nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất cao chiết hành đen từ hành tím allium ascalonicum l giàu hoạt tính sinh học

Các thành phần hóa học của dịch chiết hành tím đen được xác định thông qua phân tích LC-ESI-MS, GC-MS, tổng hàm lượng phenolic, flavonoid được đánh giá bằng phương pháp so màu và hoạt tí

Trang 1

LUẬN VĂN THẠC SĨ

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022

luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop

luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop

luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop

Trang 2

Công trình được hoàn thành tại Trường Đại học Công nghiệp TP Hồ Chí Minh Người hướng dẫn khoa học: 1 GS.TS Trần Đình Thắng

2 TS Đỗ Hữu Nghị

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Hội đồng chấm bảo vệ Luận văn thạc sĩ Trường Đại học Công nghiệp thành phố Hồ Chí Minh ngày 28 tháng 08 năm 2022

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:

1 GS TS Lê Văn Tán - Chủ tịch Hội đồng 2 TS Nguyễn Bá Thanh - Phản biện 1

3 PGS TS Phạm Văn Hùng - Phản biện 2 4 PGS TS Lại Quốc Đạt - Ủy viên 5 TS Nguyễn Đức Vượng - Thư ký

Trang 3

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: BÙI THỊ TRANG MSHV: 19630371 Ngày, tháng, năm sinh: 23/10/1997 Nơi sinh: Quảng Ngãi

Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm Mã chuyên ngành: 8540101

I TÊN ĐỀ TÀI:

Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất cao chiết hành đen từ hành tím (Allium ascalonicum L.) giàu hoạt tính sinh học

NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

 Xác định thành phần hóa học có trong hành tím đen

 Xác định khả năng chống oxi hóa của dịch chiết hành tím đen

 Xác định khả năng kháng ung thư của dịch chiết hành tím đen

 Phân lập các hợp chất có trong dịch chiết hành tím đen

 Xây dựng quy trình sản xuất cao chiết hành tím đen giàu hoạt tính sinh học

II NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: theo Quyết định số 1345/QĐ-ĐHCN về việc giao đề

tài và cử người hướng dẫn luận văn thạc sĩ của Hiệu trưởng Trường Đại học Công nghiệp Tp Hồ Chí Minh ngày 20/10/2021

III NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 20/04/2022

IV NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1 GS.TS Trần Đình Thắng

2 TS Đỗ Hữu Nghị

Tp Hồ Chí Minh, ngày … tháng … năm 2022

VIỆN TRƯỞNG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

Trang 4

i

LỜI CẢM ƠN

Sau thời gian hai năm học tập và nghiên cứu tại Viện công nghệ Sinh học và Thực phẩm với sự hướng dẫn nhiệt tình cùng những bài học quý báu của quý thầy cô ở Viện, tôi đã hoàn thành luận văn tốt nghiệp của mình Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến:

Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới GS TS Trần Đình Thắng và TS Đỗ Hữu Nghị đã tận tình trực tiếp hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp này

Tiếp đến, tôi xin chân thành cảm ơn quý Thầy Cô của Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm đã truyền đạt kiến thức và những kinh nghiệm quý báu trong thời gian tôi học tập và nghiên cứu tại trường Tôi cũng muốn gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô phòng thí nghiệm đã tạo điều kiện giúp đỡ, cung cấp các cơ sở vật chất cần thiết trong suốt thời gian tôi thực hiện nghiên cứu này

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo nhà trường đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành được luận văn này

Một lần nữa xin trân trọng cảm ơn!

Trang 5

ii

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ

Hành tím đen là một sản phẩm xử lý nhiệt từ hành tím (Allium ascalonicum L.) nhờ quá trình ủ già trong môi trường có độ ẩm và nhiệt độ được kiểm soát Mục đích của nghiên cứu này là xác định thành phần hóa học và hoạt tính sinh học cũng như đưa ra các thông số kỹ thuật để xây dựng quy trình sản xuất cao chiết hành tím đen Qua khảo sát các chế độ lão hóa nhiệt dựa vào khảo sát sự thay đổi pH, độ màu, độ ẩm, axit tổng, đường khử Quy trình sản xuất hành tím đen được chọn với điều kiện 70°C, độ ẩm 70%, thời gian xử lý 18 ngày Các thành phần hóa học của dịch chiết hành tím đen được xác định thông qua phân tích LC-ESI-MS, GC-MS, tổng hàm lượng phenolic, flavonoid được đánh giá bằng phương pháp so màu và hoạt tính chống oxy hóa của chiết xuất được đánh giá bằng khả năng thu gom gốc tự do DPPH và ABTS Hoạt tính kháng ung thư của hành tím đen đối với các dòng tế bào ung thư biểu mô cổ tử cung ở người (Hela) và ung thư biểu mô tế bào gan ở người (HepG2) đã được đánh giá bằng phương pháp MTT Quá trình tối ưu hóa quy trình sản xuất được đưa ra dựa trên phương pháp đáp ứng bề mặt RSM và tiến hành đối chiếu với thực nghiệm Nghiên cứu đã xác định sự hiện diện của 13 hợp chất bay hơi, 24 hợp chất không bay hơi, phân lập được 2 hợp chất có hoạt tính sinh học gồm quercetin và quercitrin có trong chiết xuất hành tím đen Tổng hàm lượng phenolic, flavonoid và hoạt tính chống oxi hóa của hành tím đen cao hơn hành tím tươi (tương ứng 20,493±0,76mgGAE/g so với 4,603±0,91mgGAE/g, 7,512±0,22mgQE/g so với 1,171±0,13mgQE/g, ABTS: 3,7202±0,002mg/ml so với 4,7737±0,011mg/ml, DPPH: 2,8224±0,010mg/ml so với 3,2196±0,019mg/ml) Hoạt động chống ung thư của hành tím đen đối với tế bào Hela và HepG2 (tương ứng 18,58±0,45% và 19,94±0,58% cao hơn so với hành tím tươi (lần lượt là 13,65±0,42% và 14,85±0,49%) Kết quả cũng chỉ ra rằng nhiệt độ, thời gian, nồng độ ethanol và mức công suất siêu âm có tác động đến TPC, TFC và DPPH Các điều kiện chiết xuất tối ưu từ RSM: nhiệt độ chiết 53°C, thời gian chiết 72 phút, nồng độ ethanol 48% và mức công suất siêu âm là 84% Giá trị thực nghiệm của TPC, TFC và DPPH là 17,28±0,12mgGAE/g, 5,42±0,08mgQE/g và 75,35±0,15%

123docz.net - File bi loi xin lienhe: lethikim34079@hotmail.com

Trang 6

iii

ABSTRACT

Black shallot is a heat-treated product from fresh shallot (Allium ascalonicum L.) by

aging in a controlled temperature and humidity environment The purpose of this study is to determine the chemical composition and biological activity as well as provide technical parameters to develop a production process for black shallot extract Through surveying thermal aging modes based on a survey of changes in pH, color, moisture, total acid, and reducing sugar The production process of black shallot was selected with the condition of 70°C, 70% humidity, and 18 days of processing time The chemical compositions of black shallot extract were determined through LC-ESI-MS, GC-MS analysis, total phenolic and flavonoid content was evaluated by colorimetric method, and antioxidant activity of the extract was evaluated by DPPH and ABTS free radical scavenging capacity The antitumor activity of black shallot against human cervical carcinoma (Hela) and human hepatocellular carcinoma (HepG2) cell lines was evaluated by the MTT method The process of optimizing the production process is proposed based on the RSM response surface method and compared with the experiment The study identified the presence of 13 volatile compounds and 24 non-volatile compounds and isolated 2 biologically active compounds including quercetin and quercitrin in black shallot extract TPC, TFC, antioxidant activity of black shallot was higher than that of fresh shallot (20,493±0,76 mgGAE/g vs 4,603±0,91mgGAE/g, 7,512±0,22mgQE/g vs 1,171±0,13mgQE/g, ABTS: 3,7202±0,002mg/ml vs 4,7737±0,011mg/ml, DPPH: 2,8224±0,010mg/ml vs 3,2196±0,019mg/ml, respectively) The anti-cancer activity of black shallot against Hela and HepG2 cells (18,58±0,45% and 19,94±0,58% respectively) was higher than that of fresh shallot (13,65±0,42% and 14,85±0,49% respectively) The results also show that temperature, time, ethanol concentration, and ultrasonic power level have an impact on TPC, TFC, and DPPH Optimal extraction from RSM: extraction temperature 53°C, extraction time 72 minutes, ethanol concentration 48%, and ultrasonic power level 84% The experimental values of TPC, TFC and DPPH are 17,28±0,12mgGAE/g, 5,42±0,08mgQE/g and 75,35±0,15%

123docz.net - File bi loi xin lienhe: lethikim34079@hotmail.com

Trang 7

iv

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan báo cáo luận văn tốt nghiệp đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình

sản xuất cao chiết hành đen từ hành tím (Allium ascalonicum L.) giàu hoạt tính sinh

học” là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của GS TS Trần Đình Thắng và TS Đỗ Hữu Nghị Các kết quả nghiên cứu và các kết luận trong luận văn là trung thực, không sao chép từ bất kỳ một nguồn nào và dưới bất kỳ hình thức nào Đồng thời việc tham khảo các nguồn tài liệu (nếu có) đã được thực hiện trích dẫn và ghi nguồn tài liệu tham khảo đúng quy định

Nếu như sai chúng tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm và chịu tất cả các kỷ luật của bộ môn cũng như nhà trường đề ra

Học viên

Bùi Thị Trang

Trang 8

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 3

4 Cách tiếp cận và phương pháp nghiên cứu 3

5 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài 3

1.2 Tổng quan quá trình lão hóa 10

1.2.1 Cơ chế của quá trình lão hóa bằng phương pháp xử lý nhiệt 10

1.2.2 Các biến đổi nhờ quá trình lão hóa 12

1.3 Tổng quan về hành tím đen 15

1.4 Định hướng ứng dụng 16

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Vật liệu nghiên cứu 17

2.2 Phương pháp khảo sát điều kiện tạo hành tím đen 18

2.2.1 Sơ đồ quy trình sản xuất hành tím đen từ hành tím tươi 18

Trang 9

2.2.10 Hoạt tính chống oxi hóa 24

2.3 Phương pháp nghiên cứu thành phần hóa học của hành tím đen 25

2.3.1 Xác định tổng hàm lượng phenolic 25

2.3.2 Xác định tổng hàm lượng flavonoid 25

2.3.3 Phương pháp nghiên cứu các hợp chất bay hơi 25

2.3.4 Phương pháp nghiên cứu các hợp chất không bay hơi 26

2.4 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học 29

2.4.1 Thử hoạt tính chống oxi hóa 29

2.4.2 Thử hoạt tính kháng ung thư 30

2.5 Tối ưu hóa cao chiết giàu hoạt tính sinh học 31

2.6 Phương pháp xử lý số liệu 32

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 33

3.1 Khảo sát điều kiện tạo hành tím đen 33

3.1.1 Ảnh hưởng của điều kiện ủ đến độ ẩm 33

3.1.2 Ảnh hưởng của điều kiện ủ đến pH 34

3.1.3 Ảnh hưởng của điều kiện ủ đến axit 35

3.1.4 Ảnh hưởng của điều kiện ủ đến độ màu 35

3.1.5 Ảnh hưởng của điều kiện ủ đến hàm lượng đường khử 37

3.1.6 Ảnh hưởng của điều kiện ủ đến hàm lượng phenolic 39

3.1.7 Ảnh hưởng của điều kiện ủ đến hàm lượng flavonoid 40

3.1.8 Ảnh hưởng của điều kiện ủ đến khả năng bắt gốc tự do DPPH 41

3.2 Khảo sát thành phần hóa học của hành tím đen 43

Trang 10

vii

3.2.1 Tổng hàm lượng phenolic 43

3.2.2 Tổng hàm lượng flavonoid 44

3.2.3 Thành phần các hợp chất bay hơi của hành tím đen 44

3.2.4 Thành phần các hợp chất không bay hơi của hành tím đen 46

3.3 Khảo sát hoạt tính sinh học 50

3.3.1 Khả năng chống oxi hóa 50

3.3.2 Khả năng kháng ung thư 53

3.4 Tối ưu hóa cao chiết giàu hoạt tính sinh học 54

3.4.1 Sự phù hợp của mô hình 54

3.4.2 Phân tích đáp ứng bề mặt 58

3.4.3 Tối ưu hóa và xác minh mô hình 61

3.5 Quy trình sản xuất cao chiết giàu hoạt tính sinh học từ hành tím đen 62

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 64

DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA HỌC VIÊN 66

TÀI LIỆU THAM KHẢO 67

PHỤ LỤC 79

LÝ LỊCH TRÍCH NGANG CỦA HỌC VIÊN 109

Trang 11

Hình 1.5 Sơ đồ chuyển hóa alliin thành allicin 13

Hình 1.6 Hình thành các hợp chất chứa lưu huỳnh trong quá trình trao đổi chất của tỏi đã qua chế biến 14

Hình 2.1 Quy trình tạo sản phẩm hành tím đen 17

Hình 2.2 Quy trình nghiên cứu sản xuất hành tím đen từ hành tím tươi 18

Hình 2.3 Phản ứng bắt gốc tự do DPPH của các chất chống oxy hóa 25

Hình 2.4 Phân lập các hợp chất từ hành tím đen 28

Hình 2.5 Phản ứng trung hòa gốc tự do ABTS•+ của các chất chống oxy hóa 29

Hình 3.6 Sơ đồ sản xuất cao chiết hành tím đen 63

Trang 12

ix

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 2.1 Chương trình pha động trên cột C18 26

Bảng 3.1 Độ ẩm của hành tím đen ở điều kiện nhiệt 60°C, 70°C và 80°C 33

Bảng 3.2 pH hành tím đen ở các điều kiện nhiệt 60°C, 70°C và 80°C 34

Bảng 3.3 Axit tổng của hành tím đen ở các điều kiện nhiệt 60°C; 70°C; 80°C 35

Bảng 3.4 Độ màu của hành tím đen ở điều kiện nhiệt 600C, 700C và 800C 36

Bảng 3.5 Giá trị đường khử của hành tím đen ở điều kiện nhiệt 60°C, 70°C, 80°C 38Bảng 3.6 Giá trị phenolic của hành tím đen ở điều kiện nhiệt 60°C, 70°C, 80°C 40

Bảng 3.7 Giá trị flavonoid của hành tím đen ở điều kiện nhiệt 60°C, 70°C, 80°C 41

Bảng 3.8 Giá trị DPPH của hành tím đen ở điều kiện nhiệt 60°C, 70°C và 80°C 42

Bảng 3.9 Giá trị DPPH ngày thứ 18 của hành tím đen ở điều kiện nhiệt 60°C, 70°C và 80°C 42

Bảng 3.10 Thành phần các hợp chất bay hơi của hành tím đen 45

Bảng 3.11 Thành phần các hợp chất không bay hơi của hành tím đen 47

Bảng 3.12 Khả năng trung hòa 50% gốc tự do ABTS•+ 51

Bảng 3.13 Khả năng trung hòa 50% gốc tự do DPPH 52

Bảng 3.14 Tác dụng chống ung thư của chiết xuất hành tím đen 53

Bảng 3.15 Mức độ mã hóa của các biến độc lập được sử dụng trong thiết kế RSM 54Bảng 3.16 Thiết kế thử nghiệm và các giá trị đáp ứng 55

Bảng 3.17 Mô hình thực nghiệm đa thức bậc hai của TPC, TFC và DPPH 56

Bảng 3.18 Hệ số hồi quy của các mô hình đa thức bậc hai dự đoán tổng hàm lượng phenol, tổng hàm lượng flavonoid và DPPH 57Bảng 3.19 Giá trị dự đoán và thực nghiệm của các đáp ứng trong điều kiện tối ưu 61

Trang 13

x

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

ABTS Axit 2,20 -azino-bis-3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic

13C-NMR Cacbon-13 nuclear magnetic resonance spectroscopy

DNS Axit 3,5-dinitrosalicylic

ESI-MS Electron spray ionization mass spectra

ICP Inductively coupled plasma

MTT 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]- 2,5-Diphenyltetrazolium bromide

NMR Nuclear magnetic resonance

ORS Octopole Reaction System

RSM Response Surface Methodology

Trang 14

thành phần hóa học chủ yếu được tìm thấy trong hành tím (Allium ascalonicum L.) là

flavonoid glycoside, các hợp chất chứa lưu huỳnh và saponin Flavonol glucoside bao gồm quercetin và isorhamnetin mono- và di-glucosides được tìm thấy trong hành tím

trồng ở châu Âu [1] Các nghiên cứu trước đây cho thấy cây thuộc chi Allium (trừ A sativum và A cepa) đóng vai trò quan trọng trong thành phần của các chất tạo hương,

chất chống oxy hóa, hương thơm và trị liệu [2] Củ của các loài thuộc chi Allium được

sử dụng rộng rãi làm hương liệu thực phẩm được đánh giá cao không chỉ vì hương vị và mùi đặc trưng mà còn là nguồn cung cấp đáng kể các hợp chất có hoạt tính sinh học như allicin và các dẫn xuất của chúng [3-5] hoặc flavonoid glycoside [6-8]

Hoạt tính chống oxy hóa của các loài Allium có nguồn gốc từ các hợp chất chứa lưu

huỳnh và tiền chất của chúng Bên cạnh đó, các hợp chất khác như polyphenol, chất xơ và các nguyên tố vi lượng cũng góp phần biểu hiện các hoạt tính tương tự [9] Polyphenol là hợp chất được phân bố rộng rãi trong các sản phẩm tự nhiên Chúng đã được công bố là có nhiều đặc tính sinh học, chẳng hạn như các hoạt tính chống oxy hóa, kháng biểu mô, kháng khuẩn, kháng vi rút và chống viêm [10, 11] Các cây thuốc giàu polyphenol có thể làm chậm quá trình oxy hóa phân hủy lipid và cải thiện chất lượng cũng như giá trị dinh dưỡng của thực phẩm [12] Ngoài việc là nguồn cung cấp chất chống oxy hóa cao, hành tím còn có những lợi ích quan trọng như cải thiện sức khỏe tim mạch, ngăn ngừa ung thư, tiểu đường, chống viêm, kháng khuẩn, có thể giúp chống béo phì và giúp ngăn ngừa hoặc điều trị dị ứng [13]

Hành tím chứa những chất chuyển hóa thứ cấp như flavonoid, đặc biệt là các flavonol, anthocyanin, sterol thực vật và saponin [13] Các sterol thực vật phổ biến nhất trong

các sản phẩm tự nhiên là β-sitosterol, stigmasterol và campesterol Sterol có thể làm

giảm nguy cơ xơ vữa động mạch và bảo vệ chống lại các bệnh tim mạch [14] Chúng

Trang 15

2

còn có khả năng làm giảm nguy cơ ung thư vú, tuyến tiền liệt và ruột kết [15, 16] Hơn nữa, sterol thực vật có đặc tính kháng viêm và điều hòa miễn dịch [17] Tất cả sterol thực vật trong cơ thể con người được cung cấp từ chế độ ăn, vì chúng không thể được tổng hợp bởi con người Hơn 95% tổng lượng sterol thực vật trong khẩu

phần ăn được đại diện bởi β-sitosterol, stigmasterol và campesterol [14] Chi Allium

bao gồm hơn 500 loài phổ biến trên khắp thế giới Đặc tính kháng khuẩn và kháng

nấm của Allium đã được chứng minh từ các loài A sativum, A Porrum [18], A cepa [19], A ascalonicum [20], A fistulosum [21]

Hành tím (Allium ascalonicum L.) mang lại nhiều lợi ích về sức khỏe nhưng vẫn bị

hạn chế bởi mùi hăng và vị cay của chúng Tuy nhiên, mùi và vị khó chịu của hành tím có thể bị loại bỏ thông qua quá trình xử lý nhiệt do các hợp chất kém bền và có mùi khó chịu sẽ được chuyển hóa thành hợp chất bền và không mùi [22] Dựa trên cơ sở này, tiến hành xử lý và tạo sản phẩm hành tím đen nhờ vào quá trình lão hóa được kiểm soát trong môi trường nhiệt độ và độ ẩm thích hợp nhằm cải thiện mùi vị và chất lượng của hành tím Ngoài ra, nghiên cứu của Yang và Park [22] thì thành phẩm hành tây đen từ hành tây – một nguyên liệu cùng chi của hành tím sẽ có vị ngọt, chua, thay thế cho các mùi khó chịu và vị hăng nồng ở hành tươi Đặc biệt có thể tạo ra sản phẩm với nhiều đặc tính chức năng mới

Thành phần hóa học của hành tím đen (Allium Ascalonicum) ở Việt Nam chưa được

nghiên cứu nhiều, mục đích của nghiên cứu này là mang lại dữ liệu mới về các hợp chất hóa học và hoạt tính sinh học có trong sản phẩm hành tím đen, đồng thời xây dựng quy trình sản xuất cao chiết hành tím đen giàu hoạt tính sinh học

2 Mục tiêu nghiên cứu

 Xác định thành phần hóa học có trong hành tím đen

 Xác định khả năng chống oxi hóa của dịch chiết hành tím đen

 Xác định khả năng kháng ung thư của dịch chiết hành tím đen

 Phân lập các hợp chất có trong dịch chiết hành tím đen

 Xây dựng quy trình sản xuất cao chiết hành tím đen giàu hoạt tính sinh học

Trang 16

3

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

 Hành tím được ủ già hóa trong môi trường độ ẩm và thời gian thích hợp tạo sản phẩm hành tím đen

4 Cách tiếp cận và phương pháp nghiên cứu

Để thực hiện đề tài này, chúng tôi sử dụng các phương pháp phân tích hiện đại Áp dụng GC-MS, LC-MS, kỹ thuật hóa học phân tích kết hợp khả năng phân tách vật lý của sắc ký lỏng (hoặc HPLC) với khả năng phân tích khối lượng của khối phổ (MS) để xác định các thành phần hóa học của đối tượng nghiên cứu Ngoài ra, một số phương pháp phân tích khác cũng được áp dụng như:

 Xác định hoạt tính chống oxi hóa bằng phương pháp DPPH và ABTS

 Xác định hoạt tính kháng ung thư bằng phương pháp so màu MTT

 Phân lập các chất bằng phương pháp sắc ký

 Tối ưu hóa bằng phương pháp đáp ứng bề mặt RSM

5 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

 Nghiên cứu cung cấp thông tin về các thành phần hóa học có trong hành tím đen

 Đề tài bước đầu cung cấp những thông tin về hoạt tính sinh học của hành tím đen: khả năng chống oxi hóa, khả năng kháng ung từ đó biết được tác dụng đối với sức khỏe con người

 Cung cấp thông số về quy trình sản xuất cao chiết hành tím đen giàu hoạt tính sinh học

 Là tiền đề để phát triển sản phẩm hành tím đen nâng cao giá trị kinh tế

Trang 17

4

1.1 Tổng quan về hành tím

1.1.1 Giới thiệu

Hành tím có tên khoa học là Allium ascalonicum, một loại cây thân thảo, mọc ở nhiều

nơi trên thế giới Tuy nhiên, nguồn gốc của chúng là ở châu Á Vào thời điểm hiện

tại, chi Allium có hơn 500 loài, mỗi loài khác nhau về hình dáng, màu sắc và mùi vị, nhưng giống nhau về đặc điểm sinh hóa, hóa thực vật và dược thực phẩm Allium

được biết đến là có hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm, đồng thời chứa lưu huỳnh và nhiều hợp chất phenolic khác, điều này thu hút nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học [23, 24] Hành tím lần đầu tiên được người châu Âu biết đến vào thế kỷ 12 Những người lính thập tự chinh đã mang chúng về nhà như một "kho báu quý giá" từ

thành phố cổ Ascalon của người Palestine Tên Allium được biết đến bắt nguồn từ từ “all” (hăng) của người Celt, trong khi tên ascalonicum có thể bắt nguồn từ địa điểm

trồng trọt [25] Giới : Thực vật

Ngành : Magnoliophyta Lớp : Liliopsida Bộ : Asparagales Họ : Alliaceae

Chi : Allium

Loài : A ascalonicum

Hành tím cao từ 15 - 50cm, củ hành to từ 2 - 3cm, có cạnh, vảy mỏng như giấy và có màu đỏ Lá có hình trụ nhọn, rỗng, tròn và màu xanh mốc Cụm hoa dạng tán ở đầu một cán cao từ 20 - 50cm, rộng, tán hoa hình cầu được bao chung hình bẹ màu trắng, hoa có 6 phiến hoa rời, cuống hoa từ 1 - 1,5cm [26]

Trang 18

5

Hành tím được coi là thành viên của họ hành, nhưng nhỏ hơn hành tây và trông giống tỏi hơn (Hình 1.1) Hành tím có mùi hăng, vị hơi cay được sử dụng rộng rãi cùng với

các Allium khác để tạo hương vị cho thực phẩm đặc biệt là thịt và nước sốt Hành tím

được con người sử dụng làm gia vị hàng ngày, nguyên liệu công nghiệp thực phẩm mà còn được dùng như một cây thuốc [27, 28] Loại hành này khác với giống thông

thường (Allium cepa L.) ở đặc điểm củ nhỏ hơn, có hình dạng giống như những nhánh

tỏi lớn, và có hương vị nhẹ hơn Người Pháp sử dụng loài này làm nguyên liệu nấu ăn hoặc chế biến nước sốt bằng cách băm nhỏ củ đun sôi trong rượu trắng [29] Ở các nước Đông Nam Á, hành tím được sử dụng phổ biến và quan trọng hơn hành tây và được trồng nhiều nhất là loại có củ màu đỏ [30] Mặc dù được tiêu thụ rộng rãi nhưng

các công bố liên quan đến tác dụng sinh học của hành tím rất ít so với các loài Allium

khác như tỏi và hành tây

1.1.2 Thành phần hóa học

Các nhà khoa học đã phân tích trong thành phần hóa học của A ascalonicum có sự

hiện diện của thành phần hữu ích như lectin liên kết với mannose [31] Ngoài việc Hình 1.1 Đặc điểm hình thái cây hành tím

A Củ hành tím; B Cây hành tím; C Hoa hành tím

Trang 19

6

được sử dụng như thuốc thử trong các lĩnh vực nghiên cứu, lectin còn có tiềm năng trong các liệu pháp chữa bệnh ung thư và kháng virus nhờ tính đặc hiệu khi liên kết với các cấu trúc carbohydrate khác nhau trên lớp vỏ vi khuẩn, virus hay trên bề mặt tế bào ung thư [32]

Hành tím là một nguồn quan trọng cung cấp carbohydrate, vitamin A, B và C Hợp chất phenolic trong hành tím bao gồm axit gallic, apigenin, eriodictyol, quercetin, isoquercetin, rutin, kaempferol, catechin và axit tannic [33] Ngoài ra, hai saponin furostanol mới (ascalonicoside A1/A2 và B) cũng được phân lập từ củ hành tím [7]

Các loài Allium là nguồn giàu flavonol A ascalonicum (hành tím) là một nguồn dồi

dào của các hợp chất lưu huỳnh, flavonoid và phenolic Sự hiện diện của các hợp chất này có vai trò trong việc loại bỏ gốc tự do và đặc tính chống oxy hóa [9, 34, 35] Có báo cáo cho thấy chiết xuất hành tím có chứa một số polyphenol như apigenin, axit gallic, catechin, quercetin, kaempferol và axit tannic là những hợp chất nổi bật có hoạt tính kháng nấm [36] Trong đó, hợp chất quercetin được biết đến với khả năng chống oxy hóa và loại bỏ gốc tự do cũng như khả năng bảo vệ chống lại bệnh tim mạch, chúng còn có tác dụng rõ rệt trong điều trị dị ứng, hen suyễn, viêm khớp, ung thư, biến chứng tiểu đường, rối loạn thoái hóa thần kinh và bệnh loãng xương [37-40]

Phân tích GC-MS của tinh dầu hành tím đã xác định được 42 hợp chất chiếm hơn 70,29% tổng số tinh dầu Các thành phần chính là dipropyl disulfide (15,17%), dipropyl trisulfide (11,14%), methyl propyl trisulfide (9,20%), 1-propenyl propyl disulfide (4,57%) và methyl propyl disulfide (3,26%) [41]

Các hợp chất hữu cơ dễ bay hơi của hành tây và hành tím được xác định thông qua HS-SPME-GC-MS Các thành phần chính là dipropyldisulphide và allylpropyldisulphide Thiopropanal S-oxit chỉ được phát hiện trong chất bay hơi của hành tây Điều thú vị là trong hành tím có sự hiện diện của 2-metyl-2-pentenal, một hợp chất có mùi thơm trái cây, có thể đây là đặc trưng cho mùi thơm khác nhau giữa

Trang 20

sử dụng cột mao quản có đường kính (0,53mm) với tiêm chất làm lạnh (0°C) trên cột và điều kiện nhiệt độ cột ban đầu, tốc độ gia nhiệt (2-5°C / phút) và nhiệt độ GC-MS từ 80-100°C Các mẫu của các thành phần nghi ngờ được sử dụng để định danh và định lượng, rượu benzyl làm chất chuẩn nội Trong các điều kiện này, thiosulfinat MeS(O)SMe, PrS(O)SPr, MESS(O)Pr, MeS(O)SPr, (Z)- và (E)-MeS(O)SCH=CHMe, (E)-MeSS(O)CH=CHMe và (Z)- và (E)-PrS(O)SCH=CHMe và 2,3-dimethyl-5,6 dithiabicyclo [2.1.1] hexane 5-oxit (cis- và trans zwiebelanes) đều được xác định trong hành tây, tỏi tây, hành lá, hành tím và củ nén trong khi MeS(O)SMe và (E, Z)-MeS(O)SCH=CHMe được xác định trong lá hẹ Trung Quốc Mặt khác, nghiên cứu không thể thu được các pic cho các đồng phân MeCH=CHS(O)SPr hoặc bất kỳ thiosulfinat nào có chứa nhóm 2-propenyl (allyl), được xác định bởi HPLC [43]

Selen và lưu huỳnh đồng thời được xác định có trong hành tím (Allium ascalonicum)

thực hiện bằng kỹ thuật ghép nối, HPLC được kết hợp với quang phổ nguồn plasma cảm ứng cao tần, kết nối khối phổ (HPLC – ICP-MS) được trang bị hệ thống phản ứng octopole (ORS) Hợp chất seleno phổ biến được xác định trong hành tím là γ-glutamylmethylselenocysteine được ion hóa bằng phương pháp phun mù electron, ghép nối khối phổ (ESI-MS / MS) Hơn nữa, hành tím còn cho thấy tác dụng ngăn ngừa chống lại các tế bào bệnh bạch cầu ở người [44]

1.1.3 Hoạt tính sinh học

Hành tím có nhiều hợp chất hoạt tính sinh học Một số nghiên cứu cho thấy hành tím có các đặc tính kháng khuẩn, kháng nấm [45], chống oxi hóa,kháng biểu mô, kháng khuẩn, kháng vi rút và chống viêm [10, 11, 46], chẳng những thế chúng còn có tiềm

Trang 21

8

năng điều trị chống lại vi khuẩn Hp (Helicobacter pylori) có trong dạ dày [47] Có

báo cáo chỉ ra rằng hành tím là nguyên liệu sản xuất thực phẩm chức năng hỗ trợ sức khỏe với hàm lượng selen và chất chống oxy hóa cao [48] Năm 2011, Chen cùng cộng sự đã cho thấy tiềm năng của hành tím sử dụng trong điều trị các hoạt động lây nhiễm của vi-rút adeno [49] Khả năng chống oxy hóa của hành tím cao hơn khi so sánh với các chất chiết xuất từ tỏi, đối với dịch chiết hexane của hành tím có thể bảo vệ quá trình tán huyết hồng cầu khỏi các gốc như hydrogen peroxide Nghiên cứu cũng đã chứng minh dịch chiết từ củ hành tím có tác dụng bảo vệ đối với quá trình peroxy hóa lipid từ AAPH và giữ cho glutathione trong hồng cầu không bị oxi hóa [50] Thêm vào đó, hành tím còn được xem như một loại thảo mộc hữu ích với tiềm năng điều trị hoặc phòng ngừa chống lại các rối loạn liên quan đến mạch máu [51] Đồng thời, chất chiết xuất từ hành tím có thể được sử dụng như chất bảo quản tự nhiên để kéo dài thời hạn sử dụng của các sản phẩm cá cũng đã được chứng minh [52]

Kết quả nghiên cứu cho thấy hành tím có hoạt tính chống oxi hóa mạnh hơn tỏi tây, tỏi, hẹ Trung Quốc, hành tây Qua đó, hành tím có thể có tiềm năng mang lại giá trị trong ngành công nghiệp thực phẩm như những chất thay thế chất chống oxy hóa tổng hợp Đặc tính kháng khuẩn của tinh dầu hành tím cũng được thử nghiệm và đánh giá

trên năm mầm bệnh truyền qua thực phẩm: Gram (+) Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes và ba vi khuẩn Gram (-) Salmonella Typhimurium, Escherichia coli và Campylobacter jejuni [41]

Năm 2019, Asemani và công sự đã phát hiện phân tích hóa thực vật của các loài thuộc

chi Allium khác nhau cho thấy 16 loài đã chứng minh được đặc tính chống ung thư

tiềm năng do sự tích tụ của các hợp chất hữu cơ và lưu huỳnh khác nhau như S-allyl mercaptocysterin, quercetin, flavonoid và ajoene [53] Nghiên cứu trong nhiều năm

đã chỉ ra rằng tác dụng chống ung thư của Allium là do các hợp chất có nguồn gốc từ

lưu huỳnh (OSCs), được giải phóng ra khi chế biến (băm, nhai, cắt ) Các

γ-glutamyl-S-alk (en) yl-L-cysteine là các hợp chất lưu huỳnh chính trong Allium

nguyên vẹn, được thủy phân và oxy hóa để tạo ra S-alkyl (en) yl-L-cysteine sulfoxide

Trang 22

9

(alliin) Alliin tích tụ tự nhiên trong quá trình bảo quản Allium và là tiền chất không

mùi của OSCs Các OSCs được tạo ra khi chuyển đổi alliin thành allicin và các alkyl alkane-thiosulfinat khác thông qua alliinase, được giải phóng từ không bào khi cắt,

nghiền hoặc nhai Allium Allicin và các thiosulfinat thường không ổn định và bị phân

hủy ngay lập tức để tạo ra các hợp chất lưu huỳnh khác nhau bao gồm các OSCs hòa tan trong dầu như diallyl sulfide (DAS), diallyl disulfide (DADS), diallyl trisulfide (DATS), dithin và ajoene (4,5,9-trithiadodeca-1,6,11-triene-9-oxit) Đồng thời, γ-glutamyl cysteine cũng được chuyển đổi thành các OSCs hòa tan trong nước bao gồm S-allyl cysteine (SAC) và S-allyl mercaptocysteine (SAMC) [54, 55] Kết quả của

một nghiên cứu cho thấy SAC và OSCs ở A ascalonicum có khả năng chống ung thư

và kháng sinh [56] Chúng cũng được chứng minh là có hoạt tính chống ung thư và gây độc tế bào với dòng HepG2 (ung thư gan) [57] Ngoài ra, chiết xuất trong nước

của A ascalonicum có hoạt tính chống tăng trưởng trên các dòng tế bào ung thư;

Jurkat (ung thư bạch cầu cấp tế bào T ở người) và K562 (ung thư bạch cầu nguyên bào), Wehi164 (tế bào fibrosarcoma – ung thư mô mềm của chuột) Chiết xuất cũng cho thấy độc tính tế bào ít hơn nhiều so với dòng tế bào bình thường (HUVEC) và hoạt động chống viêm đáng kể trên cơ thể sống [56] Do đó, có thể kết luận rằng hành tím là một lựa chọn chống ung thư mạnh để điều trị ung thư [57]

Nhìn chung, hành tím có nhiều chất chống oxy hóa, khoáng chất và vitamin hơn hành tây Chúng là một nguồn giàu chất chống oxy hóa flavonoid như quercetin, kaempferol Hành tím chứa các hợp chất chống oxy hóa lưu huỳnh như diallyl disulfide, diallyl trisulfide và allyl propyl disulfide, chuyển đổi thành allicin thông qua tác động của enzyme sau khi bề mặt tế bào bị phá vỡ trong khi nghiền nát và cắt nhỏ Allicin làm giảm sản xuất cholesterol bằng cách ức chế enzyme HMG-CoA reductase trong tế bào gan [13]

Trang 23

10

1.2 Tổng quan quá trình lão hóa

1.2.1 Cơ chế của quá trình lão hóa bằng phương pháp xử lý nhiệt

Xử lý nhiệt là một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãi để loại bỏ mùi

khó chịu ở loài Allium Bất kể ở nhiệt độ nào, màu của mẫu sẽ tăng dần theo thời gian

từ vàng nhạt đến nâu sẫm Nhiệt độ càng cao khả năng hóa nâu sẽ càng nhanh, nếu nhiệt độ chậm khả năng hóa nâu sẽ chậm hơn Khả năng hóa nâu của thực phẩm xử lý nhiệt (như tỏi đen) liên quan đến phản ứng Maillard, phản ứng hóa nâu không enzyme, xảy ra giữa các amin thường là axit amin và các hợp chất carbonyl thường là đường khử [58]

Trong 150 năm qua, xử lý nhiệt đã trở thành một thực tế phổ biến trong ngành công nghiệp thực phẩm Các phương pháp xử lý như khử trùng hoặc nướng cải thiện các đặc tính cảm quan và sức khỏe của thực phẩm đã qua xử lý nhiệt Nhiều phản ứng hóa học khác nhau diễn ra trong quá trình nhiệt và bảo quản thực phẩm, tạo các hợp chất mới ảnh hưởng đến các đặc tính cuối cùng của thực phẩm và khả năng chấp nhận của người tiêu dùng Một số biến đổi này bao gồm một loạt các phản ứng phức tạp được gọi là phản ứng hóa nâu không do enzyme, dẫn đến sự hình thành màu nâu mà không có sự can thiệp của enzyme Trong số đó, phản ứng Maillard là phổ biến nhất do khả năng phát triển trong một phạm vi nhiệt độ lớn, hoạt động của nước, có hoặc không có oxy Do đó, sự hình thành phản ứng maillard là điều mong muốn trong thực phẩm như cà phê hoặc bánh mì…, trong đó màu sắc và mùi thơm đặc trưng được hình thành Ngược lại, trong thực phẩm như sữa hoặc nước trái cây, phản ứng maillard bị tránh do hình thành màu sắc và mùi thơm lạ cũng như giảm dinh dưỡng

Năm 1953, Hodge lần đầu mô tả các bước liên quan đến quá trình hình thành các sản phẩm trong phản ứng Maillard Toàn bộ quá trình hình thành phản ứng Maillard có thể được chia thành ba giai đoạn chính tùy thuộc vào sự hình thành màu sắc Ở giai đoạn đầu, đường và axit amin ngưng tụ, và sau khi ngưng tụ, sự sắp xếp lại Amadori và tạo thành 1-amino-1deoxy-2 ketose Trong giai đoạn thứ hai, sự mất nước và phân mảnh xảy ra trong các phân tử đường Các axit amin cũng bị phân huỷ trong giai đoạn

Trang 24

11

này Các sản phẩm phân hạch hydroxymethylfurfural (HMF) như pyruvaldehyde và diacetyl được hình thành Giai đoạn này có thể có màu vàng nhẹ hoặc không màu Trong giai đoạn cuối cùng, sự ngưng tụ aldol xảy ra và cuối cùng hình thành các hợp chất nitơ dị vòng, melanoidin, có màu đậm [59]

Giai đoạn đầu: sản phẩm không màu và không hấp thụ tia cực tím

 Phản ứng khử nước của đường

 Phản ứng phân hủy đường và các hợp chất amin

Hình 1.3 Quá trình khử nước và khử amin để tạo ra dicarbonyl Giai đoạn cuối: sản phẩm màu sẫm, có mùi thơm

Trang 25

12

Hình 1.4 Phản ứng trùng hợp tạo aldol

 Phản ứng ngưng tụ aldol tạo thành các polyme màu nâu không chứa nitơ

 Phản ứng trùng hợp hóa aldehitamin tạo thành các hợp chất nitơ dị vòng

Cường độ hóa nâu của thực phẩm cũng phụ thuộc vào bản chất của amino axit có trong thực phẩm Do đó, người ta đã thiết lập được sự phân loại các amino axit theo mức độ hóa nâu mà chúng tạo ra:

 Các amino axit tạo ra màu nâu ở mức cao: lysine, glycine, tryptophan và tyrosine

 Các amino axit tạo ra màu nâu ở mức độ trung bình: proline, leucine, isoleucine, alanin, hydroxyproline, phenylalanin, methionine, valine, axit glutamic và asparagin

 Các amino axit tạo ra một mức độ hóa nâu thấp: histidine, threonine, axit aspartic, arginine, axit glutamic và cysteine

Phản ứng Maillard có tác động lớn không chỉ đến các đặc tính cảm quan của thực phẩm mà còn đến thành phần cuối cùng của chúng, do làm giảm các chất dinh dưỡng có liên quan (chẳng hạn như các axit amin thiết yếu), ức chế các enzyme cần thiết khác nhau cho quá trình tiêu hóa thức ăn, và phát triển các hợp chất mới có cả đặc tính có lợi (hoạt động chống oxy hóa) và có hại (acrylamide, amin dị vòng, ) [60]

1.2.2 Các biến đổi nhờ quá trình lão hóa

Một ví dụ điển hình cho sản phẩm được tạo ra nhờ quá trình ủ lão hóa của loài Allium là tỏi đen Tỏi đen chỉ đơn giản là tỏi tươi (Allium sativum L.) đã được xử lý ủ lão

hóa trong môi trường với nhiệt độ (khoảng 70-80°C) và độ ẩm (khoảng 400–500 g/kg) được kiểm soát [61, 62] Quá trình này sẽ làm cho tép tỏi có màu sẫm, tạo cho chúng có vị ngọt và thay đổi độ đặc thành dai Tỏi đen không còn mùi vị khó chịu như tỏi tươi do hàm lượng allicin giảm và chuyển đổi thành các hợp chất chống oxi

Trang 26

13

hóa S-allyl cysteine (SAC), các alkaloid (các dẫn suất Tetrahydro-β-carboline) có

hoạt tính sinh học và các hợp chất flavonoid trong quá trình lão hóa [63, 64] Điều này cũng làm cho tỏi đen có nhiều SAC hơn tỏi tươi Trong nghiên cứu của Emiko Sato và cộng sự [65] đã báo cáo rằng chiết xuất tỏi đen có hoạt tính chống lại superoxide và hydrogen peroxide và hàm lượng polyphenol trong chiết xuất tỏi đen đã tăng lên so với tỏi đối chứng Những thay đổi về đặc tính hóa lý là nguyên nhân chính làm tăng hoạt tính sinh học của tỏi đen so với tỏi tươi Một số nghiên cứu đã báo cáo dịch chiết của tỏi đen thể hiện một số chức năng như chống oxy hóa, chống dị ứng, chống tiểu đường, chống viêm và có tác dụng chống ung thư [66-70] Trong quá trình nhiệt, một số hợp chất hóa học từ tỏi tươi được chuyển hóa thành hợp chất Amadori / Heyns, là những hợp chất trung gian chủ chốt của phản ứng Maillard [71] Bên cạnh đó, tỏi đen còn chứa một thành phần có hoạt tính chống oxy hóa quan trọng là 5- hydroxymethylfurfural (5-HMF), cũng là một sản phẩm được tạo ra bởi phản ứng Maillard [61]

Hình 1.5 Sơ đồ chuyển hóa alliin thành allicin

Hàm lượng các hợp chất hóa học có trong tỏi đen phụ thuộc vào điều kiện trong quá trình xử lý nhiệt Một số nhà nghiên cứu báo cáo rằng trong tỏi đen có nhiều thành phần có giá trị đặc biệt như polyphenol, flavonoid và một số chất trung gian của phản ứng Maillard được biết đến như là chất chống oxy hóa [58, 72] Hoạt tính sinh học

Trang 27

Trang 28

15

nhận thấy rằng hàm lượng cysteine chứa lưu huỳnh giảm đáng kể trong quá trình lão hóa, điều này minh chứng cho việc mùi vị của tỏi đen cũng giảm theo Bên cạnh đó, hàm lượng axit amin thơm như phenylalanine lại tăng lên so với tỏi tươi [58] Ngoài ra, theo nghiên cứu của Rojas và cộng sự [73] về hành tây đen được xử lý bằng nhiệt, các chất như quercetin tự do được tìm thấy với số lượng cao hơn đáng kể trong hành tây đen so với hành tươi

1.3 Tổng quan về hành tím đen

Trên thế giới, việc nghiên cứu về nguyên liệu hành tím đen còn hạn chế, chưa được nghiên cứu nhiều vì là sản phẩm mới, chỉ có một nghiên cứu “Thành phần hóa học và tác dụng chống oxi hóa, kháng viêm và kháng ung của chiết xuất etanol hành tím đen” được thực hiện bởi Trần Gia Bửu và cộng sự [74] Hành tím đen là sản phẩm

mới của cây hành tím (Allium ascalonicum), một trong những loại gia vị và bài thuốc

nổi tiếng được sử dụng trong ẩm thực Việt Nam và trong y học dân gian, qua quá trình ủ già trong môi trường nhiệt độ và độ ẩm được kiểm soát Tuy nhiên, các hoạt tính sinh học của chiết xuất ethanol từ hành tím đen vẫn chưa được nghiên cứu Mục đích của nghiên cứu này là xác định thành phần hóa học và tác dụng chống oxy hóa, chống ung thư, chống viêm của chiết xuất hành tím đen Các thành phần hóa học của chiết xuất hành tím đen được xác định thông qua phân tích ESIMS / MS và hoạt tính chống oxy hóa của chiết xuất được đánh giá bằng xét nghiệm thu dọn gốc 1,1-diphenyl-2picrylhydrazil (DPPH) Hoạt tính chống ung thư của hành tím đen chống lại ung thư biểu mô cổ tử cung ở người (Hela) và các dòng tế bào ung thư biểu mô tế bào gan (HepG2) ở người đã được kiểm tra thông qua xét nghiệm MTT Tác dụng chống viêm của chiết xuất được đo thông qua định lượng sản xuất oxit nitrit bằng phản ứng Griess Đã xác định được sự hiện diện của 7 hợp chất hoạt tính sinh học trong chiết xuất hành tím đen, bao gồm quercetin 3,4’-diglucoside, isorhamnetin 3,4’-diglucoside, quercetin 3-glucoside, quercetin 4’-glucoside, isorhamnetin 4’-glucoside, quercetin aglycone, isrohamnetin Hơn nữa, chiết xuất hành tím đen thể hiện hoạt tính chống oxy hóa mạnh hơn chiết xuất hành tím tươi (25,67 ± 0,65% so với 18,21 ± 0,35%, tương ứng) Tác dụng chống ung thư và chống viêm của hành tím

Trang 29

16

đen cũng cao hơn hành tím tươi Các dữ liệu cho thấy hành tím đen là một trong những thực phẩm chức năng đầy hứa hẹn để điều trị các bệnh liên quan đến viêm và ung thư

1.4 Định hướng ứng dụng

Hành tím đen là sản phẩm được tạo từ hành tím tươi qua quá trình xử lý nhiệt thời gian dài trong điều kiện nhiệt độ và độ ẩm được kiểm soát chặt chẽ Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng so với nguyên liệu ban đầu thì sản phẩm sau quá trình xử lý nhiệt có nhiều đặc tính sinh học vượt trội hơn như khả năng kháng oxi hóa, kháng viêm, kháng ung, chống dị ứng, chống tiểu đường [58, 65-70, 72-74] Dựa vào các dữ liệu đã được nghiên cứu cho thấy hành tím đen là sản phẩm đầy hứa hẹn để hỗ trợ điều trị ngăn ngừa ung thư, các bệnh liên quan đến viêm, điều chỉnh lượng đường trong máu, tăng cường sức đề kháng và hệ miễn dịch Đồng thời, hành tím đen với khả năng chống oxi hóa mạnh mẽ cũng là một nguồn thực phẩm hữu hiệu hỗ trợ điều trị các bệnh lý liên quan đến việc sản sinh các gốc tự do

Trang 30

17

2.1 Vật liệu nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu: Chỉ dẫn địa lý “Vĩnh Châu” cho sản phẩm hành tím của tỉnh Sóc Trăng được Cục Sở hữu trí tuệ cấp giấy chứng nhận đăng ký chỉ dẫn địa lý tại Quyết định số 2665/QĐ-SHTT, ngày 28-5-2019, với khu vực địa lý gồm: Phường 1, Phường 2, phường Vĩnh Phước, xã Vĩnh Hải, Vĩnh Tân, Lạc Hòa và Lai Hòa Hành tím tươi được thu mua từ phường Vĩnh Phước, thị xã Vĩnh Châu, tỉnh Sóc Trăng Sau khi thu mua, tiến hành phân loại và chọn lựa các củ hành nguyên vẹn, tròn chắc, không sâu mọt, không hư hỏng vật lý Ngoài ra, các củ hành được lựa chọn có màu sắc và kích thước đồng đều (đường kính khoảng 20 – 30mm) [26] Nguyên liệu sau khi lựa chọn được rửa sạch đất cát, cắt bỏ phần cuống và rễ, bóc vỏ khô bên ngoài Sau khi xử lý sơ bộ, hành tím được bọc trong giấy bạc (có các lỗ nhỏ đường kính 1.5 - 2mm để thoát hơi nước) và đem ủ ở điều kiện có thể điều chỉnh nhiệt độ và độ ẩm (70°C, 70% RH) trong 18 ngày Sản phẩm của quy trình xử lý nhiệt có màu nâu đen, khô, kết cấu dẻo, có vị ngọt nhẹ

Hình 2.1 Quy trình tạo sản phẩm hành tím đen

Hành tím đen được ngâm với dung dịch ethanol thực phẩm tỉ lệ 1:5 (nguyên liệu:dung môi) trong 1 tuần và lặp lại 2 lần để thu được hàm lượng tối đa Tiếp theo, dịch chiết

Trang 31

18

hành tím đen được lọc và cô đặc bằng máy cô quay chân không ở 60°C thu được cao chiết Sau đó, cao chiết tiếp tục được loại bỏ nước bằng phương pháp sấy thăng hoa, mẫu cao hành tím đen sau cùng được bảo quản ở 4°C cho đến khi sử dụng tiếp

2.2 Phương pháp khảo sát điều kiện tạo hành tím đen

2.2.1 Sơ đồ quy trình sản xuất hành tím đen từ hành tím tươi

Hình 2.2 Quy trình nghiên cứu sản xuất hành tím đen từ hành tím tươi Lấy mẫu và kiểm tra ở thời điểm ngày thứ: 0; 3; 6; 9; 12; 15; 18; 21

Khảo sát sự thay đổi pH, độ màu, độ ẩm, axit tổng, đường khử

Điều kiện ủ ĐK60:

+ Nhiệt độ: 60 oC + Độ ẩm: 70%

+ Thời gian: 21 ngày

Điều kiện ủ ĐK80:

+ Nhiệt độ: 80 oC + Độ ẩm: 70%

+ Thời gian: 21 ngày

Khảo sát hàm lượng Phenolic tổng và

Flavonoid tổng

Khảo sát khả năng bắt gốc tự do DPPH

HÀNH TÍM ĐEN

Trang 32

19

2.2.2 Thuyết minh quy trình

Nguyên liệu hành tím tươi: thu nhận từ thị xã Vĩnh Châu, tỉnh Sóc Trăng Yêu cầu củ hành còn nguyên vẹn, không dập nát, sâu mọt, kích thước đạt đồng đều

Xử lý sơ bộ: hành tím được xử lý làm sạch đất cát bên ngoài, cắt bỏ phần rễ, cuống và bóc vỏ khô bên ngoài

Khảo sát các điều kiện xử lý nhiệt: sau khi tiến hành xử lý làm sạch, hành tím được bọc trong giấy bạc và thực hiện quá trình lão hóa nhiệt với thiết bị buồng ủ lão hóa Hành tím đen được tạo thành khi được ủ hành tím tươi ở 03 điều kiện được ký hiệu ĐK60, ĐK70 và ĐK80 tương ứng với nhiệt độ lần lượt là: 60oC; 70oC; 80oC với độ ẩm 70%, thời gian ủ 21 ngày Thực hiện lấy mẫu kiểm tra với tần suất 01 mẫu/03 ngày tại một giờ nhất định (lúc 10 giờ sáng) và khảo sát các thông số hóa lý:

 Khảo sát sự thay đổi pH, độ màu, độ ẩm, axit tổng, đường khử

 Khảo sát tổng hàm lượng phenolic và flavonoid

 Khảo sát khả năng bắt gốc tự do DPPH

Do đặc điểm của củ hành có hàm lượng ẩm cao, vì vậy khi gói giấy bạc đem ủ cần tạo một số lỗ nhỏ ở bốn góc giấy bạc nhằm tạo môi trường thông thoáng để hơi ẩm có thể thoát ra bên ngoài, tránh động nước ở trong quá trình ủ

Hành tím đen: sản phẩm thu được sau quá trình lão hóa nhiệt ở quy trình được lựa chọn thông qua việc đánh giá các chỉ tiêu hóa lý như pH, độ ẩm, độ màu, axit tổng, đường khử và các hoạt chất có hoạt tính chống oxi hóa như phenolic, flavonoid

Công thức tính hàm lượng độ ẩm W1(%):

Trang 33

20 W1(%) = m−(m1−m0 )

2.2.4 Xác định pH

Xác định pH theo TCVN 7806:2007 (ISO 1842:1991) - Sản phẩm rau, quả - Xác định độ pH Sử dụng máy đo pH hiệu Hana HI8424 - Mỹ với điện cực thủy tinh, máy có khả năng bù nhiệt

Nguyên tắc: xác định sự chênh lệch điện giữa hai điện cực được nhúng vào dung dịch thử pH là phép đo hoạt động của ion H+, xác định bằng cách đo sự khác nhau về điện thế giữa điện cực thủy tinh và điện cực tham chiếu Máy đo pH được chuẩn hóa bằng cách sử dụng bộ đệm pH tiêu chuẩn (pH = 4; 7 và 10) trước khi tiến hành đo

Cách tiến hành:

Trộn 50g mẫu thử với 50ml nước cất và nghiền ở máy xay Nhúng điện cực vào phần mẫu thử và tiến hành đo giá trị pH của mẫu thử với quy trình vận hành của máy Sau một thời gian, pH đạt được giá trị ổn định, thực hiện đọc giá trị pH trực tiếp từ màn hình đo của thiết bị

Trang 34

21

2.2.5 Xác định độ axit

Nguyên tắc: xác định độ axit theo TCVN 5483:2007 (ISO 750:1998) Sản phẩm rau, quả - Xác định độ axit chuẩn độ được Chuẩn độ với dung dịch thể tích chuẩn natri hydroxit dùng phenolphtalein làm chất chỉ thị màu

Chuẩn bị mẫu thử:

Cắt mẫu thành những mẩu nhỏ, đưa vào máy xay để đồng nhất mẫu Cân 25g mẫu cho vào bình nón, thêm 50ml nước nóng, trộn đều cho đến khi đồng nhất mẫu Lắp bộ ngưng đối lưu vào bình nón và đun cách thủy bình trong 30 phút Để nguội, chuyển toàn bộ lượng chứa trong bình nón vào bình định mức và định mức 100ml bằng nước Lắc kỹ và lọc

Cách tiến hành:

Lấy 50ml dung dịch chiết và thêm từ 0,4ml dung dịch phenolphtalein, chuẩn độ bằng dung dịch natri hydroxit 0,1M cho đến khi xuất hiện màu hồng bền trong 30 giây Công thức tổng quát tính hàm lượng axit tổng là:

2.2.6 Xác định độ màu

Phương pháp đo màu củ hành bằng máy đo màu Konica Minolta CR-410 (Konica Minolta, Hà Lan) với hệ màu Lab Giá trị L* cho biết độ sáng khác nhau, từ màu đen (L*= 0) đến màu trắng (L*= 100) Giá trị a* cho biết màu đỏ khác nhau, từ xanh lục (a*= - 60) đến màu đỏ (a*= 60) và giá trị b* dao động từ xanh dương (b*= - 60) đến màu vàng (b*= 60) Dụng cụ được hiệu chuẩn với tiêu chuẩn chuẩn màu đen và trắng

Trang 35

22

Tổng sai số màu ∆E được tính toán từ các tham số L*, a* và b* được tính toán liên quan đến mẫu đối chứng (hành tươi) theo Saricoban và cộng sự [75]:

∆E = √(𝐿(𝑡) − 𝐿0)2+ (𝑎(𝑡) − 𝑎0)2+ (𝑏(𝑡) − 𝑏0)2 (2-4) Trong đó: L*0; a*0; b*0 giá trị độ màu của hành tím tươi (tại ngày 0); L*(t), a*(t), b*(t) giá trị độ màu của hành tím đen (tương ứng tại các ngày 3; 6; 9; 12; 15; 18; 21) Cách tiến hành:

Mẫu nghiên cứu được đặt trong một dụng cụ chuyên dụng hình trụ và được đậy kín bằng nắp (bộ dụng cụ chuyên dụng đi kèm với máy Minolta) để đo chỉ số màu sắc, mỗi mẫu được đo ở 03 vị trí khác nhau xoay quanh trên bề mặt mẫu Ghi nhận giá trị

2.2.7 Xác định hàm lượng đường khử

Hàm lượng đường khử được xác định theo phương pháp DNS [76]

Nguyên tắc: dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với axit dinitrosalicylic (DNS), từ màu vàng của axit DNS trong dung dịch kiềm sẽ bị khử thành 3-amino-5 nitrosalicylic có màu đỏ cam Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ đường khử

3,5-Pha dung dịch thuốc thử DNS: cân 1g DNS pha trong 20ml NaOH 2N, thêm vào 50ml nước cất và 30g muối Sodium potassium tartrate, đun cách thủy cho tan rồi định

mức 100ml

Pha dung dịch chuẩn: dung dịch glucose mẫu (500µg/ml) bằng cách cân 0,5g

D-glucose pha trong nước cất thành 1 lít Chuẩn bị mẫu thử:

Cân 5g mẫu, tiến hành trích ly bằng 50ml ethanol 90% bằng cách cho vào thiết bị đun cách thủy cho sôi khoảng 10 phút Thực hiện lọc và đưa về pH = 7 bằng NaOH, định mức lên 100ml

Cách tiến hành:

Trang 36

23

Hút 0,5ml dịch mẫu thử và 1,5ml DNS, đun sôi 5 phút Sau khi đun sôi, để nguội, định mức 10ml bằng nước và mang đi đo độ hấp thu tại bước sóng cực đại 575nm Kết quả được tính theo mg/kg của nguyên liệu khô (mg/kg DW)

Công thức tính hàm lượng đường khử:

2.2.8 Xác định hàm lượng phenolic

Nguyên tắc: dùng thuốc thử Folin-Ciocalteu, thuốc thử này chứa chất oxi hóa là axit phospho-vonframic, trong quá trình khử, các nhóm hydroxyl phenol dễ bị oxi hóa, chất oxi hóa này sinh ra màu xanh có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 765nm Phản ứng do sự hình thành màu xanh của vonfarm và molypden Các thuốc thử Folin-Ciocalteu phản ứng với nhiều hợp chất polyphenol và mặc dù có thể có đáp ứng khác nhau với các hợp chất đơn lẻ, thì việc lựa chọn axit gallic làm chất chuẩn hiệu chuẩn cũng giúp ích cho việc thu được dữ liệu phenolic tổng số

Tổng hàm lượng phenolic được xác định theo Li Fu và cộng sự [77] với một số thay đổi Tiến hành pha loãng dung dịch với nồng độ phù hợp (dịch thu được ở phần chiết mẫu) Lấy 1ml mẫu đã pha loãng thêm vào 5ml thuốc thử Folin– Ciocalteu pha loãng 1:10 Sau 3 phút, 4ml dung dịch natri cacbonat 7,5% (khoảng 75g/L) được thêm vào Ủ 1 giờ ở nhiệt độ phòng và đo độ hấp thụ của hỗn hợp ở bước sóng 765nm Axit gallic được sử dụng như một chất chuẩn đối chiếu và kết quả được biểu thị bằng đương lượng miligam axit gallic (mg GAE/g cao chiết) Hàm lượng phenolic tổng được tính theo công thức:

Trang 37

24

Trong đó: P là hàm lượng phenolic tổng (mg axit gallic /g cao chiết); a là giá trị x từ đường chuẩn với axit gallic (g/ml); V là thể tích dung dịch cao chiết (ml); m là khối lượng cao chiết có trong thể tích V (g)

2.2.9 Xác định hàm lượng flavonoid

Nguyên tắc: dựa vào đặc tính tạo phức màu rất mạnh của flavonoid với kim loại Kim

loại Al3+ thường được sử dụng vì nó là kim loại tạo phức màu mạnh và an toàn Đo độ hấp thu cực đại ở bước sóng 415nm

Tổng hàm lượng flavonoid được xác định theo Chang và cộng sự [78] với một số thay đổi Lần lượt cho 0,5ml dung dịch mẫu vào 1,5ml ethanol 75% Sau đó, thêm tiếp 0,1ml AlCl3 10% và để phản ứng trong 6 phút Cuối cùng, hỗn hợp được thêm vào 0,1ml CH3COOK 0.1M và 2,8ml nước cất, lắc đều rồi để ổn định ở nhiệt độ phòng trong 30 phút Sau đó, tiến hành xác định độ hấp thụ bằng máy đo quang phổ ở bước sóng 415nm Tiến hành pha chuẩn quercetin tương tự với mẫu đo (thay thế mẫu bằng quercetin) Hàm lượng flavonoid tổng được tính theo công thức:

Trong đó: F là hàm lượng flavonoid tổng (mg quercetin/g cao chiết); c là giá trị x từ đường chuẩn với quercetin (mg/ml); V là thể tích dịch chiết (ml); m là khối lượng cao chiết có trong thể tích V (g)

2.2.10 Hoạt tính chống oxi hóa

Nguyên tắc: DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) là một gốc tự do bền có màu tím

đậm Sản phẩm khử của DPPH là 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazine (DPPH-H) có màu vàng nhạt Các chất có khả năng chống oxy hóa sẽ trung hòa gốc tự do DPPH• bằng cách cho hydro và dừng quá trình oxy hóa bằng cách chuyển các gốc tự do sang trạng thái ổn định hơn, làm giảm độ hấp thu tại bước sóng cực đại và màu của dung dịch sẽ nhạt dần, chuyển từ tím sang vàng nhạt [79]

Hoạt tính chống oxi hóa của hành tím đen được xác định dựa trên việc bắt gốc DPPH (1,1-diphenyl-2picryl-hydrazil) theo phương pháp được mô tả bởi Luciana L Mensor và cộng sự [80] với một số thay đổi Cho 3ml dung dịch ethanol DPPH 0,05mM vào

Trang 38

25

1ml dung dịch mẫu có nồng độ khác nhau Hỗn hợp được lắc mạnh và đặt ở nhiệt độ phòng trong 30 phút và đo độ hấp thụ của mẫu ở bước sóng 517nm Hoạt động thu dọn gốc DPPH được tính theo công thức sau:

Hoạt động bắt gốc tự do của DPPH (%) =𝐴0−𝐴1

Hình 2.3 Phản ứng bắt gốc tự do DPPH của các chất chống oxy hóa

2.3 Phương pháp nghiên cứu thành phần hóa học của hành tím đen

2.3.1 Xác định tổng hàm lượng phenolic

Thực hiện theo phương pháp được nêu tại mục 2.2.8

2.3.2 Xác định tổng hàm lượng flavonoid

Thực hiện theo phương pháp được nêu tại mục 2.2.9

2.3.3 Phương pháp nghiên cứu các hợp chất bay hơi

Các hợp chất bay hơi được phân tích bằng thiết bị sắc ký khí ghép khối phổ GC-MS của Agilent, GC 7890A - MS 5975C Cột HP5 (30m; 0,25mm; 0,25pm), sử dụng khí

Trang 39

26

mang là He Nhiệt độ buồng bơm mẫu là 250°C, nhiệt độ đầu dò 280°C Tỉ lệ chia dòng 1:20, mẫu được pha loãng trong n-hexan, thế tích tiêm 1µl Chương trình nhiệt: nhiệt độ đầu 90°C, tăng 8°C/phút đến 280°C, giữ 5 phút, sử dụng thư viện phổ NIST 2011 của máy để định danh các cấu tử trong mẫu hành tím đen

2.3.4 Phương pháp nghiên cứu các hợp chất không bay hơi

Các hợp chất không bay hơi được phân tích bằng thiết bị sắc ký lỏng ghép khối phổ LC-MS Agilent 1200 (USA) Hệ thống khối phổ MS/MS phân giải cao micrOTOF-QII Bruker Daltonic (Germany) Các dữ liệu được xử lý trên phần mềm Data Analysis (Bruker, Germany)

 Pha tĩnh: cột ACE3- C18 (4,6 ×150mm; 3,5µm), được ổn nhiệt ở 40°C

 Pha động: chương trình pha động được thực hiện theo bảng 2.1 tại tốc độ dòng 0,3 ml/phút Trong đó, pha A là dung dịch nước khử ion chứa 0,1% axit formic và pha B là acetonitril chứa 0,1% axit formic

Bảng 2.1 Chương trình pha động trên cột C18

2.3.4.1 Chiết xuất, phân lập

Sử dụng phương pháp ngâm chiết với dung môi methanol để chiết xuất cao methanol thô

Các cao phân đoạn được điều chế bằng phương pháp trích pha rắn cao methanol ban đầu với các dung môi có độ phân cực tăng dần: etyl acetate, nước

Trang 40

27

Sử dụng sắc ký cột silica gel (CC), sắc ký điều chế (PC), sắc ký bản mỏng (TLC), các phương pháp kết tinh để phân lập các chất tinh khiết từ cao etyl acetate

Kiểm tra độ tinh khiết các chất phân lập được bằng sắc ký bản mỏng

2.3.4.2 Xác định cấu trúc các hợp chất hóa học của hành tím đen

Cấu trúc hóa học của các hợp chất được khảo sát nhờ sự kết hợp các phương pháp vật lý hiện đại như: phổ khối lượng phun mù electron (ESI - MS) (HR – ESI – MS), phổ tử ngoại (UV), phổ hồng ngoại (IR), phổ công hưởng từ hạt nhân một chiều (1D NMR) và hai chiều (2D NMR) với các kỹ thuật khác như 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, H1-H1 COSY, HSQC và HMBC đã được sử dụng

Hành tím đen (A ascalonicum) (4,0 kg) được sấy khô, nghiền nhỏ, ngâm chiết 3 lần

bằng dung môi methanol (10L x 3) ở nhiệt độ phòng thu được dịch chiết, sau đó cô đặc bằng thiết bị cô quay chân không thu được cao methanol (240g) Cao methanol được hòa tan trong nước và chiết lỏng-lỏng với dung môi etyl acetate, chưng cất chân không thu được hai phần: cao etyl acetate (110g) và dịch chiết nước

Cao etyl acetate được tiến hành sắc ký cột silica gel với hệ dung môi hexan-axeton (100:0, 25:1, 15:1, 10:1, 7:1, 5:1) và hệ dung môi CHCl3:CH3OH (100:0, 6:1, 3:1,

2:1, 1:1) thu được 6 phân đoạn chính (kí hiệu từ F1 đến F6) (Hình 2.3)

Phân đoạn F1 (7,6 g) được tiến hành sắc ký cột silica gel (200 gam, 60 x 5 cm) rửa

giải bằng hệ dung môi hexan:axeton (100:0, 25:1, 15:1, 10:1, 4:1), mỗi hệ dung môi

sử dụng 250ml, thu được 7 phân đoạn (kí hiệu từ F1.1 đến F1.7) Phân đoạn F1.6

(3g) được tiến hành sắc ký cột với hệ dung môi rửa giải hexan:axeton (100:0, 25:1,

15:1, 10:1, 4:1) thu được hợp chất AA1(130mg)

Phân đoạn F5 (15,5g) được phân lập bằng sắc ký cột silica gel (200 gam, 60 x 3cm)

được rửa giải bằng hệ dung môi CHCl3:CH3OH (9:1, 6:1, mỗi hệ dung môi sử dụng

200ml) thu được hợp chất AA2(6,7mg).