nguyễn vương huyền trâm 21126213

Trang 1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC TIỂU LUẬN MÔN HỌC Quy trình tạo chế phẩm sinh học từ nấm Trichoderma và kiểm tra mật s

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

TIỂU LUẬN MÔN HỌC

Quy trình tạo chế phẩm sinh học từ nấm Trichoderma và kiểm tra

mật số bào tử của chế phẩm sinh học

Ngành học :CÔNG NGHỆ SINH HỌC Môn học : Phát triển sản phẩm sinh học Sinh viên thực hiện : NGUYỄN VƯƠNG HUYỀN TRÂM

Mã số sinh viên : 21126213 Niên khóa :2023 - 2024

TP Thủ Đức, tháng 3 năm 2024

ii

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

TIỂU LUẬN MÔN HỌC

Quy trình tạo chế phẩm sinh học từ nấm Trichoderma và kiểm tra

mật số bào tử của chế phẩm sinh học

Giáo viên hướng dẫn Sinh viên thực hiện

TP Thủ Đức, tháng 3 năm 2024

i

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT iii

DANH SÁCH CÁC HÌNH iv

Chương 1: Mở đầu 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 1

1.3 Nội dung thực hiện 1

Chương 2: Tổng quan tài liệu 2

2.1 Nấm Trichoderma 2

2.1.2 Đặc điểm hình thái 3

2.1.2 Đặc tính sinh học và công dụng 4

2.1.3 Điều kiện nuôi cấy phù hợp 5

2.2 Giới thiệu về chế phẩm sinh học 5

2.2.1 Đặc điểm và phân loại chế phẩm sinh học 5

2.2.2 Vai trò của chế phẩm sinh học 6

2.2.3 Chế phẩm sinh học Tricoderma 6

2.3 Phương pháp kiểm tra mật số bào tử 7

Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 8

3.1 Thời gian thực hiện 8

3.2 Vật liệu và đối tượng 8

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu 8

3.2.2 Dụng cụ, hóa chất và vật liệu nghiên cứu 8

3.3 Phương pháp nghiên cứu 8

3.3.1 Bố trí thí nghiệm 8

3.3.2 Quy trình thực hiện 9

Chương 4: Kết quả và thảo luận 12

4.1 Kết quả 12

ii

4.1.1 Kết quả của thí nghiệm tạo chế phẩm sinh học từ vi nấm 12

4.1.2 Kết quả của thí nghiệm kiểm tra mật số bào tử 12

4.2 Thảo luận 14

4.2.1 Thí nghiệm tạo chế phẩm sinh học từ vi nấm 14

4.2.2 Thí nghiệm kiểm tra mật số bào tử 14

Chương 5: Kết luận và kiến nghị 16

5.1 Kết luận : 16

5.2 Kiến nghị 16

TÀI LIỆU THAM KHẢO 17

iii

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT

PDA : Potato Dextrose Agar

iv

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Nấm Trichoderma kí sinh nấm hại .1 2

Hình 2.2 Cây thuốc lá và khoai tây được chuyển gen endochitinase từ Trichoderma thể hiện tính kháng bệnh cao với nấm Alternaria alternata và nấm Rhizoctonia solani 1 3

Hình 2.3 Trichoderma virens (trái) và Trichoderma asperellum (phải) 2……… 4

Hình 3 1 Quy trình sản xuất chế phẩm sinh học Trichoderma……… 8

Hình 3 2 Trấu và tấm được trộn………9

Hình 3 3.Quy trình thực hiện nhân giống … 10

Hình 3 4 Chuẩn bị dung dịch có nồng độ 10o 10

Hình 4 1 Kết quả sau 7 ngày ủ từ lúc thêm dung dịch giống ……… 12

Hình 4 2 Kết quả 6 đĩa petri sau 2 ngày cấy 13

1

Chương 1: Mở đầu

1.1 Đặt vấn đề

Ngày nay, phong trào chuyển dịch xu hướng sản xuất nông nghiệp từ hóa học sang hữu

cơ vi sinh ngày càng mạnh mẽ Sử dụng chế phẩm vi sinh trong sản xuất nông nghiệp nhằm cải tạo đất, thúc đẩy phát triển các sản phẩm chủ lực, xử lý ô nhiễm môi trường Đến nay,

khoảng 50 loài nấm Trichoderma được tìm thấy, có 33 loại có khả năng đối kháng Trong

đó, 11 loài có khả năng đối kháng cao như Trichoderma harzianum, Trichoderma seesei, Trichoderma aureoviride,… Chúng ngăn chặn gần như tuyệt đối, đối kháng, tiêu diệt các

loại nấm bệnh bằng các enzym tiết ra từ cơ thể của chúng.Vì lẽ đó việc nắm bắt được quy

trình tạo ra 1 chế phẩm sinh học từ nấm Trichoderma đã trở thành một trong các hướng

nghiên cứu quan trọng nông nghiệp cũng như góp phần trong quá trình hướng tới ngành nồng nghiệp bền vững

1.2 Mục tiêu đề tài

Hiểu được tầm quan trọng, ưu nhược điểm và xu hướng tương lai của chế phẩm sinh

học Biết cách thực hành quy trình tạo chế phẩm sinh học từ nấm Trichoderma.Biết cách sử

dụng chế phẩm nấm để đạt hiệu quả cao trong trồng trọt, tạo tiền đề cho việc ứng dụng các chế phẩm sinh học trên quy mô lớn trong thực tế tương lai Kiểm tra được mật số bào tử

trong chế phẩm sinh học từ nấm Trichoderma đã thí nghiệm và thao tác cơ bản trong 1 quy

trình kiểm tra mật số chế phẩm sinh học Rút ra được kết luận về sản phẩm và làm tiền đề trong các ứng dụng trong các thí nghiệm về sản phẩm sinh học sau này

1.3 Nội dung thực hiện

Nhân giống cấp 1 chủng nấm được chọn làm thí nghiệm và tiến hành tạo chế phẩm sinh học từ nấm theo quy trình Sau đó pha loãng thành các nồng độ khác nhau, chọn ra nồng

độ phù hợp để cấy, tiến hành đếm khuẩn lạc và tính toán cho ra kết quả mật số bào tử

2

Chương 2: Tổng quan tài liệu

2.1 Nấm Trichoderma

2.1.1 Giới thiệu chung về nấm Trichoderma

Trichoderma là một chi nấm thuộc họ Hypocreaceae hiện diện ở tất cả các loại đất,

nơi chúng là loại nấm trồng phổ biến nhất Nhiều loài trong chi này có thể được mô tả là thực vật cộng sinh không độc tính cơ hội Điều này đề cập đến khả năng của một số loài

Trichoderma hình thành mối quan hệ nội sinh tương hỗ với một số loài thực vật Một số chủng Trichoderma đã được phát triển làm tác nhân kiểm soát sinh học chống lại bệnh nấm

trên cây trồng Các cơ chế khác nhau bao gồm kháng sinh , ký sinh , gây ra sự kháng thuốc của cây chủ và cạnh tranh Trichoderma, đến nay, đã xác định có ít nhất 33 giống, mỗi

giống có những đặc tính riêng

- Ký sinh nấm hại (Mycoparasitism): Trichoderma có khả năng khống chế, cạnh tranh

và tiêu diệt nhiều loại nấm gây bệnh thối rễ, chết rạp cây con, xì mủ… trên cây trồng như

Pythium, Rhizoctonia, Fusarium, Phytophthora, Sclerotium…bằng cách tiết ra một enzym

làm tan vách tế bào các loài nấm hại, sau đó xâm nhập và hấp thu các chất dinh dưỡng làm nấm hại bị chết

Hình 2.1 0.1Nấm Trichoderma kí sinh nấm hại (a) Kí sinh nấm Pythium trên đạu

Hà Lan; (b) Nấm Rhizotonia bị enzyme nấm Trichoderma chọc chủng và xâm nhập

http://spchcmc.vn/VN/Bac-Si-Cay-Trong-Chi-Tiet/Nam-Trichoderma-la-gi 2-105.html

3

Kích thích cây trồng sinh trưởng và phát triển: Một số giống giúp cây phát triển nhiều

rễ, rễ mạnh nhiều hơn và mọc sâu hơn nhờ đó giúp cây tăng cường tính chịu hạn và kháng

đổ ngã… Ngoài ra, nghiên cứu gần đây cho thấy trên rễ cây bắp có nấm Trichoderma giống T.22 cần ít hơn tới 40% đạm so với cây không có nấm Trichoderma

Phân giải hữu cơ: Trichoderma spp được xem như nhà máy sản xuất phân hoá tố

(enzymes) cellulase và nhiều phân hoá tố khác như chitinase, protease, pectinase, amylase… giúp phân giải chất xơ cellulose và các chất polysacharides khác như : chitin, lignin, pectin…

do đó, Trichoderma thường được trộn chung với chất thải hữu cơ đẩy nhanh quá trình phân

huỷ các chất hữu cơ thành các đơn chất dinh dưỡng giúp cây hấp thu dễ dàng hơn

Phân hữu cơ sinh học : Cải tạo lý hoá tính giúp đất tơi, xốp hơn, nhiều chất mùn hơn, tăng độ phì.Giúp vi sinh vật có ích và vi sinh vật đối kháng có điều kiện phát triển

Công nghệ chuyển gen: Nhiều gen có nguồn gốc từ Trichoderma có tiềm năng ứng

dụng to lớn trong công nghệ chuyển gen để sản xuất ra cây trồng có khả năng kháng bệnh

Hình 2.2 0.1 Cây thuốc lá và khoai tây được chuyển gen endochitinase từ

Trichoderma thể hiện tính kháng bệnh cao với nấm Alternaria alternata và

nấm Rhizoctonia solani

1

2.1.2 Đặc điểm hình thái

Trichoderma virens là một loại nấm thường được tìm thấy trong đất, hoạt động như

một loại ký sinh trùng không gây bệnh cho cây trồng Nó có thể được đặc trưng bởi sự phát triển nhanh chóng và bào tử màu xanh lá cây tươi sáng được hình thành ở đầu sợi nấm Sự

http://spchcmc.vn/VN/Bac-Si-Cay-Trong-Chi-Tiet/Nam-Trichoderma-la-gi 2-105.html

4

phát triển ban đầu có lông tơ và màu trắng Theo thời gian, nó có thể trở nên đặc lại và mịn hơn, phát triển các búi màu xanh lá cây thường xuất hiện dưới dạng các vòng đồng tâm

Hình 2.3 0.2 Trichoderma virens (trái) và Trichoderma asperellum (phải)

Loài Trichoderma asperellum được phân biệt với T viride ở chỗ hình dạng bào tử

mịn hơn, bào tử hơi hình trứng, tốc độ tăng trưởng nhanh hơn, hầu hết là các nhánh ghép đôi, phialides dạng ống và sự hiện diện nhất quán của chlamydos- lỗ chân lông.T

asperellum thường được phân lập từ đất không có rễ, đất vụn, thân rễ của các loài thực vật

khác nhau, các môthực vật khỏe mạnh, sinh khối nấm và gỗ chết Phổ rộng của các lớp nền của nó cho thấy cơ hội môi trường nổibật của nó, từ thoái hóa tế bào đến thoái hóa sinh học

2.1.2 Đặc tính sinh học và công dụng

Trichoderma viren có khả năng phân hủy vật liệu xenlulo, ngoài việc sử dụng nhiều

loại enzyme và chất chuyển hóa được tiết ra, giúp nấm có khả năng hoạt động tích cực chống

lại vật chủ hoặc làm suy giảm điều kiện phát triển của nấm gây bệnh Trichoderma viren

xâm chiếm rễ cây chủ dẫn đến giảm hoạt động của các vi khuẩn có hại và vô hiệu hóa các hợp chất độc hại trong vùng rễ .Nó ức chế hoặc tiêu diệt nấm gây bệnh thực vật thông qua việc sản xuất kháng sinh chống nấm và ký sinh trùng sợi nấm và hạch nấm Sự hội tụ, hay

sự sản sinh các bào tử vô tính, một quá trình có thể cảm ứng được kích hoạt bởi ánh sáng hoặc stress dinh dưỡng

https://www.sinhhoc.pro/trichoderma-asperellum/

5

T asperellum là một chất đối kháng mạnh mẽ của các loại nấm khác vì nó có thể ký

sinh trên chúng hoặc ức chế sự tăng trưởng và phát triển của chúng Do đó, loài này được

sử dụng làm tác nhân kiểm soát sinh học chống lại nhiều loại nấm gây bệnh thựcvật, động

vật nguyên sinh dạng nấm như Phytophthora megakarya và cả tuyến trùng T asperellum

cũng đã được chứng minh là có hoạt tính kháng khuẩn thông qua việc sản xuất các

peptaibolstrichotoxin Sợi nấm của T asperellum có thể không chỉ phát triển trên rễ cây mà

còn xâm nhập vào biểu bì rễ (nội sinh), giúp tăng cường sự phát triển và hệ thống miễn dịch

của cây T.asperellum đã được đặc biệt nghiên cứu về khả năng kích thích các phản ứng bảo

vệ thực vật chống lại các mầm bệnh thực vật

2.1.3 Điều kiện nuôi cấy phù hợp

Các môi trường nuôi cấy thường phát triển nhanh ở 25–30 °C (77–86 °F), nhưng một

số loài Trichoderma sẽ phát triển ở 45 °C (113 °F) Lúc đầu, khuẩn lạc trong suốt trên môi

trường như thạch bột ngô (CMD) hoặc màu trắng trên môi trường giàu hơn như thạch dextrose khoai tây (PDA) Sợi nấm thường không rõ ràng trên CMD, bào tử thường hình thành trong vòng một tuần ở dạng chùm nhỏ hoặc lỏng lẻo có màu xanh lục hoặc vàng hoặc

ít thường xuyên hơn là màu trắng Sắc tố màu vàng có thể được tiết vào môi trường thạch, đặc biệt là trên PDA Một số loài tạo ra mùi ngọt hoặc mùi 'dừa' đặc trưng

2.2 Giới thiệu về chế phẩm sinh học

2.2.1 Đặc điểm và phân loại chế phẩm sinh học

Chế phẩm sinh học là những chế phẩm được điều chế, chiết xuất từ những thành phần nguyên liệu có nguồn gốc từ tài nguyên sinh học tái tạo trong tự nhiên rất an toàn, thân thiện với con người và môi trường Về chế phẩm sinh học nông nghiệp, thành phần hoạt chất của chúng có thể là thực vật, tảo, chiết xuất, vi sinh vật hoặc chất chuyển hóa có hoạt tính Các Chế phẩm sinh học sản xuất phục vụ trong canh tác Nông Nghiệp mà chúng ta có thể hay gặp như: Phân bón sinh học, thuốc trừ sâu sinh học phục vụ cho trồng trọt; đệm lót sinh học, cám vi sinh phục vụ cho chăn nuôi; các chế phẩm bổ sung vi khuẩn có lợi cho nguồn nước, thức ăn vi sinh dùng cho nuôi trồng thủy sản…

6

Để phân loại chế phẩm sinh học người ta chia ra: Chế phẩm sinh học truyền thống và chế phẩm sinh học mới Các chế phẩm ( sản phẩm ) sinh học truyền thống Ví dụ bao gồm vật liệu xây dựng từ gỗ, giấy và bột giấy, rừng và các sản phẩm từ rừng Các chế phẩm sinh học mới có thể bao gồm các chế phẩm có nguồn gốc sinh học như: nhiên liệu sinh học, năng lượng sinh học , tinh bột và cellulose ethanol , chất kết dính sinh học, hóa sinh, nhựa sinh học, …

Các chế phẩm sinh học ứng dụng cho canh tác cây trồng hiện nay cơ bản được chia làm 3 nhóm sản phẩm với các tính năng khác nhau có nguồn gốc từ thảo mộc, nấm, vi khuẩn, virus hoạc các tuyến trùng như:

- Nhóm chế phẩm sinh học ứng dụng cho việc phòng trừ dịch hại trên cây trồng

- Nhóm chế phẩm sinh học dùng cho sản xuất phân bón hữu cơ sinh học, phân bón vi sinh

- Nhóm chế phẩm sinh học dùng cho cải tạo đất, xử lý phế thải nông nghiệp

- Nhóm điều hòa sinh trưởng cây trồng bao gồm nhóm các chất kích thích sinh trưởng và nhóm các chất ức chế sinh trưởng

2.2.2 Vai trò của chế phẩm sinh học

Không gây ảnh hưởng tiêu cực đến sức khỏe con người, vật nuôi, cây trồng Không gây ô nhiễm môi trường sinh thái Có tác dụng cân bằng hệ sinh thái ( vi sinh vật, dinh dưỡng …) trong môi trường đất nói riêng và môi trường nói chung Ứng dụng các chế phẩm sinh học không làm hại kết cấu đất, không làm chai đất, thóai hóa đất mà còn góp phần tăng

độ phì nhiêu của đất Có tác dụng đồng hóa các chất dinh dưỡng, góp phần tăng năng suất

và chất lượng nông sản phẩm Có tác dụng tiêu diệt côn trùng gây hại, giảm thiểu bệnh hại, tăng khả năng đề kháng bệnh của cây trồng mà không làm ảnh hưởng đến môi Có khả năng phân hủy, chuyển hóa các chất hữu cơ bền vững, các phế thải sinh học, phế thải nông nghiệp, công nghiệp

2.2.3 Chế phẩm sinh học Tricoderma

Chế phẩm Trichoderma được sản xuất chủ yếu từ nấm Trichoderma, nó tiết ra một loại

enzyme có khả năng làm tan vách tế bào của những loại nấm khác Sau đó, enzyme này tiếp

7

tục tấn công vào bên trong các loại nấm gây bệnh hại cho cây trồng và biến chúng thành

nguồn hữu cơ có lợi.Điều đó cho phép Trichoderma vừa bảo vệ rễ cây, vừa chống lại các

loài nấm gây thối rễ Đồng thời, tái tạo, phục hồi lại những rễ bị tổn thương

Các chế phẩm từ nhóm nấm còn có nấm đối kháng Trichoderma vừa có tác dụng đề

kháng một số nấm bệnh gây hại trên bộ rễ cây trồng như: bệnh vàng lá chết nhanh, còn gọi

là bệnh thối rễ do nấm Phytophthora palmirova gây ra Hay bệnh vàng héo rũ hay còn gọi

là bệnh héo chậm do một số nấm bệnh gây ra: Furasium solari, Pythium sp, Sclerotium rolfosii Việc sử dụng chế phẩm sinh học Trichoderma ủ phân hữu cơ để bón cho cây giúp

tăng cường hệ vi sinh vật có ích trong đất; chuyển đổi các chất hữu cơ thành dạng dễ hấp thụ, chất lượng phân tốt hơn Lưu ý khi sử dụng: không dùng trong điều kiện khô hạn thiếu

ẩm, Trichoderma chỉ có tác dụng trên các phần thân cây khô, vàng úa, mất đi diệp lục; nên

dùng đúng hướng dẫn liều lượng

2.3 Phương pháp kiểm tra mật số bào tử

Dùng phương pháp đếm mật số trên môi trường chuyên biệt cho từng nhóm vi sinh vật, xác định được mật số vi sinh vật có sự biến đổi hay không trong suốt quá trình sau khi cấy Phương pháp đếm bào tử kiểm tra mật số được dùng để ước tính số lượng tế bào nấm trong 1 mẫu thử nghiệm nhất định Đây là phương pháp được áp dụng phổ biến trong nghiên cứu và kiểm nghiệm vi sinh, thực phẩm, nông nghiệp và y học……

Với phương thức đếm thủ công, mỗi chấm khuẩn lạc đặc trưng cho loại vi nấm đích được đếm một lần Để dễ kiểm soát quá trình đếm, người ta thường đặt đĩa petri lên một lưới được kẻ, trước đó cần pha loãng thành các nồng độ và cho ra 3 nồng độ thích hợp cấy lên đĩa, tiến hành thay kết quả vào công thức để có mật độ bào tử đối tượng đang làm