tốc độ đồng hóa lần lượt là 12.000 rpm và 15 phút Loại HĐBM có khả năng hỗ trợ giảm kích thước hệ tốt, đảm bảo độ bền của hệ theo thời gian và phù hợp với định hướng của đề tài sẽ được lựa chọn cố định cho tất cả các khảo sát tiếp theo trên cả 3 đối tượng
Sau khi lựa chọn chất hướng dẫn bảo vệ micelle (HĐBM) phù hợp, nghiên cứu tiến hành khảo sát tỷ lệ cao chiết và HĐBM trong khoảng từ 1:0,5 g/g đến 1:5 g/g Mục đích của khảo sát này là xác định tỷ lệ cao chiết và HĐBM tối ưu để tạo ra hệ micelle có kích thước nhỏ và độ đồng đều tốt.
Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đồng hóa: Tiến hành đánh giá và lựa chọn thời gian đồng hóa tối ưu nhất cho qui trình (trong khoảng 5 – 30 phút)
Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ đồng hóa: Tốc độ đồng hóa được tăng dần từ 10.000 rpm lên đến 13.000 rpm bằng thiết bị đồng hóa FSH-2A để đánh giá khả năng ảnh hưởng đến tính chất của hệ phân tán cao chiết
Thử nghiệm gia tăng nồng độ cao chiết: Giữ nguyên các thông số đã được lựa chọn, thực hiện thay đổi nồng độ cao chiết trong hệ phân tán từ 2 g/L lần lượt lên 5 g/L và 10 g/L Với mỗi nồng độ cao chiết xác định, cần gia tăng lượng chất HĐBM hỗ trợ để đảm bảo tỷ lệ giữa các nguyên liệu là không đổi Kích thước và độ đồng đều của hệ là tiêu chí để đánh giá tiềm năng gia tăng nồng độ cao chiết trong hệ cho những qui mô ứng dụng lớn
• Đối với hệ phân tán chế phẩm:
Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ chế phẩm và chất HĐBM: Hệ phân tán chế phẩm ở nồng độ 2 g/L được thực hiện ở các tỷ lệ chế phẩm: HĐBM khác nhau, từ 1:0 g/g lên đến 1:5 g/g để xem xét sự ảnh hưởng đến hệ phân tán thu được Quá trình được tiến hành ở tốc độ 12.000 rpm với thời gian đồng hóa là 20 phút
Tiến hành thí nghiệm đồng hóa với thời gian tăng dần từ 5 đến 60 phút nhằm xác định thời gian thích hợp nhất cho hệ phân tán Dựa trên kết quả thu được, thời gian đồng hóa tối ưu sẽ được lựa chọn.
Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ đồng hóa: Hệ phân tán chế phẩm được khảo sát tại các tốc độ đồng hóa 11.000, 12.000, 13.000 và 14.000 (rpm) Kích thước và độ đồng đều của hệ ở mỗi tốc độ được đánh giá và so sánh
Thử nghiệm gia tăng nồng độ chế phẩm: Sau khi lựa chọn các thông số phù hợp cho hệ phân tán, tiến hành khảo sát ảnh hưởng của quá trình nâng nồng độ chế phẩm trong hệ từ 2 g/L lên 4, 5 và 10 (g/L) đến tính chất hệ
• Đối với hệ phân tán mangiferin:
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
CHUẨN BỊ VÀ ĐÁNH GIÁ NGUYÊN LIỆU
Nguyên liệu lá dó bầu tươi được thu hoạch tại tỉnh Bình Phước vào tháng 11 Mặt trên lá dó bầu tươi có màu xanh sẫm, bóng nhẵn, mặt dưới nhạt hơn và có lớp lông mềm Tiến hành xử lí nguyên liệu bằng cách rửa nhanh với nước tinh khiết, sấy khô đến độ ẩm dưới 12% và nghiền nhỏ để đưa về dạng bột mịn Tiếp theo, thực hiện chiết nóng bột lá dó bầu với các điều kiện được trình bày trong phần 2.5.1, sau đó loại dung môi bằng cô quay chân không để thu được cao chiết lá dó bầu
(a) - Lá dó bầu (b) - Bột lá dó bầu Hình 3.1 Nguyên liệu lá dó bầu
Nghiên cứu trước đây đã chứng minh hiệu quả của việc sử dụng nhựa hấp phụ trong việc tinh chế và nâng cao hàm lượng hoạt chất trong các chiết xuất khác nhau Nghiên cứu này đã thành công trong việc nâng cao hàm lượng mangiferin trong chiết xuất lá dó bầu bằng phương pháp hấp phụ - rửa giải sử dụng nhựa hấp phụ Các thông số ảnh hưởng đến quá trình hấp phụ - rửa giải đã được xác định để tối ưu hóa quá trình, từ đó thu được chiết xuất có hàm lượng mangiferin cao Kết quả nghiên cứu đã được công bố trên tạp chí "Science & Technology Development Journal - Engineering and Technology" với tựa đề "Nâng cao hàm lượng mangiferin từ chiết xuất lá dó bầu (Aquilaria crassna Pierre ex Lecomte)".
Do đó, trong luận văn này tiếp tục thực hiện quá trình nâng cao hàm lượng mangiferin từ cao chiết lá dó bầu thông qua phương pháp hấp phụ - rửa giải bằng nhựa hấp phụ HPD300 Qui trình và điều kiện tiến hành được thể hiện trong phần
2.5.2 Để kiểm tra lại hiệu quả của quá trình này, hàm lượng mangiferin trong dung dịch rửa giải và chế phẩm được đánh giá thông qua phương pháp HPLC
Hình 3.2.Tỷ lệ mangiferin trong dịch hấp phụ - rửa giải
Dựa vào Hình 3.2 có thể thấy quá trình hấp phụ - rửa giải bằng nhựa HPD300 thu được kết quả tương đối tốt với hiệu suất của 2 quá trình lần lượt đạt 73,8% và 87,0% Trong đó, hàm lượng mangiferin thất thoát trong nước rửa thấp, chỉ chiếm 1,8% Hàm lượng mangiferin trong dịch rửa giải (DRG) đầu tiên chiếm khoảng 60% tổng dịch rửa giải, điều này chứng tỏ phần lớn mangiferin đã được giải hấp chỉ sau 1 lần rửa giải Dung dịch rửa giải tiếp tục được loại bỏ hoàn toàn dung môi bằng thiết bị cô quay chân không để thu hồi bột chế phẩm có hàm lượng mangiferin cao
Ngoài ra, mangiferin 95% thương mại dành cho dược phẩm cũng được sử dụng để đánh giá và so sánh với cao chiết và chế phẩm từ lá dó bầu
Ngoại quan và tính chất của nguyên liệu bao gồm: cao chiết lá dó bầu, chế phẩm lá dó bầu và mangiferin thị trường được trình bày trong Bảng 3.1 Cao chiết lá dó bầu thu được có màu nâu ánh xanh, dạng dẻo sệt với hàm lượng hợp chất dễ bay hơi tương đối cao, đạt 13% Trong khi đó, bột chế phẩm có màu nâu ánh vàng, dạng tinh thể rời, điều này chứng tỏ quá trình hấp phụ - rửa giải đã loại bỏ được một phần lớn chlorophyll còn trong cao chiết Ngoài ra, sự khác biệt về ngoại quan của chế phẩm so với mangiferin trên thị trường có thể giải thích là do ngoài thành phần chính là
Bột chế phẩm tuy có hàm lượng mangiferin thấp (khoảng 5%) nhưng vẫn chứa các hợp chất màu khác Độ ẩm của bột chế phẩm và mangiferin thấp, thuận lợi cho quá trình lưu trữ và bảo quản lâu dài hơn cao chiết Tuy nhiên, cả cao chiết, chế phẩm lá dó bầu và mangiferin đều có khả năng phân tán trong nước kém, hạt lắng xuống đáy bình khi dừng khuấy, đặc biệt là mangiferin.
Bảng 3.1 Tính chất cơ bản của các nguyên liệu
Nguyên liệu Cao chiết Chế phẩm Mangiferin
Màu sắc Màu nâu ánh xanh Màu nâu ánh vàng Màu vàng nhạt
Hình thái Dạng dẻo sệt Tinh thể rời Bột mịn
Mùi hương Mùi thảo mộc, hắc nhẹ Không mùi Mùi thơm nhẹ Độ ẩm ~ 13% ~ 5% ~ 5 %
Khả năng hòa tan trong nước
Khó tan Khó tan Rất khó tan (0,11 g/L)
Hàm lượng polyphenol trong chế phẩm chiết xuất lá dó bầu cao gấp 1,82 lần so với cao chiết ban đầu, đạt 87,0% Hàm lượng xanthone cũng được nâng cao đáng kể trong chế phẩm, tăng khoảng 1,7 lần, đạt 39,8% Những kết quả này cho thấy quy trình chế biến đã góp phần làm tăng hàm lượng các thành phần hoạt tính trong chiết xuất từ lá dó bầu.
Bảng 3.2 Hàm lượng hoạt chất trong cao chiết và chế phẩm lá dó bầu
(xác định trong nguyên liệu) Cao chiết lá dó bầu Chế phẩm lá dó bầu
Hàm lượng polyphenol (UV-Vis) 47,7%
Hàm lượng xanthone (UV-Vis) 23,3%
Quá trình đánh giá hàm lượng mangiferin bằng HPLC cũng thấy trên sắc kí đồ của mẫu cao chiết và chế phẩm lá dó bầu xuất hiện peak rõ nét ở thời gian lưu 4,8 phút, tương ứng peak của mangiferin chuẩn Điều này cho thấy cao chiết và chế phẩm có chứa hàm lượng mangiferin tương đối cao
Hình 3.3 Sắc kí đồ HPLC của cao chiết, chế phẩm lá dó bầu và mangiferin
42 Các mẫu nguyên liệu được tiến hành thử nghiệm khả năng bắt gốc tự do ABTS ∙+ để đánh giá khả năng kháng oxy hóa
Hình 3.4 Giá trị IC50 của các nguyên liệu thông qua phương pháp ABTS
Nhìn chung, khả năng bắt gốc tự do ABTS ∙+ tăng dần theo thứ tự cao chiết, chế phẩm lá dó bầu và mangiferin tinh khiết Trong đó, cao chiết thể hiện khả năng bắt gốc tự do tốt với giá trị IC50 đạt 11,86 ppm, cao hơn khoảng 2,7 lần khi so sánh với đối chứng dương vitamin C Quá trình nâng cao hàm lượng mangiferin trong cao chiết lá dó bầu bằng phương pháp hấp phụ - rửa giải đã cải thiện khả năng bắt gốc tự do của chế phẩm với giá trị IC50 giảm khoảng 1/2 lần so với cao chiết ban đầu, đạt 5,66 ppm Mangiferin tinh khiết cho thấy khả năng bắt gốc tự do ABTS ∙+ tốt nhất trong 3 nguyên liệu, thể hiện thông qua giá trị IC50 thấp hơn chất chuẩn (3,98 ppm)
Kết quả chỉ ra các nguyên liệu sử dụng trong đề tài có khả năng bắt gốc tự do tốt, chứng tỏ khả năng kháng oxy hóa tương đối mạnh Điều này cho thấy tiềm năng ứng dụng các nguyên liệu này vào trong các sản phẩm mỹ phẩm và thực phẩm chức năng.
NGHIÊN CỨU QUI TRÌNH TẠO HỆ PHÂN TÁN
Quá trình khảo sát sơ bộ hàm lượng hoạt chất đã chứng minh chiết xuất từ lá dó bầu có chứa nhiều thành phần mang hoạt tính Đặc biệt, mangiferin là một trong những hoạt chất có hàm lượng tương đối cao trong lá dó bầu và thể hiện nhiều hoạt tính sinh học như khả năng kháng oxy hóa, kháng viêm, kháng khuẩn, chống ung
Do độ tan thấp của mangiferin (0,11 g/L), cao chiết và chế phẩm từ lá dó bầu cũng có độ tan trong nước không cao Hạn chế lớn nhất trong việc phát triển các sản phẩm từ lá dó bầu là độ hòa tan kém và tính thấm thấp Vì vậy, đề tài nghiên cứu tập trung tạo hệ phân tán trong nước từ cao chiết và chế phẩm lá dó bầu bằng các chất hoạt động bề mặt Kết quả tạo hệ sẽ được so sánh với hệ phân tán mangiferin để đánh giá hiệu quả.
Hiện nay, phương pháp đồng hóa tốc độ cao đang được sử dụng rộng rãi trong trong nhiều ngành thực phẩm, mỹ phẩm, dược phẩm và các ngành công nghiệp khác Với mục đích giảm kích thước và phân bố đều các hạt thuộc pha phân tán vào trong pha liên tục, phương pháp đồng hóa hạn chế hiện tượng bị tách pha dưới tác dụng của trọng lực, nhờ đó thu được sản phẩm đồng nhất Các yếu tố ảnh hưởng đến kích thước hạt được tạo ra bởi quá trình đồng hóa bao gồm loại hoạt động bề mặt được sử dụng, tỷ lệ của các thành phần pha và năng lượng đầu vào Trong đề tài này sẽ tiến hành xem xét sự ảnh hưởng của các yếu tố trên đến tính chất hệ phân tán cao chiết, hệ phân tán chế phẩm lá dó bầu và hệ phân tán mangiferin
3.2.1 Hệ phân tán cao chiết lá dó bầu
3.2.1.1 Ảnh hưởng của chất hoạt động bề mặt
Loại chất hoạt động bề mặt được sử dụng là một trong những yếu tố chính tác động đến ngoại quan, khả năng phân tán và độ ổn định của hệ theo thời gian thông qua việc kiểm soát quá trình kết tụ hạt Do đó, đề tài sẽ tiến hành khảo sát ảnh hưởng của một số loại hoạt động bề mặt đến hệ phân tán cao chiết, bao gồm lecithin, polysorbate 80 (Tween80) và sodium lauryl sulfate (SLS)
Không HĐBM Lecithin Tween 80 SLS
Hình 3.5 Ảnh hưởng của loại HĐBM đến ngoại quan HPT cao chiết
Hệ phân tán không có chất hoạt động bề mặt ban đầu có ngoại quan màu vàng ánh xanh, trong suốt Khi bổ sung lecithin vào hệ, màu sắc chuyển sang vàng sáng hơn nhưng độ đục tăng cao Ngược lại, nếu sử dụng Tween80 và SLS, hệ phân tán có xu hướng chuyển sang sắc nâu.
Kết quả Hình 3.6 thể hiện rõ chất hoạt động bề mặt ảnh hưởng mạnh đến khả năng làm giảm kích thước trung bình và độ đồng đều của hệ Hệ phân tán không chứa chất hoạt động bề mặt có hiệu quả làm giảm kích thước thấp với giá trị median đạt khoảng 3,9 m Đồng thời, sau vài ngày lưu trữ, hệ có hiện tượng sa lắng tạo thành một lớp cặn dưới đáy bình, điều này không xảy ra đối với các hệ có sự hỗ trợ của chất hoạt động bề mặt Hệ sử dụng SLS cũng thu được kích thước lớn, nằm ở vùng micromet Trong khi đó, kích thước hệ phân tán thu được là nhỏ nhất khi có mặt leicithin và đạt khoảng 0,248 m
Hình 3.6 Ảnh hưởng của loại HĐBM đến kích thước HPT cao chiết
Ngoài ra, trong khi tween 80 được sử dụng nhiều trong mỹ phẩm thì lecithin là một chất nhũ hóa tự nhiên quan trọng được ứng dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp mỹ phẩm, thực phẩm và dược phẩm Với bản chất là phospholipid – an toàn đối với sức khỏe cùng khả năng hỗ trợ phân tán tốt, lecithin được xem như một nguyên liệu tiềm năng để phát triển các sản phẩm có nguồn gốc từ tự nhiên Do đó, chất hoạt động bề mặt lecithin được sử dụng cho các khảo sát tiếp theo
3.2.1.2 Ảnh hưởng giữa tỷ lệ cao chiết và chất hoạt động bề mặt
Hàm lượng chất hoạt động bề mặt sử dụng đóng một vai trò quan trọng trong việc ổn định các hạt phân tán, đặc biệt là trong hệ thống huyền phù Tiến hành khảo sát sự ảnh hưởng giữa tỷ lệ cao chiết và lecithin đến ngoại quan và kích thước hệ phân tán Dựa vào kết quả được thể hiện ở Hình 3.7 có thể thấy màu sắc của hệ phân tán có xu hướng chuyển dần sang ánh vàng, độ đục tăng theo hàm lượng của lecithin
Hình 3.7 Ảnh hưởng tỷ lệ cao chiết: HĐBM (g/g) đến ngoại quan HPT cao chiết
Hình 3.8 Ảnh hưởng tỷ lệ cao chiết: HĐBM (g/g) đến kích thước HPT cao chiết
Tỷ lệ giữa cao chiết và lecithin (g/g) cũng ảnh hưởng rõ rệt đến kích thước của hệ phân tán Nhìn chung, kích thước hệ phân tán dưới sự ảnh hưởng của hàm lượng lecithin biến đổi tương đối phức tạp Lượng hoạt động bề mặt sử dụng ở hàm lượng thích hợp có khả năng làm giảm sức căng bề mặt hiệu quả và hỗ trợ gia tăng độ nhớt của hệ, giúp giữ các tiểu phân phân tán ở kích thước nhỏ và bảo vệ chúng trước sự kết tụ theo thời gian Khi tăng lượng chất hoạt động bề mặt sử dụng từ 1:0,5 g/g đến 1:1,25 g/g thì kích thước trung bình của hệ huyền phù giảm và độ đồng đều tăng, thể hiện thông qua sự sai biệt giữa kích thước mean và median của hệ giảm (từ 0,4 m
46 xuống còn 0,2 m) Dự đoán ở tỷ lệ này các phân tử chất hoạt động bề mặt đã đạt được độ bao phủ bề mặt tối đa các hạt trong hệ Tuy nhiên, khi tiếp tục tăng tỉ lệ từ 1:1,5 đến 1:5 g/g trong quá trình đồng hóa, kích thước của hệ bắt đầu tăng mạnh Nguyên nhân là do lượng lecithin cao có khả năng bao bọc các hạt ở kích thước lớn trước khi chúng bị phân cắt thành các tiểu phân nhỏ, đồng thời độ nhớt quá cao sẽ cản trở lực tác động giữa các lớp chất lỏng, làm giảm hiệu quả phân cắt hạt trong hệ
Tỉ lệ 1:1,25 g/g cho thấy kích thước của hệ phân tán nhỏ, đồng đều nhất nên được lựa chọn để khảo sát các yếu tố ảnh hưởng tiếp theo.
3.2.1.3 Ảnh hưởng của thời gian đồng hóa
Bên cạnh yếu tố hoạt động bề mặt thì tổng năng lượng cung cấp cho hệ cũng tác động mạnh đến việc đưa hạt về kích thước nhỏ Do đó, đề tài tiếp tục nghiên cứu sự ảnh hưởng của thời gian đồng hóa đến tính chất của hệ phân tán Kết quả khảo sát thời gian đồng hóa từ 5 phút đến 30 phút được trình bày trong Hình 3.9
5 phút 10 phút 15 phút 20 phút 30 phút
Hình 3.9 Ảnh hưởng của thời gian đồng hóa đến ngoại quan HPT cao chiết
Ngoại quan hệ huyền phù thu được đều có màu vàng ánh xanh, độ đục nhẹ và không có sự khác biệt rõ rệt giữa các mẫu Tuy nhiên, khi tăng thời gian đồng hóa đến 30 phút thì ngoại quan của hệ có xu hướng sậm màu
Hình 3.10 Ảnh hưởng của thời gian đồng hóa đến kích thước HPT cao chiết
Thời gian đồng hóa ảnh hưởng đến kích thước hệ phân tán thu được Thời gian đồng hóa ngắn (5 phút) cho kích thước hệ lớn và không đều, trong khi thời gian 10-15 phút giảm đáng kể kích thước hạt xuống còn khoảng 0,2-0,3 µm Tuy nhiên, thời gian đồng hóa kéo dài (> 20 phút) làm tăng kích thước hệ (0,5-0,6 µm) do va chạm giữa các tiểu phân mang trạng thái năng lượng cao Do vậy, để tiết kiệm năng lượng và đảm bảo hệ ổn định, thời gian đồng hóa được chọn là 15 phút.
3.2.1.4 Ảnh hưởng của tốc độ đồng hóa
Trong quá trình đồng hóa, vận tốc dịch chuyển và xác suất va chạm của các phần tử trong hệ còn bị ảnh hưởng bởi tốc độ quay của rotor Do vậy, hệ phân tán cao chiết lá dó bầu tiếp tực được khảo sát tại các tốc độ đồng hóa khác nhau để đánh giá hiệu quả giảm kích thước hạt Kết quả được trình bày trong Hình 3.11
ĐÁNH GIÁ TÍNH CHẤT CÁC HỆ PHÂN TÁN
Sau quá trình khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình đồng hóa, các sản phẩm thu được bao gồm:
− Hệ phân tán cao chiết lá dó bầu 2 g/L
− Hệ phân tán chế phẩm lá dó bầu 2 g/L
Trong phần này sẽ tập trung đánh giá tính chất, độ bền cũng như động học quá trình hòa tan và hoạt tính sinh học của 3 loại sản phẩm trên
3.3.1 Tính chất cơ bản của các hệ phân tán
3.3.1.1 Ngoại quan và hàm lượng hoạt chất
Các thông số tính chất của ba hệ phân tán được trình bày trong Bảng 3.6 Quan sát ngoại quan các sản phẩm sau khi được tạo thành nhận thấy hệ phân tán cao chiết lá dó bầu có màu vàng, hơi đục Trong khi đó, hệ phân tán chế phẩm có màu nâu và trong suốt, còn hệ phân tán mangiferin thu được cho ngoại quan màu vàng sáng, không đục Điều này cho thấy ảnh hưởng của tỷ lệ lecithin sử dụng đến độ đục của
60 hệ: lượng lecithin càng cao thì độ đục tăng Cả ba hệ phân tán đều không xuất hiện sự sa lắng sau khi quá trình đồng hóa
Bảng 3.6 Ngoại quan và hàm lượng các HPT
Tính chất HPT cao chiết HPT chế phẩm
C = 12,35; h = 120,11 Độ đục Đục nhẹ Trong suốt Trong suốt
(xác định trong sản phẩm) 878,7 1697,9 338,7
(xác định trong sản phẩm) 441,1 841,9 314,0
(xác định trong sản phẩm) 177,7 391,7 308,5 Ở cùng nồng độ phân tán 2 g/L, hàm lượng polyphenol, xanthone và mangiferin của hệ huyền phù chế phẩm lá dó bầu thu được cao gấp từ 1,9 – 2,2 lần so với hệ huyền phù cao chiết Đồng thời, đối với hệ phân tán mangiferin tinh khiết thì hàm lượng hoạt chất có sự khác biệt khi kiểm tra thông qua các phương pháp đo khác
61 nhau Quá trình đo dựa trên hàm lượng polyphenol và xanthone tổng được xử lý mẫu bằng phản ứng tạo phức đặc trưng và xác định thông qua phương pháp quang phổ hấp thu nên có sai số với kết quả HPLC Tuy nhiên, các phương pháp này nhanh, thuận tiện, kết quả không quá khác biệt nên vẫn có thể sử dụng khi so sánh trong các khảo sát sơ bộ Việc kiểm tra lại các kết quả bằng các phương pháp có độ chính xác cao được thực hiện song song trong các giai đoạn nghiên cứu tiếp theo
Kết quả phân tích bằng phương pháp tán xạ laser cho thấy trong 3 hệ phân tán, cao chiết lá dó bầu dễ đưa về kích thước nhỏ nhất với giá trị trung bình nằm dưới 300 nm Đồng thời, đường phân bố của hệ huyền phù cao chiết có hình chuông nhưng vẫn còn hiện diện phần đuôi nằm vùng kích thước lớn mặc dù không nhiều, nguyên nhân là do quá trình tạo hệ phân tán chưa đồng đều Kích thước hệ phân tán chế phẩm và mangiferin có giá trị cao hơn, nằm trong khoảng 2,0 – 2,5 m Sai biệt giữa kích thước mean và median trong hệ thấp, đường phân bố không xuất hiện phần đuôi trải dài thể hiện hệ có phân bố kích thước tốt hơn so với hệ phân tán cao chiết
Bảng 3.7 Phân bố kích thước hạt của các HPT
HPT cao chiết lá dó bầu
HPT chế phẩm lá dó bầu
3.3.1.3 Hình thái của các hệ phân tán
Các hệ phân tán được kiểm tra hình thái và cấu trúc bằng phương pháp kính hiển vi điện tử quét qua (SEM)
Hình 3.20 Ảnh chụp SEM của các hệ phân tán: (a) – Từ cao chiết, (b) – Từ chế phẩm
Kết quả cho thấy đối với hệ phân tán cao chiết lá dó bầu, các hạt có dạng hình tròn, kích thước nhỏ, không đều và trải dài từ khoảng 100 – 300 nm Trên bề mặt các hạt có lớp bao phủ dày và giữa các hạt xảy ra hiện tượng kết dính thành chùm Nguyên nhân có thể là do những thành phần phụ còn lại trong cao chiết như gum, nhựa, … cũng như lecithin ở dạng paste dẻo nên dễ bị kết dính khi được làm khô trên bề mặt đo
Trong khi đó, hệ phân tán có chế phẩm lá dó bầu thu được hạt có hình dạng nhiều mặt với kích thước không đều, nằm trong khoảng từ 1 – 2 µm.
m) và lớn hơn so với kích thước hệ phân tán cao chiết Bên ngoài hạt có lớp vân mờ thể hiện lớp solvate hóa bao quanh Hệ có xảy ra hiện tượng kết chùm nhưng không nhiều như hệ phân tán cao chiết Điều này có thể cho thấy quá trình hấp phụ - rửa giải không chỉ nâng cao hàm lượng hoạt chất mà còn hỗ trợ loại bỏ bớt một phần tạp chất trong cao chiết Ngoài ra, lượng lecithin sử dụng trong hệ phân tán chế phẩm (1 g/L) thấp hơn hệ phân tán cao chiết (2,5 g/L) nên cũng đã giảm bớt hiện tượng kết dính sau khi làm khô a b
3.3.2 Độ bền của các hệ phân tán
Tiến hành lưu trữ các mẫu phân tán trong 2 tuần nhằm đánh giá độ bền về ngoại quan, kích thước và hàm lượng của các hệ theo thời gian tại hai điều kiện: nhiệt độ phòng và ủ ấm (45 o C) Dựa vào kết quả này có thể dự đoán sự biến đổi của các hệ phân tán, từ đó xác định thời gian và điều kiện lưu trữ mẫu cho phép
Ngoại quan của hệ cuối quá trình khảo sát được thể hiện trong Bảng 3.8
Bảng 3.8 Ngoại quan của các HPT sau 2 tuần tại: (a) Nhiệt độ thường và (b) 45 o C
Ban đầu Nhiệt độ thường Nhiệt độ tủ ấm
Sau 1 tuần Sau 2 tuần Sau 1 tuần Sau 2 tuần
Hệ phân tán cao chiết lá dó bầu
Hệ phân tán chế phẩm lá dó bầu
Nhìn chung, các hệ trên hầu hết đều duy trì ngoại quan ban đầu khi ở nhiệt độ thường Tuy nhiên, khi bảo quản trong tủ ấm, màu sắc của các hệ có xu hướng đậm dần Trong đó, hệ phân tán cao chiết thể hiện sự ổn định về ngoại quan tốt hơn cả.
64 hệ Sự thay đổi rõ nét được quan sát ở mẫu hệ phân tán mangiferin, bắt đầu có hiện tượng kết tụ và sa lắng theo thời gian khi ở nhiệt độ cao (45 o C)
Dựa vào kết quả Hình 3.21 và Hình 3.22 có thể thấy sau hai tuần ở cả 2 điều kiện nhiệt độ, kích thước của hệ phân tán cao chiết lá dó bầu có xu hướng tăng và nằm trong khoảng 1,1- 1,2 m, nhưng nhìn chung kích thước vẫn thấp hơn so 2 hệ còn lại Điều này cho thấy khi hệ có kích thước càng nhỏ (nằm trong vùng nanomet), năng lượng bề mặt lớn, theo thời gian các hạt dịch chuyển dễ xảy ra hiện tượng va chạm và dính chùm, dẫn đến kích thước tăng Hệ phân tán chế phẩm có kích thước sau 2 tuần ở nhiệt độ thường giảm nhẹ, còn ở điều kiện tủ ấm gần như không đổi, đây có thể là vùng kích thước tối ưu của hệ, hệ đạt trạng thái cân bằng và giảm hiện tượng sa lắng
Hình 3.21 Độ bền kích thước của các HPT sau 2 tuần ở nhiệt độ thường
Trong khi đó, đối với hệ phân tán mangiferin, kích thước hệ tăng mạnh sau 1 tuần lưu trữ ở điều kiện tủ ấm với giá trị median đạt 76,325 m và giá trị mean đạt 77,628 m Nguyên nhân là do khi không có sự hỗ trợ của các thành phần phụ (gum, nhựa, …) như trong chiết xuất từ thực vật, hệ phân tán mangiferin tương đối lỏng lẻo Ở nhiệt độ cao, chuyển động Brown tăng nhanh, các hạt dễ va chạm và kết dính với nhau làm kích thước hệ tăng mạnh
Hình 3.22 Độ bền kích thước HPT sau 2 tuần ở nhiệt độ tủ ấm
Như vậy, nhiệt độ cũng là một trong những yếu tố có ảnh hưởng lớn đến ngoại quan và kích thước của các hệ phân tán Đồng thời có thể thấy trong ba hệ, hệ phân tán chế phẩm có độ ổn định kích thước tốt nhất còn hệ phân tán mangiferin có độ bền kích thước kém ở nhiệt độ cao Do đó, cần lưu ý đến thời gian và nhiệt độ để bảo quản từng mẫu trong khi sử dụng cho các giai đoạn tiếp theo
Tiếp tục kiểm tra hàm lượng hoạt chất trong 3 hệ phân tán ở điều kiện thường sau 2 tuần, kết quả được thể hiện trong Hình 3.23 Có thể thấy, hàm lượng các hoạt chất trong cả 3 hệ phân tán đều có sự suy giảm theo thời gian Trong đó, hệ phân tán cao chiết và hệ phân tán chế phẩm có khả năng bảo toàn hoạt chất sau 2 tuần gần tương đương nhau, tốt hơn hẳn so với hệ phân tán mangiferin Điển hình, sau thời gian lưu trữ, hàm lượng mangiferin còn lại trong hệ phân tán mangiferin đạt khoảng 82% so với ban đầu, trong khi chế phẩm và cao chiết bảo toàn đến 85 – 86% Ngoài ra, hàm lượng polyphenol và xanthone còn lại trong hệ phân tán cao chiết tương đối cao, đạt khoảng 94% và 87%, tương tự đối với hệ huyền phù chế phẩm lần lượt là 95% và 89%
Hình 3.23 Độ bền hàm lượng của các HPT sau 2 tuần ở nhiệt độ thường
THỬ NGHIỆM TẠO SẢN PHẨM DẠNG BỘT
Trong đề tài này, các hệ huyền phù tạo thành được đưa về dạng bột bằng phương pháp sấy phun với giá mang là maltodextrin để gia tăng thời gian lưu trữ cũng như bảo vệ hoạt chất, tránh các hiện tượng biến đổi khi ở dạng huyền phù Nồng độ cao chiết, chế phẩm và mangiferin được thiết kế trong bột sấy phun là 2% Tính chất cơ bản của sản phẩm bột sau khi sấy phun được trình bày trong Bảng 3.10
Bảng 3.10 Tính chất cơ bản của các loại bột sấy phun
Sản phẩm Bột phân tán từ cao chiết (BN-CC)
Bột phân tán từ chế phẩm (BN-CP)
Bột phân tán từ mangiferin (BN-M)
Dạng bột khô, mịn Dạng bột khô, mịn Dạng bột khô, mịn
Màu Lục nhạt Vàng nhạt Lục nhạt
Mùi Hăng nhẹ Không mùi Hăng nhẹ
Vị Ngọt nhẹ Ngọt nhẹ Ngọt nhẹ
Khả năng phân tán trong nước
Cả 3 loại bột sấy phun thu được ở dạng mịn, vị ngọt nhẹ, có mùi hăng nhẹ hoặc không có mùi Màu sắc của các hệ bột sáng màu hơn so với hệ phân tán kích thước
Khả năng hòa tan vào nước là một đặc điểm quan trọng của các sản phẩm dạng bột, vì nó ảnh hưởng đến quá trình bào chế và sử dụng Nghiên cứu này đã chỉ ra rằng bột sấy phun từ lá dó bầu có khả năng hòa tan vào nước tốt hơn nhiều so với các dạng cao chiết, chế phẩm lá dạng ban đầu và hoạt chất mangiferin ở cùng nồng độ Điều này cho thấy bột sấy phun có khả năng hấp thụ và phân tán tốt hơn trong nước, giúp tăng cường hiệu quả và tính khả dụng của các thành phần hoạt tính trong sản phẩm.
Hàm lượng hoạt chất trong các sản phẩm bột sấy phun được kiểm tra và so sánh với hệ phân tán để đánh giá tác động của quá trình sấy phun đến sự biến đổi hoạt chất, kết quả được trình bày trong Bảng 3.11 và Hình 3.28
Bảng 3.11 Hàm lượng hoạt chất trong 3 sản phẩm bột sấy phun
(xác định trong sản phẩm) BN-CC BN-CP BN-M
Kết quả Hình 3.28 thể hiện hàm lượng mangiferin còn lại sau quá trình sấy phun so với hệ phân tán ban đầu
Hình 3.28 Ảnh hưởng của quá trình sấy phun đến hàm lượng mangiferin trong bột
Khoảng 89% và 76% lượng mangiferin được bảo toàn khi đưa hệ phân tán cao chiết và hệ phân tán chế phẩm lá dó bầu về dạng bột sấy phun Trong khi đó, bột mangiferin chỉ giữ được 72% lượng mangiferin so với trước khi tiến hành đưa về
BN-CC BN-CP BN-M
74 dạng bột Điều này có thể thấy hệ phân tán mangiferin tinh khiết dễ bị thất thoát và biến đổi hơn so với 2 hệ còn lại dưới tác động của các yếu tố ảnh hưởng như nhiệt độ, thời gian sấy phun
Ngoài ra, các sản phẩm bột sấy phun cũng được kiểm tra khả năng bắt gốc tự do ABTS ∙+ dựa trên nồng độ nguyên liệu trong bột Đường cong biểu thị mối quan hệ giữa nồng độ và phần trăm ức chế gốc tự do ABTS ∙+ được thể hiện trong Hình 3.29
HPT chế phẩm Bột sấy phun
Hình 3.29 Đường cong biểu thị mối quan hệ giữa nồng độ và phần trăm ức chế gốc tự do
Kết quả cho thấy giá trị IC50 của các mẫu BN-CC, BN-CP và BN-M lần lượt được xác định là 12,44 ppm, 5,91 ppm và 5,39 ppm Tổng quan, do ảnh hưởng của quá trình sấy phun làm thất thoát và biến tính một số hoạt chất có hoạt tính kháng oxy hóa nên giá trị IC50 của các mẫu bột sấy phun cao hơn so với ban đầu, trong đó BN-
CP và BN-M có sự chênh lệnh nhiều hơn cao chiết Tuy nhiên, khi so sánh với chất đối chứng, BN-CP và BN-M vẫn thể hiện hoạt tính bắt gốc tự do ABTS ∙+ tốt (gấp khoảng 1,2 lần so với vitamin C), trong khi cao chiết có khả năng bắt gốc tự do thấp hơn với giá trị IC50 gấp khoảng 2,8 lần so với vitamin C
Hình 3.30 So sánh khả năng bắt gốc tự do ABTS ∙+ giữa các sản phẩm bột và HPT
Thông qua kết quả so sánh khả năng bắt gốc tự do ABTS ∙+ , các sản phẩm từ hệ phân tán khi đưa về dạng bột sấy phun cho thấy hoạt tính kháng oxy hóa tốt, mở ra tiềm năng ứng dụng vào trong các sản phẩm chăm sóc cá nhân cũng như các sản phẩm theo đường uống.
SO SÁNH VÀ ĐÁNH GIÁ
Các kết quả thu được sau quá trình nghiên cứu tạo hệ phân tán khi đi từ cao chiết, chế phẩm lá dó bầu và mangiferin cùng các sản phẩm dạng bột sấy phun được trình bày trong Bảng 3.12
Bảng 3.12 Tính chất của các sản phẩm thu được
Sản phẩm Cao chiết Chế phẩm Mangiferin
Nâu ánh xanh, dạng dẻo sệt, mùi thảo mộc
Nâu ánh vàng, dạng tinh thể rời, không mùi
Vàng nhạt, dạng bột mịn, mùi thơm nhẹ
Hàm lượng hoạt chất (xác định trong nguyên liệu):
Giá trị IC 50 (ppm) 11,86 5,66 3,98 Độ tan trong nước Khó tan Khó tan Rất khó tan
(thiết kế sản phẩm ban đầu) 2 2 0,314
Ngoại quan Nâu ánh vàng, độ đục nhẹ Nâu, trong suốt Vàng, trong suốt
Hàm lượng hoạt chất (xác định trong sản phẩm):
(thiết kế sản phẩm ban đầu) 2 2 2
Ngoại quan Lục nhạt, bột mịn, vị ngọt nhẹ
Vàng nhạt, bột mịn, vị ngọt nhẹ
Lục nhạt, bột mịn, vị ngọt nhẹ
Hàm lượng hoạt chất (xác định trong sản phẩm):
Giá trị IC 50 (ABTS) 12,44 5,91 5,39 Độ tan trong nước Tốt Tốt Tốt
77 Dựa vào các kết quả trên, có thể đưa ra những so sánh và đánh giá như sau:
1 Nguyên liệu: Bột chế phẩm thu được sau quá trình hấp phụ - rửa giải bằng nhựa
HPD300 có hàm lượng polyphenol, xanthone và mangiferin cao gấp từ 1,7 – 1,9 lần so với cao chiết ban đầu Nhờ đó, bột chế phẩm lá dó bầu có khả năng kháng oxy hóa tốt hơn cao chiết, kết quả được đánh giá thông qua giá trị IC50 bằng phương pháp ABTS Mặt khác, nghiên cứu cũng cho thấy mangiferin 95% trên thị trường có khả năng kháng oxy hóa tốt nhất trong 3 nguyên liệu
• Khả năng tạo hệ phân tán và kích thước trung bình: Hệ phân tán cao chiết lá dó bầu thu được có kích thước trung bình nhỏ nhất trong 3 hệ với giá trị dưới 300 nm và có thể nâng nồng độ lên đến 10 g/L Kích thước hệ phân tán chế phẩm có giá trị cao hơn, nằm trong khoảng 2,0 – 2,5 m nhưng phân bố đồng đều hơn Đồng thời, hệ phân tán chế phẩm có xu hướng dễ đạt kích thước nhỏ hơn khi tăng nồng độ lên đến 10 g/L Trong khi đó, hệ phân tán mangiferin không chứa các thành phần phụ (gum, nhựa, các polymer tự nhiên có trong lá cây) như cao chiết và chế phẩm nên rất khó tạo hệ phân tán cũng như có độ ổn định kém khi gia tăng nồng độ lên 0,628 g/L (tương đương 4 g/L ở hệ phân tán mangiferin)
• Độ bền hệ phân tán theo thời gian: Sau thời gian bảo ôn tại các điều kiện nhiệt độ phòng và nhiệt độ tủ ấm (45 o C), có thể thấy ngoại quan của cả 3 hệ không có sự thay đổi rõ rệt so với ban đầu Kích thước của hệ phân tán cao chiết lá dó bầu có xu hướng tăng và nằm trong khoảng 1,1- 1,2 m nhưng vẫn thấp hơn so với 2 hệ phân tán còn lại Hệ phân tán chế phẩm có độ ổn định kích thước tốt nhất, sau 2 tuần gần như không đổi (2,0 – 2,5 m) ở cả hai điều kiện lưu trữ Tuy nhiên, hệ phân tán mangiferin dễ bị sa lắng trong điều kiện tủ ấm, và chỉ sau 1 tuần lưu trữ kích thước hệ tăng nhanh Ngoài ra, quá trình đánh giá hàm lượng hoạt chất sau 2 tuần cho thấy hệ phân tán từ chiết xuất lá dó bầu (86%) ít bị thất thoát hàm lượng mangiferin hơn so với hệ phân tán từ mangiferin thị trường (82%)
• Khả năng hòa tan và hoạt tính kháng oxy hóa: Khi đưa về kích thước nhỏ, khả năng hòa tan của cả ba hệ phân tán cao chiết, chế phẩm và mangiferin được cải
78 thiện rõ rệt Hoạt tính kháng oxy hóa dựa trên phương pháp ABTS cũng được thể hiện một cách chính xác hơn Trong đó, hệ phân tán mangiferin vẫn cho thấy khả năng kháng oxy hóa tốt nhất, tiếp theo lần lượt là hệ phân tán chế phẩm lá dó bầu và cao chiết
3 Sản phẩm bột sấy phun: Sau quá trình thực hiện sấy phun có thể thấy hệ phân tán mangiferin khi không có các thành phần gum, nhựa, … bao bọc như cao chiết và chế phẩm sẽ dễ bị biến đổi hơn dưới tác động của quá trình tạo bột Ở cùng nồng độ 2 g/L, cả 3 loại bột sấy phun đều có khả năng hòa tan vào nước tốt hơn rất nhiều so với cao chiết ban đầu
Như vậy, nghiên cứu đã chứng minh hiệu quả của việc đưa hệ về kích thước nhỏ làm gia tăng độ hòa tan cũng như hoạt tính của hoạt chất Đồng thời, đề tài cũng cho thấy các hệ phân tán đi từ chiết xuất từ tự nhiên cho hiệu quả giảm kích thước hạt, độ ổn định cũng như độ bền hệ theo thời gian tốt hơn so với việc đi từ hoạt chất tinh khiết