luận án tiến sĩ nghiên cứu tác dụng điều trị suy thận mạn của bài thuốc gk1 trên thực nghiệm và lâm sàng

Theo y học hiện đại, những phương pháp điều trị cho bệnh nhân suy thận mạn chủ yếu điều trị triệu chứng, chế độ ăn giảm đạm kết hợp liệu pháp keto acid và sử dụng các biện pháp thay thế

CHẤT LIỆU, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

CHẤT LIỆU VÀ PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU

- Vị thuốc Hạ khô thảo nam: là phần trên mặt đất của cây Hạ khô thảo nam (Blumea lacera (Burn.F.) DC) được thu hái vào tháng 3/2018 tại Sapa, Lào Cai, được xác định tên khoa học bởi TS Đỗ Văn Hải, có ký hiệu là HKTN- 018-4 lưu giữ tại Phòng tiêu bản, Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (phụ lục 1) Vị thuốc được phơi sấy, kiểm tra đạt Tiêu chuẩn cơ sở (phụ lục 2) trước khi chiết xuất, bào chế phục vụ các giai đoạn nghiên cứu

Cao chiết toàn cây trên mặt đất của Hạ khô thảo nam được pha chế bằng cách hòa tan với nước vừa đủ để tạo dung dịch 630mg/10ml Để nghiên cứu tác dụng của cao chiết này, chuột được cho uống hai liều lượng khác nhau: 4g dược liệu khô/kg thể trọng (tương ứng với 0,05ml dung dịch/10g thể trọng) và 8g dược liệu khô/kg thể trọng (tương ứng với 0,1ml dung dịch/10g thể trọng).

- Bài thuốc GK1 được bào chế dưới dạng viên nang cứng (gọi tắt là Viên nang GK1): đạt tiêu chuẩn cơ sở (Phụ lục 4), đóng trong lọ PET nâu, đậy kín có màng seal, có hút ẩm silicagel, bảo quản tránh ánh sáng, được sản xuất tại Trung tâm Nghiên cứu ứng dụng và sản xuất thuốc – Học viện Quân y Mỗi viên nang GK1 chứa 500 mg cao khô GK1 tương ứng với hàm lượng các vị thuốc sau: Tên dược liệu Tên khoa học Thành phần viên nang

GK1 tương ứng với hàm lượng dược liệu Đại hoàng Rhizoma Rhei 870mg

Thổ phục linh Rhizoma Smilacis glabrae 1300mg

Bồ công anh Herba Lactucae indicae 1300mg

Long cốt Os Draconis 2610mg

Mẫu lệ Concha Ostreae 2610mg

Hạ khô thảo nam Blumea lacera 1300mg

Tá dược vừa đủ 1 viên Đánh giá độc tính cấp và bán trường diễn: viên nang GK1 được bóc loại bỏ vỏ nang, thu thập dạng bột thuốc, hòa với nước cất tạo hỗn dịch đặc (1 gam chế phẩm pha với 1,5ml nước cất) để cho động vật thực nghiệm uống Đánh giá tác dụng trên lâm sàng: viên nang GK1 được dùng với liều 6 viên/ngày, tương đương với 1 thang thuốc dùng trên lâm sàng

- Adenine: (mã A8626-25, hàm lượng 99%) được cung cấp bởi công ty Sigma (Hoa Kỳ), được pha trong dầu ăn với hàm lượng 10 mg/ml dầu

- Viên nén bao phim Ketosteril ® chứa Ketosteril 600mg; hộp 5 vỉ x 20 viên Thuốc thuộc quyền sở hữu của tập đoàn Fresenius Kabi (Đức) Sản xuất bởi Labesfal - Laboratórios Almiro, S.A (Bồ Đào Nha) Hạn sử dụng 12/10/2021, lô 18P3956

2.1.2 Phương tiện và trang thiết bị nghiên cứu

Kim đầu tù cho chuột uống thuốc (Nhật Bản), ống nghiệm pha thuốc, chai dựng thuốc, cân điện tử TE3102S Sartorius (Đức) để cân thuốc và cân điện tử α Series Ohaus (Đức) để cân chuột với độ chính xác 0,1g

Máy phân tích huyết học tự động Swelab Alfa (Thụy Điển)

Máy phân tích sinh hóa bán tự động BTS350 của hãng Biosystem (Tây Ban Nha)

Bộ dụng cụ mổ động vật cỡ nhỏ, các dụng cụ để pha chế, lưu mẫu, bảo quản mẫu và các dụng cụ thí nghiệm khác

Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker Avance 500 FT NMR Spectrometer (Đức) Máy đo khối phổ Hewlett Packard 5989B MS Engine Máy phun sấy LPG-5 (Trung Quốc)

Máy xét nghiệm huyết học Sysmex XN - 550 (Nhật Bản)

Máy phân tích hóa sinh tự động Erba (Đức)

Bộ đo huyết áp cơ ALPK2 (Nhật Bản), máy ghi điện tim Cardiofax S ECG 1250, máy chụp XQ kỹ thuật số, cân, thước đo chiều cao.

ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.2.1 Chiết xuất, phân lập một số hoạt chất và đánh giá tác dụng điều trị của vị thuốc Hạ khô thảo nam trên mô hình thực nghiệm suy thận mạn

Chiết xuất, phân lập một số hoạt chất của vị thuốc Hạ khô thảo nam

Vị thuốc Hạ khô thảo nam mô tả tại mục 2.1.1 Đánh giá tác dụng điều trị của vị thuốc Hạ khô thảo nam trên mô hình thực nghiệm suy thận mạn

Bảng 2.1 Động vật nghiên cứu

Tiêu chuẩn chuột đầu vào Chuẩn bị trước nghiên cứu Số lượng

Chuột nhắt trắng, chủng Swiss, cả hai giống, khỏe mạnh, trọng lượng 20 ± 2g

Không gây suy thận mạn 7

Gây suy thận mạn bằng adenine đưa thẳng vào dạ dày chuột, liều 100mg/kg trọng lượng, uống cách ngày trong 5 tuần 45 2.2.2 Đánh giá độc tính cấp và độc tính bán trường diễn của viên nang GK1

- Động vật dùng cho nghiên cứu độc tính cấp: 120 con chuột nhắt trắng chủng Swiss, cả hai giống, khỏe mạnh, trọng lượng cơ thể (TLCT) từ 20g ± 2g

- Động vật dùng cho nghiên cứu độc tính bán trường diễn: 30 thỏ chủng Newzealand White, lông trắng, cả hai giống, khỏe mạnh, trọng lượng cơ thể 2kg ± 0,2kg

Tất cả động vật thí nghiệm do Ban chăn nuôi động vật thí nghiệm - Học viện Quân y cung cấp, được nuôi dưỡng trong điều kiện phòng thí nghiệm 5 ngày trước khi thử thuốc Trong suốt thời gian nghiên cứu động vật được ăn thức ăn theo tiêu chuẩn, nước uống tự do

2.2.3 Đánh giá tác dụng của viên nang GK1 điều trị suy thận mạn trên lâm sàng Đối tượng nghiên cứu lâm sàng là 60 bệnh nhân được chẩn đoán suy thận mạn độ I, II, IIIa [36], tương ứng với bệnh thận mạn giai đoạn G3a-G4 [96], phù hợp với tiêu chuẩn chẩn đoán và loại trừ như sau:

2.2.3.1 Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân

* Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân theo y học hiện đại:

- Tuổi: từ 18 tuổi trở lên

- Giới tính: cả nam và nữ

- 60 bệnh nhân đã được chẩn đoán suy thận mạn độ I, II, IIIa [36], chưa có chỉ định điều trị lọc máu, tương đương bệnh thận mạn giai đoạn G3a-G4 [96]

- Bệnh nhân tình nguyện tham gia nghiên cứu

* Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân theo y học cổ truyền:

Bệnh nhân đã được chẩn đoán suy thận mạn theo tiêu chuẩn lựa chọn của y học hiện đại

2.2.3.2 Tiêu chuẩn loại trừ bệnh nhân

- Suy thận cấp, đợt cấp của suy thận mạn, các bệnh lý cấp tính, truyền nhiễm: sốt, nhiễm trùng cấp, ung thư, bệnh về máu, viêm gan cấp, xơ gan, giai đoạn cấp tai biến mạch máu não, lao, HIV

- Phụ nữ có thai và cho con bú

2.2.3.3 Tiêu chuẩn loại khỏi diện tổng kết trong nghiên cứu

- Trong thời gian điều trị, phát hiện mắc bệnh trong tiêu chuẩn loại trừ

- Bệnh nhân không tuân thủ các yêu cầu nghiên cứu: uống thuốc không đủ liều, bỏ thuốc 3 ngày liên tục trở lên, không làm đủ các xét nghiệm theo yêu cầu nghiên cứu.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Chiết xuất, phân lập một số hoạt chất và đánh giá tác dụng điều trị của vị thuốc Hạ khô thảo nam trên mô hình thực nghiệm suy thận mạn

2.3.1.1 Chiết xuất, phân lập một số hoạt chất của Hạ khô thảo nam a) Chiết xuất cao Hạ khô thảo nam

Cân 200g vị thuốc Hạ khô thảo nam, sử dụng phương pháp chiết hồi lưu với 2 lít ethanol 96% trong mỗi lần chiết, thực hiện 3 lần chiết Sau mỗi lần chiết, lọc bỏ bã và tiểu phân bằng giấy lọc Whatman để thu được dịch chiết trong.

Dịch này được bốc hơi dung môi dưới áp suất giảm sử dụng thiết bị cô quay chân không (nhiệt độ 65°C, tốc độ quay 300 vòng/phút) thu được cao đặc Cao này được để yên về nhiệt độ phòng, sau đó bảo quản ở điều kiện lạnh (4°C- 8°C) để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo b) Phân lập một số hoạt chất từ phân đoạn có tác dụng điều trị suy thận mạn

Bước 1 Chiết xuất cao chiết phân đoạn

Lấy 27,5 g cao Hạ khô thảo nam thu được ở trên, phân tán trong khoảng

100 ml nước cất nóng ở 70°C Khuấy đều, sau đó chiết lỏng-lỏng với 200 ml n-hexan (chiết lặp lại 3 lần), cất thu hồi dung môi thu được cao phân đoạn n- hexan (BL-H) và lớp nước Lớp nước tiếp tục được lắc lần lượt với dung môi Dichloromethan (DCM, 200 ml/lần × 3 lần) và dung môi Ethyl acetat (EtOAc, 200ml /lần × 3 lần), cất thu hồi dung môi thu được cao phân đoạn DCM (BL-D) và phân đoạn EtOAc (BL-E) Toàn bộ quá trình được sơ đồ hoá như hình:

Sơ đồ 2.1 Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn từ cao ethanol của Hạ khô thảo nam Bước 2 Phân lập các hợp chất từ phân đoạn DCM

Mẫu cần phân lập: cao DCM (BL-D) được phân lập bằng sắc kí cột silica gel trên cột có chiều dài 60cm, đường kính 5cm với hệ dung môi rửa giải n- hexan/aceton (30/1-0/1, v/v) Sau đó, xác định các phân đoạn có các hoạt chất để tiếp tục phân lập Phân đoạn này được phân lập bằng sắc kí cột silica gel trên cột có chiều dài 60cm, đường kính 2,5cm với hệ dung môi rửa giải phù hợp để thu được các phân đoạn tiếp theo Tinh chế phân đoạn cuối bằng sắc kí cột silica

Phân tán trong 100 ml nước nóng

Cao phân đoạn n – hexan (BL-H)

Cất thu hôi dung môi

Cất thu hồi dung môi

Lắc phân đoạn với n- hexan ầ ầ

Lắc phân đoạn với DCM ầ ầ

Cất thu hồi dung môi

Lắc phân đoạn với EtOAc 200 ml/lần × ầ

Lớp nước gel trên cột có chiều dài 40cm, đường kính 1cm và rửa giải bằng hệ dung môi phù hợp để thu được hợp chất tinh khiết

Bước 3 Phân lập các hợp chất từ phân đoạn EtOAc

Phân đoạn cao EtOAc (BL-E; 6,20g) được phân lập bằng sắc kí cột silica gel trên cột có chiều dài 60cm, đường kính 5cm với hệ dung môi rửa giải DCM/ EtOAc (30/1-0/1, v/v) thu được các phân đoạn Các phân đoạn này sau đó được tiếp tục phân lập trên sắc ký cột với các hệ dung môi phù hợp để thu được các hợp chất tinh khiết

Bước 4 Nhận dạng cấu trúc các hợp chất phân lập được

Các hợp chất tinh khiết đã phân lập từ các phân đoạn ở trên được phân tích phổ 1 H-NMR, 13 C-NMR để xác định cấu trúc Cụ thể: mẫu được hòa tan mẫu vào dung môi Dimethyl sulfoxide (DMSO, sử dụng dung môi deuterium); sau đó cho dung dịch này vào một ống thủy tinh chuyên dụng có độ cao 5mm, đậy nắp kín lại Đặt ống thủy tinh vào buồng đo và tiến hành đo phổ 1 H -NMR

(500 MHz) và 13 C-NMR (125 MHz) trên máy Bruker Ascend TM 500 Một số thông số kỹ thuật chính của máy: Tần số cộng hưởng proton 500 MHz; từ trường siêu dẫn: 11,7 Tesla; số đầu đo: 02 (BBFO, BBI) và số kênh: 02 [97]

Từ các phổ cộng hưởng từ hạt nhân của các hợp chất phân lập được, tiến hành phân tích, đánh giá, kết hợp so sánh đối chiếu với các tài liệu tham khảo và ngân hàng các hợp chất tự nhiên để nhận dạng và khẳng định cấu trúc 2.3.1.2 Đánh giá tác dụng điều trị của vị thuốc Hạ khô thảo nam trên mô hình thực nghiệm suy thận mạn

Nhóm chứng sinh học: 07 chuột nhắt trắng uống nước cất thông thường Nhóm đã gây mô hình: 45 chuột nhắt trắng đã gây mô hình suy thận mạn bằng cách đưa adenine đã pha trong dầu ăn (hàm lượng 10mg/ml dầu) vào thẳng dạ dày chuột với thể tích 0,1ml/10g TLCT qua kim đầu tù, tương ứng liều 100mg/kg TLCT/cách ngày trong 5 tuần Sau đó, chuột được chia làm 4 lô:

Lô 1 (chứng sinh học, n = 7): chuột nhắt trắng không gây suy thận mạn, uống nước cất theo nhu cầu

Lô 2 (chứng bệnh, n = 15): chuột nhắt trắng suy thận mạn uống nước cất theo nhu cầu

Lô 3 (HKTN 4gDL/kg, n = 15): chuột nhắt trắng suy thận mạn, uống dịch chiết Hạ khô thảo nam liều 4g DL/kg TLCT/ngày (tương đương liều dùng trên lâm sàng)

Lô 4 (HKTN 8gDL/kg, n = 15): chuột nhắt trắng suy thận mạn, uống dịch chiết Hạ khô thảo nam liều 8g DL/kg TLCT/ngày (gấp đôi liều dùng trên lâm sàng)

Thời gian nghiên cứu: 5 tuần

Các chỉ tiêu theo dõi:

- Thể trạng chung, tình trạng hoạt động, cân nặng 1 tuần/lần, số lượng chuột sống/chết

- Chỉ số sinh hóa máu: nồng độ urê và creatinin, AST, ALT

- Tổng phân tích tế bào máu: số lượng hồng cầu, nồng độ Hemoglobin, số lượng bạch cầu, số lượng tiểu cầu

Thời điểm xét nghiệm trước nghiên cứu và sau nghiên cứu 5 tuần Xét nghiệm mô bệnh học thận vào cuối tuần 5 tại Khoa Giải phẫu bệnh - Bệnh viện Quân y 103

2.3.2 Đánh giá độc tính cấp và độc tính bán trường diễn của viên nang GK1 Đánh giá độc tính cấp và độc tính bán trường diễn theo Hướng dẫn của

Tổ chức y tế thế giới [98] và Hướng dẫn thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng thuốc đông y, thuốc từ dược liệu (Quyết định 141/QĐ-K2ĐT của Cục Khoa học công nghệ và đào tạo - Bộ Y tế ngày 27/10/2015) [99]

2.3.2.1 Đánh giá độc tính cấp

Chuột được chia thành 10 lô, mỗi lô 12 con được nhịn ăn 16 giờ trước khi thí nghiệm, nước uống theo nhu cầu Kiểm tra cân nặng trước khi thử nghiệm Cho chuột uống hỗn dịch viên nang GK1 với các mức liều tăng dần trong cùng một thể tích (0,25 ml) để xác định liều thấp nhất gây chết 100% chuột và liều cao nhất không gây chết chuột

Theo dõi tình trạng chung của chuột, quá trình diễn biến bắt đầu có dấu hiệu nhiễm độc (nôn, co giật, kích động, bài tiết…) và số lượng chuột chết trong vòng 72 giờ sau khi uống thuốc Các chuột chết được mổ để đánh giá tổn thương đại thể Từ đó xây dựng đồ thị tuyến tính để xác định LD50 của thuốc thử Tiếp tục theo dõi tình trạng của chuột đến hết ngày thứ 7 sau thời gian uống thuốc thử 2.3.2.2 Đánh giá độc tính bán trường diễn

Thỏ được chia thành 3 lô, mỗi lô 10 con, mỗi con nhốt riêng 1 chuồng

- Lô chứng: uống nước cất

- Lô trị 1: uống hỗn dịch cao của viên nang GK1 mức liều 0,15g/kg/ngày (tương đương liều dùng trên lâm sàng)

- Lô trị 2: uống hỗn dịch cao của viên nang GK1 mức liều 0,45 g/kg/ngày (gấp 3 liều dùng tương đương trên lâm sàng)

Tất cả thỏ nghiên cứu được cho uống cùng một thể tích 2ml/ngày và theo dõi liên tục trong thời gian 60 ngày

* Các chỉ tiêu theo dõi đánh giá trong quá trình nghiên cứu

- Theo dõi tình trạng chung, trọng lượng cơ thể của thỏ

- Đánh giá chức phận tạo máu thông qua số lượng hồng cầu, chỉ số Hemoglobin, Hematocrit, số lượng bạch cầu và số lượng tiểu cầu

- Đánh giá hủy hoại tế bào gan thông qua định lượng một số chất chuyển hoá trong máu: ALT, AST Đánh giá chức năng lọc của cầu thận thông qua định lượng nồng độ urê, creatinin huyết thanh

XỬ LÝ SỐ LIỆU

- Các số liệu được xử lý bằng phương pháp thống kê y học bằng phần mềm SPSS 20.0

- Kết quả thu được thể hiện dưới dạng:

+ Tỷ lệ tỷ lệ phần trăm (%)

+ Giá trị trung bình (X ± SD ).

Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05

60 BN suy thận mạn chưa có chỉ định lọc máu

Nhóm đối chứng (30 BN) uống Ketosteril

Nhóm NC (30 BN) uống viên nang GK1

Theo dõi LS, XN (D15) Đánh giá kết quả Khám LS YHHĐ, YHCT XN (D30)

- Sử dụng test χ để so sánh sự khác nhau giữa hai tỷ lệ phần trăm

- Sử dụng test T-Student cho biến phân bố chuẩn, Wilcoxon test (Mann- Whitney) cho biến không phân bố chuẩn để so sánh sự khác nhau giữa hai giá trị trung bình

Kết quả nghiên cứu được coi là có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05.

PHƯƠNG PHÁP KHỐNG CHẾ SAI SỐ

Để hạn chế sai số trong quá trình nghiên cứu, chúng tôi tuyệt đối tuân thủ một số quy định như sau:

- Bệnh nhân nghiên cứu được điều trị tại Viện Y học cổ truyền Quân đội: được hướng dẫn cụ thể, giải thích đầy đủ các yêu cầu trong việc khai thác, đánh giá các triệu chứng và trong quá trình điều trị để họ phối hợp chặt chẽ với bác sỹ điều trị trong việc lượng hóa mức độ nặng nhẹ tương đối chính xác từng triệu chứng cơ năng theo y học hiện đại và y học cổ truyền

Tất cả các bệnh nhân nghiên cứu đều được theo dõi, giám sát chặt chẽ y lệnh điều trị trong quá trình nghiên cứu thông qua bảng theo dõi uống thuốc hàng ngày Bệnh nhân trả vỏ thuốc sau mỗi đợt uống thuốc và phát tiếp thuốc đợt sau

- Các chỉ số cận lâm sàng được thực hiện trên cùng một thiết bị tại Viện

Y học cổ truyền Quân đội.

ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

Nghiên cứu thành phần hoá học của Hạ khô thảo nam: tiến hành tại Trung tâm Nghiên cứu ứng dụng sản xuất thuốc và Viện Đào tạo Dược, Học viện Quân y từ 3/2019-12/2020

Nghiên cứu thực nghiệm: được tiến hành tại Viện Nghiên cứu Y dược học Quân sự - Học viện Quân y, từ tháng 6/2019 đến tháng 3/2020

Nghiên cứu lâm sàng: được tiến hành tại Viện Y học cổ truyền Quân đội từ tháng 3/2020 đến tháng 05/2022.

ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU

- Nghiên cứu lâm sàng được chấp thuận bởi Hội đồng nghiên cứu sinh và Hội đồng đạo đức Viện Y học cổ truyền Quân đội

- Tất cả các bệnh nhân trong nghiên cứu đều được giải thích rõ về mục đích nghiên cứu, biết được trách nhiệm và quyền lợi cụ thể của mình, tự nguyện tham gia và hợp tác chấp hành đầy đủ các quy định trong quá trình nghiên cứu Bệnh nhân đồng ý ký vào bản thỏa thuận nghiên cứu sau khi đọc kỹ và giải thích đầy đủ Bệnh nhân có quyền rút ra khỏi nghiên cứu bất kỳ thời điểm nào

- Thuốc điều trị cho bệnh nhân là miễn phí

- Nếu bệnh nặng hoặc xuất hiện tác dụng không mong muốn, bệnh nhân sẽ dừng nghiên cứu và chuyển chuyên khoa điều trị phù hợp

- Các kết quả nghiên cứu phải trung thực, đảm bảo bí mật và chỉ phục vụ cho lợi ích của bệnh nhân.

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP MỘT SỐ HOẠT CHẤT VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG ĐIỀU TRỊ CỦA VỊ THUỐC HẠ KHÔ THẢO NAM TRÊN MÔ HÌNH THỰC NGHIỆM SUY THẬN MẠN

3.1.1 Kết quả chiết xuất, phân lập một số hoạt chất

3.1.1.1 Chiết xuất các phân đoạn dịch chiết từ cao đặc Hạ khô thảo nam

Từ 0,2 kg phần trên mặt đất của cây Hạ khô thảo nam chiết xuất được 27,5 g cao đặc Hạ khô thảo nam Lấy 27,5g cao đặc Hạ khô thảo nam này phân tán trong khoảng 100 ml nước cất nóng ở 70°C Khuấy đều, sau đó chiết lỏng- lỏng với 200ml n-hexan (chiết lặp lại 3 lần), cất thu hồi dung môi thu được 3,6g cao phân đoạn n-hexan (ký hiệu là BL-H) và lớp nước Lớp nước tiếp tục được lắc lần lượt với dung môi DCM (200 ml/lần x 3 lần) và dung môi EtOAc (200ml /lần x 3 lần), cất thu hồi dung môi thu được 3,82g cao phân đoạn DCM (ký hiệu là BL-D) và 6,20g cao phân đoạn EtOAc (ký hiệu là BL-E)

Sơ đồ 3.1 Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn dịch chiết từ cao ethanol 3.1.1.2 Phân lập các hợp chất a Phân lập các hợp chất từ phân đoạn DCM

Mẫu cần phân lập: cao DCM (BL-D; 3,82g) được phân lập bằng sắc kí cột silica gel trên cột có chiều dài 60cm, đường kính 5cm với hệ dung môi rửa giải n-hexan/aceton (30/1-0/1, v/v) thu được 6 phân đoạn: BLD-I (35,6mg), BLD-II (88,4mg), BLD-III (113,7mg), BLD-IV (301,7mg), BLD-V (482,5mg), BLD-VI (198,1mg)

Phân đoạn BLD-IV (301,7mg) được phân lập bằng sắc kí cột silica gel trên cột có chiều dài 60cm, đường kính 2,5cm với hệ dung môi rửa giải n- hexan/EtOAc (10/1-0/1, v/v) thu được 3 phân đoạn (BLD-IV-1, BLD-IV-2,

BLD-IV-3) Tinh chế phân đoạn BLD-IV-1 (43,2mg) bằng sắc kí cột silica gel trên cột có chiều dài 40cm, đường kính 1cm và rửa giải bằng hệ dung môi DCM/aceton (10/1, v/v) thu được hợp chất BLD1 (12,1mg)

Phân đoạn BLD-V (482,5mg) được phân lập bằng sắc kí cột silica gel trên cột có chiều dài 60cm, đường kính 2,5cm với hệ dung môi rửa giải DCM/EtOAc (20/1-0/1, v/v) thu được 3 phân đoạn (BLD-V-1, BLD-V-2, BLD-V-3) Tinh chế phân đoạn BLD-V-2 (40,8mg) bằng sắc kí cột silica gel trên cột có chiều dài 40cm, đường kính 1cm và rửa giải bằng hệ dung môi DCM/Aceton (15/1, v/v) thu được hợp chất BLD2 (15,2mg)

Sơ đồ 3.2 Sơ đồ phân lập các chất từ cao phân đoạn DCM b Phân lập các hợp chất từ phân đoạn EtOAc

Mẫu EtOAc cao (BL-E; 6,20g) được phân lập bằng sắc ký cột silica gel trên cột có chiều dài 60cm, đường kính 5cm với hệ dung môi rửa giải DCM/ EtOAc (30/1-0/1, v/v) thu được 6 phân đoạn: BLE-I (1,20g), BLE-

II (0,63g), BLE-III (0,73g), BLE-IV (2,47mg), BLE-V (540 mg) và BLE-VI

Phân đoạn BLE-I (1,2g) được phân lập bằng sắc ký cột silica gel trên cột có chiều dài 60cm, đường kính 2,5cm với hệ dung môi rửa giải n-hexan/ aceton (15/1, 0/1, vv) thu được các phân đoạn: BLE-I-1 (175 mg), BLE-I-2 (430 mg), BLE-I-3 (76 mg), BLE-I-4 (56 mg)

Phân đoạn BLE-I-02 tiếp tục được tách trên sắc ký cột silica gel trên cột có chiều dài 40cm, đường kính 1cm và rửa giải với hệ dung môi CH2Cl2/EtOAc (20/1, v/v) thu được hợp chất BLE1 (17,2 mg)

Phân đoạn BLE-IV (2,47g) tiếp tục được phân lập bằng sắc ký cột silica gel trên cột có chiều dài 60cm, đường kính 2,5cm và sử dụng hệ dung môi rửa giải CH2Cl2/MeOH (20/1, 0/1, vv) thu được các phân đoạn BLE-IV-1 (320 mg), BLE-IV-3 (840 mg), BLE-IV-2 (364 mg)

Phân đoạn BLE-IV-3 (840 mg) được tách trên cột silica gel pha đảo, rửa giải bằng hệ dung môi MeOH/H2O (1/3, 3/1 v/v), thu được hai phân đoạn BLE-IV-3a và BLE-IV-3b Tiến hành tinh chế trên cột silica gel pha thuận và rửa giải với hệ dung môi DCM/MeOH/H2O (10/2/1, 6/4/1) thu được hợp chất BLE2 (27,6 mg)

Sơ đồ 3.3 Sơ đồ phân lập các chất từ cao phân đoạn EtOAc c Nhận dạng các hợp chất phân lập

Hợp chất BLD1 thu được ở dạng tinh thể vô định hình, màu trắng

Phổ 1 H-NMR của hợp chất BLD1 cho thấy sự xuất hiện tín hiệu của 6 nhóm methyl cộng hưởng tại δH 0,66 (3H, s); 0,99 (3H, s); (3H, s), 0,91 (3H, d,

J = 6,4 Hz) Ngoài ra còn có tín hiệu của một proton olefin cộng hưởng tại δH

5,33 (1H, dd, J = 3,0 Hz), tín hiệu của một nhóm methin mang oxy tại δH 3,50 (1H, m) Các tín hiệu của proton nhóm methylen và methin cộng hưởng trong vùng trường cao với độ chuyển dịch từ 1,04-2,31 ppm

Hình 3.1 Phổ 1 H-NMR của hợp chất BLD1

Hình 3.2 Phổ 13 C-NMR của hợp chất BLD1 Phổ 13 C-NMR của BLD1 cho thấy sự xuất hiện của 29 carbon, trong đó có 2 tín hiệu liên kết đôi tại δC 140,8 (C-5) và 121,7 (C-6), tín hiệu của 6 nhóm methyl tại δC 19,1 (C-28); 11,9 (C-29); 19,4 (C-19); 12,0 (C-24); 19,8 (C-26) và 19,4 (C-27); 9 nhóm methylen tại δC 37,3 (C-1); 32,0 (C-2); 42,3 (C-4);

31,7 (C-7); 21,1 (C-11); 39,8 (C-12); 26,2 (C-15); 28,2 (C-16); 23,1 (C-23); 10 nhóm methin; 3 carbon bậc 4 tại δC 140,8 (C-5); 36,5 (C-10); 42,3 (C-13) cùng với tín hiệu của một nhóm methin mang oxy tại δC 71,8 (C-3)

Bảng 3.1 Dữ liệu phổ 1 H-NMR và 13 C-NMR của chất BLD1

Vị trí Số liệu trong tài liệu đã công bố Số liệu thực nghiệm đo được δ Cd δ Ca,c δ Ha,b

Chú thích: a Đo trong CDCl3, b 500 MHz, c 125 MHz

Số liệu trong tài liệu đo C-NMR (CDCl3, 150 MHz)

So sánh số liệu phổ NMR của hợp chất BLD1 với tài liệu đã công bố về hợp chất β-sitosterol [103] cho thấy hoàn toàn phù hợp Do đó hợp chất BLD1 được xác định là β-sitosterol

Hình 3.3 Cấu trúc hóa học của hợp chất BLD1 b Hợp chất BLD2

Hợp chất BLD2 phân lập được dưới dạng bột màu trắng hơi vàng

Hình 3.4 Phổ 1 H-NMR của hợp chất BLD2

Phổ 1 H-NMR của hợp chất BLD2 cho thấy sự xuất hiện tín hiệu proton của 5 nhóm methoxy tại δH 3,87 (3H, s), 3,93(3H, s), 3,97 (3H, s), 3,97 (3H, s) và 3,97 (3H, s); ba tín hiệu proton của hệ ABX của vòng thơm tại δH 6,99 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-5´), 7,69 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-2´) và 7,73 (1H, dd, J = 1,5 &

8,5 Hz, H-6´), điều này chứng tỏ vòng thơm bị thế tại vị trí 1, 3 và 4; một tín hiệu proton thơm xuất hiện dưới dạng mũi đơn tại δH 6,50 (1H, s, H-8)

Trên phổ 13 C-NMR kết hợp với phổ HSQC của hợp chất BLD2 thấy có sự xuất hiện của 20 carbon Trong đó có 5 tín hiệu carbon của nhóm methoxy tại δC 56,0; 56,1; 56,4; 60,2 và 60,9 ppm; một tín hiệu carbon của nhóm keton tại δC 178,9 ppm (C-4)

Hình 3.5 Phổ 13 C-NMR của hợp chất BLD2

Hình 3.6 Các tương tác phổ HMBC của hợp chất BLD2

KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH CẤP VÀ ĐỘC TÍNH BÁN TRƯỜNG DIỄN CỦA VIÊN NANG GK1

3.2.1 Kết quả đánh giá độc tính cấp của viên nang GK1

Nghiên cứu độc tính cấp của viên nang GK1 xác định LD50 theo phương pháp Litchfield – Wilcoxon [107] Kết quả nghiên cứu độc tính cấp trên chuột nhắt trắng sau 7 ngày uống hỗn dịch viên nang GK1 được thể hiện trong bảng sau:

Bảng 3.13 Kết quả nghiên cứu độc tính cấp trên chuột nhắt trắng

TLCT/ngày) Tỷ lệ chết

(%) Dấu hiệu bất thường khác

Lô 6 12 10,0 0 đi ngoài phân nát 2/12 trong 3 ngày đầu

Lô 7 12 20,0 0 đi ngoài phân nát 6/12 trong 3 ngày đầu

Lô 8 12 30,0 0 đi ngoài phân nát 6/12 trong 3 ngày đầu

Lô 9 12 40,0 0 đi ngoài phân nát 8/12 trong 3 ngày đầu

Lô 10 12 50,0 0 đi ngoài phân nát 11/12 trong 3 ngày đầu Nhận xét:

Sau khi uống hỗn dịch viên nang GK1 trong thời gian 12 giờ đầu, tất cả các chuột không có biểu hiện bất thường: chuột ăn uống, vận động bình thường, lông mượt, niêm mạc hồng hào, mắt sáng, phân khô Lô chuột uống hỗn dịch GK1 liều 10g/kg TLCT đến 50g/kg TLCT sau 12 giờ uống thuốc trong 3 ngày đầu, một số chuột biểu hiện phân nát, sau đó phân mềm, khô Ở mức liều cao nhất có thể cho chuột nhắt uống 50g/kg TLCT (gấp 83,3 lần liều dùng tương đương trên lâm sàng), tối đa cho chuột uống 0,25ml hỗn dịch đặc/10g trọng lượng cơ thể/lần x 3 lần/ngày, một số chuột có biểu hiện phân lỏng nát trong 3 ngày đầu, tuy nhiên chuột vẫn ăn uống, vận động bình thường Không nhận thấy biểu hiện ngộ độc nào trên chuột thí nghiệm trong thời gian theo dõi Sau 72 giờ, các lô thí nghiệm đều không có chuột chết Như vậy, chưa xác định được LD50 của viên nang GK1

3.2.2 Kết quả đánh giá độc tính bán trường diễn của viên nang GK1

3.2.2.1 Ảnh hưởng của viên nang GK1 đến tình trạng chung và trọng lượng cơ thể của thỏ

Trong thời gian thí nghiệm, tất cả các thỏ đều hoạt động bình thường, ăn uống tốt, phân mềm, lông mượt, không có hiện tượng rụng lông hoặc lông bị khô, cứng Không thấy biểu hiện gì đặc biệt trong suốt thời gian nghiên cứu

* Trọng lượng cơ thể của thỏ

Kết quả theo dõi trọng lượng cơ thể của thỏ nghiên cứu trong suốt quá trình thí nghiệm được trình bày ở bảng sau:

Bảng 3.14 Ảnh hưởng của viên nang GK1 đến trọng lượng cơ thể của thỏ

Lô nghiên cứu n Trọng lượng cơ thể thỏ (kg, X ± SD )

Trước thí nghiệm Sau 30 ngày Sau 60 ngày

+ : p < 0,05 so sánh với lô chứng; *: p < 0,05 so sánh với trước thí nghiệm

Sau 30 ngày, trọng lượng thỏ ở cả 3 lô thay đổi so với thời điểm trước thí nghiệm không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Đến ngày thứ 60, ở cả 3 lô nghiên cứu, trọng lượng thỏ ở mỗi lô đều tăng so với thời điểm trước thí nghiệm (p < 0,05)

Không có sự khác biệt về tăng trọng lượng thỏ giữa lô chứng và các lô dùng thuốc thử tại cùng thời điểm nghiên cứu (p > 0,05)

3.2.2.2 Ảnh hưởng của viên nang GK1 đến một số chỉ số công thức máu của thỏ

Bảng 3.15 Ảnh hưởng của viên nang GK1 đến số lượng hồng cầu

Lô nghiên cứu n Số lượng hồng cầu thỏ (T/L, X ± SD )

Trước thí nghiệm Sau 30 ngày Sau 60 ngày

+ : p < 0,05 so sánh với lô chứng; *: p < 0,05 so sánh với trước thí nghiệm

Sau 30 ngày và 60 ngày dùng viên nang GK1, so sánh trong từng lô giữa các thời điểm nghiên cứu và so sánh giữa các lô ở cùng một thời điểm, số lượng hồng cầu thỏ thay đổi không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05)

Bảng 3.16 Ảnh hưởng của viên nang GK1 đến nồng độ huyết sắc tố

Lô nghiên cứu n Nồng độ HST thỏ (g/L, X ± SD )

Trước thí nghiệm Sau 30 ngày Sau 60 ngày

+ : p < 0,05 so sánh với lô chứng; *: p < 0,05 so sánh với trước thí nghiệm

Sau 30 ngày và 60 ngày dùng viên nang GK1, so sánh trong từng lô giữa các thời điểm thí nghiệm và so sánh giữa các lô ở cùng một thời điểm, nồng độ HST thay đổi không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05)

Bảng 3.17 Ảnh hưởng của viên nang GK1 đến nồng độ hematocrit

Lô nghiên cứu n Nồng độ HCT thỏ (%, X ± SD)

Trước thí nghiệm Sau 30 ngày Sau 60 ngày

+ : p < 0,05 so sánh với lô chứng; *: p < 0,05 so sánh với trước thí nghiệm

Sau 30 ngày và 60 ngày dùng viên nang GK1, so sánh trong từng lô giữa các thời điểm thí nghiệm và so sánh giữa các lô ở cùng một thời điểm, nồng độ HCT thay đổi không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05)

Bảng 3.18 Ảnh hưởng của viên nang GK1 đến số lượng bạch cầu

Lô nghiên cứu n Số lượng bạch cầu thỏ (G/L, X ± SD )

Trước thí nghiệm Sau 30 ngày Sau 60 ngày

+ : p < 0,05 so sánh với lô chứng; *: p < 0,05 so sánh với trước thí nghiệm

Sau 30 ngày và 60 ngày uống viên nang GK1, số lượng bạch cầu thỏ ở lô trị 1, lô trị 2 thay đổi không có ý nghĩa thống kê so với lô chứng sinh học và so với trước khi uống thuốc (p > 0,05)

Bảng 3.19 Ảnh hưởng của viên nang GK1 đến số lượng tiểu cầu

Lô nghiên cứu n Số lượng tiểu cầu thỏ (G/L, X ± SD )

Trước thí nghiệm Sau 30 ngày Sau 60 ngày

+ : p < 0,05 so sánh với lô chứng; *: p < 0,05 so sánh với trước thí nghiệm

Sau 30 ngày và 60 ngày uống viên nang GK1, số lượng tiểu cầu thỏ ở lô trị 1, lô trị 2 thay đổi không có ý nghĩa thống kê so với lô chứng sinh học và so với trước khi uống thuốc (p > 0,05)

3.2.2.3 Ảnh hưởng của viên nang GK1 đến sự hủy hoại tế bào gan và chức năng thận thỏ

Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của viên nang GK1 đối với sự hủy hoại tế bào gan và chức năng thận thỏ thực nghiệm được trình bày ở các bảng sau:

Bảng 3.20 Ảnh hưởng của viên nang GK1 đến nồng độ enzym AST

Lô nghiên cứu n Nồng độ enzym AST của thỏ (U/L, X ± SD )

Trước thí nghiệm Sau 30 ngày Sau 60 ngày

+ : p < 0,05 so sánh với lô chứng; *: p < 0,05 so sánh với trước thí nghiệm

Sau 30 ngày và 60 ngày uống viên nang GK1, nồng độ enzym AST của thỏ ở lô trị 1, lô trị 2 thay đổi không có ý nghĩa thống kê so với lô chứng sinh học và so với trước khi uống thuốc (p > 0,05)

Bảng 3.21 Ảnh hưởng của viên nang GK1 đến nồng độ enzyme ALT

Lô nghiên cứu n Nồng độ enzym ALT của thỏ (U/L, X ± SD )

Trước thí nghiệm Sau 30 ngày Sau 60 ngày

+ : p < 0,05 so sánh với lô chứng; *: p < 0,05 so sánh với trước thí nghiệm

Sau 30 ngày và 60 ngày uống viên nang GK1, nồng độ enzym ALT của thỏ ở lô trị 1, lô trị 2 thay đổi không có ý nghĩa thống kê so với lô chứng sinh học và so với trước khi uống thuốc (p > 0,05)

Bảng 3.22 Ảnh hưởng của viên nang GK1 đến nồng độ creatinin máu

Lụ nghiờn cứu n Nồng độ creatinin mỏu thỏ (àmol/L, X ± SD )

Trước thí nghiệm Sau 30 ngày Sau 60 ngày

+ : p < 0,05 so sánh với lô chứng; *: p < 0,05 so sánh với trước thí nghiệm

Sau 30 ngày và 60 ngày uống viên nang GK1, nồng độ creatinin của thỏ ở lô trị 1, lô trị 2 thay đổi không có ý nghĩa thống kê so với lô chứng sinh học và so với trước khi uống thuốc (p > 0,05)

Bảng 3.23 Ảnh hưởng của viên nang GK1 đến nồng độ urê máu

Lô nghiên cứu n Nồng độ urê máu thỏ (mmol/L, X ± SD )

Trước thí nghiệm Sau 30 ngày Sau 60 ngày

+ : p < 0,05 so sánh với lô chứng; *: p < 0,05 so sánh với trước thí nghiệm

Sau 30 ngày và 60 ngày uống viên nang GK1, nồng độ urê máu thỏ ở lô trị 1, lô trị 2 thay đổi không có ý nghĩa thống kê so với lô chứng sinh học và so với trước khi uống thuốc (p > 0,05)

3.2.2.4 Ảnh hưởng của viên nang GK1 đến mô bệnh học gan, thận và lách thỏ Đại thể: Quan sát và so sánh đại thể bằng mắt thường và dưới kính lúp có độ phóng đại 25 lần thấy: màu sắc, hình thái của gan, lách và thận ở hai lô dùng viên nang GK1 không khác so với lô chứng

Vi thể: Kết quả về hình ảnh mô bệnh học các tạng gan, lách, thận được trình bày ở các bảng sau:

Bảng 3.24 Kết quả nghiên cứu về mô bệnh học của gan thỏ

Lô chứng Lô trị 1 Lô trị 2

KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CỦA VIÊN NANG GK1 ĐIỀU TRỊ

3.3.1 Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu

Bảng 3.27 Phân bố bệnh nhân theo tuổi, giới Đặc điểm

Số lượng Tỷ lệ % Số lượng Tỷ lệ %

- Tuổi trung bình của bệnh nhân nhóm GK1 là 71,60 ± 14,99 tuổi cao hơn so với nhóm đối chứng là 66,23 ± 12,92 tuổi với p < 0,05 Tuổi trung bình của cả hai nhóm là 68,92 ± 14,13 tuổi Nhóm bệnh nhân từ 65 tuổi trở lên chiếm tỷ lệ cao, ở nhóm GK1 là 76,66% và nhóm đối chứng là 53,33%

- Phân bố bệnh nhân theo giới, nam giới chiếm đa số với tỷ lệ 93,33% ở nhóm GK1 và 76,67% ở nhóm đối chứng, sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê với p > 0,05

* Một bệnh nhân có thể có một hoặc nhiều nguyên nhân gây suy thận mạn

Biểu đồ 3.2 Tỷ lệ các nguyên nhân gây suy thận mạn Nhận xét:

Tỷ lệ bệnh nhân có tăng huyết áp chiếm tỷ lệ cao là 70% ở nhóm GK1 và 73,3% ở nhóm đối chứng Tỷ lệ các nguyên nhân gây suy thận mạn như đái tháo đường, gút, bệnh thận tiết niệu khác chiếm tỷ lệ thấp hơn từ 20% tới 43,33% Không có sự khác biệt giữa tỷ lệ nguyên nhân gây suy thận mạn giữa hai nhóm (p > 0,05)

Biểu đồ 3.3 Phân bố bệnh nhân theo mức lọc cầu thận

Tăng huyết áp Đái tháo đường Gút Bệnh thận, tiết niệu khác

Nhóm đối chứng Nhóm GK1 p > 0,05

Nhóm đối chứng Nhóm GK1

Tỷ lệ phân bố bệnh nhân theo MLCT Độ 1 Độ 2 Độ 3a

Bệnh nhân suy thận độ 1 và độ 2 ở nhóm GK1 và nhóm đối chứng chiếm tỷ lệ rất cao lần lượt là 96,67% và 93,33% Phân bố bệnh nhân theo mức độ suy thận ở 2 nhóm khác biệt không có ý nghĩa thống kê với p > 0,05)

Bảng 3.28 Phân bố thể bệnh suy thận mạn theo y học cổ truyền

Số lượng Tỷ lệ % Số lượng Tỷ lệ %

Khí âm lưỡng hư 8 26,67 8 26,67 Âm dương lưỡng hư 2 6,67 1 3,33

*Một bệnh nhân có thể có một hoặc nhiều thể tà thực kèm theo

Với thể chính hư, ở cả 2 nhóm GK1 và nhóm đối chứng, thể tỳ thận khí hư, khí âm lưỡng hư và can thận âm hư chiếm tỷ lệ cao (trên 20%) Sự khác biệt về tỷ lệ các thể chính hư ở 2 nhóm là không có ý nghĩa thống kê với p > 0,05

Với thể tà thực, ở cả hai nhóm, tỷ lệ thể bệnh đàm thấp và huyết ứ chiếm tỷ lệ cao (trên 33,33%), thể thủy thấp chiếm tỷ lệ thấp nhất (3,33%) Sự khác biệt về các thể tà thực ở 2 nhóm không có ý nghĩa thống kê với p > 0,05

Bảng 3.29 Đặc điểm về triệu chứng thường gặp theo y học cổ truyền STT Triệu chứng Nhóm đối chứng

Số lượng Tỷ lệ % Số lượng Tỷ lệ %

9 Sắc da, móng tay nhợt 16 53,33 16 53,33

21 Chân tay l ạnh, sợ lạnh 10 33,33 7 23,33

Các triệu chứng y học cổ truyền thường gặp hai nhóm là đau lưng, mỏi lưng, mỏi gối, tiểu đêm, chân tay co rút, mệt mỏi vô lực chiếm tỷ lệ cao, trên 70% Tiếp đến là các triệu chứng chóng mặt, miệng khô, tứ chi nặng mỏi, sắc da móng tay nhợt, cơ thể tê bì chiếm trên 50% Triệu chứng buồn nôn, thủy thũng gặp với tỷ lệ thấp (6,67% và 3,33%)

Bảng 3.30 Đặc điểm về lưỡi và mạch theo y học cổ truyền Đặc điểm về lưỡi Nhóm đối chứng

Số lượng Tỷ lệ % Số lượng Tỷ lệ %

Triệu chứng về lưỡi thường gặp trong nhóm GK1 là chất lưỡi hồng chiếm tỷ lệ cao là 33,33% chất lưỡi nhợt chiếm tỷ lệ thấp là 13,33% ở nhóm GK1 và 23,33% ở nhóm đối chứng Chất lưỡi bệu, hằn răng chiếm tỷ lệ cao 53,33% ở nhóm GK1 và 46,67 % ở nhóm đối chứng Ở các nhóm nghiên cứu, rêu lưỡi vàng, dày chiếm trên 50%, rêu lưỡi nhớt ở nhóm GK1 chiếm tỷ lệ 50%, ở nhóm đối chứng chiếm 43,34%

3.3.2.1 Kết quả điều trị trên lâm sàng theo y học hiện đại

Bảng 3.31 Biến đổi mạch, huyết áp ở bệnh nhân nghiên cứu Chỉ số

(n = 30) Trước điều trị Sau điều trị Trước điều trị Sau điều trị Mạch

(lần/phút, X ± SD ) 79,20 ± 5,58 79,27 ± 4,46 78,73 ± 6,79 77,6 ± 5,36 Huyết áp tâm thu

(mmHg, X ± SD ) 126,27 ± 12,60 126,17 ± 14,64 124,73 ± 15,37 126,70 ± 12,83 Huyết áp tâm trương

*: p < 0,05 so sánh với nhóm đối chứng tại cùng thời điểm Δ : p < 0,05 so sánh với trước điều trị trong cùng nhóm

Nhận xét: Ở cả 2 nhóm GK1 và nhóm đối chứng, sau 30 ngày theo dõi và điều trị sự biến đổi các chỉ số mạch, huyết áp tâm thu, huyết áp tâm trương thay đổi không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Sự khác biệt giữa các chỉ số mạch, huyết áp tâm trương và huyết áp tâm thu tại các thời điểm ngày thứ 0 và ngày thứ 30 của thử nghiệm trong cùng một nhóm không có ý nghĩa thống kê với p > 0,05 Bảng 3.32 Ảnh hưởng của viên nang GK1 đến một số chỉ số công thức máu Chỉ số

(n = 30) Trước điều trị Sau điều trị Trước điều trị Sau điều trị Hồng cầu

*: p < 0,05 so sánh với nhóm đối chứng tại cùng thời điểm Δ : p < 0,05 so sánh với trước điều trị trong cùng nhóm

Trước điều trị, nhóm GK1 có chỉ số hồng cầu và hematocrit cao hơn nhóm đối chứng có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) Tuy nhiên, sau khi điều trị, khi so sánh giữa hai nhóm nghiên cứu và so sánh với trước điều trị thì các chỉ số công thức máu (số lượng hồng cầu, nồng độ hemoglobin, hematocrit, số lượng bạch cầu, tiểu cầu) đều không có sự thay đổi có ý nghĩa thống kê (p > 0,05).

Bảng 3.33 Ảnh hưởng của viên nang GK1 đến một số chỉ số đánh giá chức năng gan, hủy hoại tế bào gan Chỉ số

(n = 30) Trước điều trị Sau điều trị Trước điều trị Sau điều trị (U/l, AST X ± SD ) 24,40 ± 6,41 23,50 ± 6,33 27,61 ± 8,72 28,08 ± 14,70 ALT

*: p < 0,05 so sánh với nhóm đối chứng tại cùng thời điểm Δ : p < 0,05 so sánh với trước điều trị trong cùng nhóm

Trước nghiên cứu, các chỉ số AST, ALT, GGT, protein, albumin giữa hai nhóm tương đương nhau với p > 0,05

Sau nghiên cứu, chỉ số ALT ở nhóm GK1 tăng hơn so với nhóm đối chứng, tuy nhiên vẫn trong giới hạn bình thường Chỉ số Albumin máu ở cả 2 nhóm GK1 và nhóm đối chứng đều tăng hơn so với trước điều trị với p < 0,05

Bảng 3.34 Ảnh hưởng của viên nang GK1 đến chức năng thận

(n = 30) Trước điều trị Sau điều trị Trước điều trị Sau điều trị Urê

*: p < 0,05 so sánh với nhóm đối chứng tại cùng thời điểm Δ : p < 0,05 so sánh với trước điều trị trong cùng nhóm

Trước thời điểm nghiên cứu, chỉ số urê, creatinin, mức lọc cầu thận và acid uric không có sự khác biệt giữa 2 nhóm GK1 và nhóm đối chứng với p > 0,05

Sau điều trị, ở nhóm GK1 chỉ số creatinin giảm hơn, mức lọc cầu thận tăng hơn có ý nghĩa thống kê so với trước điều trị và so với nhóm đối chứng (p

< 0,05); Chỉ số acid uric máu giảm hơn so với trước điều trị (p < 0,05) Ở nhóm đối chứng, sau nghiên cứu, chỉ số creatinin cao hơn so với trước điều trị với p < 0,05, tuy nhiên mức lọc cầu thận thay đổi không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05)

Bảng 3.35 Tỷ lệ bệnh nhân cải thiện creatinin, mức lọc cầu thận

Chỉ số Nhóm đối chứng

Chỉ số Nhóm đối chứng

*: p < 0,05 so sánh với nhóm đối chứng

Sau điều trị, tỷ lệ bệnh nhân có giảm creatinin máu và tăng mức lọc cầu thận ở nhóm GK1 (đều là 80%) cao hơn nhóm đối chứng (lần lượt là 30% và 33,33%), sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,05

3.3.2.2 Kết quả điều trị suy thận mạn của viên nang GK1 theo y học cổ truyền

Bảng 3.36 Ảnh hưởng của viên nang GK1 đến các triệu chứng thường gặp theo y học cổ truyền STT Triệu chứng Trước điều trị

Số lượng Tỷ lệ % Số lượng Tỷ lệ %

9 Sắc da, móng tay nhợt 16 53,33 16 53,33 > 0,05

STT Triệu chứng Trước điều trị

Số lượng Tỷ lệ % Số lượng Tỷ lệ %

21 Chân tay lạnh, sợ lạnh 7 23,33 6 20,00 > 0,05

So sánh trước và sau điều trị của nhóm GK1, tỷ lệ bệnh nhân có các triệu chứng thường gặp theo y học cổ truyền như đau lưng, tiểu đêm, chân tay co rút, mệt mỏi vô lực, ăn kém, đau đầu, hoa mắt, đại tiện táo, ngực sườn đầy tức giảm có ý nghĩa thống kê p < 0,05

Các triệu chứng khác như mỏi lưng, miệng khô, sắc mặt ám tối, đoản khí ngại nói, miệng đắng thay đổi không có ý nghĩa thống kê với p > 0,05

Bảng 3.37 Tổng điểm triệu chứng theo y học cổ truyền Thời điểm Nhóm đối chứng

*: p < 0,05 so sánh với nhóm đối chứng tại cùng thời điểm Δ : p < 0,05 so sánh với trước điều trị trong cùng nhóm

Trước điều trị, tổng điểm triệu chứng theo y học cổ truyền của nhóm GK1 là 29,17 ± 14,83 và của nhóm đối chứng là 32,87 ± 17,49, sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê với p > 0,05

BÀN LUẬN

BÀN LUẬN VỀ CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP MỘT SỐ HOẠT CHẤT VÀ TÁC DỤNG ĐIỀU TRỊ CỦA VỊ THUỐC HẠ KHÔ THẢO NAM TRÊN MÔ HÌNH THỰC NGHIỆM SUY THẬN MẠN

4.1.1 Bàn luận về chiết xuất, phân lập một số hoạt chất

Nghiên cứu chiết xuất, phân lập một số hoạt chất trong vị thuốc Hạ khô thảo nam là việc cần thiết và quan trọng để góp phần tìm ra những hoạt chất sinh học có tiềm năng của vị thuốc trong điều trị suy thận mạn

Nghiên cứu công bố về thành phần hóa học của vị thuốc Hạ khô thảo nam (Blumea lacera (Burn.F.) DC) chủ yếu là các hoạt chất thân dầu không phân cực và các hợp chất nhóm tinh dầu của vị thuốc này [108], [109] Một số ít các nghiên cứu khác cũng có phân lập và xác định một số hợp chất nhóm flavonoid và monoterpen glycosid [110], steroidal glycoalcaloid [111], một số polyphenol như: acid rosmarinic, quercetin, và kaempferol [24] Đồng thời, các tác dụng sinh học được quan tâm ở đây gồm tác dụng chống viêm, chống oxy hoá [112], [22], hạ đường huyết, gây độc tế bào ung thư, tẩy giun [113], cải thiện loét dạ dày cấp tính và stress oxy hóa trên thực nghiệm [114], kháng khuẩn, kháng nấm, chống tiêu chảy [115], [116]

Nghiên cứu này phân lập được 4 hợp chất từ Hạ khô thảo nam gồm β- sitosterol, artemetin, campesterol, acid protocatechuic Đây là các hợp chất lần đầu tiên được phân lập từ loài này Cấu trúc phân tử của các hợp chất này đã được khẳng định qua các dữ liệu phân tích phổ thực nghiệm như 1 H-NMR, 13 C- NMR kết hợp đối chiếu so sánh với các dữ liệu phổ đã công bố Đáng chú ý, các hợp chất này đều được chứng minh là có tác dụng bảo vệ thận [117], [118], [119], [120], [121] Điều này đưa thêm bằng chứng khoa học vững chắc góp phần chứng minh rằng do chứa các phân tử hoạt chất có tác dụng bảo vệ thận nên Hạ khô thảo nam có tác dụng tốt trong bảo vệ thận Điều này góp phần minh chứng thêm cho tính khoa học và đúng đắn trong lựa chọn đối tượng nghiên cứu là bài thuốc GK1 được cấu thành từ 2 bộ phận đều có tác dụng bảo vệ thận là Hạ khô thảo nam và bài thuốc Bảo thận thang

Như vậy, các tiếp cận trong việc nghiên cứu thành phần hoá học của đề tài luận án có nhiều điểm mới: phân lập các hợp chất theo hướng tác dụng điều trị suy thận mạn để minh chứng cho việc kết hợp giữa vị thuốc Hạ khô thảo nam và bài thuốc Bảo thận thang Đồng thời, kết quả khách quan về tác dụng bảo vệ thận trên thực nghiệm và lâm sàng đã minh chứng thêm về tính đúng đắn trong cách tiếp cận này

4.1.2 Bàn luận về tác dụng điều trị của vị thuốc Hạ khô thảo nam trên mô hình thực nghiệm suy thận mạn

Mô hình suy thận mạn bằng adenine được các tác giả cứu thử nghiệm, đánh giá nhiều lần trên chuột nhắt trắng với nhiều mức liều khác nhau [78],

[79] Kết quả cho thấy adenine pha trong dầu ăn đưa thẳng vào dạ dày chuột với hàm lượng 10mg/ml dầu (chuột uống 0,1ml/10g TLCT, tương ứng liều 100mg/kg TLCT/cách ngày) trong 5 tuần gây được mô hình suy thận mạn trên thực nghiệm và đảm bảo chuột sống 100% để tiến hành nghiên cứu các thí nghiệm tiếp theo [79] Đây là cơ sở để đánh giá tác dụng điều trị của vị thuốc

Hạ khô thảo nam trên mô hình thực nghiệm suy thận mạn

4.1.2.1 Tình trạng chung, tỷ lệ sống chết của các lô chuột

Tại thời điểm trước nghiên cứu, các lô chuột sau 5 tuần gây mô hình suy thận mạn có biểu hiện chuột lông xù, bết, ăn uống kém, ít vận động Sau 3 tuần nghiên cứu, chuột suy thận mạn ở các lô dùng Hạ khô thảo nam liều 4g DL/kg TLCT/ngày và liều 8g DL/kg TLCT/ngày (lô 3 và lô 4) bắt đầu có sự phục hồi về thể lực thể hiện bằng việc chuột nhanh nhẹn trở lại, ăn khá hơn, lông đỡ xù, đỡ bết Trong khi ở lô chuột chứng bệnh (lô 2) chuột yếu dần, vận động kém, lông xù và bết (Bảng 3.5)

Phù hợp với quan sát tình trạng chung, trọng lượng cơ thể chuột trung bình của lô chuột suy thận mạn dùng Hạ khô thảo nam (lô 3 và lô 4) sau nghiên cứu đều tăng có ý nghĩa thống kê so với trước nghiên cứu (p < 0,05) và cao hơn lô chứng bệnh (lô 2) với p < 0,05 Như vậy có thể thấy, dịch chiết Hạ khô thảo nam giúp cải thiện tình trạng chung và TLCT của chuột nhắt suy thận mạn sau nghiên cứu (Bảng 3.6)

Theo số liệu Biểu đồ 3.1 cho thấy, sau 5 tuần nghiên cứu, cả 3 lô chuột gây mô hình suy thận mạn đều có chuột chết Trong đó, lô chuột suy thận mạn dùng dịch chiết Hạ khô thảo nam liều 4g DL/kg TLCT/ngày (lô 3) và liều 8g DL/kg TLCT/ngày (lô 4) tỷ lệ chuột chết thấp là 6,67% và 20% Lô chứng bệnh (lô 2), sau khi gây mô hình suy thận mạn, không dùng Hạ khô thảo nam, được nuôi dưỡng theo dõi trong 5 tuần số lượng chuột chết nhiều nhất là 8 con (chiếm 53,33%) Bên cạnh đó tình trạng chung, thể trọng các lô chuột dùng Hạ khô thảo nam cũng cải thiện tốt hơn so với lô chứng bệnh (lô 2)

Sở dĩ có chuột chết trong quá trình nghiên cứu là do suy thận mạn là sự suy giảm chức năng thận tiến triển kéo dài, diễn tiến tăng dần theo thời gian, số lượng các nephron bị xơ hóa và mất chức năng tăng dần trong quá trình tiến triển của bệnh, làm giảm mức lọc cầu thận gây ứ đọng các sản phẩm chuyển hóa và gây chết chuột Dùng adenine là phương pháp gây suy thận mạn không phẫu thuật được nghiên cứu, sử dụng phổ biến làm tiến triển suy thận mạn thông qua quá trình viêm, xơ hóa nhu mô kẽ thận

Cơ chế bệnh sinh của suy thận mạn là những tổn thương thận dẫn tới tăng quá trình phản ứng viêm, quá trình xơ hóa cầu thận từng vùng, xơ hóa ống thận và mô kẽ [32] Trong khi đó vị thuốc Hạ khô thảo nam là vị thuốc y học cổ truyền có tác dụng giải độc, tiêu viêm, tiêu u cục, sát trùng [87], từ lâu được sử dụng với vai trò thuốc kháng khuẩn, chống viêm, chống oxy hóa [115] Chính những tác dụng này làm giảm quá trình xơ hóa cầu thận, giảm quá trình tiến triển tổn thương thận ở chuột suy thận mạn trên thực nghiệm Do vậy làm tăng khả năng sống sót của chuột trong quá trình nghiên cứu

4.1.2.2 Bàn luận về biến đổi urê, creatinin huyết thanh của các lô chuột nghiên cứu

Bảng 3.7 và Bảng 3.8 cho thấy, thời điểm trước nghiên cứu, chuột nhắt được gây mô hình suy thận mạn bằng cách uống adenine với liều 100mg/kg/cách ngày qua kim đầu tù, lô chuột được gây mô hình (lô 2, lô 3 và lô 4) có chỉ số urê trung bình và creatinin trung bình cao hơn lô chứng sinh học (lô 1) có ý nghĩa thống kê với p < 0,05

Sau 5 tuần nghiên cứu, khi so sánh 3 lô chuột đã được gây mô hình suy thận mạn nồng độ urê, creatinin máu trung bình của lô dùng Hạ khô thảo nam liều 4g DL/kg TLCT/ngày và lô dùng liều 8g DL/kg TLCT/ngày (lô 3 và lô 4) lần lượt là 9,9 ± 1,1 mmol/L, 69,7 ± 7,9 àmol/L và 10,2 ± 1,2 mmol/L, 71,5 ± 8,0 àmol/L thấp hơn lụ chứng bệnh (lụ 2) là 11,6 ± 1,2 mmol/L, 92,6 ± 6,8 àmol/L với p < 0,05 So với trước nghiờn cứu, creatinin mỏu trung bỡnh của lụ dùng Hạ khô thảo nam liều 4g DL/kg TLCT/ngày (lô 3) và liều 8g DL/kg TLCT/ngày (lô 4) chỉ số creatinin máu sau điều trị giảm có ý nghĩa thống kê (p

Hạ khô thảo nam là vị thuốc có tác dụng chống oxy hóa, chống viêm ứng dụng trên lâm sàng điều trị suy thận mạn và được chứng minh tác dụng trong điều trị suy thận mạn trên thực nghiệm Kết quả nghiên cứu ở Bảng 3.7 và Bảng 3.8 chứng minh rằng ở lô 3 và lô 4 với Hạ khô thảo nam liều 4g DL/kg TLCT/ngày (tương đương liều dùng trên lâm sàng) và liều 8g DL/kg TLCT/ngày giúp cải thiện tình trạng tăng urê, creatinin máu trên chuột gây suy thận mạn bằng adenine

Hạ khô thảo nam có tác dụng kháng viêm, giảm đau và kháng khuẩn, được sử dụng trong y học cổ truyền để điều trị bệnh thận Các thành phần như acid rosmarinic, quercetin và kaempferol có đặc tính chống oxy hóa, giảm phản ứng viêm và ức chế xơ hóa thận Quercetin làm giảm xơ hóa do TGF-β trong các tế bào biểu mô ống thận, trong khi kaempferol cải thiện tình trạng viêm thận, xơ hóa và rối loạn chức năng ở chuột mắc bệnh thận do streptozotocin.

Qua nghiên cứu, 4 thành phần hóa học được tìm thấy là β-sitosterol, campesterol, artemetin và acid protocatechuic Trong đó có β-sitosterol, acid protocatechuic… có tác dụng chống oxy hóa, giảm phản ứng viêm, ức chế quá trình xơ hóa cầu thận, xơ hóa kẽ thận, cải thiện tốt tình trạng suy thận mạn trên thực nghiệm [122], [121], [123] Các nghiên cứu cho thấy β-sitosterol chống lại các chất gây độc cho thận chống oxy hóa, giảm quá trình viêm mạn tính, bảo vệ thận chuột trên mô hình Acid protocatechuic có tác chống viêm và chống oxy hóa, chống độc tính của các tác nhân gây độc lên thận chuột trên mô hình thực nghiệm như doxorubicin [119] hay của cisplatin-induced [122] Dịch chiết Hạ khô thảo nam bước đầu được chứng minh tác dụng điều trị suy thận mạn trên mô hình chuột nhắt suy thận mạn bằng profenofos (50mg/kg) đường uống [27] Các thành phần chiết phân đoạn của vị thuốc Hạ khô thảo nam giúp cải thiện chức năng thận thể hiện ở giảm các chỉ số urê và creatinin máu Điều đó phù hợp với nghiên cứu tác dụng của Hạ khô thảo nam trên mô hình chuột suy thận mạn bằng adenine của chúng tôi

4.1.2.3 Bàn luận về biến đổi một số chỉ số công thức máu của các lô chuột nghiên cứu

BÀN LUẬN VỀ KẾT QUẢ ĐỘC TÍNH CẤP VÀ ĐỘC TÍNH BÁN TRƯỜNG DIỄN CỦA VIÊN NANG GK1

Viên nang GK1 là kết quả của ứng dụng công nghệ chiết xuất từ những vị thuốc y học cổ truyền trong bài thuốc Bảo thận thang và vị thuốc Hạ khô thảo nam Bảo thận thang gồm Đại hoàng, Bồ công anh, Thổ phục linh, Long cốt nung, Mẫu lệ nung được tác giả Phạm Xuân Phong và cộng sự ứng dụng điều trị dưới dạng thụt đại tràng có tác dụng hạ urê, creatinin máu [9] Vị thuốc Hạ khô thảo nam có tác dụng chống viêm, chống oxy hóa [22], hạ creatinin, urê, acid uric ở chuột được dùng profenofos (50mg/kg) đường uống [27], có tác dụng bảo vệ các đơn vị thận toàn vẹn thông qua ngăn chặn, ức chế nguyên bào sợi fibroblasts và các cytokin gây viêm xơ trên thực nghiệm Tuy nhiên để đảm bảo an toàn cho việc thử nghiệm các giai đoạn tiếp theo trên lâm sàng, chúng tôi tiến hành nghiên cứu độc tính cấp và độc tính bán trường diễn của viên nang GK1 4.2.1 Bàn luận về kết qỉa độc tính cấp của viên nang GK1

Nghiên cứu độc tính cấp trên đối tượng chuột nhắt trắng (Bảng 3.13) cho thấy sau khi uống hỗn dịch viên nang GK1 trong thời gian 12 giờ đầu, tất cả các chuột không có biểu hiện bất thường: chuột ăn uống, vận động bình thường, lông mượt, niêm mạc hồng hào, mắt sáng, phân khô Lô chuột uống hỗn dịch GK1 liều 10g/kg TLCT/ngày sau 12h uống thuốc ở một số chuột phân nát trong

3 ngày đầu, sau đó phân mềm, khô Lô chuột uống uống hỗn dịch GK1 liều 40g/kg TLCT/ngày đến 50g/kg TLCT/ngày sau 12h uống thuốc trong 3 ngày đầu phân lỏng, sau đó chuột đi phân mềm, khô Triệu chứng này có thể do trong thành phần viên nang GK1 có chứa các dẫn chất anthranoid của Đại hoàng có tác dụng nhuận tẩy lên đại tràng, làm giảm sự tái hấp thu nước bằng cách làm tăng tiết dịch và tăng nhu động ruột sau khi uống từ 12 giờ Emodin có trong Đại hoàng có tác dụng tăng nhu động ruột làm nhuận tràng [124], [125] Sau 3 ngày dùng thuốc phân chuột trở lại bình thường do sự tích hợp chất tanin có trong Đại hoàng Tùy vào liều sử dụng mà tác dụng gây nhuận tràng và gây xổ ở các lô chuột khác nhau

Sau khi dùng hỗn dịch viên nang GK1 đến mức liều cao nhất có thể cho chuột nhắt uống 50g/kg TLCT/ngày (tối đa cho chuột uống 0,25ml hỗn dịch đặc/10g trọng lượng cơ thể x 3 lần/ngày), gấp 83,3 lần liều dùng tương đương trên lâm sàng Đây cũng là hỗn dịch đặc nhất còn có thể qua kim cho chuột nhắt uống và đây cũng là lượng thuốc lớn nhất mà chuột có thể uống được trong ngày Ngoài triệu chứng đại tiện nát, lỏng 3 ngày đầu, tất cả các chuột không có thêm biểu hiện bất thường khác khi uống thuốc Chất gây đại tiện phân nát và lỏng trên chuột nhắt của Đại hoàng là anthranoid với tác dụng chủ yếu gây tăng nhu động đoạn giữa và cuối đại trường, nhưng không trở ngại cho việc hấp thu chất dinh dưỡng của tiểu trường Do vậy chuột vẫn ăn uống và vận động bình thường [124], [125] Liều 50g/kg là liều cao nhất có thể cho chuột uống nhưng không có chuột chết trong vòng 72 giờ, vì vậy chưa xác định được LD50 trên chuột nhắt trắng theo đường uống Theo hướng dẫn của WHO, viên nang GK1 được sử dụng với liều dùng trên lâm sàng là an toàn

4.2.2 Bàn luận về kết quả độc tính bán trường diễn của viên nang GK1

Theo quy định của Bộ Y tế và của WHO, thời gian nghiên cứu độc tính bán trường diễn của thuốc tối thiểu gấp đôi thời gian dùng trên lâm sàng [99],

[98] Viên nang GK1 được chỉ định dùng trên lâm sàng 30 ngày, nghiên cứu theo dõi độc tính bán trường diễn trong 60 ngày: Để xác định liều dùng của thuốc trên động vật thực nghiệm, chúng tôi dựa vào nguyên tắc ngoại suy liều với hệ số ngoại suy trên thỏ trắng là 3 Như vậy với liều dùng trên lâm sàng 6 viên nang GK1 hàm lượng 500mg (tương đương 3g viên nang/kg/ngày và là 0,05g cao/kg người/ngày), liều ngoại suy trên thỏ trắng sẽ là 0,15g/kg/ngày

Trong nghiên cứu độc tính bán trường diễn, thỏ được chia thành 3 lô, mỗi lô 10 con, mỗi con nhốt riêng 1 chuồng Ở lô chứng, thỏ được uống nước cất 2ml/ngày Lô trị 1, thỏ uống chế phẩm GK1 liều 0,15g/kg/ngày (liều tương đương liều dùng trên lâm sàng) Lô trị 2, thỏ uống chế phẩm GK1 liều 0,45g/kg/ngày (gấp 3 liều dùng tương đương trên lâm sàng) Thỏ được theo dõi trong 60 ngày liên tục và được đánh giá tình trạng chung, thể trọng, chỉ số huyết học và sinh hóa máu trước thí nghiệm, sau 30 ngày, 60 ngày, nhằm dự đoán ảnh hưởng của thuốc tới cơ thể và khả năng gây độc tới cơ quan tạo máu, hủy hoại tế bào gan, chức năng thận

* Ảnh hưởng viên nang GK1 tới tình trạng chung và thể trọng của thỏ Bảng 3.14 cho thấy, tình trạng chung của thỏ ở tất cả các lô sau 30 ngày và 60 ngày đều bình thường Trọng lượng thỏ ở cả 3 lô sau 60 ngày đều tăng so với trước khi nghiên cứu (p < 005), sự gia tăng trọng lượng không có sự khác biệt giữa các lô trị 1, lô trị 2 so với lô chứng (p > 0,05) Viên nang GK1 không làm ảnh hưởng tới tình trạng chung và thể trọng thỏ

* Ảnh hưởng của viên nang GK1 tới cơ quan tạo máu Đánh giá ảnh hưởng của thuốc tới cơ quan tạo máu thực sự quan trọng do đây là những tế bào có khả năng nhiễm độc tính sớm nhất do sự nhân lên nhanh chóng của chúng trong cơ thể

Các kết quả từ Bảng 3.15 đến Bảng 3.19 đến cho thấy số lượng hồng cầu, nồng độ huyết sắc tố, hematocrit, số lượng bạch cầu, tiểu cầu ở lô thỏ uống viên nang GK1 liều 0,15g/kg TLCT và liều 0,45g/kg TLCT, sau 60 ngày thay đổi không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) và không thấy có sự khác biệt với lô chứng (p > 0,05) Như vậy, viên nang GK1 không ảnh hưởng đến chức năng tạo máu của thỏ trắng

* Ảnh hưởng của viên nang GK1 tới sự hủy hoại tế bào gan

Gan với hệ thống các enzym chuyển hóa phong phú, đóng vai trò quan trọng trong cơ thể Khi đánh giá độc tính của thuốc, việc theo dõi ảnh hưởng của thuốc tới nồng độ các enzym của gan là cần thiết Để đánh giá mức độ tổn thương của tế bào gan, cần định lượng nồng độ các enzym có nguồn gốc tại gan trong máu ALT và AST là hai enzym có nhiều trong bào tương, ty thể của tế bào gan Khi tổn thương, tế bào gan giải phóng enzym vào trong huyết thanh, do vậy nồng độ ALT, AST tăng cao Ở Bảng 3.20 và Bảng 3.21, nồng độ ALT, AST trong máu thỏ ở 2 lô uống viên nang GK1 liều 0,15g/kg TLCT và liều 0,45g/kg TLCT, sau 30 ngày, sau 60 ngày cho thấy không có sự khác biệt so với trước khi uống thuốc và so với lô chứng (p > 0,05) Như vậy, viên nang GK1 an toàn khi sử dụng liều 0,15g/kg TLCT và liều 0,45g/kg TLCT trong thời gian dài

* Ảnh hưởng của viên nang GK1 tới chức năng thận

Thận đóng vai trò là cơ quan bài tiết của cơ thể Xét nghiệm đánh giá chức năng thận thường sử dụng là định lượng creatinin và urê máu Tuy nhiên, xét nghiệm creatinin hiện phổ biến hơn do kết quả urê dễ bị ảnh hưởng bởi chế độ ăn uống của bệnh nhân.

Kết quả ở Bảng 3.22 cho thấy, sau 30 ngày và 60 ngày uống viên nang GK1, nồng độ creatinin trong máu thỏ ở 2 lô trị 1 và lô trị 2 với liều 0,15g/kg TLCT và liều 0,45g/kg TLCT, thay đổi không có ý nghĩa thống kê so với lô chứng và so với trước khi uống thuốc thử Như vậy, viên nang GK1 không ảnh hưởng tới chức năng thận Điều này phù hợp với kết quả của các nghiên cứu chứng minh vị thuốc Đại hoàng, Thổ phục linh, Hạ khô thảo nam có tác dụng bảo vệ thận, giảm urê, creatinin máu trên thực nghiệm và lâm sàng

* Ảnh hưởng của viên nang GK1 đến cấu trúc đại thể và vi thể của gan, thận

Kết quả giải phẫu đại thể và vi thể gan, thận cung cấp những luận cứ để đánh giá tổn thương của gan, thận Theo hướng dẫn của WHO, đây là bước bắt buộc khi đánh giá độc tính bán trường diễn của thuốc

Kết quả giải phẫu đại thể thỏ trắng ở tất cả các lô trong nghiên cứu cho thấy, không có sự thay đổi bệnh lý về mặt đại thể của các cơ quan gan, lách, thận