Chương 1: Nhập môn sắc ký khí và những khái niệm cơ bảnNgày nay sắc ký khí Gas Chromatography đã trở thành một trong những phương phápsắc ký quan trọng nhất để tách, xác định cấu trúc, n
Nhập môn sắc ký khí và những khái niệm cơ bản
Sự lưu giữ
Tư liệu của một quá trình sắc ký là sắc đố Mỗi pic của sắc đồ ứng với một hoặc một nhóm cấu tử của hỗn hợp cần tách.
Thời gian từ khi bơm mẫu đến điểm cực đại của pic được gọi là thời gian lưu toàn phần (thường gọi là thời gian lưu, nó bao gổm cả thời gian chết (chính là thời gian lưu của một cấu tử trơ như không khí, mêtan, đối với pha tĩnh) và thời gian lưu thật (còn được gọi là thời gian lưu hiệu chỉnh)
Như vậy, không khí thường được sử dụng để xác định thời gian chết trong detectơ dẫn nhiệt (TCD) vì không khí cho tín hiệu trong detectơ này Với detectơ ion hóa ngọn lửa (FID) thì không khí lại không cho tín hiệu nên viêc xác định thời gian chết được thực hiện bẳng cách dùng một cấu tử nhẹ nhất cho tín hiệu, đó là mêtan Trong trường hợp không sử dụng được không khí và không có mêtan thì có thể xác định thời gian chết từ thời gian lưu của 3 cấu tử thuộc cùng một dãy đổng đẳng.
Sắc đồ là đồ thị thể hiện sự phân bố màu sắc theo hai trục tọa độ.
Khoảng cách từ giữa đinh pic đến điểm bơm mẫu E (tính theo đơn vị thời gian) được định nghĩa là thời gian lưu Nếu gọi F là lưu lượng dòng khí mang thì có thể xác định thể tích lưu như sau:
Trong đó, được goi là thể tích chết Thể tích chết của thiết bị sắc ký bao gồm 3 yếu tố: thể tích của pha động trong bản thân cột sắc ký, thể tích rỗng của các chi tiết nối giữa cột với detectơ và thể tích tế bào đo của detectơ.
Hình 1 1 Sắc đồ đẳng nhiệt đặc trưng cho một quá trình sắc ký
Do chênh lệch áp suất giữa đầu và cuối cột tách, áp suất giảm dần theo chiều dài cột Nếu khí mang không bị nén, lưu lượng khí sẽ tỷ lệ thuận với độ giảm áp suất Tuy nhiên, do khả năng bị nén của khí, lưu lượng khí tăng nhanh hơn độ giảm áp suất Để loại bỏ sự phụ thuộc của lưu lượng (và thể tích lưu) vào chênh lệch áp suất đầu cột, hệ số hiệu chỉnh Martin (j) được sử dụng.
Mặt khác, để có thể so sánh các đại lượng lưu giữ được đo ở các diểu kiện phòng thí nghiệm khác nhau (nhiệt độ, áp suát), cần phải hiệu chỉnh lưu lượng dòng theo công thức sau:
: Lưu lượng dòng hiệu chỉnh
: lưu lượng dòng đo ở cuối cột tách
: áp suất hơi nước tại nhiệt độ phòng
Từ đó có thể suy ra rằng: Đối với các phép đo hóa lý vẫn sử dụng khái niệm thể tích lưu riêng Đây chính là giá trị pha tĩnh được quy về.
: khối lượng pha tĩnh Áp dụng định luật Rault và Henry cho trường hợp sắc ký khí - lỏng (pha tĩnh là một lớp phim mỏng bao quanh chất mang rắn) sẽ có mối tương quan giữa và (hệ số hoạt độ của chất tan trong dung môi là pha tĩnh ở nồng độ vô cùng loãng):
R: hằng số khí lý tương
: áp suất hơi bão hòa của chất tan tinh khiêt tại nhiệt độ đã cho
: khối lượng phân tử của chất lỏng làm pha tĩnh
Trên cơ sở phương trình (1.10), có thể áp dụng có hiệu quả cao phương phạp sắc ký khí - lỏng để xác định hệ số hoạt động đóng góp vào việc nghiên cứu các hệ chiết lỏng - lỏng cũng như hiệu ứng muởi.
Khi mẩu đi vào cột sắc ký, chúng nhanh chóng phân bố giữa hai pha, pha lòng (tĩnh) và pha khí (đọng) Quá trình đó được thể hiện bằng hệ số phân bố K :
Trong đó: n : số mol của chất tan
V : thể tích toàn thể của pha tĩnh trong cột tách
K : hằng số phận bố, chỉ phụ thuộc vào bản chất của chất tan, pha fĩnh và nhiệt độ mà không phụ thuộc vào kiểu cột tách k: hệ số dung lượng , là đại lượng biểu diễn mối tương
Môi liên hệ giữa thể tích lưu và hẳng số phân bố K được biểu thị bằng phương trình:
: thể tích của pha động (khí)
: thể tích của pha tĩnh (lỏng)
Tương tự như vậy, có thể nhận được mối tương quan giữa thời gian lưu và hằng số phân số K như sau:
Với L : chiểu dài cột tách
: tốc độ trung bình của khí mang
Từ phương trình ( 1.13 ) và ( 1.16 ), có thể xác định được hẳng số phân bố K từ các giá trị lưu giữ và , nếu biết các giá trị thể tích của pha động và pha tĩnh
Năng suất cột tách
Chiều rộng của dải sắc ký trong điều kiện bơm mẫu lý tưởng phụ thuộc vào hiệu suất tách của cột và thời gian lưu Hiệu suất tách của cột sắc ký được thể hiện qua số đĩa lý thuyết n, được tính theo công thức sau:
: thời gian lưu của chất tan
: độ lệch chuẩn của pic sắc kí
Hình 1 2 Mối tương quan giữa chiều rộng của pic tại các độ cao khác nhau với độ lệch chuẩn σ của đường cong hình Gauss
Trong trường hợp lý tường, pic sắc ký có dạng hình Gauss thì có thể biểu diễn độ rộng của pic tại điểm uốn, tại một nửa chiểu cao pic và tại đáy pic như sau:
Tại một nửa chiều cao
Do vậy, có thể thiết lập mối quan hệ giữa số đĩa lý thuyết n với các đại lượng trên như sau :
Nếu gọi chiều cao của một đĩa lý thuyết là h và chiều dài toàn thể của cột là L thì ta có :
Trong sắc ký khí cột nhồi, có thể chế được những cột tách có số đĩa lý thuyết tới 3000 đĩa/m, tương ứng với chiều cao một đia lý thuyết khoảng 0,2 -0,5 mm Những cột tách như vậy có thể tạo ra những pic rất hẹp, ngay với cả thời gian lưu khá lớn.
Hiệu quả cột tách
Để đánh giá hiệu quả một cột tách sắc ký, có thể sử dụng nhiều đại lượng khác nhau. Trước hềt phải nói đến "số phân tách" Khái niệm này được ký hiệu là TZ là chữ viết fắ
10 của thuật ngữ tiếng Đức "Trennzahl" TZ được định nghĩa là sự phân giải giữa hai thành viên liền nhau của dãy đồng đẳng n-parafin
Trong thực tế, TZ chính là số lượng pic có thể chiếm chỗ trong khoảng cách giữa hai pic của hai cấu tử Khái niệm TZ rất gần với độ phân giải và được định nghĩa như sau :
Trong trường hợp R=1 hai pic có độ lớn tương tự nhau được phân tách khỏi nhau khoảng 95% Còn nếu R=1.5 thì sự phân giải được coi là hoàn toàn 99,7 %.
Hình 1 3 Sơ đồ biểu diễn độ phân giải Rs
Nếu gọi là hệ số tách tương đối, thì có thể biểu diễn sự liên quan giữa và n trong phương trình sau:
Từ đó có thể xác định được số đĩa lý thuyết cần thiết đối với một yêu cầu tách nhất định để đạt được độ phân giải như mong muốn Và khi đã xác định được số đĩa lý thuyết cần thiết, thì có thể tính được chiều dài cột sắc ký tối thiểu lầ bao nhiêu theo phương trình:
Trong trường hợp được thay bằng sẽ thu được số đĩa lý thuyết hiệu dụng
Từ đó suy ra độ cao hiệu dụng của một đia lý thuyết H là:
Như vậy, muốn tăng hiệu suất phân giải Rs giữa hai pic lên gấp hai lần thì phải tăng số đĩa lý thuyết N lên gấp 4 lần.
Phương trình Van Deemter
Từ lý thuyết đĩa, có thể xác định được các đại lượng đặc trưng quan trọng là n (số đĩa lý thuyết) và h (độ cao của một đĩa lý thuyết) nhưng không cho biết về ảnh hưởng cảu các điều kiện làm việc (nhiệt độ, áp suất, tốc độ dòng,…đến các đại lượng nói trên Chỉ sau khi có sự hỗ trợ của lý thuyết động học ("rate theory"), đặc biêt là với sự ra đời của phương trình Van Deemter, thì mọi ảnh hưởng của các thêng số thực nghiệm lên các đại lượng nói trên mới trở nên sáng tỏ Phương trình Van Deemter được biểu diễn như sau:
: tốc độ trung bình dòng khí mang
: độ không đồng nhất của chất nhồi cột
: đường kính trung bình của hạt chất mang
: hệ số Labyrinth về đường đi của khí trong cột
: hệ số khuếch tán phân tử trong pha khí
: hệ số khuếch tán phân tử trong pha lỏng
: độ dày của lớp phim pha tĩnh trên chất mang
Trong đó A đại diện cho sự khếch tán tán xạ (còn gọi là khuếch tán Eddy), cho những thông tin về đường đi khác nhau của khí do chất nhồi cột quyết định Còn B thì cho những chỉ dẫn về sự khuếch tán phân tử trong pha khí Đại lượng C biểu thị trở kháng của cột trong quá trình chuyển khối trong pha động cũng như trong pha tĩnh Sơ đồ biễu diễn sự phụ thuộc của h vào cả 3 thành phần nói trên được trình bày trong hình 1.6
Hình 1 4 Sự phụ thuộc của chiều cao đĩa lý thuyết h (cũng như của độ làm doãng pic) vào tốc độ khí mang theo phương trình Van Deemter
Nếu lấy vi phân của phương trình (1.36) và gán cho nó giá trị 0 sẽ nhận được gía trị tối ưu cho tốc độ khí mang và cho độ cao của cột đĩa lý thuyết ( hoặc )
Năng suất tách cột sắc ký đạt được giá trị tối ưu khi tốc độ khí mang là Trong thực tế, tốc độ khí mang thường được chọn lớn gấp đôi so với , bởi vì tuy có thiệt ít nhiều về năng suất tách nhưng lại lợi hơn hẳn về thời gian phân tích Sở dĩ có thể làm như vậy là nhờ độ dốc của nhánh bên phải đường cong Van Deemter (hình 1.6) thường nhỏ hơn nhiều so với thì chỉ làm giảm không đáng kể năng suất tách của cột trong khi đó thời gian phân tích mẫu có thể giảm đi nhiều Điều này được thể hiện rõ nét hơn trong trường hợp sử dụng hydro làm khí mang, đặc biệt trong sắc ký khí mao quản Bởi vì khí đó nhánh bên phải của đường cong Van Deemter còn choãi hơn nhiều, gần như nằm song song với trục hoành
Hệ thống sắc ký khí
Thiết bị
Hiện nay, hơn 30 nhà sản xuất cung cấp ra thị trường khoảng 150 mẫu khác nhau của thiết bị sắc kí khí.
Trong thập niên 70, các bộ tích phân kế điện tử và xử lý số liệu dựa trên máy tính trở nên thông dụng.
Thập niên 80 đã xuất hiện các thiết bị sắc kí khí với các thông số như nhiệt độ của cột, tốc độ dòng, tiêm mẫu, được điều khiển bằng máy tính với giá cả vừa phải; và có lẽ quan trọng nhất là sự phát triển của các cột có khả năng tách những mẫu phức tạp có chứa nhiều cấu tử trong một khoảng thời gian ngắn.
Hình 2 1 Sơ đồ khối của một máy sắc ký
Hệ thống cấp khí mang
2.2.1 Hệ thống cấp khí mang
Hệ thống cung cấp khí mang bao gồm các bộ điều chỉnh áp suất (pressure regulators), các thiết bị đo áp suất (gauges), và thiết bị đo tốc độ dòng (flowmeter) Hệ thống khí mang còn chứa một hệ thống lọc phân tử để tách nước và các chất nhiễm bẩn khác Tốc độ dòng được kiểm soát bởi các bộ điều chỉnh áp suất hai giai đoạn được lắp vào các bình chứa khí mang.
Hình 2 8 Khả năng tách trên 3 cột
(ii)cột wide bore 10m x 0.53mm x 2.5um HP 50;
(iii) cột narrow bore 25m x 0.25mm x 0.25um Cabowax -20M 2.4.3 Pha tĩnh
Pha tĩnh chia làm 2 loại: pha tĩnh rắn và pha tĩnh lỏng Hai loại hạt được nhồi vào trong cột, là chất hấp phụ (Adsorbent)và chất mang (Support) phủ pha tĩnh Các hạt phải đồng nhất và thường có đường kính 30/40 Mesh hay 100/120 Mesh Yêu cầu chung cho pha tĩnh là ít bay hơi, bền nhiệt, trơ về mặt hóa học. a Pha tĩnh rắn
Pha tĩnh rắn cho cột nhồi: thường dùng là Diatomic,
Molecular sieve, Prorapak, Chromosorb, Tenax…Pha tĩnh rắn có
28 vài ưu điểm hơn pha tỉnh lỏng:
- Chất hấp phụ rắn bền và ổn định trong một khoảng nhiệt độ lớn.
- Không xảy ra hiện tượng chảy máu cột (Bleeding), đặc biệt là đối với các chất hâp phụ vô cơ và rây phân tử (Molecular Sieve)
- Tách rất tốt các Hydrocacbon nhẹ, các khí hiếm, khí trơ và các Alcol
Pha tĩnh rắn cho cột PLOT: về căn bản giống như pha tĩnh trong cột nhồi Tuy nhiờn kớch thước hạt nhỏ hơn (≤ 1àm) và cú độ đồng nhất cao hơn nên dễ phủ lên bề mặt cột mao quản Fused Silica.
Cột pha rắn liên hợp (WCOT) có bề mặt rắn lớn và hệ số tải lớn như cột nhồi, nhưng do chiều dài cột dài hơn nên hiệu quả phân tách, độ ổn định và độ lặp lại cao hơn so với cột nhồi Đặc biệt, WCOT còn cho phép phân tích các hợp chất rất phân cực mà cột WCOT thông thường không phân tích được hoặc rất khó phân tích.
Các chất hấp phụ thường sử dụng
- Alumina (Al2O3): Hoạt hóa ở 200°C – 1h, tách khí và các hyrocacbonđến C5, kích thước hạt: 100/120 mesh, kích thước lỗ xốp:1 Å - 100 Å.
- Silica (SiO ): 2 dùng khi tách các khí có M nhỏ và các
Hydrrocacbon nhẹ Bề mặt riêng750 m /g, kích 2 thước lỗ xốp trung bình: 22 Å
Bề mặt riêng 100m /g kích thước lỗ xốp trung binh: 300 Å 2
- Zeolite: Tách các khí có M nhỏ bằng phương pháp loại trừ
(exclusion):Rây phân tử (molecular sieves).Các zeolite kí hiệu5A và 13Xthường được sử dụng để tách H , O2 2,N2, CH ,4
Sử dung các nhóm Silanol (≡Si-OH) và dùng phương pháp tẩm (slurry method of coating) để chuyển chất hấp phụ lên chất mang
Hexamethyldisilazane + ≡Si-OH ⇒gốc trimethylsilyl
Hình 2 9 Quá trình Silan hóa của chất mang pha tĩnh
Biến tính bề mặt fused silica Độ phân cực (polar) của các gốc Silanol trên bề mặt
- Phân cực: -CN, -CO và –OH
- Không phân cực: Hydrrocacbon (dialkyl siloxane)
Hình 2 10 Biến tính bề mặt fused silica
Hình 2 11 Các pha tĩnh thường sử dụng trong GLC Ảnh hưởng của độ phân cực của pha tĩnh đến thời gian lưu b.Pha tĩnh lỏng
Chủ yếu dùng cho cột WCOT.
Những yêu cầu về pha tĩnh lỏng
- Một pha tĩnh lỏng lý tưởng cho sắc ký khí lỏng cần thể hiện độ chọn lọc và khả năng hòa tan của các cấu tử được tách và có khoảng nhiệt độ làm việc rộng.
- Nó cũng phải bền hóa học và có áp suất hơi bão hòa thấp ở tại các nhiệt độ cao Nhiệt độ làm việc nhỏ nhất nên gần nhiệt độ phòng, ở đây chất lỏng pha tĩnh phải tồn tại ở dạng lỏng chứ không phải rắn.
Trong sắc ký khí lỏng, khả năng chọn lọc của một cột chi phối khoảng trống giữa các peak và độ lớn cực đại của peak được tách Sự khác nhau về độ chọn lọc là có ý nghĩa vì chúng cho phép việc tách các chất tan có cấu trúc gần giống nhau bởi một pha tĩnh chọn lọc.
Các thông số sau đây ảnh hưởng đến độ chọn lọc:
- Bản chất của pha tĩnh
- Nồng độ của pha tĩnh
- Việc chọn lựa và xử lý sơ bộ chất mang rắn hoặc chất hấp phụ. Một vài loại pha tĩnh lỏng thông dụng được liệt kê trong bảng và việc chọn pha tĩnh lỏng cho một đối tượng mẫu được dựa trên qui tắc “các chất càng giống nhau thì càng tan tốt vào nhau”.
Cột không phân cực là tốt nhất cho mẫu phân tích không phân cực.
Các cột có độ phân cực trung bình thì tốt cho mẫu phân cực trung bình và phân cực mạnh thì tốt cho mẫu phân cực mạnh Ví dụ để tách ancol ta phải chọn pha lỏng phân cực như cacbowax-20, ngược lại để tách hidrocacbon no mạch thẳng phải sử dụng các pha lỏng không phân cực.
Khi cột dùng nhiều bị lão hóa thì pha tĩnh bị đốt bay mất nên các nhóm silan (Si-OH) bị lộ ra và các peak bị kéo dài đuôi tăng lên.
Nếu trong cột có oxi ở nhiệt độ cao cũng dẫn đến sự thoái hóa cột và pic bị kéo đuôi Để giảm khuynh hướng pha tĩnh bị mất ở nhiệt độ cao, người ta gắn chúng vào bề mặt pha tĩnh
32 silica bằng các liên kết cộng hóa trị.
Người ta chia các pha lỏng và các đối tượng cần tách ra nhiều nhóm theo tính phân cực của phân tử như sau:
- Nhóm rất phân cực: H O, glycol, glyxerin, poliphenol, axit2 dicacboxylic.
- Nhóm phân cực: ancol mạch thẳng, axit béo hữu cơ, phenol, amin bậc 1,2, hợp chất nitro và nitril có chứa hydro α.
- Nhóm phân cực trung bình: ete, ankanal, ankanon, este, amin bậc 3, hợp chất nitro và nitril không chứa hidro α.
- Nhóm ít phân cực: hidrocacbon thơm, anken, hidrocacbon đã bị halogen hóa một phần.
- Nhóm không phân cực: ankan, thioankanol, sunfua, ankan đã bị halogen hóa Các loại pha tĩnh phổ biến nhất là Squalane, polysioxanes và polyethylene glycol Trong đó, nhóm Methyl Silicone (hay Polydimethyl Siloxane) là quan trọng nhất và hay được sử dụng nhất.
Polysioxanes là pha tĩnh được sử dụng phổ biến nhất cho cột sắc ký khí mao quản và cột nhồi Chúng có cấu trúc cho phép gắn nhiều nhóm chức đa dạng, dẫn đến tính phân cực trong phạm vi rộng Đặc tính dạng gôm của chúng giúp phủ tốt trên silica, lý tưởng cho cột sắc ký mao quản.
Polydimethyl siloxane (R = CH ) là khung cơ bản cho việc tạo4 thành các pha tĩnh khác Khi thay thế nhóm methyl bằng các nhóm khác sẽ dẫn đến sự thay đổi độ phân cực và khả năng tách.
Hình 2 12 Sắc ký đồ của một số cột mao quản với các pha tĩnh
Các pha tĩnh không chứa silicon được sử dụng rộng rải nhất là các polyethylene glycol Chúng có sẵn trên thị trường với một khoảng rộng của trọng lượng phân tử như Carbowax 20M và Superox-4.
Cấu trúc chung của một polyethylene glycol có thể được mô tả như sau: HO-CH2-CH -(-O-CH -CH -) -O-CH -2 2 2 n 2
Lò cột và chương trình nhiệt độ (Columnoven)
Khi buồng tiêm được đặt ở nhiệt độ cao (vaporizing inlet), mẫu bay hơi nhanh và di chuyển đến cột, do đó thường gây ra độ lệch tương đối lớn về thể tích mẫu vào cột Dù nhiệt độ cao của buồng tiêm giúp bảo vệ cột, tuy nhiên nó có thể làm phân hủy các chất kém bền nhiệt, phân biệt các chất có điểm sôi khác nhau trong mẫu, gây mất mẫu hay quá tải cột tách
Khi nhiệt độ của buồng tiêm được giữ dưới nhiệt độ sôi của dung môi khi tiêm mẫu (cool inlet), sau đó tăng dần và bắt đầu quá trình sắc ký sẽ làm giảm tối thiểu sự phân hủy, giảm sự phân biệt đối xử giữa các chất có mức độ hóa hơi khác nhau trong mẫu phân tích, đồng thời làm tăng độ nhạy và độ lặp lại của quá trình sắc ký khí Để bảo đảm tính lặp lại của thời gian lưu thì cần phải ổn định nhiệt độ cột sắc ký (Column Thermostating)do đó lò ổn nhiệt (thermostating oven) là cần thiết Tùy vào độ phức tạp các cấu tử ttrong mẫu mà có hai chế độ nhiệt trong lò là Isothermal và Temperature Programming
Isothermal : đối với mẫu đơn giản T = f(T ), T ≥ Topti sôi opti sôi với RT= 2 – 30 phút
Temperature Programming : đối với mẫu phức tạp Việc tách các cấu tử dựa vào sự thay đổi của T sôi
Hình 2 15 Sắc ký đồ ở hai chế độ: Isothermal và Temperature Programming
Chương trình nhiệt độ làm tăng khả năng tách của cột nhờ ngưng tụ rồi bốc hơi dung môi, từ đó giúp cải thiện:
Hình 2 16 Các vùng có gia nhiệt của hệ GC
Đầu dò (Detector)
Detector có nhiệm vụ chuyển hóa một đại lượng không điện (trong trường hợp này là nồng độ của các chất được tách khỏi cột sắc ký) thành đại lượng điện và có chức năng phát hiện và đo độ lớn của các cấu tử khi ra khỏi cột sắc ký Vì vậy detector quyết định một phần độ chính xác cũng như độ nhạy của phương pháp
Nguyên tắc hoạt động của các detector là dựa vào tính chất vật lí của các cấu tử như: tính chất hấp thụ và phát xạ ánh sáng, tính phân cực, tính khúc xạ, tính dẫn điện, dẫn nhiệt, khối lượng riêng…
Bảng 7 Một số detector trong sắc ký khí
Detector Giới hạn phát hiện
Khoảng tuyến tính Độ nhạy A.s/g Áp dụng cho
Tất cả các chất không làm hỏng dây nung
Kiểu dây 2,5.10 -6 1:10 5 2000-9000 đối với benzen
Kiểu nhiệt điện trở 2.10-6 1:2,5:10 4 15000 đối với không khí Phân tích khí Bán dẫn 1,2.10 -7 1:10 4 15000 đối với heptan Phân tích khí
Khỏang nhiệt độ giới hạn
Ion hóa ngọn lửa (FID)
Detector vạn năng cho tất cả các chất có nhóm CH2
(ECD) ện 2.10-14 1:10 3 40 đối lindan với Đối với các chất có ái lực điện tử cao như các thuốc trừ sâu, diệt cỏ, hợp chất chứa nitơ, hợp chất dị nguyên Quang ngọn
Phát xạ tối ưu cho lưu hùynh ở 394mm và photpho ở 526mm Detector hóa heli ion 5.10-13 1:10 4 300 Phân tích lượng vết khí vô cơ, độ nhạy
41 phụ thuộc vào độ tinh khiết của hem Detectorion hóa argon:
Bao gồm tất cả các chất có năng lượng ion hóa nhỏ hơn 11,6eV 2.6.1 Dectector dẫn nhiệt (thermal conductivity dectector)
Dựa trên nguyên tắc cầu Wheatstone, đôi khi còn được gọi là Katharometer Các điện trở của cầu bằng kim loại trơ, có độ dẫn nhiệt tốt, như: vàng, bạch kim, tungsteng Cấu tử mẩu ra khỏi cột, đi vào một nhánh của cột Khi có sự hiện diện của mẫu làm thay đổi nhiệt độ Nhiệt độ của nó phụ thuộc vào độ dẫn nhiệt của chất khí bao quanh nó Khi các phân tử hữu cơ thay thế chất khí mang thì tính đãn nhiệt của nó thay đổi do nhiệt độ trong các cấu tử tăng lên sẽ dẫn đến sự thay đổi trong điện trở Dựa trên sự thay đổi điện trở của cầu, gây sự mất cân bằng trong mạch, tạo một tín hiệu dưới dạng mũi sắc ký Khi mẫu ra khỏi cột tín hiệu biến mất
Máy dò TCD có thể được thiết kế theo một số kiểu khác nhau Ba kiểu thường gặp là tế bào dòng chảy, tế bào bán khuếch tán và tế bào khuếch tán.
Hình 2 17 Cấu tạo detector dẫn nhiệt
A-kiểu tế bào dòng chảy
B-kiểu tế bào bán khuếch tán
C-kiểu tế bào khuếch tán
Loại A ít nhạy hơn cả, thời gian đáp ứng lâu, chỉ thích hợp cho sắc ký điều chế Loại B, với thể tớch tối thiểu 100àl được sử dụng phổ biến cho sắc ký cột nhồi Cũn loại C với giới hạn phỏt hiện 10-100àl cú thể sử dụng cho sắc ký mao quản cột hở Độ nhạy của detector TCD phụ thuộc vào hai yếu tố sau:
- Khả năng dẫn nhiệt của khí mang (các khí mang có độ dẫn nhiệt tốt như hydro, heli thường được ưu tiên sử dụng)
Độ nhạy tỷ lệ thuận với dòng nuôi cầu Dòng nuôi cầu này có thể thay đổi tùy thuộc vào loại và lưu lượng khí mang, nhiệt độ detector và nhiệt độ cột tách.
Với detector này, diện tích của các pic không chỉ phụ thuộc vào hàm lượng thể tích mà còn phụ thuộc vào sự chênh lệch giữa độ dẫn nhiệt của cấu tử và của khí mang Điều này lý giải tại sao phải dùng hệ số hiệu chỉnh trong phân tích định lượng Đặc điểm:
- Đơn giản, dùng được các mẫu hữu cơ và vô cơ, không phân hủy mẫu
- Thời gian cho tín hiệu lớn và kém nhạy
2.6.2 Detector ion hóa ngọn lửa (flame-ionization detector):
Hình 2 18 Detector ion hóa ngọn lửa
Detector FID là một trong những detector có độ nhạy cao Nguyên tắc làm việc của nó dựa trên sự biến đổi độ dẫn điện của ngọn lửa của hydro đặt trong một điện trường khi có chất hữu cơ cần tách chuyển qua Nhờ nhiệt độ cao của ngọn lửa hydro, các chất hữu cơ từ cột tách đi vào detector bị bẻ gãy mạch, bị ion hóa nhờ có oxy của không khí để tạo
44 thành các ion trái dấu tương ứng Cơ chế tạo thành ion trong trường hợp benzen như sau:
Các ion tạo thành được chuyển về các bản điện cực trái dấu nằm ở hai phía của ngọn lửa (thế hiệu giữa hai bản điện cực này khỏang 250-300V). Dòng ion được giảm áp trên một điện trở có chỉ số rất cao (10 8 -10 12 Ω) và độ giảm hiệu điện thế này được khuếch đại và ghi lại trên máy tự ghi Số lượng của ion tạo thành (chính là độ nhạy của detector) phụ thuộc vào các yếu tố sau:
- Cấu trúc hình học của detector - Tỷ lệ thành phần của hydro/không khí - Nhiệt độ của ngọn lửa
- Cấu trúc của các phần tử mẫu cần xác định
Hình 2 19 Sơ đồ nguyên lý hoạt động của detector ion hóa ngọn lửa (FID)
Các hợp chất hữu cơ được đốt cháy bằng ngọn lửa hydro/không khí tạo thành các ion Khí mang từ cột sẽ được được trộn trước với hydro và đốt cháy bằng ngọn lửa ở buồng đốt Một điện cực hình trụ đựợc đặt cách vài mm phía trên ngọn lửa để thu thập các ion sinh ra Dòng ion này sẽ được đo
45 bằng cách đặt một điện thế giữa đầu phun của ngọn kửa và điện hình trụ để hạn chế đến mức tối đa sự tái kết hợp của các ion, phải đặt điện thế chọn lọc vào vùng bảo hòa (vùng mà khi tăng điện thế sẽ không làm tăng dòng ion) các tính hiệu tạo thành sẽ được khuếch đại bằng bộ khếch đại điện tử rồi qua bộ sử lý và ghi tính hiệu Đặc điểm:
- Không bị ảnh hưởng bởi vận tốc khí mang
- Thời gian chi tín hiệu nhỏ hơn 0,1giây và có độ nhạy gấp 1000 detector TCD
- Giới hạn phát hiện dưới 10-12g/s
- Tuy nhiên cũng có những điểm bất lợi là phải dùng thêm hệ thống khí đốt, ngoài khí mang không được dùng khi mẫu có các khí như:
SO2, CO , H2 2O,NOx Ngoài ra cấu tử mẫu bị phân hủy trong ngọn lửa nên không thể dùng trong trường hợp muốn cho cấu tử qua tiếp một thiết bị phân tích khác (thí dụ máy hồng ngoại)
- Chỉ đáp ứng với các hợp chất hữu cơ, không có đáp ứng đối với các khí bền và nước
- Độ ổn định cao ít bị ảnh hưởng tới sự thay đổi nhiệt độ và tốc độ dòng
- Nhiệt độ làm việc tới 400 C 0
- Phân hủy chất đòi hỏi 3 khí: khí mang, hydro, oxi
2.6.3 Detector cộng kết điện tử (electron capture dtector):
ECD sử dụng hoạt độ phóng xạ β phóng ra để ion hóa các khí mang và phát sinh ra dòng điện ở giữa cặp điện cực khi những phân tử hữu cơ có chứa nhóm electron mang điện tích như: halogen, photpho và nhóm nitro đi qua detector, detector giữa lại một vài electron và làm biến đổi số đo của dòng điện giữa các điện cực
Detector gồm có điện trường, bên trong có nguồn phát tia β (do Ni , 63 được phủ bên ngoài tấm bạch kim hay titan), khí mang được dùng là Ar. Điện tử sơ cấp của tia β sẽ ion hóa phân tử khí mang làm bắn ra điện tử
Hệ thống ghi nhận và xử lý số liệu
Từ những tín hiệu được ghi nhận từ detector sẽ đi qua hệ thống khuyếch đại, sau đó qua hệ thống chuyển đổi tín hiệu, đưa tín hiệu vào máy tính Ở đó ta có thể xử lý số liệu và xuất dữ liệu ra được
Hình 2 26 Hệ thống ghi nhận và xử lý số liệu
TIẾN TRÌNH PHÂN TÍCH SẮC KÝ KHÍ
Xác định mục tiêu phân tích
- Mục tiêu của phép phân tích là phân tích định tính hay định lượng?
Việc sử dụng tách phân giải cao (high resolution) một cấu tử hoặc tách có độ phân giải đủ tốt cho một phần của sắc ký đồ phụ thuộc vào mục đích của phân tích Nếu mục tiêu là định tính (xác định cấu tử), thì độ phân giải cao hơn có thể cần thiết để phân biệt các cấu tử có thời gian lưu gần nhau Tuy nhiên, nếu mục tiêu là định lượng (xác định nồng độ), thì độ phân giải đủ tốt để tách các cấu tử quan tâm là đủ.
- Có cần hy sinh độ phân giải để rút ngắn thời gian phân tích?
- Cần phân tích định lượng chỉ một cấu tử hoặc nhiều cấu tử trong mẫu và có cần độ chính xác cao không?
- Chất phân tích hiện diện trong mẫu ở nồng độ thích hợp hoặc cần có những kỹ thuật đặc biệt (cô mẫu và một detector rất nhạy) cho phân tích siêu vết.
Chuẩn bị mẫu
Các mẫu trong thực tế rất phong phú và thường có thành phần phức tạp:
- Có mẫu có hàm lượng tương tự nhau nhưng cũng có mẫu bên cạnh cấu tử chính mẫu còn chứa một số cấu tử với hàm lượng vết
- Có mẫu có các cấu tử với nhiệt độ sôi khác nhau trong một khoảng rộng - Mẫu có thể ở dạng dung dịch nhưng cũng có ở dạng khí hoặc dạng rắn
- Mẫu chứa nhiều cấu tử phân cực hoặc chứa nhiều cấu tử ít hoặc kém phân cực
Chìa khóa để có một quá trình sắc ký thành công cho một mẫu phức tạp là cần phải làm “sạch” nó trước khi giới thiệu nó vào cột.
Các phương pháp như vi chiết pha rắn, chiết lỏng - lỏng, chiết rắn - lỏng, sự giải hấp nhiệt các các cấu tử dễ bay hơi và nhiều phương pháp mới khác giúp cô lập những cấu tử cần phân tích trong mẫu phức tạp từ những chất cản trở.
Các phương pháp này giúp cô lập và làm giàu các cấu tử cần phân tích đến mức độ có thể dò tìm được Nếu ta không làm “sạch” mẫu thì sắc ký đồ thu được sẽ chứa một rừng các peak kém phân giải và các cấu tử không bay hơi sẽ còn giữ trong cột và phá hủy các cột đắt tiền.
Chọn Detector
Vấn đề đặt ra là cần biết mọi thông tin trong mẫu hay chỉ cần một detector chuyên biệt dò tìm một hoặc một nhóm các cấu tử đặc biệt nào đó trong mẫu.
Detector được sử dụng rộng rải nhất là detector khối phổ nhưng đắt tiền. Detector ion hóa ngọn lửa cũng là loại được dùng phổ biến nhất nhưng nó chỉ đáp ứng tốt cho hợp chất chứa mạch cacbon dài hoặc các hydrocacbon Loại này không nhạy như detector bắt electron hoặc detector huỳnh quang Detector ion hóa ngọn lửa đòi hỏi mẫu phải chứa lớn hơn 10 ppm chất cần phân tích cho phân tích tiêm mẫu chia dòng.
Detector dẫn nhiệt là cách phổ biến nhất để dò tìm các chất nhưng nó không đủ nhạy cho những cột mao quản mở có độ phân giải cao Các detector nhạy cho phân tích siêu vết chỉ đáp ứng với một loại hợp chất nào đó thôi Ví dụ detector bắt electron là loại đặc biệt cho các hợp chất chứa halogen, cacbonyl lien hợp, nitril, và hợp chất nitro.
Nếu chỉ cần biết những thông tin định tính để nhận diện các chất rửa giải,các detector khối phổ và hồng ngoại là những chọn lựa tốt Detector hồng ngoại giống detector đo độ dẫn nhiệt thường không đủ nhạy cho những cột mao quản mở.
Chọn cột
Những chọn lựa chính là pha tĩnh, đường kính cột và chiều dài cột Chọn pha tĩnh theo nguyên tắc các chất có cấu tạo càng giống nhau thì tương tác tốt với nhau Các pha tĩnh không phân cực được sử dụng nhiều Pha tĩnh có độ phân cực trung bình được sử dụng hầu hết những phép tách mà pha tĩnh không phân cực không thể Đối với những hợp chất phân cực cao thì một cột phân cực mạnh là cần thiết Các đồng phân quang học và những hợp chất có cấu trúc hình học gần giống nhau đòi hỏi những pha tĩnh đặc biệt cho phép tách này Giữa đường kính cột và bề dày của lớp phim có mối quan hệ trong việc ảnh hưởng đến độ phân giải Độ phân
61 giải cao nhất có thể đạt được bởi những cột hẹp nhất với pha tĩnh mỏng nhất.Sự kết hợp này làm giảm thiểu độ trở kháng đối với sự chuyển khối (số hạn C trong phương trình Van Deemter) trong cả hai pha tĩnh và pha động nhờ vậy làm giảm chiều cao đĩa lý thuyết Các cột hẹp và lớp phim mỏng đặc biệt thích hợp cho việc tách các hỗn hợp của các chất có nhiệt độ sôi cao nên bị lưu giữ quá mạnh trên các cột có lớp phim mỏng Các thời gian lưu ngắn cung cấp những phép phân tích nhanh Tuy nhiên, các cột hẹp có lớp phim mỏng có dung lượng mẫu rất thấp, đòi hỏi những detector có độ nhạy cao (detecter ion hóa ngọn lửa có thể không tương thích), không lưu giữ tốt những hợp chất dễ bay hơi và có thể chịu những ảnh hưởng do những vị trí hoạt động trên bề mặt có thể bị lộ ra Các cột cở hẹp có lớp phim dày cung cấp một thỏa hiệp tốt giữa độ phân giải và dung lượng mẫu.Chúng có thể được sử dụng với nhiều detector (nhưng thường không phải các detector đo độ dẫn điện hoặc hồng ngoại) và với những hợp chất dễ bay hơi Các thời gian lưu giữ dài hơn so với cột có lớp phim mỏng Các cột cở rộng và có lớp phim dày được đòi hỏi cho việc sử dụng các detector đo độ dẫn điện và hồng ngoại Chúng có dung lượng mẫu cao và có thể xử lý các hợp chất dễ bay hơi nhưng cho độ phân giải thấp và thời gian lưu giữ lâu Nếu một cột chuyên biệt đáp ứng với hầu hết những yêu cầu đặt ra nhưng không cung cấp đủ độ phân giải thì cột dài hơn cùng loại có thể được sử dụng Chiều dài gấp đôi của cột làm tăng gấp đôi số đĩa lý thuyết và theo phương trình tính độ phân giải thì làm tăng độ phân giải lên √2 lần. Điều này không phải là cách tốt nhất để tăng độ phân giải bởi vì nó làm tăng gấp đôi thời gian lưu.
Để tăng độ phân giải mà không kéo dài thời gian lưu giữ, có thể sử dụng cột hẹp hơn hoặc lớp pha tĩnh mỏng hơn Một xét nghiệm khác là thay đổi pha tĩnh, dẫn đến sự thay đổi hoàn toàn trong độ giữ tương đối của các hợp chất khác nhau (α trong phương trình) Điều này cho phép phân giải các thành phần mong muốn.
Chọn phương pháp tiêm mẫu
Cuối cùng là làm thế nào để tiêm mẫu?
Chế độ tiêm mẫu chia dòng: Tốt nhất cho những mẫu phân tích có nồng độ cao hoặc phân tích khí, nhưng phân tích định lượng có thể có các cấu tử khó bay hơi bị mất trong suốt quá trình tiêm mẫu Tiêm mẫu chia dòng cung cấp độ phân giải cao và có thể xử lý những mẫu bẩn nếu nhồi vào ống trong bộ tiêm mẫu một chất hấp phụ thích hợp Các hợp chất không bền nhiệt có thể phân hủy trong suốt quá trình tiêm mẫu ở nhiệt độ cao.
Chế độ tiêm mẫu không chia dòng thích hợp cho những dung dịch rất loãng Nó cung cấp độ phân giải tốt nhưng trong phân tích định lượng có thể có các hợp chất kém bay hơi bị mất trong quá trình tiêm Nó tốt hơn chế độ tiêm mẫu chia dòng đối với những hợp chất có độ bền nhiệt trung bình bởi vì nhiệt độ tiêm mẫu hạ thấp hơn Tiêm mẫu không chia dòng giới thiệu mẫu vào cột chậm vì vậy bẫy dung môi và bẫy lạnh được đòi hỏi.
Các mẫu chứa mỗi chất phân tích ít hơn 100 ppm có thể được phân tích trong những cột có chiều dày lớp phim < 1μm với chế độ tiêm mẫu không chia dòng Những mẫu có mỗi chất phân tích từ 100-1000 ppm đòi hỏi lớp phim dày hơn 1μm.
Tiêm mẫu trên cột (on-column injection): Tốt nhất cho phân tích định lượng và cho những hợp chất kém bền nhiệt Nó là một kỹ thuật có độ phân giải thấp và không thể sử dụng cho những cột có đường kính nhỏ hơn 0.25 mm Nó có thể xử lý những dung dịch đặc cũng như loãng.
Chương trình hóa nhiệt độ và áp suất
Những thuận lợi của chương trình hóa nhiệt độ cột
Cột sắc ký hoạt động ở nhiệt độ không đổi có một số điểm bất lợi:
Nếu nhiệt độ được chọn quá thấp, những peak hòa tan đầu tiên sẽ có khoảng cách rất gần nhau, trong khi đó các cấu tử bị lưu giữ mạnh sẽ có các pic bị doãng rộng và nằm thấp Ngoài ra nếu nhiệt độ cột hơi thấp thì thời gian phân tích sẽ tăng theo cấp số nhân.
Khi phân tích hỗn hợp gồm các cấu tử có nhiệt độ sôi khác nhau nằm trong một khoảng hẹp thì việc chọn nhiệt độ cho cột ở chế độ không đổi không thực sự khó khăn Tuy nhiên, đối với những mẫu phức tạp nhiều cấu tử có khoảng nhiệt độ sôi rộng thì không thể dùng chế độ nhiệt độ cột không đổi.
Chọn nhiệt độ tách hợp lý rất quan trọng Nhiệt độ thấp khiến các cấu tử có điểm sôi cao lưu lại lâu trong cột, làm dãn rộng pic của chúng Ngược lại, nhiệt độ cao giúp cấu tử có điểm sôi cao rửa giải nhanh, độ phân giải tốt, nhưng lại làm chậm quá trình tách và giảm độ phân giải của cấu tử có điểm sôi thấp, thậm chí dẫn đến chồng chéo các pic.
Những cấu tử lưu giữ mạnh có thể được nhanh chóng rửa giải nếu chọn nhiệt độ cao hơn và cũng cải thiện khả năng dò tìm chúng Tuy nhiên, nếu làm như vậy thì các cấu tử cùng bị rửa giải tăng lên dẫn đến các pic cũng sít gần nhau và sẽ làm mất độ phân giải cho các peak ở đầu sắc ký đồ Trở ngại này có thể được giải
63 quyết trong GC bằng chương trình hóa nhiệt độ, ở đây nhiệt độ của cột trong lò được tăng dần tại một tốc độ tuyến tính suốt quá trình phân tích.
Chương trình hóa nhiệt độ có một vài ưu điểm:
Phương pháp dẫn xuất hóa là một kỹ thuật hữu ích làm giảm thời gian phân tích và cải thiện khả năng dò tìm của các cấu tử, đặc biệt đối với các cấu tử có nhiệt độ sôi cao hoặc mẫu phức tạp Bằng cách phản ứng các cấu tử với dẫn xuất hóa thích hợp, nhiệt độ sôi của chúng có thể giảm, dẫn đến thời gian lưu giữ ngắn hơn và khả năng dò tìm cao hơn.
Lập trình nhiệt độ giúp rửa sạch các chất có nhiệt độ sôi cao còn bám lại trong cột từ các lần tiêm trước Nhiệt độ ban đầu của cột được thiết lập sao cho thấp hơn 90oC, phù hợp với nhiệt độ sôi của cấu tử thấp nhất Sau đó, nhiệt độ sẽ được tăng dần với tốc độ đã chọn tới nhiệt độ cuối cùng tương ứng với nhiệt độ sôi của cấu tử có nhiệt độ sôi cao nhất Khi nhiệt độ cột tăng lên, các cấu tử sẽ lần lượt tách ra khỏi cột khi nhiệt độ cột đạt đến nhiệt độ sôi của chúng.
Có ba kiểu chương trình hóa nhiệt độ được sử dụng trong sắc ký khí: kiểu đường đạn (ballistic), kiểu tuyến tính và kiểu đa tuyến tính.
Chương trình kiểu đạn đạo diễn ra khi một lò (oven) được duy trì tại một nhiệt độ đà nhanh chóng thay đổi đến một nhiệt độ cao hơn (đường A), và thỉnh thoảng được sử dụng cho việc điều kiện hóa cột sắc ký khí rắn sau khi nó được sử dụng trong một thời gian dài Tuy nhiên, một cột sắc ký được duy trì ở tại nhiệt độ cao sau đó nhanh chóng nâng nhiệt độ lên cao thì lớp phim pha tĩnh có thể bị phá hủy do bị sốc nhiệt.
Chương trình hóa nhiệt độ được sử dụng rộng rải nhất là kiểu tuyến tính (đường B) Bắt đầu từ nhiệt độ thấp và được duy trì đẳng nhiệt trong một khoảng thời gian nào đó, sau đó nhiệt độ trong lò chứa cột được tăng với một tốc độ tuyến tính đến một nhiệt độ cuối cùng được chọn sẵn Nhiệt độ cuối cùng này cũng được duy trì trong một khoảng thời gian cụ thể nào đó Nhiệt độ ban đầu và tốc độ tăng tuyến tính sau đó được xác định từ một phép phân tích thăm dò trước đó với ghi chú những nhiệt độ rửa giải Sự chọn lựa những điều kiện ban đầu thích hợp sẽ cho phép việc tách những chất có nhiệt độ sôi thấp, trong khi đó nhiệt độ cuối cùng được chọn nên đủ lớn để rửa giải được nhiều hơn những cấu tử bị lưu giữ mạnh (lưu ý giới hạn nhiệt độ cao nhất của pha tĩnh).
Kiểu đa tuyến tính được thực hiện trong một vài trường hợp để dò tìm hoặc tăng cường độ phân giải trong một phép tách, nhưng được sử dụng thông dụng hơn trong việc kết hợp với tiêm mẫu trên cột.
Trong sắc ký nhiệt độ, tăng nhiệt độ cột trong quá trình tách nhằm tăng áp suất hơi của chất tan, giúp giảm thời gian lưu trữ của các hợp chất được rửa trôi chậm Ví dụ, ở 150oC, các hợp chất dễ bay hơi xuất hiện gần nhau, còn hợp chất khó bay hơi có thể không bị rửa trôi Nếu tăng nhiệt độ theo dốc, các hợp chất sẽ tách theo trình tự điểm sôi.
50 oC đến 250 oC với tốc độ tăng 8 oC/phút, tất cả các cấu tử được rửa giải và các peak xuất hiện khá đều Cần tránh tăng nhiệt độ lên quá cao để ngăn sự phân hủy nhiệt của chất phân tích và pha tĩnh.
Ngày nay, hầu hết các máy sắc ký đều được trang bị hệ thống điện tử điều khiển áp suất lập trình cho các khí mang đi vào cột Áp suất tăng vào cột làm tăng tốc độ pha động và do đó, làm giảm thời gian lưu.
(a) tách đẳng nhiệt của các ankan tương tự ở 150oC Cột 3% Apiezon-L on 100– 120 mesh VarAport 30 Khí mang helium ở 10 ml min–1.
(b) Mẫu và cột như (a) nhưng nhiệt độ tách được chương trình hóa cho thấy độ phân giải cao hơn và thời gian ngắn hơn.
Phương pháp định lượng và định giác bằng GC
Phân tích định tính
Trong phân tích định tính, phổ khối và hồng ngoại chuyển hóa Fourier là hai bộ phận phát hiện có khả năng nhận dạng các hợp chất Quá trình nhận dạng đỉnh được thực hiện bằng cách so sánh phổ của mẫu với thư viện phổ đã có sẵn trong máy tính.
Một phương pháp kém tinh tế hơn là nhận diện thời gian lưu của một chất với thời gian lưu của chất đó trong một mẫu đã biết trước (mẫu chuẩn) trên các cột có độ phân cực khác nhau.
Cách đáng tin cậy nhất là so sánh các thời gian lưu trong cùng một sắc kí đồ thu được bởi mẫu đã biết trước (mẫu chuẩn) được thêm mẫu cần dò tìm vào trong cùng một điều kiện sắc kí Nếu như chất cần dò tìm trùng với chất có trong mẫu chuẩn thì pic của chất đó trong mẫu đã thêm sẽ có diện tích hay chiều cao tăng lên so với khi chưa thêm chất chưa biết vào Sự nhận diện chỉ ở mức thăm dò khi thực hiện trên một cột, nhưng khẳng định hơn khi thực hiện trên một vài cột trên những loại pha tĩnh khác nhau.
Trong hình cho thấy có thể nhận diện được các đỉnh 2,3,4,7 và 9 là metyl, etyl, npropyl, n-butyl, và n-amyl alcol Cần chú rằng có thể có những chất khác nhau nhưng có thời gian lưu giống hoặc rất gần nhau Vì vậy cần xác định trên nhiều pha tĩnh khác nhau hoặc sử dụng các detector khối phổ hoặc hồng ngoại để xác định.
Hình 4 1 Phân tích định tính bằng cách so sánh thời gian lưu với chất chuẩn
Phân tích định lượng
4.2.1 Một số nguyên nhân gây ra sai số
Chuẩn bị mẫu: cũng như mọi phương pháp khác, mẫu đem phân tích được lấy mẫu sao đại diện đúng cho cả lô nguyên liệu hay sản phẩm Các qui tắc lấy mẫu cần phải tuân thủ cho từng loại mẫu Mẫu cần được làm sạch trước khi tiêm mẫu vào GC Việc này nếu làm không tốt có thể gây nên mất cấu tử cần xác định.
Tiêm mẫu: khi chất lỏng tiêm vào buồng tiêm mẫu thì nhiệt độ thiết lập nếu quá cao có thể gây nên sự phân hủy mẫu, hoặc mẫu có tham dự vào một phản ứng nào đó Kỹ thuật tiêm mẫu cũng có thể gây sai số.
Mẫu bị phân hủy hoặc bị hấp phụ: có nhiều trường hợp có sự phân hủy hoặc hấp phụ trong buồng tiêm mẫu, trong cột, trong detector có thể làm cho các pic đó không đại diện cho lượng của chúng có trong mẫu Để khắc phục điều này ta nên dùng phương pháp lập đường chuẩn để biết diện tích hay chiều cao của pic có tỉ lệ tuyến tính với lượng mẫu đưa vào hay không. Đáp ứng của detector: mỗi detector đáp ứng khác nhau với các hợp chất khác nhau Vì vậy cần biết rõ các hệ số đáp ứng này Hơn nữa khi điều kiện làm việc thay đổi thì đáp ứng của detector cũng thay đổi Trong GC có thể sử dụng phương pháp chuẩn nội để khắc phục điều này.
Kỹ thuật lấy tích phân: trong GC có nhiều cách thiết lập quan hệ giữa thông tin nhận được từ pic sắc kí với hàm lượng của cấu tử: Đo chiều cao pic, dùng máy ghi và tích phân, cắt và cân giấy Các cách này có thể có những sai số riêng trong
67 quá trình xử lí Ngày nay với sự ghép nối máy tính và các phần mềm hỗ trợ việc tích phân hóa diện tích các peak trở nên dễ dàng và thông dụng Kết quả được báo cáo đầy đủ các thông tin của peak như chiều cao, diện tích, phần trăm trong mẫu
4.2.2 Các phương pháp tính toán định lượng a Phương pháp chuẩn hóa diện tích Đây là phương pháp tính thành phần phần trăm của mẫu bằng cách đo diện tích từng peak trên sắc kí đồ Theo cách này đem diện tích pic của chất quan tâm A cho tổng diện tích của các peak: %A = (diện tích peak A/tổng diện tích các peak)x100 %
Khi phân tích thành phần có điểm sôi sát nhau của một dãy đồng đẳng, phương pháp này có thể dùng để tính tỷ lệ phần trăm khối lượng Phương pháp này chỉ đúng nếu tất cả các cấu tử đều được rửa giải và đáp ứng của detector với mọi cấu tử là giống nhau Nếu những điều kiện này thõa mãn thì đây là phương pháp nhanh và hiệu quả. b Phương pháp tính theo hệ số hiệu chỉnh
Như đã biết detector đáp ứng khác nhau đối với các chất khác nhau Vì vậy cần phải tính hệ số hiệu chỉnh Nhờ hệ số này có thể tính được thành phần phần trăm của các cấu tử trong mẫu.
Cách xác định hệ số hiệu chỉnh:
- Tiêm dung dịch chuẩn đã biết nồng độ các cấu tử A, B, C… vào GC
- Sắc kí đồ thu được có các pic phân giải hoàn toàn và diện tích thu được tương ứng
- SA, SB, SC… tương ứng với các khối lượng trong mẫu mA, mB, mC…
- Chọn một pic làm chuẩn ví dụ A có tỉ lệ SA/mA được gán giá trị FA = 1
- Từ tỉ lệ SB/mB, SC/mC… suy ra FB, FC… c Phương pháp lập đường chuẩn:
Lập các đường chuẩn riêng rẽ đối với từng cấu tử trong hỗn hợp bằng cách tiêm những thể tích bằng nhau của một loạt dung dịch hỗn hợp chất chuẩn có nồng
68 độ khác nhau Như vậy một loạt các nồng độ của các chất chuẩn đã được phân tích và diện tích của chúng được xác định Một đường chuẩn được dựng cho mỗi cấu tử với một trục nồng độ và trục kia là diện tích tương ứng để kiểm tra sự tuyến tính của đáp ứng của detector.
Tiêm cùng thể tích của mẫu có các cấu tử cần phân tích và chạy sắc kí trong cùng điều kiện như khi chạy chuẩn Từ các diện tích thu được của các cấu tử cần phân tích và đường chuẩn vừa thiết lập suy ra được nồng độ của chúng. d Phương pháp dùng chuẩn nội
Phương pháp này còn được gọi là phương pháp chuẩn hóa tương đối hay gián tiếp Để định lượng một cấu tử X ta cần phải chọn một chất chuẩn S sao cho:
- Nếu trộn lẫn X với S ta phải thu được 2 đỉnh riêng biệt trên sắc kí đồ
- Peak của X và S phải khá gần nhau.
Sau đó ta phải pha các hỗn hợp có tỷ lệ trọng lượng của X và S biết trước, chạy sắc kí, đo diện tích các peak, lập tỉ số diện tích tương ứng, cuối cùng lập đường chuẩn tương đối.
Sc /Ss là tỉ lệ diện tích của các cặp cấu tử cần xác định X và chất chuẩn nội
Wc/Ws là tỉ lệ trọng lượng của các cặp cấu tử cần xác định X và chất chuẩn nội
Khi phân tích mẫu thật, ta cho một lượng biết trước chất chuẩn nội S vào mẫu rồi tiến hành sắc kí hỗn hợp Từ tỉ lệ diện tích đo được, bằng đường chuẩn tương đối vừa dựng ta có tỉ lệ trọng lượng Với trọng lượng chuẩn S thêm vào đã biết ta tính được trọng lượng của chất X.
Phương pháp này có các ưu điểm:
- Không cần biết đến đáp ứng của detector
- Không cần duy trì nghiêm ngặt các điều kiện tiến hành sắc kí vì những thay đổi được loại trừ theo cách tính tỷ số.
ỨNG DỤNG CỦA GC
Ứng dụng của GC tại CASE
Tại CASE, các hệ thống sắc ký khí của các hãng sản xuất thiết bị phân tích nổi tiếng như Shimadzu (GC 2010, GC 2010 Plus), Perkin Elmer, Varian (3800), Thermo Finnigan (Trace GC),… với các đầu dò như FID, ECD, NPD, FPD, TCD,
MS có khả năng phân tích được các hợp chất hữu cơ có bản chất khác nhau Các hệ thống GC đều có gắn các bộ phận chích mẫu tự động (Autosampler) và bộ phận hóa hơi (Headspace).
Các hệ thống sắc ký khí với tất cả các loại đầu dò, CASE có thể phân tích được hầu hết các hợp chất thuốc trừ sâu họ Chlor (Aldrin, Eldrin,…), họ Phospho (Chlorpyriphos, Diazinon,…) họ Cúc (Cypermethrin, Deltamethrin,…), các loại thuốc diệt cỏ, diệt nấm trong các nền mẫu nông sản, thực phẩm, thủy hải sản, môi trường… phục vụ công tác an toàn vệ sinh cho các loại hàng hóa lưu thông trong nước và xuất khẩu.
Phân tích các chỉ tiêu trong nước theo quy chuẩn của
Bộ Y tế (QCVN 01:2009/BYT) và các quy chuẩn khác.71 ã Phõn tớch dư lượng PCBs, PAHs, trong cỏc nền mẫu thực phẩm, môi trường, nước,… theo yêu cầu của các cơ quan quản lý trong và ngoài nước
Phân tích các hóa chất POPs (Persistent Organic Pollutants) trong môi trường, thực phẩm,…
Phân tích hơn 20 amino acid trong thực phẩm, phân bón, chế phẩm sinh học,…
Phân tích mẫu bệnh phẩm, mẫu ngộ độc: Methanol, Trichloroacetic, Benzen, Toluen,… trong máu, nước tiểu Phân tích BTX (Benzen – Toluen – Xylen) và một số hợp chất bay hơi khác trong không khí
Phân tích các hoạt chất, hương liệu trong dược phẩm,… theo các dược điển Anh (BP), Mỹ (USP), Nhật (JP), Châu Âu (EP), Việt Nam,…
Phân tích thành phần acid béo, cholesterol, và các thành phần khác theo yêu cầu trong bảng giá trị dinh dưỡng (Nutrition Fact)…
Hệ thống sắc ký khí ghép khối phổ đầu dò Ion Trap(CASE)
Hệ thống GCMS Thermo Polaris Q là sự kết hợp giữa máy sắc ký khí Ultra Trace GC, đầu dò khối phổ bẫy ion Polaris Q và hệ bộ phận bơm mẫu CompiPAL, cho phép phân tích, nhận dạng và định lượng nhiều loại hợp chất hữu cơ trong các loại mẫu khác nhau.
5.2.1 Nguyên tắc hoạt động hệ thống sắc ký khí ghép khối phổ (GCMS – Gas Chromatography Mass
Tương tự như các hệ thống sắc ký khí khác, hệ thống sắc ký khí ghép khối phổ cũng bao gồm các bộ phận: nguồn cung cấp khí, lò cột, bộ phận tiêm mẫu, cột phân tích, đầu dò, bộ phận ghi nhận tín hiệu, và bộ phận in dữ liệu phân tích; trong đó, đầu dò là đầu dò khối phổ.
Hình 5 1 Sơ đồ cấu tạo đầu dò khối phổ
Các cấu tử của mẫu sau khi tách ra khỏi cột mao quản sẽ đi vào trong đầu dò khối phổ Tại đây, tùy thuộc vào bản chất của chất cần phân tích, sẽ diễn ra quá trình ion hóa với các kiểu ion hóa khác nhau (API, ESI hay APPI), sau đó các ion được ghi nhận bởi đầu dò
5.2.2 Cấu tạo đầu dò khối phổ đầu dò bẫy ion (Ion trap)
Hệ thống GCMS Thermo Polaris Q bao gồm bơm chân không, bô bơm mẫu tự động (CompiPAL), máy sắc ký khí Trace GC Ultra, đầu dò khối phổ bẫy ion Polaris Q. Đầu dò Polaris Q gồm có bốn bộ phận chính như sau:
Nguồn ion hóa tại áp suất khí quyển (API)
Hệ quang học ion (ion optics)
Bộ phân tích khối (mass analyzer)
Hệ thống phát hiện ion (ion detection system)
Hình 5 2 Cấu tạo đầu dò khối phổ bẫy ion
5.2.3 Ứng dụng hệ thống Thermo Polaris Q
- Phân tích dư lượng PCBs, PAHs, trong các nền mẫu thực phẩm, môi trường, nước, … theo yêu cầu của các cơ quan quản lý trong và ngoài nước
- Phân tích các hóa chất POPs (Persistent Organic Pollutants) trong môi trường, thực phẩm,… - Phân tích các dư lượng thuốc trừ sâu trong thực phẩm, thủy hải sản như Trifluralin, Chlorpyrifos,… với khả năng phát hiện đáp ứng yêu cầu khắt khe của các nước Nhật, châu Âu,…
- Phân tích các độc chất trong thực phẩm (3-MCPD, Histamin, Urea,…)
- Phân tích các hormone tăng trưởng trong các nền mẫu thịt, thức ăn chăn nuôi như học beta-agonist (Clenbuterol và Salbutamol), Testosterol, DES,… hỗ trợ các cơ quan chức năng trong công tác kiểm soát chất lượng và bảo đảm vệ sinh an toàn thực phẩm của các sản phẩm lưu hành trên thị trường.
Hình 5 3 Cấu tạo đầu dò khối phổ bẫy ion
- Phân tích các chất thuộc nhóm Phthalate (đặc biệt là DEHP) trong các nền mẫu thực phẩm, thôi nhiễm từ bao bì,… theo yêu cầu của Bộ Y tế và các cơ quan quản lý khác.
- Phân tích Glyphosate trong các sản phẩm gạo trong việc kiểm soát chất lượng nông sản xuất khẩu sang châu Âu.
- Phân tích các chất thuộc nhóm Nitroimidazole, thuốc diệt nấm (Propiconazole, Hexaconazole, Difenconazole) trong thủy sản, trái cây và các loại rau quả
- Phân tích 22 hợp chất amin thơm sinh ra do từ thuốc nhộm azo trong sản phẩm dệt may theo quy định của Bộ Công thương (QCVN 01:2010/BCT)
- Phân tích nhận danh, định tính các tinh dầu và các hợp chất hữu cơ khác.