khảo sát khả năng ức chế nấm mốc neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu trên thanh long của vi khuẩn bacillus licheniformis d7

Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2021 Hồ Nguyễn Hoàng Yến hghieh euu thu hghiem hhah giohg eay hoc hgah xco clyxxum mcritimum bahg uhuohg uhau gieo hathghieh euu thu hghiem hhah giohg eay hoc

Trang 1

Neoscytalidium dimidiatum GÂY BỆNH

ĐỐM NÂU TRÊN THANH LONG

CỦA VI KHUẨN Bacillus licheniformis D7

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã chuyên ngành: 52420201

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2021

702413069:31:37 PM9:31:37 PM702413069:31:37 PM9:31:37 PM702413069:31:37 PM9:31:37 PM

hghieh euu thu hghiem hhah giohg eay hoc hgah xco clyxxum mcritimum bahg uhuohg uhau gieo hathghieh euu thu hghiem hhah giohg eay hoc hgah xco clyxxum mcritimum bahg uhuohg uhau gieo hathghieh euu thu hghiem hhah giohg eay hoc hgah xco clyxxum mcritimum bahg uhuohg uhau gieo hathghieh euu thu hghiem hhah giohg eay hoc hgah xco clyxxum mcritimum bahg uhuohg uhau gieo hat

hghieh euu thu hghiem hhah giohg eay hoc hgah xco clyxxum mcritimum bahg uhuohg uhau gieo hathghieh euu thu hghiem hhah giohg eay hoc hgah xco clyxxum mcritimum bahg uhuohg uhau gieo hathghieh euu thu hghiem hhah giohg eay hoc hgah xco clyxxum mcritimum bahg uhuohg uhau gieo hathghieh euu thu hghiem hhah giohg eay hoc hgah xco clyxxum mcritimum bahg uhuohg uhau gieo hathghieh euu thu hghiem hhah giohg eay hoc hgah xco clyxxum mcritimum bahg uhuohg uhau gieo hathghieh euu thu hghiem hhah giohg eay hoc hgah xco clyxxum mcritimum bahg uhuohg uhau gieo hathghieh euu thu hghiem hhah giohg eay hoc hgah xco clyxxum mcritimum bahg uhuohg uhau gieo hathghieh euu thu hghiem hhah giohg eay hoc hgah xco clyxxum mcritimum bahg uhuohg uhau gieo hat

70Thursday, June 13, 20249:31:37 PM9:31:37 PM70Thursday, June 13, 20249:31:37 PM9:31:37 PM70Thursday, June 13, 20249:31:37 PM9:31:37 PM

hghieh euu thu hghiem hhah giohg eay hoc hgah xco clyxxum mcritimum bahg uhuohg uhau gieo hathghieh euu thu hghiem hhah giohg eay hoc hgah xco clyxxum mcritimum bahg uhuohg uhau gieo hathghieh euu thu hghiem hhah giohg eay hoc hgah xco clyxxum mcritimum bahg uhuohg uhau gieo hathghieh euu thu hghiem hhah giohg eay hoc hgah xco clyxxum mcritimum bahg uhuohg uhau gieo hathghieh euu thu hghiem hhah giohg eay hoc hgah xco clyxxum mcritimum bahg uhuohg uhau gieo hathghieh euu thu hghiem hhah giohg eay hoc hgah xco clyxxum mcritimum bahg uhuohg uhau gieo hathghieh euu thu hghiem hhah giohg eay hoc hgah xco clyxxum mcritimum bahg uhuohg uhau gieo hathghieh euu thu hghiem hhah giohg eay hoc hgah xco clyxxum mcritimum bahg uhuohg uhau gieo hathghieh euu thu hghiem hhah giohg eay hoc hgah xco clyxxum mcritimum bahg uhuohg uhau gieo hathghieh euu thu hghiem hhah giohg eay hoc hgah xco clyxxum mcritimum bahg uhuohg uhau gieo hathghieh euu thu hghiem hhah giohg eay hoc hgah xco clyxxum mcritimum bahg uhuohg uhau gieo hathghieh euu thu hghiem hhah giohg eay hoc hgah xco clyxxum mcritimum bahg uhuohg uhau gieo hathghieh euu thu hghiem hhah giohg eay hoc hgah xco clyxxum mcritimum bahg uhuohg uhau gieo hathghieh euu thu hghiem hhah giohg eay hoc hgah xco clyxxum mcritimum bahg uhuohg uhau gieo hathghieh euu thu hghiem hhah giohg eay hoc hgah xco clyxxum mcritimum bahg uhuohg uhau gieo hathghieh euu thu hghiem hhah giohg eay hoc hgah xco clyxxum mcritimum bahg uhuohg uhau gieo hat

hghieh euu thu hghiem hhah giohg eay hoc hgah xco clyxxum mcritimum bahg uhuohg uhau gieo hathghieh euu thu hghiem hhah giohg eay hoc hgah xco clyxxum mcritimum bahg uhuohg uhau gieo hathghieh euu thu hghiem hhah giohg eay hoc hgah xco clyxxum mcritimum bahg uhuohg uhau gieo hathghieh euu thu hghiem hhah giohg eay hoc hgah xco clyxxum mcritimum bahg uhuohg uhau gieo hathghieh euu thu hghiem hhah giohg eay hoc hgah xco clyxxum mcritimum bahg uhuohg uhau gieo hathghieh euu thu hghiem hhah giohg eay hoc hgah xco clyxxum mcritimum bahg uhuohg uhau gieo hathghieh euu thu hghiem hhah giohg eay hoc hgah xco clyxxum mcritimum bahg uhuohg uhau gieo hathghieh euu thu hghiem hhah giohg eay hoc hgah xco clyxxum mcritimum bahg uhuohg uhau gieo hathghieh euu thu hghiem hhah giohg eay hoc hgah xco clyxxum mcritimum bahg uhuohg uhau gieo hathghieh euu thu hghiem hhah giohg eay hoc hgah xco clyxxum mcritimum bahg uhuohg uhau gieo hathghieh euu thu hghiem hhah giohg eay hoc hgah xco clyxxum mcritimum bahg uhuohg uhau gieo hathghieh euu thu hghiem hhah giohg eay hoc hgah xco clyxxum mcritimum bahg uhuohg uhau gieo hat

70hghieh euu thu hghiem hhah giohg eay hoc hgah xco clyxxum mcritimum bahg uhuohg uhau gieo hatThursday, June 13, 2024

Trang 2

i

THÔNG TIN CHUNG

Họ và tên sinh viên: Hồ Nguyễn Hoàng Yến MSHV: 17026901 Lớp : DHSH13A Khóa: K13 (2017-2021) Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Mã chuyên ngành: 52420101

Cơ quan công tác : Trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh

Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2021

Hồ Nguyễn Hoàng Yến

hghieh euu thu hghiem hhah giohg eay hoc hgah xco clyxxum mcritimum bahg uhuohg uhau gieo hathghieh euu thu hghiem hhah giohg eay hoc hgah xco clyxxum mcritimum bahg uhuohg uhau gieo hathghieh euu thu hghiem hhah giohg eay hoc hgah xco clyxxum mcritimum bahg uhuohg uhau gieo hathghieh euu thu hghiem hhah giohg eay hoc hgah xco clyxxum mcritimum bahg uhuohg uhau gieo hat702413069:31:37 PM9:31:37 PM702413069:31:37 PM9:31:37 PM702413069:31:37 PM9:31:37 PM

Trang 3

ii

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành được đề tài nghiên cứu này, em đã nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình và những lời động viên sâu sắc của quý Thầy Cô, gia đình và bạn bè trong suốt khoảng thời gian thực hiện đề tài

Lời đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh, Ban lãnh đạo Viện, Ban quản lý phòng thí nghiệm và quý Thầy Cô của Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm đã hỗ trợ về cơ sở vật chất và tạo điều kiện tốt nhất để em hoàn thành đề tài nghiên cứu

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Thị Diệu Hạnh đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt nhiều kinh nghiệm và kiến thức chuyên môn giúp em kịp thời giải quyết vấn đề, động viên em những lúc khó khăn và luôn tạo mọi điều kiện thuận lợi để em hoàn thành đề tài nghiên cứu này

Em xin chân thành cảm ơn TS Phạm Tấn Việt và TS Nguyễn Ngọc Ẩn đã luôn quan tâm, chỉ bảo và luôn sẵn lòng hỗ trợ em trong suốt thời gian thực hiện đề tài Em xin gửi lời cảm ơn đến tập thể sinh viên làm việc tại Phòng Thí nghiệm Công nghệ Vi sinh thuộc Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm đã giúp đỡ, san sẻ và tạo động lực để em hoàn thành tốt đề tài nghiên cứu này

Cảm ơn gia đình đã luôn chia sẻ, hỗ trợ và là nguồn động viên to lớn đối với con trong suốt thời gian qua

Tuy đã cố gắng rất nhiều nhưng vì vốn kiến thức, kinh nghiệm của bản thân còn hạn chế, do đó trong quá trình thực hiện và hoàn thành đề tài, em không tránh khỏi những thiếu sót nên rất mong nhận được những ý kiến đóng góp của quý Thầy Cô để em có thể hoàn thiện hơn

Cuối cùng, em xin kính chúc quý Thầy Cô luôn dồi dào sức khỏe và gặt hái được nhiều thành công trong công việc cũng như trong cuộc sống Em xin chân thành cảm ơn!

Trang 4

iii

TÓM TẮT

Thanh long là loại trái cây giàu dinh dưỡng và có giá trị kinh tế cao Tuy nhiên, từ những năm 2008-2009, trên thanh long xuất hiện một bệnh mới có tên gọi là bệnh đốm nâu Bệnh đốm nâu làm cho thân cây và quả thanh long xuất hiện các đốm cam hình tròn nhỏ, trũng xuống, đốm đen và thối rữa, làm thiệt hại nghiêm trọng đến

chất lượng cũng như năng suất cây trồng Chủng nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum được xác định là nguyên nhân chính gây ra bệnh đốm nâu trên thanh

long Do đó, nhằm tìm ra các đối tượng vi sinh vật có khả năng kiểm soát hiệu quả

bệnh đốm nâu do N dimidiatum gây ra và an toàn đối với môi trường, chúng tôi đã khảo sát khả năng ức chế sự sinh trưởng và phát triển của nấm N dimidiatum bởi chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis D7 Dịch nuôi cấy của chủng B licheniformis

D7 có khả năng ức chế sự nảy mầm và làm biến dạng cấu trúc bào tử mốc cũng như tế bào hệ sợi tơ nấm Bên cạnh đó, dịch nuôi cấy vi khuẩn có hoạt tính kháng nấm mốc tốt nhất khi ở điều kiện nhiệt độ phòng và tại pH 7.0 Thêm vào đó, dịch nuôi

cấy của chủng B licheniformis D7 có khả năng ức chế sự phát triển bệnh đốm nâu do N dimidiatum gây ra và làm giảm mức độ bệnh trên quả thanh long Hơn nữa,

dịch nuôi cấy vi khuẩn còn cho thấy có khả năng ngăn ngừa hoàn toàn sự phát triển

bệnh trên thân cây thanh long trong ít nhất 21 ngày gây nhiễm với mốc N dimidiatum Nghiên cứu này cho thấy chủng vi khuẩn B licheniformis D7 có tiềm

năng trong việc ứng dụng sản xuất chế phẩm sinh học để kiểm soát bệnh do nấm

mốc N dimidiatum gây ra nhằm phục vụ cho ngành trồng thanh long ở nước ta

Trang 5

1.2.2 Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu trên thanh long 10

1.3 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 12

1.3.1 Một số nghiên cứu ngoài nước 12

1.3.2 Một số nghiên cứu trong nước 13

1.3.3 Đánh giá kết quả các công trình nghiên cứu đã công bố 13

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 15

2.1 Nguyên vật liệu 15

2.2 Các phương pháp nghiên cứu 18

2.2.1 Bố trí thí nghiệm 18

123docz.net - File bi loi xin lienhe: lethikim34079@hotmail.com

Trang 6

v

2.2.2 Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật 18

2.2.2.1 Phương pháp bảo quản giống vi khuẩn 18

2.2.2.2 Phương pháp bảo quản bào tử nấm mốc 19

2.2.2.3 Phương pháp bảo quản hệ sợi tơ nấm mốc 19

2.2.3 Phương pháp thu nhận dịch nuôi cấy vi khuẩn 19

2.2.4 Phương pháp khuếch tán qua giếng thạch 19

2.2.5 Phương pháp xây dựng đường cong tăng trưởng của vi khuẩn 20

2.2.6 Phương pháp khảo sát các thành phần khác nhau của dịch nuôi cấy vi khuẩn lên hoạt tính ức chế nấm mốc 20

2.2.7 Phương pháp khảo sát tác động của dịch nuôi cấy vi khuẩn lên sự nảy mầm của bào tử nấm mốc 20

2.2.8 Phương pháp khảo sát tác động của dịch nuôi cấy vi khuẩn lên sự phát triển của hệ sợi tơ nấm mốc 21

2.2.9 Phương pháp khảo sát khả năng bền nhiệt, bền pH của dịch nuôi cấy vi khuẩn lên hoạt tính ức chế sự phát triển của nấm mốc 21

2.2.10 Phương pháp kiểm tra hiệu quả ngăn ngừa bệnh đốm nâu do nấm mốc gây ra trên thanh long của dịch nuôi cấy vi khuẩn 22

2.2.11 Phương pháp xử lí số liệu 23

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 24

3.1 Định danh chủng nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum 24

3.2 Định danh chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis D7 26

3.3 Kết quả sơ bộ khả năng ức chế sự sinh trưởng và phát triển của nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum bởi dịch nuôi cấy vi khuẩn Bacillus licheniformis D7 29

123docz.net - File bi loi xin lienhe: lethikim34079@hotmail.com

Trang 7

vi

3.4 Đường cong tăng trưởng của chủng Bacillus licheniformis D7 30

3.5 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên hoạt tính ức chế nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum của dịch nuôi cấy chủng vi khẩn Bacillus licheniformis D7 31

3.6 Tác động của dịch nuôi cấy chủng Bacillus licheniformis D7 lên sự nảy mầm của bào tử nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum 32

3.7 Tác động của dịch nuôi cấy chủng Bacillus licheniformis D7 lên sự phát triển của hệ sợi tơ nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum 36

3.8 Khả năng bền nhiệt và bền pH của dịch nuôi cấy chủng Bacillus licheniformis D7 lên hoạt tính ức chế nấm mốc Neoscytlidium dimidiatum 38

3.8.1 Khả năng bền nhiệt 38

3.8.2 Khả năng bền pH 40

3.9 Hiệu quả ngăn ngừa bệnh đốm nâu trên thanh long do nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum gây ra của dịch nuôi cấy chủng Bacillus licheniformis D7 42

702413069:31:37 PM9:31:37 PM702413069:31:37 PM9:31:37 PM702413069:31:37 PM9:31:37 PM

Trang 8

vii

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Hình thái đại thể và vi thể của chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis 8 Hình 1.2 Hình thái đại thể và vi thể của nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum 10 Hình 1.3 Các giai đoạn phát triển bệnh thối thân do Neoscytalidium dimidiatum gây

ra trên thanh long 12 Hình 1.4 Bệnh đốm nâu trên thân cây và quả thanh long 12 Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 18 Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc của nấm mốc HY trong 7 ngày nuôi cấy trên môi trường PGA 24 Hình 3.2 Hình thái vi thể của chủng nấm mốc HY 25 Hình 3.3 Tỉ lệ tương đồng (gene mã hóa cho 18S-rRNA) của chủng HY với các loài lân cận 25 Hình 3.4 Cây phả hệ của chủng HY với các loài lân cận 26

Hình 3.5 Hình thái khuẩn lạc và khả năng sinh catalase của chủng vi khuẩn Bacillus

sp D7 27

Hình 3.6 Hình thái vi thể của chủng Bacillus sp D7 khi được nhuộm Gram và

nhuộm bào tử 27

Hình 3.7 Tỉ lệ tương đồng (gene mã hóa cho 16S-rRNA) của chủng Bacillus sp D7

với các loài lân cận 28

Hình 3.8 Cây phả hệ của chủng Bacillus sp D7 với các loài lân cận 28 Hình 3.9 Khả năng đối kháng nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum của dịch nuôi cấy vi khuẩn Bacillus licheniformis D7 29

Trang 9

Neoscytalidium dimidiatum của dịch nuôi cấy chủng Bacillus licheniformis D7 32 Hình 3.13 Tác động của dịch nuôi cấy chủng Bacillus licheniformis D7 lên hình thái và khả năng nảy mầm của bào tử nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum 34 Hình 3.14 Tác động của dịch nuôi cấy chủng Bacillus licheniformis D7 lên sự sinh trưởng của bào tử nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum 35 Hình 3.15 Tác động của dịch nuôi cấy chủng Bacillus licheniformis D7 lên hình thái và sự phát triển của hệ sợi tơ nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum 37 Hình 3.16 Phần trăm hoạt tính kháng mốc Neoscytalidium dimidiatum còn lại của dịch nuôi cấy chủng Bacillus licheniformis D7 tại các nhiệt độ khác nhau ở thời gian

Trang 10

ix

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 2.1 Một số thiết bị và dụng cụ 15

Bảng 2.2 Một số hóa chất 16

Bảng 2.3 Thành phần một số môi trường sử dụng trong nghiên cứu 16

Bảng 2.4 Một số nguyên vật liệu được sử dụng trong nghiên cứu 17

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis D7 đối với sự nảy mầm của bào tử nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum ở các tỉ lệ và thời gian khác nhau 33

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis D7 đối với sự phát triển của hệ sợi tơ mốc Neoscytalidium dimidiatum ở các tỉ lệ và thời gian khác nhau 36 hghieh euu thu hghiem hhah giohg eay hoc hgah xco clyxxum mcritimum bahg uhuohg uhau gieo hathghieh euu thu hghiem hhah giohg eay hoc hgah xco clyxxum mcritimum bahg uhuohg uhau gieo hathghieh euu thu hghiem hhah giohg eay hoc hgah xco clyxxum mcritimum bahg uhuohg uhau gieo hathghieh euu thu hghiem hhah giohg eay hoc hgah xco clyxxum mcritimum bahg uhuohg uhau gieo hat

702413069:31:37 PM9:31:37 PM702413069:31:37 PM9:31:37 PM702413069:31:37 PM9:31:37 PM

Trang 11

1

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Thanh long là một loại cây ăn quả nhiệt đới và cận nhiệt đới quan trọng Thanh long

thuộc họ Xương rồng (Cactaceae) và xuất hiện ở các vùng nhiệt đới bản địa của

châu Mỹ Latinh, bao gồm Mexico, Trung và Nam Mỹ Hiện nay, nó cũng được trồng rộng khắp các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới trên toàn thế giới, đặc biệt là ở các nước châu Á, như Malaysia, Việt Nam, Thái Lan, Philippines và Trung Quốc [1]

Tại Việt Nam, thanh long được trồng chủ yếu ở các tỉnh Bình Thuận, Long An và Tiền Giang, tổng diện tích sản xuất thanh long khoảng 50.000 ha với giống ruột

trắng (Hylocereus undatus) chiếm hơn 95% sản lượng, tiếp theo là giống ruột đỏ (Hylocereus polyrhizus) chiếm 4,5% [2] Trong đó, sản lượng để xuất khẩu lớn hơn rất nhiều so với tiêu thụ trong nước

Diện tích trồng thanh long ở Việt Nam tăng nhanh từ 5.512 ha năm 2000 lên đến 35.665 ha năm 2014 với tổng sản lượng đạt khoảng 614.346 tấn [3] Theo số liệu ước tính sơ bộ năm 2015, diện tích trồng mới thanh long gần 5.000 ha, sản lượng đạt khoảng 686.195 tấn [3] Theo thống kê, sản lượng thanh long ở Việt Nam đạt khoảng 1,2 triệu tấn vào năm 2019 và dự kiến sẽ đạt 1,7 triệu tấn vào năm 2025, dự báo tốc độ tăng trưởng đạt 6,0% [2] Do đó, việc xuất khẩu thanh long mang lại nguồn thu nhập lớn cho nông dân nước ta

Tuy nhiên, việc sản xuất thanh long ở Việt Nam đang gặp nhiều khó khăn do tác động của biến đổi khí hậu và dịch bệnh như bệnh đốm nâu, bệnh nám cành, bệnh thối nhũn, bệnh thán thư, bệnh nấm bồ hóng,… [4] Bên cạnh đó, việc mở rộng diện tích và thâm canh cao đã tạo điều kiện cho nhiều loại sâu bệnh gây hại phát triển Từ năm 2008 đến nay, các loại bệnh mới như bệnh đốm trắng, đốm vàng, đốm nâu xuất hiện làm hư hại, gây loét trên thân và quả thanh long Trong đó, bệnh đốm nâu do

nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum gây ra hậu quả nghiêm trọng nhất [5, 6]

Trang 12

2

Neoscytalidium dimidiatum thuộc ngành nấm túi Ascomycota, lớp

Dothideomycetes, bộ Botrysphaeriales, họ Botrysphaeriaceae, chi Neoscytalidium

[7] Nó được xác định là tác nhân gây ra các bệnh nhiễm trùng giống bệnh nấm da ở người [8], xâm nhập và làm viêm phổi dẫn đến cái chết ở cá heo [9], bên cạnh đó,

chủng nấm mốc N dimidiatum còn được báo cáo là tác nhân chủ yếu gây bệnh trên

nhiều đối tượng thực vật như: cà chua, cây có múi, thanh long,… [10-12]

Bệnh đốm nâu do nấm mốc N dimidiatum gây ra làm ảnh hưởng nặng nề tới năng

suất cũng như chất lượng quả thanh long [11] Điều này gây khó khăn trong việc tiêu thụ nội địa và xuất khẩu, cũng như ảnh hưởng rất lớn đến đời sống của người nông dân và ngành trồng thanh long Để ngăn chặn bệnh, thuốc diệt nấm hóa học đã được sử dụng tràn lan trong nông nghiệp Việc sử dụng thuốc diệt nấm hóa học không những không có hiệu quả trong kiểm soát bệnh đốm nâu do nấm mốc gây ra mà còn ảnh hưởng xấu đối với sức khỏe con người, gây ô nhiễm môi trường và làm tăng khả năng kháng thuốc của nấm bệnh Hiện nay, xu hướng phát triển của thế giới là hướng tới một nền nông nghiệp sạch và bền vững Do đó, việc sử dụng các biện pháp sinh học như các hợp chất đối kháng có nguồn gốc từ vi sinh vật là một phương pháp thay thế hiệu quả và thân thiện với môi trường Trong đó, các hợp chất đối kháng nấm mốc có nguồn gốc từ vi khuẩn đã và đang được sử dụng rộng rãi trên thế giới

Bacillus licheniformis là vi khuẩn Gram dương, hình que, ưa nhiệt Trong điều kiện

môi trường khắc nghiệt, chúng có khả năng hình thành nội bào tử [13] Những bào tử này có khả năng chịu nhiệt, lạnh, bức xạ và các áp lực khác của môi trường

Thêm vào đó, chủng B licheniformis còn có khả năng sản sinh ra nhiều loại enzyme

có hoạt tính mạnh như amylase, protease, cellulase, chitinase… [13], đồng thời, chúng cũng có khả năng sinh tổng hợp các chất kháng sinh tự nhiên có tác dụng ức chế sự sinh trưởng hoặc tiêu diệt một số vi sinh vật khác, bao gồm cả vi khuẩn Gram âm lẫn Gram dương và nấm gây bệnh [14, 15]

Xuất phát từ thực trạng trên, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Khảo sát khả năng ức chế nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu trên thanh long của vi khuẩn Bacillus licheniformis D7” với mục đích hướng tới việc

Trang 13

3

sản xuất chế phẩm sinh học hỗ trợ cho sự phát triển bền vững của ngành nông nghiệp nói chung và ngành trồng thanh long nói riêng ở nước ta

2 Mục tiêu của đề tài

Đánh giá được khả năng ức chế nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu trên thanh long của vi khuẩn Bacillus licheniformis D7

Để đạt được mục tiêu này, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu với các nội dung sau: ➢ Nội dung 1: Khảo sát sơ bộ khả năng ức chế sự sinh trưởng và phát triển của

nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum bởi dịch nuôi cấy chủng Bacillus licheniformis D7

➢ Nội dung 2: Khảo sát sự tác động của dịch nuôi cấy chủng Bacillus licheniformis D7 lên khả năng nảy mầm của bào tử Neoscytalidium dimidiatum ➢ Nội dung 3: Khảo sát sự tác động của dịch nuôi cấy chủng Bacillus

licheniformis D7 lên sự phát triển của hệ sợi tơ Neoscytalidium dimidiatum

➢ Nội dung 4: Khảo sát khả năng bền nhiệt và bền pH của dịch nuôi cấy chủng

Bacillus licheniformis D7 lên hoạt tính ức chế nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum

➢ Nội dung 5: Kiểm tra hiệu quả ngăn ngừa bệnh đốm nâu trên cây và quả thanh

long do Neoscytalidium dimidiatum gây ra của dịch nuôi cấy chủng Bacillus licheniformis D7

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu:

➢ Chủng nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum được phân lập từ thân cây thanh

long bị nhiễm bệnh đốm nâu ở Bình Thuận, được lưu trữ trong bộ sưu tập giống của Phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh, Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm, Trường Đại học Công Nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh

➢ Chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis D7 được phân lập từ đất ở Thành phố Hồ

Chí Minh, được lưu trữ trong bộ sưu tập giống của Phòng thí nghiệm Công nghệ hghieh euu thu hghiem hhah giohg eay hoc hgah xco clyxxum mcritimum bahg uhuohg uhau gieo hathghieh euu thu hghiem hhah giohg eay hoc hgah xco clyxxum mcritimum bahg uhuohg uhau gieo hathghieh euu thu hghiem hhah giohg eay hoc hgah xco clyxxum mcritimum bahg uhuohg uhau gieo hathghieh euu thu hghiem hhah giohg eay hoc hgah xco clyxxum mcritimum bahg uhuohg uhau gieo hat

702413069:31:37 PM9:31:37 PM702413069:31:37 PM9:31:37 PM702413069:31:37 PM9:31:37 PM

Trang 14

4 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

Đề tài này được tiến hành nhằm xác định khả năng ức chế nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu trên thanh long của chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis D7, bao gồm sự tác động của dịch nuôi cấy vi khuẩn lên khả năng nảy

mầm bào tử nấm mốc cũng như sự phát triển của hệ sợi tơ nấm và hiệu quả ngăn ngừa bệnh đốm nâu do nấm mốc gây ra trên thân cây và quả thanh long Nghiên cứu

này có ý nghĩa trong việc tạo ra chế phẩm sinh học từ Bacillus licheniformis D7 để kiểm soát bệnh đốm nâu trên thanh long do nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum

gây ra, ứng dụng cho ngành trồng thanh long trong tương lai.

Trang 15

5

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Chi Bacillus

1.1.1 Đặc điểm chung

Các chủng Bacillus là vi khuẩn Gram dương hình que, hiếu khí hoặc kỵ khí đa dạng,

có khả năng sinh enzyme catalase và hiện diện ở khắp nơi trong tự nhiên [16] Chúng có khả năng hình thành nội bào tử khi điều kiện môi trường trở nên bất lợi, chỉ có một nội bào tử được hình thành trên một tế bào và có thể ở trạng thái không

hoạt động này trong nhiều năm Nội bào tử của một chủng Bacillus từ vùng

Morocco đã được báo cáo là vẫn sống sót sau khi được xử lí bằng nhiệt khô với nhiệt độ lên đến 420℃ và khả năng này được duy trì sau nhiều thế hệ [17] Do bào

tử của nhiều loài Bacillus có khả năng chịu nhiệt, bức xạ, chất khử trùng và hút ẩm

nên chúng khó bị loại bỏ khỏi các nguyên liệu y tế, dược phẩm và là nguyên nhân

thường xuyên gây ô nhiễm Một số loài Bacillus được biết đến như những sinh vật

gây hư hỏng thực phẩm [16]

Bênh cạnh đó, các loài Bacillus cũng được sử dụng trong nhiều quy trình y tế, dược

phẩm, nông nghiệp và công nghiệp bằng cách tận dụng các đặc điểm sinh lý đa dạng, khả năng tạo ra nhiều loại enzyme, kháng sinh và các chất chuyển hóa khác

[16] Ngoại trừ B anthracis và B cereus sản sinh độc tố, các chủng Bacillus còn lại

thường có lợi, an toàn cho thực vật và môi trường sinh thái [18] Những đặc tính này

của các loài Bacillus làm cho chúng trở thành tác nhân kiểm soát sinh học tốt để

thay thế thuốc trừ nấm hóa học tổng hợp Nhiều chủng Bacillus đã được sử dụng để kiểm soát các bệnh do nấm mốc gây ra trên thực vật như Botrytis cinerea, các chủng Aspergillus… [19, 20] Ngoài ra, bacitracin và polymyxin là hai loại kháng sinh nổi tiếng được thu nhận từ các loài Bacillus Một số loài được sử dụng làm tiêu chuẩn

trong các thử nghiệm y tế và dược phẩm [16]

Từ những năm 1990, C Ash và cộng sự đã cho ra đời hệ thống phân loại Bacillus

dựa trên phân tích trình tự đoạn gene 16S-rRNA [21] Chúng bao gồm ít nhất 9 loài hghieh euu thu hghiem hhah giohg eay hoc hgah xco clyxxum mcritimum bahg uhuohg uhau gieo hathghieh euu thu hghiem hhah giohg eay hoc hgah xco clyxxum mcritimum bahg uhuohg uhau gieo hathghieh euu thu hghiem hhah giohg eay hoc hgah xco clyxxum mcritimum bahg uhuohg uhau gieo hathghieh euu thu hghiem hhah giohg eay hoc hgah xco clyxxum mcritimum bahg uhuohg uhau gieo hat

702413069:31:37 PM9:31:37 PM702413069:31:37 PM9:31:37 PM702413069:31:37 PM9:31:37 PM

Trang 16

6

là B amyloliquefaciens, B atrophaeus, B axarquiensis, B malacitensis, B mojavensis, B sonorensis, B tequilensis, B vallismortis và B subtilis Các loại enzyme từ Bacillus như amylase, cellulase, protease và lipase có nhiều đặc tính quý

như khả năng hoạt động tốt trong dải pH rộng và bền nhiệt, do đó, các loại enzyme này đã được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau Bên cạnh đó, các chủng

Bacillus cũng có khả năng sinh tổng hợp nhiều loại hợp chất kháng sinh như

lipopeptide, peptide, protein,… được sử dụng rộng rãi trong các chế phẩm sinh học nông nghiệp, sản xuất enzyme công nghiệp, và sản xuất kháng sinh [16] Nhiều

chủng Bacillus đã được sử dụng để kiểm soát các bệnh ở thực vật, đặc biệt là các bệnh gây ra bởi nấm như Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum, các chủng Aspergillus và Penicillium… [19, 20]

1.1.2 Bacillus licheniformis

Bacillus licheniformis là một trực khuẩn Gram dương, phân bố rộng rãi trong tự

nhiên Chủng vi khuẩn này có khả năng hình thành nội bào tử để chống lại các bất

lợi khác nhau của môi trường [22] Bên cạnh đó, B licheniformis còn sinh tổng hợp

các chất kháng khuẩn khác nhau, chẳng hạn như lipopeptide, peptide, phospholipid, polyenes, amino acid và nucleic acid, có khả năng ức chế các mầm bệnh khác nhau

từ động vật, thực vật và con người Đồng thời, B licheniformis cũng có khả năng

sinh tổng hợp nhiều loại enzyme có hoạt tính cao như protease, lipase, amylase,

glucanase và chitinase [23-27] Chính vì vậy mà B licheniformis được sử dụng rộng

rãi trong các ứng dụng y tế, thuốc trừ sâu, thực phẩm, chế biến thức ăn chăn nuôi và làm sạch môi trường

Bacillus licheniformis là một loại vi khuẩn thúc đẩy tăng trưởng thực vật điển hình,

cơ chế tác động của nó bao gồm cạnh tranh dinh dưỡng và không gian với mầm bệnh, sinh tổng hợp các chất kháng sinh tự nhiên có tác dụng diệt khuẩn, cảm ứng sự đề kháng của cây trồng và thúc đẩy sự phát triển của cây trồng Các ví dụ bao

gồm B licheniformis NJWGYH 833051, có thể xâm nhập vào lá và thân rễ của cà chua, đóng một vai trò trong kiểm soát sinh học [28]; B licheniformis GZ-3, được phát hiện bởi Ma và cộng sự không chỉ cho thấy khả năng đối kháng tốt với Botrytis cinerea và Fusarium oxysporum mà còn có hoạt tính ức chế chống lại nhiều loại

Trang 17

7

nấm gây bệnh đã được thử nghiệm khác [29]; một loài B licheniformis được phân

lập từ ngũ cốc lên men và có hoạt tính kháng các chủng vi khuẩn Gram dương khác nhau [30] Bên cạnh đó, khi xử lý rễ cây dưa chuột bằng B licheniformis TG116 có thể làm tăng hoạt động của các enzyme bảo vệ như peroxidase (POD), polyphenol oxidase (PPO), và phenylalanine amoniac-lyase (PAL) trong lá, đồng thời làm giảm nhẹ hàm lượng malondialdehyde (MDA) về trạng thái cân bằng mới và gây ra sức

đề kháng trên toàn thân cây [31] Ansari và cộng sự đã phát hiện ra rằng B licheniformis B642 và Pseudomonas fluorescens FAP2 có thể tương tác trong màng

sinh học, do đó làm tăng sự phát triển và quang hợp của thực vật [32]

Với những đặc tính hữu ích trên mà chủng B licheniformis chỉ đứng sau Escherichia coli về mức độ chi tiết đã được nghiên cứu [33] Trình tự bộ gen được chú thích của B licheniformis trước đây đã được phân tích để đánh giá tầm quan

trọng về công nghệ sinh học của sinh vật [34]

Theo phân loại của (Weigmann 1898) Chester vào năm 1901 [13], Bacillus licheniformis thuộc:

Loài: Bacillus licheniformis

Trang 18

Bacillus licheniformis là một chủng Bacillus tiềm năng với khả năng tổng hợp

phong phú các chất chống nấm ngoại bào, bao gồm glucanase, chitinase, protein kháng nấm, peptide, lipopeptide [36] Một vài hợp chất có khả năng kháng mốc của

B licheniformis đã được nghiên cứu và công bố như Fungicin M4, Protein F2,

Surfactin, benzoic acid [37-40]…

Chủng B licheniformis M4 sản xuất một peptide ưa nước 3.4 kDa với hoạt tính

kháng nấm, được đặt tên là Fungicin M4 Hợp chất này có phổ ức chế hẹp chỉ ức

chế được các loài như Microsporum canis CECT 2797, Mucor mucedo CECT 2653, Mucor plumbeus CCM F 443, Sporothrix schenckii CECT 2799 [37]

Một loại protein chống nấm được tạo ra bởi chủng B licheniformis BS-3 đã được

tinh chế bằng kết tủa ammonium sulfate, sắc ký cột DEAE-52 và sắc ký cột Sephadex G-75 Protein tinh khiết được gọi là protein F2, có khả năng ức chế sự

phát triển của Aspergillus niger, Magnaporthe oryzae và Rhizoctonia solani Protein

F2 là một monomer có trọng lượng phân tử xấp xỉ 31 kDa [38]

Trang 19

9

Hợp chất kháng nấm được tổng hợp từ B licheniformis BC98 có hoạt tính kháng mạnh nhất đối với nấm đạo ôn Magnaporthe grisea Ngoài ra, hợp chất này còn ức chế sự phát triển của các loại nấm gây bệnh khác như Curvularia lunata và Rhizoctonia bataticola Sau khi tiến hành phân tích HPLC mô tả cấu trúc chi tiết và phân tích 500 MHz 1H NMR thì lipopeptide đối kháng được tiết ra bởi B licheniformis BC98 có khối lượng phân tử xấp xỉ 1 kDa và được xác định là

Neoscytalidium dimidiatum thuộc ngành nấm túi Ascomycota, lớp

Dothideomycetes, bộ Botrysphaeriales, họ Botrysphaeriaceae, chi Neoscytalidium [7] Sợi nấm N dimidiatum phân nhánh, có vách ngăn, màu nâu và có khả năng

phân cắt thành các bào tử đốt Bào tử có hình dạng ellipse, hình trụ hoặc tròn, chứa một hoặc hai nhân, màu sắc từ trong suốt đến nâu tối, thành bào tử dày, có 0-1 vách [7]

Một đĩa sợi nấm đường kính 6mm được cấy vào trung tâm của đĩa thạch PGA (đường kính 90mm), ủ ở 25℃ Hình thái khuẩn lạc và sắc tố được đánh giá sau 7 ngày nuôi cấy, trong khi tốc độ tăng trưởng được đo mỗi ngày cho đến khi lan đầy

đĩa (3 ngày) [41] Khuẩn lạc nấm N dimidiatum dạng sợi, có màu xám đen đến nâu

Trang 20

với các triệu chứng như đau ở trán và thái dương, chảy nước mũi, nghẹt mũi, ho và

khó thở [42] Ở động vật, theo báo cáo của Daniel Elad và cộng sự năm 2011, N dimiditum xâm nhập và làm viêm phổi dẫn đến cái chết ở cá heo [9] Ở thực vật, mốc N dimiditum gây bệnh trên nhiều đối tượng hơn như: cà chua, cây có múi,

thanh long,… làm giảm năng suất cũng như chất lượng quả, gây thiệt hại nặng nề về mặt kinh tế [10-12]

Hình 1.2 Hình thái đại thể (A) và vi thể (B) của nấm mốc Neoscytalidium

dimidiatum [43]

1.2.2 Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu trên thanh long

Bệnh đốm nâu do nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum gây ra trên cây thanh long là

một bệnh cực kỳ nghiêm trọng, rất khó kiểm soát trong mùa mưa Bệnh dễ dàng lây lan trong môi trường nóng và ẩm, hiện tại không có phương pháp kiểm soát hiệu quả Bệnh gây thiệt hại cho thân cây, làm ảnh hưởng đến năng suất quả Ngoài ra, bệnh đốm nâu cũng ảnh hưởng đến sự ra quả Kết quả là mất lợi ích kinh tế trong xuất khẩu

Sau khi bị nhiễm bệnh, chuỗi các biểu hiện triệu chứng sẽ xuất hiện như sau (Hình 1.3) [34]:

Trang 21

6 Các vùng tổn thương bị phân rã và rơi ra tạo thành một lỗ trống

Ở nước ta, dịch đốm nâu trên cây thanh long được phát hiện đầu tiên ở tỉnh Bình Thuận vào năm 2008 và bệnh bắt đầu lan rộng trên cả nước vào năm 2009 Đến năm 2012, bệnh lan mạnh với diện tích gần 1.000 ha, bệnh có mặt khắp các vùng trồng thanh long lớn trên cả nước như Bình Thuận, Tiền Giang, Long An Đến tháng 6/2013 diện tích bệnh đốm nâu đã tăng lên 3.000 ha Bệnh làm giảm khả năng sinh trưởng, phát triển và chất lượng quả thanh long, gây thiệt hại lớn cho nông dân trồng thanh long trên cả nước [44]

Trang 22

12

Hình 1.3 Các giai đoạn phát triển bệnh thối thân do Neoscytalidium dimidiatum gây ra trên thanh long [34]

Hình 1.4 Bệnh đốm nâu trên thân cây và quả thanh long [44]

1.3 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

1.3.1 Một số nghiên cứu ngoài nước

Trên thế giới đã có một số nghiên cứu về ứng dụng vi sinh vật trong kiểm soát

bệnh ở cây trồng do mốc N dimidiatum gây ra và đã đạt được nhiều kết quả

tích cực Tại Trung Quốc, Lan và các cộng sự (2012) đã đưa ra báo cáo đầu hghieh euu thu hghiem hhah giohg eay hoc hgah xco clyxxum mcritimum bahg uhuohg uhau gieo hathghieh euu thu hghiem hhah giohg eay hoc hgah xco clyxxum mcritimum bahg uhuohg uhau gieo hathghieh euu thu hghiem hhah giohg eay hoc hgah xco clyxxum mcritimum bahg uhuohg uhau gieo hathghieh euu thu hghiem hhah giohg eay hoc hgah xco clyxxum mcritimum bahg uhuohg uhau gieo hat

702413069:31:37 PM9:31:37 PM702413069:31:37 PM9:31:37 PM702413069:31:37 PM9:31:37 PM

Trang 23

13

tiên mô tả đặc tính của mầm bệnh, hình thái và đặc điểm phân tử của mốc N dimidiatum gây bệnh trên thanh long (Hylocereus undatus) [5]

Montiel và các cộng sự (2018) đã phân lập và tuyển chọn được chủng vi khuẩn

Stenotrophomonas rhizophila có khả năng ức chế nấm mốc N dimidiatum lên

tới 98% [45]

Gần đây, nghiên cứu của Alwan và các cộng sự (2019) về khả năng đối kháng

nấm bệnh N dimidiatum của vi khuẩn cũng cho kết quả rất khả quan Hai chủng vi khuẩn Lactobacillus rhamnosus và Azotobacter chroococcum đã được chứng minh có khả năng ức chế sự phát triển của mốc N dimidiatum xuống

còn 44% và 75% [46]

1.3.2 Một số nghiên cứu trong nước

Trong nước cũng có nhiều nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn để tạo các hợp chất kháng mốc ứng dụng trong nông nghiệp trồng trọt Năm 2014, Võ Thị Thu Oanh và các cộng sự đã phân lập, mô tả hình thái và đặc điểm phân tử của

chủng nấm mốc N dimidiatum gây bệnh đốm nâu trên thân cây và quả thanh

long ở tỉnh Bình Thuận [47]

Năm 2016, Hà Thị Thúy và các cộng sự đã phân lập được chủng vi khuẩn

Bacillus polyfermenticus có khả năng ức chế nấm mốc N dimidiatum và đảm

bảo an toàn sinh học khi được phóng thích ra môi trường [48]

Gần đây, vào năm 2019, Nguyễn Như Nhứt và các cộng sự đã phân lập, kiểm

tra hình thái, bệnh học in vitro, in vivo và sinh học phân tử hai chủng N dimidiatum Bên cạnh đó, các tác giả còn kiểm tra hiệu quả đối kháng in vitro đối với 2 chủng nấm mốc N dimidiatum của 20 chủng Bacillus spp và 75% các chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus có khả năng đối kháng với nấm mốc

[49]

1.3.3 Đánh giá kết quả các công trình nghiên cứu đã công bố

Các công trình nghiên cứu đã công bố trên thế giới hầu hết đã xác định được

Neoscytalidium dimidiatum là nguyên nhân gây ra bệnh đốm nâu trên nhiều

Trang 24

14

loại cây trồng, đặc biệt là trên thanh long và cũng đã khảo sát được khả năng đối kháng nấm mốc của các chủng vi khuẩn Tuy nhiên vẫn chưa có giải pháp

hiệu quả để kiểm soát nấm mốc N dimidiatum gây bệnh trên thực vật, đặc biệt

là trên cây thanh long

Các chủng vi khuẩn là đối tượng có tiềm năng trong việc kiểm soát nấm mốc

N dimidiatum gây bệnh trên thực vật Do đó, chúng tôi đã nghiên cứu khả năng ức chế nấm mốc N dimidiatum gây bệnh đốm nâu trên thanh long của chủng vi khuẩn B licheniformis D7 nhằm hướng tới việc sản xuất chế phẩm sinh học

ứng dụng trong ngành trồng thanh long ở nước ta

Trang 25

Tủ sấy MEMMERT Model;

Tủ ấm SHELLAB, Model:

Tủ mát ALASKA Nhật Bản Buồng đếm hồng

Máy lắc ngang IKA,

Model: HS 260 basic Đức Ống nhỏ giọt Việt Nam Cân phân tích

SARTORIUS, Model: CP 224S

Trang 26

16 Máy ly tâm lạnh Hettich Đức

Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu được trình bày trong Bảng 2.2 Bảng 2.2 Một số hóa chất

Cao nấm men Ấn Độ Disodium hydrogen

phosphate dodecahydrate Trung Quốc D-Glucose Trung Quốc Hydrochloric acid Trung Quốc Glycerol Trung Quốc Sodium hydroxide Trung Quốc

Sodium chloride Trung Quốc

Thành phần các môi trường sử dụng trong nghiên cứu được trình bày trong Bảng 2.3

Bảng 2.3 Thành phần một số môi trường sử dụng trong nghiên cứu

Môi trường nuôi cấy vi khuẩn LB agar

10g Peptone, 5g Cao nấm men, 10g NaCl, 20g agar, nước cất vừa đủ

1000 mL, pH 7.0 ± 0.2

Môi trường tăng sinh vi khuẩn LB

10g Peptone, 5g Cao nấm men, 10g NaCl, nước cất vừa đủ 1000 mL, pH

7.0 ± 0.2

Trang 27

17 Môi trường nuôi cấy nấm mốc PGA

200g khoai tây, 20g D-Glucose, 20g agar, nước cất vừa đủ 1000 mL, pH

5.6 ± 0.2 Môi trường thu nhận bào tử và hệ sợi tơ

nấm mốc Potato D-Glucose Broth (PGB)

200g khoai tây, 20g D-Glucose, nước cất vừa đủ 1000 mL, pH 5.6 ± 0.2

Môi trường giữ giống vi khuẩn LB + 50% Glycerol

10g Peptone, 5g Cao nấm men, 10g NaCl, nước cất vừa đủ 1000 mL, pH

Các nguyên vật liệu sử dụng trong nghiên cứu được trình bày ở Bảng 2.4

Bảng 2.4 Một số nguyên vật liệu được sử dụng trong nghiên cứu

Trang 28

2.2.2 Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật

2.2.2.1 Phương pháp bảo quản giống vi khuẩn

Để bảo quản lâu dài, một khuẩn lạc thuần được cấy vào 5mL môi trường LB, nuôi lắc 150 vòng/phút trong 16 giờ ở nhiệt độ phòng Sau đó, dịch nuôi cấy được phân phối vào các eppendorf, bổ sung glycerol vô trùng để đạt nồng độ glycerol cuối cùng là 50% và bảo quản ở -80℃

Trang 29

19

2.2.2.2 Phương pháp bảo quản bào tử nấm mốc

Để bảo quản lâu dài, chủng nấm mốc được cấy trên ống nghiệm PGA ở nhiệt độ phòng sau 7 ngày, thu bào tử bằng môi trường PGB Sau đó, dịch bào tử được phân phối vào các eppendorf, bổ sung glycerol vô trùng để đạt nồng độ glycerol cuối cùng là 50% và bảo quản ở -80℃

2.2.2.3 Phương pháp bảo quản hệ sợi tơ nấm mốc

Để bảo quản lâu dài, chủng nấm mốc được cấy trên môi trường PGA ở nhiệt độ phòng sau 7 ngày Sau đó, các đĩa thạch có chứa hệ sợi tơ nấm được phân phối vào các eppendorf, bổ sung glycerol 50% (vô trùng) và bảo quản ở -80℃

2.2.3 Phương pháp thu nhận dịch nuôi cấy vi khuẩn

Một khuẩn lạc vi khuẩn được cấy vào bình chứa 10 mL môi trường LB, nuôi lắc ở 150 vòng/phút ở nhiệt độ phòng, 16 giờ (giống hoạt hóa) Giống hoạt hóa được bổ sung 5% vào bình chứa 100 mL môi trường LB, nuôi lắc ở 150 vòng/phút ở nhiệt độ phòng, 16 giờ (giống tăng sinh) Sau đó, giống tăng sinh được ly tâm 13000 vòng/phút ở 4℃ trong 15 phút (2 lần) và thu dịch nổi chính là dịch nuôi cấy vi khuẩn Dịch nuôi cấy vi khuẩn này được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo [50]

2.2.4 Phương pháp khuếch tán qua giếng thạch

Để đánh giá sơ bộ khả năng ức chế sự sinh trưởng và phát triển của nấm mốc bởi dịch nuôi cấy vi khuẩn, phương pháp khuếch tán qua giếng thạch được thực hiện bằng cách khuếch tán 50 μL dịch nuôi cấy vi khuẩn trên đĩa môi trường PGA, cấy đồng thời nấm mốc và quan sát sự phát triển của tơ mốc Khả năng ức chế của dịch nuôi cấy vi khuẩn đối với sự sinh trưởng và phát triển của nấm mốc sẽ được thể hiện thông qua độ lớn vòng ức chế xuất hiện quanh giếng thạch Độ lớn vòng ức chế được ghi nhận và tính toán theo công thức sau:

Độ lớn vòng ức chế = D – d Trong đó, D: đường kính vòng ức chế (mm)

d: đường kính của giếng thạch (mm)

Trang 30

20

Khả năng ức chế càng mạnh thì độ lớn vòng ức chế càng lớn và ngược lại [51] Thí nghiệm được lặp lại 3 lần

2.2.5 Phương pháp xây dựng đường cong tăng trưởng của vi khuẩn

Giống vi khuẩn được lưu trữ trong tủ đông được cấy ria trên môi trường LB agar, ủ ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ để kiểm tra độ thuần chủng Sau đó, giống vi khuẩn được hoạt hóa bằng cách cho sinh khối một khuẩn lạc vào 10 mL môi trường LB, lắc 150 vòng/phút trong 16 giờ ở nhiệt độ phòng (giống hoạt hóa) Giống hoạt hóa được bổ sung 5% vào trong 100 mL môi trường LB, lắc 150 vòng/phút trong 16 giờ ở nhiệt độ phòng (giống tăng sinh)

Đường cong tăng trưởng của vi khuẩn được khảo sát bằng cách cấy 5% giống tăng sinh vào 100 mL môi trường LB, lắc 150 vòng/phút Giá trị OD600nm của dịch nuôi cấy vi khuẩn được xác định sau mỗi 2 giờ [52] Thí nghiệm được lặp lại 3 lần Phần mềm Graphpad prism 8.0.2 được sử dụng để xây dựng đường cong tăng trưởng theo mô hình Gompert

2.2.6 Phương pháp khảo sát các thành phần khác nhau của dịch nuôi cấy vi khuẩn lên hoạt tính ức chế nấm mốc

Nấm mốc được cấy trên môi trường PGA trong 7 ngày ở nhiệt độ phòng

Giống tăng sinh vi khuẩn (mục 2.2.3) được ly tâm 13000 vòng/phút ở 4℃ trong

15 phút, thu nhận dịch nổi và cặn tế bào vi khuẩn Dịch nổi được lọc qua màng lọc vô trùng 0.22 µm để thu nhận dịch nuôi cấy vi khuẩn vô bào Cặn tế bào vi khuẩn được tái huyền phù với nước cất vô trùng, ly tâm 13000 vòng/phút ở 4℃ trong 5 phút (3 lần) và thu cặn [53]

50 µL dịch nuôi cấy vi khuẩn vô bào và 50 µL huyền phù tế bào vi khuẩn sau khi rửa với nước cất vô trùng được đồng nuôi cấy với nấm mốc trên cùng đĩa môi trường PGA Ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 ngày và đo độ lớn vòng ức chế

2.2.7 Phương pháp khảo sát tác động của dịch nuôi cấy vi khuẩn lên sự nảy mầm của bào tử nấm mốc

Trang 31

Đối chứng được thực hiện tương tự với dịch bào tử nấm mốc nhưng thay dịch nuôi cấy vi khuẩn bằng môi trường PGB

2.2.8 Phương pháp khảo sát tác động của dịch nuôi cấy vi khuẩn lên sự phát triển của hệ sợi tơ nấm mốc

Dịch bào tử nấm mốc được thu nhận bằng cách thêm 3 mL môi trường PGB, vortex, đếm mật độ bào tử bằng buồng đếm hồng cầu và ủ ở nhiệt độ phòng trong 4 giờ Dịch nuôi cấy vi khuẩn được phối trộn với dịch chứa hệ sợi tơ nấm mốc theo các tỉ lệ khác nhau (0.5:1, 1:1, 2:1), ủ ở nhiệt độ phòng và quan sát sự phát triển của hệ sợi tơ nấm mốc theo các mốc thời gian khác nhau (4, 8, 12 và 24 giờ) [40]

Đối chứng được thực hiện tương tự với dịch chứa hệ sợi tơ nấm mốc nhưng thay dịch nuôi cấy vi khuẩn bằng môi trường PGB

2.2.9 Phương pháp khảo sát khả năng bền nhiệt, bền pH của dịch nuôi cấy vi khuẩn lên hoạt tính ức chế sự phát triển của nấm mốc

Để khảo sát khả năng bền nhiệt, dịch nuôi cấy vi khuẩn được đun cách thủy 100℃) và được xử lí bằng hơi nước áp suất cao (121℃) trong thời gian 30 phút Hoạt tính kháng mốc của dịch nuôi cấy vi khuẩn được khảo sát bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch trên đĩa môi trường PGA và cấy đồng thời nấm mốc [54] Đối chứng (+) là dịch nuôi cấy vi khuẩn không qua xử lí và đối chứng (-) là môi trường LB Thí nghiệm được lặp lại 3 lần

(40-hghieh euu thu hghiem hhah giohg eay hoc hgah xco clyxxum mcritimum bahg uhuohg uhau gieo hat(40-hghieh euu thu hghiem hhah giohg eay hoc hgah xco clyxxum mcritimum bahg uhuohg uhau gieo hat(40-hghieh euu thu hghiem hhah giohg eay hoc hgah xco clyxxum mcritimum bahg uhuohg uhau gieo hat(40-hghieh euu thu hghiem hhah giohg eay hoc hgah xco clyxxum mcritimum bahg uhuohg uhau gieo hat702413069:31:37 PM9:31:37 PM702413069:31:37 PM9:31:37 PM702413069:31:37 PM9:31:37 PM

Trang 32

22

Để đánh giá khoảng pH của dịch nuôi cấy vi khuẩn có hoạt tính kháng mốc, chúng tôi đã xử lí dịch nuôi cấy vi khuẩn bằng hydrochloric acid (pH 1.0-2.0), citric acid/ disodium hydrogen phosphate buffer (pH 3.0-8.0), Tris amino methane/hydrochloric acid buffer (pH 8.0-10.0) và sodium hydroxide (pH 11.0-12.0) [55] Sau đó, các hỗn hợp trên được ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ, đối chứng là dịch nuôi cấy vi khuẩn không xử lí pH Khả năng kháng mốc được kiểm tra bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch [54]

Đối chứng (+) là dịch nuôi cấy không xử lí pH, đối chứng (-) là môi trường LB và dung dịch đệm tương ứng Thí nghiệm được lặp lại 3 lần

Hoạt tính ức chế nấm mốc của dịch nuôi cấy vi khuẩn được tính toán theo công thức sau:

Hoạt tính ức chế nấm mốc = 𝐷−𝑑

𝐷 × 100 (%) Trong đó, D: khoảng cách từ nấm mốc đến mép giếng thạch (mm)

d: khoảng cách lan tơ của nấm mốc (mm)

2.2.10 Phương pháp kiểm tra hiệu quả ngăn ngừa bệnh đốm nâu do nấm mốc gây ra trên thanh long của dịch nuôi cấy vi khuẩn

Chủng nấm mốc được nuôi trên môi trường PGA trong 7 ngày ở nhiệt độ phòng Dịch bào tử nấm mốc được thu nhận bằng môi trường PGB và đếm mật độ bào tử bằng buồng đếm hồng cầu

Dịch nuôi cấy vi khuẩn được phối trộn với dịch bào tử nấm mốc theo các tỷ lệ 0.5:1; 1:1; 2:1, hiệu chỉnh mật độ bào tử cuối cùng là 106 bào tử/mL bằng môi trường PGB, ủ ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ

Các hỗn hợp được tiêm lên thân cây và quả thanh long các vết gồm môi trường LB, dịch nuôi cấy vi khuẩn, dịch bào tử nấm mốc, dịch nuôi cấy vi khuẩn phối trộn với dịch bào tử nấm mốc theo các tỉ lệ 0.5:1, 1:1 và 2:1, thể tích mỗi vết tiêm là 200 μL, độ sâu 0.5 cm [56]

Trang 33

23

2.2.11 Phương pháp xử lí số liệu

Số liệu được tính toán, vẽ biểu đồ trên Excel 2019 và được xử lý thống kê với phần mềm Statgraphics Centurion XV bằng phương pháp phân tích ANOVA với độ tin cậy 95%

Đường cong tăng trưởng của chủng vi khuẩn được tính toán và xây dựng theo mô hình Gompert bằng phần mềm Graphpad prism 8.0.2

Trang 34

24

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Định danh chủng nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum

Sau khi phân lập và làm thuần, chủng nấm mốc HY được gửi mẫu sang Chi cục Kiểm dịch thực vật vùng II để định danh dựa trên đặc điểm hình thái đại thể và vi thể (Hình 3.1 và Hình 3.2) Đồng thời, chúng tôi cũng đã gửi mẫu sang trường Đại học Konkuk, Hàn Quốc để giải trình tự vùng gen 18S-rRNA để định danh một cách chính xác đến loài

Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc của nấm mốc HY trong 7 ngày nuôi cấy trên môi

trường PGA

Về hình thái đại thể, khuẩn lạc của chủng nấm mốc HY có dạng sợi, có màu xám đen đến nâu đen ở mặt trên, mặt dưới có màu đen, không có vòng đồng tâm Sợi nấm phân nhánh, vươn cao như bông gòn trên bề mặt môi trường PGA

Trang 35

25

Hình 3.2 Hình thái vi thể của chủng nấm mốc HY (a) – (e): bào tử; (f): hệ sợi tơ

Về hình thái vi thể, sợi nấm của chủng HY phân nhánh, có vách ngăn, màu nâu và có khả năng phân cắt thành các bào tử đốt Bào tử có hình dạng ellipse, hình trụ hoặc tròn, chứa một hoặc hai nhân, màu sắc từ trong suốt đến nâu tối, thành bào tử dày, có 0-1 vách ngăn

Sau khi giải trình tự, chúng tôi đã so sánh vùng trình tự 18S-rRNA của chủng nấm mốc HY với ngân hàng dữ liệu trên NCBI bằng công cụ BLAST (Hình 3.3) và sử dụng các phần mềm FinchTV, Seaview, ClustalX2 và MEGA5 để xây dựng cây phát sinh loài của chủng nấm mốc HY với các loài lân cận

Hình 3.3 Tỉ lệ tương đồng (gene mã hóa cho 18S-rRNA) của chủng HY với các loài