đánh giá ảnh hưởng của các điều kiện lên men lên sự tăng trưởng của vi sinh vật và kiểm soát vi sinh

- Điều chế 2 bình môi trường hoạt hóa 50mL môi trường Hansen/bình, đậy nútbông, ghi nhãn, dùng nuôi hoạt hóa cấp 1.- Hấp tiệt trùng ống Hansen lỏng, bình Hansen hoạt hóa ở 121 độ C, 15 p

BỘ CÔNG THƯƠNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG THƯƠNG THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM



BÁO CÁO THÍ NGHIỆM

MÔN: THÍ NGIỆM VI SINH VẬT HỌC THỰC PHẨM

ĐÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC ĐIỀU KIỆN LÊN MEN

LÊN SỰ TĂNG TRƯỞNG CỦA VI SINH VẬT VÀ KIỂM SOÁT VI SINH

GVHD: Phan Thị Kim Liên

Ngày thí nghiệm: 27/02/2024 – 15/03/2024 Nhóm: 01

Họ và tên:

Tp Hồ Chí Minh, tháng 3 năm 2024

Bài 1 HOẠT HÓA VI SINH VẬT, CHUẨN BỊ NGUYÊN LIỆU LÊN MEN VÀ MÔI

TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT

1 Nguyên tắc và các bước tiến hành hoạt hóa giống nấm men

1.1 Nguyên tắc hoạt hóa giống

Việc hoạt hóa giống vi sinh vật trước khi cấy là một bước quan trọng trong quá trìnhsản xuất và sử dụng vi sinh vật để đảm bảo hiệu quả của quá trình cấy và sự sốngcủa vi sinh vật Ban đầu, ta sử dụng giống nấm men thương mại, đây là dạng menkhô đã được sấy để bảo quản giống nấm men Nghiên cứu đã chỉ ra rằng vi sinh vậttrong trạng thái ngủ hoặc không hoạt động không thể phát triển hoặc sinh sản hiệuquả khi được cấy vào môi trường mới Việc hoạt hóa giống giúp kích thích vi sinhvật hoạt động, tăng cường khả năng sinh sản và phát triển của chúng [1] Ngoài ra,việc hoạt hóa nấm men còn có thể tăng hiệu suất của quá trình cấy: Vi sinh vật đãđược hoạt hóa có khả năng cao hơn để phát triển và thích ứng với môi trường mới.Điều này tăng hiệu suất của quá trình cấy và đảm bảo sự thành công của nó [2] Do

đó, trước khi tiến hành nuôi cấy phải có bước hoạt hóa nấm men

1.2 Các bước tiến hành hoạt hóa giống nấm men

Giống nấm thuần khiết trên môi trường thạch nghiêng Hansen, cấy chuyển sau

12-24 giờ sau khi đã hoạt hóa sơ bộ trên môi trường Hansen lỏng Môi trường lỏng đểhoạt hóa nấm men người ta dùng dịch Hansen có có hàm lượng chất khô 12% Nấmmen sau hoạt hóa để đồng bộ về pha sinh trưởng lũy thừa

Tiến hành thí nghiệm

- Điều chế 2 ống môi trường Hasen lỏng (5ml/ống), nút bông, ghi nhãn, để cấy nấmmen từ thạch nghiêng

- Điều chế 2 bình môi trường hoạt hóa (50mL môi trường Hansen/bình), đậy nútbông, ghi nhãn, dùng nuôi hoạt hóa cấp 1.

- Hấp tiệt trùng ống Hansen lỏng, bình Hansen hoạt hóa ở 121 độ C, 15 phút

- Hoạt hóa tế bào nấm men - Saccharomyces cerevisiae (Ống thạch nghiêng) và

nhân giống cấp 1 (5ml môi trường Hansen vô trùng  ống giống thạch nghiêng đểthu tế bào nấm  50mL môi trường Hansen để tiến hành hoạt hóa cấp 1 (2-3 ngày

ở nhiệt độ phòng, tiến hành lắc (không lắc))

2 Nguyên tắc và các bước tiến hành kiểm tra hình thái nấm men đại thể và

ti thể

2.1 Nguyên tắc

Tế bào nấm men có hình thái và kích thước khác nhau tuỳ loài, tuỳ chi và tuỳ môitrường nuôi cấy Trong môi trường dinh dưỡng cơ bản thường thấy, chúng có thể cóhình cầu, hình bầu dục, hình trứng, hình quả chanh châu Âu, hình ống v.v Khiquan sát tế bào nấm men dưới kính hiển vi có thể phân biệt được thành tế bào, tếbào chất, không bào (vacuole) và các hạt dị nhiễm (metachromatic granules)

3 Nguyên tắc và các bước tiến hành kiểm tra hình thái nấm men đại thể và

ti thể

3.1 Nguyên tắc

Tế bào nấm men có hình thái và kích thước khác nhau tuỳ loài, tuỳ chi và tuỳ môitrường nuôi cấy Trong môi trường dinh dưỡng cơ bản thường thấy, chúng có thể cóhình cầu, hình bầu dục, hình trứng, hình quả chanh châu Âu, hình ống v.v Khiquan sát tế bào nấm men dưới kính hiển vi có thể phân biệt được thành tế bào, tếbào chất, không bào (vacuole) và các hạt dị nhiễm (metachromatic granules)

3.2 Các bước tiến hành kiểm tra hình thái nấm men đại thể và ti thể

Tiêu bản giọt ép (quan sát nấm men ở trạng thái sống)

Bước 1 Lấy một phiến kính sạch cho một giọt nước hay 1 giọt phẩm màumethylene blue (0,1%) Sau đó cho vi sinh vật hòa tan trong giọt nước hay giọt màuloãng đó

Bước 2 Đậy lá kính sao cho chân của lá kính chạm vào giọt nước hay giọt màu,nghiêng một góc nhỏ hơn hoặc bằng 45o và hạ lá kính xuống để không có bọt khí.Bước 3 Đặt phiến kính lên bàn mẫu, hạ tụ quang, đóng bớt chắn sáng, quan sát ởvật kính 10X, dùng ốc chỉnh thô nâng bàn vật mẫu chạm tới vật kính, đặt mắt vàoquan sát, dùng ốc chỉnh thô hạ bàn mẫu xuống cho đến khi thấy ảnh VSV rồi dùngnút chỉnh tinh vặn để xem rõ ảnh VSV Trên bàn mẫu, dùng ốc di chuyển mẫu vật dichuyển phiến kính đến vùng muốn quan sát trong thị trường

Bước 4 Để quan sát ảnh có độ phóng đại lớn hơn, chuyển sang vật kính 40X vàđiều chỉnh ốc chỉnh tinh để tìm ảnh

Kết quả quan sát:

- Quan sát tế bào nấm men, tế bào nấm men nẩy chồi, tế bào sống, tế bào chết.

- Nấm men sống không bắt màu thuốc nhuộm Nấm men chết bắt màu thuốc

nhuộm

- Nguyên nhân: Ở những tế bào nấm men sống, màng tế bào có tính thấm chọn

lọc, tức là thuốc nhuộm như xanh methylene blue không thể đi qua, khiếncho khi quan sát dưới kính hiển vi, ta không thấy nấm men sống có màuxanh Ngược lại, đối với tế bào nấm men chết, màng mất đi tính thấm chọnlọc, nên khi nhuộm với hoá chất này nó sẽ bắt màu xanh và dễ dàng quan sátđược dưới kính hiển vi

Hình 1 Quan sát mẫu nấm men dưới kính hiển vi X10

(Bên trái chưa nhuộm màu methylene blue, bên phải đã được nhuộm màu)

4 Nguyên tắc và các bước tiến hành đo hoạt lực nấm men

4.1 Nguyên tắc:

Trong quá trình lên men rượu có hai sản phẩm chính là rượu ethylic và CO2, để xácđịnh hoạt lực lên men của nấm men có thể dựa vào khả năng thoát khí CO2 trongquá trình lên men Vì vậy, có thể dựa vào thời gian đẩy hết ống Durham sớm nhất

để xác định có hoạt lực lên men mạnh nhất [3] Tuy nhiên, do thời gian lên mentrong ống Durham ngắn trong khi quá trình lên men rượu có thời gian dài Vì vậy,phương pháp đo chiều cao cột khí CO2 bằng ống Durham chỉ là cơ sở ban đầu đểxác định dòng nấm men có hoạt tính cao Chiều cao cột khí CO2 thể hiện khả nănglên men rượu của các dòng nấm men [4]

4.2 Các bước tiến hành để đo hoạt lực nấm men

Bước 1: Nuôi sinh khối nấm men trong 24 giờ ở 30oC, lấy nửa vòng que cấy nấmmen trong ống thạch nghiêng chủng vào 100 ml môi trường Hansen lỏng (đã khửtrùng ở 121oC trong 10 phút) Trong trường hợp dùng men khô cân 0,1 g nấm menkhô cho 100 ml vào 100 ml môi trường Hansen lỏng, nuôi cấy trong 24 giờ ở 30oC

Bước 2: Chủng men giống lấy 1 ml dung dịch nấm men cho vào ống Durham có

chứa 9 ml dung dịch Hansen lỏng đã hấp khử trùng dùng ống nghiệm nắp vặn

Bước 3: Lắc thật đều để dung dịch đường tràn đầy vào ống thủy tinh úp ngược nằm

bên trong ống Durham ủ ở 30oC

Bước 4: Chỉ tiêu đánh giá khả năng lên men của nấm men là đo chiều cao cột khí

CO2 sinh ra trong ống thuỷ tinh úp ngược tại các thời điểm 12h, 24h ủ Dòng nấmmen có hoạt tính cao là dòng nấm men có chiều cao cột khí CO2 sinh ra là cao nhất

Bài 2 NHÂN SINH KHỐI NẤM MEN VÀ ĐO SINH TRƯỞNG NẤM MEN

1 Nguyên tắc và các bước tiến hành nhân sinh khối tế bào nấm men:

1.2 Các bước tiến hành:

* Môi trường Hansen lỏng đã được chuẩn bị từ buổi 1 (5 ống môi trường) nhưng chỉ sử dụng 3 ống để tiến hành nhân giống Qui trình thực hiện được ghi lại dựa trên các bước tiến hành tại nơi làm việc.

Bước 1: Chuẩn bị khu vực nhân giống nấm mem gồm có giá đỡ ống nghiệm, đèn cồn, 3ống nghiệm chứa môi trường Hasen lỏng

Bước 2: Cân 0,01g nấm men giống

Bước 3: Tiến hành đốt đèn cồn, tạo môi trường vô trùng, lấy 0,01g nấm men giống cho vàoống nghiệm đầu tiên (10mL) và lắc để lượng nấm men bám trên thành ống được hòa tanhết (như hình mô tả bên dưới) và ghi nhãn

Bước 4: Tiến hành soi mật độ các tế bào nấm men khi chưa pha loãng dưới kính hiển vi vớiông kính (x4) và (x10) Kết quả hình ảnh ghi hình được theo vật kính (x4) và (x10) lần lượtnhư sau:

Bước 5: Tiến hành pha loãng hoạt hóa nấm men trong môi trường Hasen cấp 1 (D=1/2).Sau khi ống thứ nhất ổn định, cho 10mL dung dịch có trong ống sang ống thứ 2 và ghinhãn

Bước 6: Tiếp tục pha loãng (D=1/4), hút 10mL dung dịch môi trường trong ống thứ 2 bằngpipet sau đó cho vào ống nghiệm thứ 3 và ghi nhãn Lắc ống nghiệm cho môi trường đượchòa tan và dàn đều

Bước 6: Tiến hành soi mật độ visinh vật khi được pha loãng ở ống nghiệm thứ 3 (D=1/4)bằng vật kính (x4) và (x10) Kết quả ghi hình được lần lượt như hai hình bên dưới:

Lưu ý: các dụng cụ thí nghiệm đã được rữa sạch và tráng qua nước cất trước khi thực hiện

2 Trình bày nguyên tắc và các bước đếm tế bào nấm men bằng buồng đếm hồng cầu và đo quang phổ OD

2.1 Kiểm tra số lượng nấm men bằng buồng đếm hồng cầu (phương pháp đếm trực tiếp)

2.1.1 Nguyên tắc:

Vi sinh vật đơn bào có kích thước lớn như: nấm men, tảo… có thể được định lượngbằng cách đếm trực tiếp bằng buống đếm trên kính hiển vi Phương pháp này có ưu

điểm là có thể xác định được ngay lượng tế bào trong mẫu, nhưng lại có nhượcđiểm là không xác định được tế bào còn sống hay đã chết, dễ lầm tế bào VSVvới các hạt vật thể khác có trong môi trường và dịch huyền phù VSV phải có mật

Bước 3: Tiến hành pha loãng các dung dịch với D=1/2 và D=1/4

Bước 4: Khi hoàn thành quá trình pha loãng tiến hành vệ sinh buồng đếm Dùngống hút nhỏ giọt hút từ 1 đến 2 giọt dung dịch từ ống thứ 3 (D=1/4) cho vào buồngđếm rồi tiến hành quan sát bằng kính hiển vi với vật kính (x4) và (x10) Kết quả ghihình lần lượt như ảnh dưới đây:

Bước 5: Đếm tổng số nấm men dựa theo nguyên tắc “lấy tế bào chạm vào cạnh bêntrái và cạnh dưới của ô”, không đếm các tế bào tiếp xúc với cạnh bên phải và phíatrên của ô.

Bước 6: Tính kết quả

Tổng số tế bào nấm men:

C (tb/mL) =T n * 250.000 * DTrong đó:

 C: mật độ tế bào nấm men là tổng số tế bào có trong 1ml dịch men (tếbào/ml);

 T: tổng số tế bào nấm men đếm được trong n lớn (5 ô lớn)

2.2 Kiểm tra số lượng nấm men bằng cách đo quang phổ OD (phương pháp đo độ đục):

Phương pháp này được thực hiện dễ dàng và nhanh chóng cho dịch lêm menbia hoặc trong dịch nuôi cấy tế bào nấm men Nấm men có thể được đo trực tiếp ởbước sóng 600 nm trong bình nuôi cấy tế bào Phương pháp này có thể được thựchiện tại bất kỳ địa điểm nào và không yêu cầu phải lắp đặt phòng thí nghiệm Cácmáy quang phổ khác nhau sẽ cho giá trị OD600 khác nhau (sai số) đối vớicùng một mẫu nấm men Lý do cho điều này là các tế bào nấm men là các hạt tán

xạ và hấp thụ ánh sáng Một mẫu tế bào nấm men không tuân theo định luậtLambert-Beer, vì đây là huyền phù không phải dung dịch

Các thiết bị đo mật độ quang: máy đo độ đục (để bàn và cầm tay), máy đoquang phổ khả kiến (Vis)

2.2.2 Qui trình thực hiện:

*Qui trình thực hành được ghi chepd dựa theo phần lí thuyết hướng dẫn vì phần

đo quang phổ OD không được thực hiện tại nơi làm việc.

Bước 1: Cân chuyển 1 gram nấm men khô vào trong 99 mL dung dịch sinh lý(0,9% NaCl) hoạt hoá ở nhiệt độ phòng (30oC) trong 30 phút (trong nhà máy,dùng dịch lên men bia, dịch nuôi cấy sinh khối nấm men khi cần xác định mật độnuôi cấy đương thời)

Bước 2: Pha loãng liên tiếp dịch nấm men để dựng đường chuẩn

Bước 3: Đếm mật độ tế bào nấm men bằng buồng đếm Neubauer cải tiến

Bước 4: Dựng đường tuyến tính (đường chuẩn) giữa giá trị OD của các độ phaloãng dịch nấm men và số lượng tế bào

Mỗi độ pha loãng kế tiếp của dịch tế bào nấm men, thực hiện 3 phép đo Sau khi

có kết quả mật độ tế bào, chúng ta cũng có thể quy về logarit theo cơ số 10

Lấy giá trị trung bình và vẽ đường tương quan tuyến tính giữa giá trị OD và sốlượng tế bào đếm được tương ứng Xác định phương trình tuyến tính.

Bảng 1 Xây dựng đường tương quan tuyến tính giữa giá trị OD và số lượng tế bàonấm men

Bài 3 TIẾN HÀNH LÊN MEN

I CƠ SỞ LÝ THUYẾT

Quá trình lên men ở phòng thí nghiệm thường được thưc hịên trong ống nghiệm,trong hộp petri, trong bình tam giác và trong bình lên men, nhưng chủ yếu là trongcác bình tam giác Việc thông khí đối với vi sinh vật hiếu khí được đảm bảo bằngkhông khí khuếch tán qua nút bông hoặc khe hở hộp petri, còn ở bình men có hệ cấpkhông khí riêng

Công việc làm với giống vi sinh vật được tiến hành trong buồng cấy vô trùng, mộtphòng thí nghiệm lên men cần phải có một buồng vô trùng để tránh nguy cơ bị tạpnhiễm những vi sinh vật lạ do không khí hay người thao tác mang vào

Buồng cấy vô trùng: Hoàn toàn được cách ly chỉ có một lối vào duy nhất có trang bịđèn cực tím để sát khuẩn và được cung cấp không khí vô khuẩn Tiếp theo lối đi làbuồng đệm có quần áo, mũ, khẩu trang và dép sạch đã vô khuẩn để người thao tácthay đổi trước khi bước vào phòng làm việc chính thức Phòng phải được lắp đặtcác đèn cực tím thích hợp để diệt khuẩn

Hầu hết các chủng vi sinh vật dùng trong công nghệ lên men là các chủng di dưỡng,nghĩa là chúng cần có các chất dinh dưỡng hữu cơ có trong môi trường để tiến hành

dị hoá, đồng hoá xây dựng tế bào, phát triển và sản sinh ra các sản phẩm mà tamong muốn Vì vậy, việc tiến hành lên men ở phòng thí nghiệm cũng nghĩa lànghiên cứu các thành phần môi trường nuôi cấy bán tổng hợp sao cho thích hợp vừa

rẻ tiền vừa đơn giản và có được năng suất cao

Môi trường dinh dưỡng : lên men bề mặt người ta thường chọn môi trường là cám

có thêm các loại bột (xay từ các loại hạt ngũ cốc như gạo, ngô, đậu tương …) Cámvừa là nguồn cacbon vừa là nguồn chất sinh trưởng, trong cám có khoảng 20 đến25% tinh bột, nhiều vitamin, đặc biệt là vitamin B1 Ngoài ra còn có trấu, các loại

xơ từ xenlulose, hemixenlulose làm cho môi trường xốp dễ thông khí, khi nuôi đượcthực hiện trong bình tam giác hoặc trên khay

Lên men chìm thì thực hiện ở môi trường lỏng, thành phần môi trường cần phải cónguồn cung cấp là các hợp chất hữu cơ, nitơ (có thể là chất hữu cơ hoặc muối amônhay urê) những nguyên tố vô cơ và một số chất sinh trưởng như vitamin, hỗn hợpcác acid amin trong các dịch protein thuỷ phân

Nguồn cacbon hữu cơ là glucose, sacarose, đôi khi là lactoza hay glyxerin, cùngmột số sản phẩm của tự nhiên như rỉ đường, tinh bột…

Đây là nguồn cacbon dinh dưỡng và cũng là nguồn năng lượng trong quá trình biếnđổi hoá sinh

Các nguồn thuỷ phân động vật, thực vật, các pepton, nước thịt cùng với các muốinitơ- vô cơ, như muối amoni, nitrat là nguồn nitơ cần thiết cho vi sinh vật

Dịch chiết nấm men hay cao nấm men, dịch chiết ngô hay cao ngô, cao gan, dịchrau quả, giá đỗ, dịch bã rượu v.v… là những chất sinh trưởng cần thiết cho các visinh vật di dưỡng

Trong thành phần môi trường người ta còn dùng các chất đệm để ổn định pH, cácchất đó là các muối kali photphat hoặc muối canxi cacbonat

Nước máy dùng để pha chế môi trường Trong nước máy có đủ các chất khoáng vilượng cần thiết đối với sinh trưởng của nhiều vi sinh vật Nhưng đôi khi cần thiếtngười ta vẫn cho thêm một số muối vô cơ hay hữu cơ vào môi trường nuôi cấy Thanh trùng: là khử trùng môi trường ở trong nồi hấp (autoclave) với áp suất dưtương ứng với 110- 120oC trong 20 phút hoặc lâu hơn Ơ đây cần lưu ý: một sốthành phần môi trường khi hấp ở nhiệt độ cao xảy ra giữa đường với các acid amin( phản ứng Maillard) làm cho môi trường có màu nâu và xuất hiện một số sản phẩmđộc với vi sinh vật Vì vậy, ta có thể phải khử khuẩn riêng đối với dịch đường ( vớidịch đường glucose khử trùng ở 105- 1100C ) và trước khi cấy giống đem trộn lẫnvới các thành phần khác của môi trường Một số chất sinh trưởng có thể bị phá huỷkhi ở nhiệt độ cao thì phải khử khuẩn riêng bằng cách lọc qua lọc vô khuẩn rồimới cho vào môi trường Các lọc này thường là lọc Seti2 hoặc Milipore

Nuôi cấy : những ống nghiệm và các bình tam giác khi đã cấy giống được nuôi tĩnh

sẽ đặt trong tủ ấm từ 25- 37oC hoặc nhiệt độ trong phòng tuỳ từng chủng nghiêncứu

Vì các vi sinh vật đem sử dụng thường là loại hiếu khí nên cần đảm bảo cung cấpoxy cho môi trường, oxy đóng vai trò quan trọng, nó làm tăng tốc độ phát triển vàtăng tốc độ hình thành các chất chuyển hoá

Mục đích của phương pháp mới này là tạo điều kiện cho việc cung cấp oxy vàomôi trường bằng cách làm phân tán không khí thành những bọt rất nhỏ, đồng thời

tăng diện tiếp xúc Có ba loại máy: máy lắc giật, máy lắc quay tròn, máy lắc đungđưa

Máy lắc quay tròn thực tế đã thay thế các loại máy khác vì cấu tạo chắc chắn hơn vàkhả năng cung cấp oxy cao hơn Máy này gồm có một giá đỡ, trên đặt một động cơđiện giảm tốc có tốc độ vòng phút thay đổi được trong khoảng từ 50- 300 vòng /phút Trục giảm tốc mang một đĩa lệch tâm quay tròn một mặt bàn

Vì mục đích của việc dùng máy lắc để đảm bảo nhu cầu thông khí thích hợp chomôi trường nên cần phải đo tốc độ hấp thu oxy Cách đo này làm theo phương phápcủa Cooper (1944) như sau: thay môi trường ở trong các bình tam giác bằng cùngmột thể tích dung dịch natri sunfit đã chuẩn độ Trong cùng một điều kiện lắc trộn

và nhiệt độ, sau một thời gian nhất định, người ta định lường số oxy đã được hấpthu bằng dung dịch chuẩn iôt với sự có mặt của vết đồng hay coban Có thể địnhlượng trực tiếp hoặc dùng natri hyposunfit định lượng gián tiếp

Thời gian nuôi cấy trên máy lắc thay đổi tuỳ chủng Thời gian này tuỳ thuộc mụcđích muốn có một môi trường để phân tích hay dùng để làm giống gieo cấy tiếp vàocác bình lớn hơn, như các nồi lên men thí nghiệm

Những bình lên men (fermentor) thí nghiệm cho phép nuôi cấy ở những thể tích môitrường quan trọng hơn Dung tích của những bình này là từ 5-50lít, hay dùng nhất làloại 10- 20lít

II TRẢ LỜI CÂU HỎI

1 Trình bày các bước tiến hành lên men

- Bước 1:Chuẩn bị nước trái cây cô đặc/mua nước trái cây cô đặc (táo);

- Bước 2:Đo OD tế bào nấm men (NGC2→ xác định tế bào nấm men qua đườngchuẩn);

- Bước 3: Tiến hành bổ sung natri metabisunfit (Na2S2O5) vào sản phẩm để thanhtrùng dịch lên men nhằm ức chế và tiêu diệt các vi sinh vật không có lợi cho quátrình lên men (30mg/l tính theo SO2) (1 số nhóm sp không bổ sung chất này) (1-1.5h)

- Bước 4: Thanh trùng nguyên liệu trước khi lên men (1 số nhóm sp không thanhtrùng)