phát triển một số kỹ thuật hiển vi huỳnh quang soi nổi để phân tích mẫu y sinh học

Từ thế kỷ XVI đến nay, các nhà khoa học đã phát minh ra nhiều loại kính hiển vi khác nhau có độ phóng đại và độ phân giải cao, những thiết bị này có thể dùng để quan sát những vật thể nh

TỔNG QUAN

Lịch sử phát triển của kính hiển vi

Kính hiển vi là một loại kính được thiết kế đặc biệt để phục vụ cho mục đích khoa học, vi sinh học Tùy thuộc vào loại kính hiển vi, Dùng để tăng cường khả năng quan sát các đối tượng, vật thể có kích thước nhỏ bé mà so với mắt thường không thể quan sát được bằng cách tạo các hình ảnh phóng đại của vật thể đó độ phóng đại mẫu vật có thể gấp bình thường lên từ 40-3000 lần Kỹ thuật quan sát và ghi nhận hình ảnh bằng các kính hiển vi được gọi là kỹ thuật hiển vi (microscopy) [1] Đầu thế kỷ 14, ở Italy đã có sự phát triển về nghề mài kính thuỷ tinh, kính mắt Kính hiển vi ban đầu được phát minh vào những năm 1950 ở Middelburg, Hà Lan Zacharias Jansen (1580 – 1638), quốc tịch Hà Lan Ông là một người thợ mài kính, kính lúp và kính đeo mắt đã rất phổ biến vào khoảng thời gian này Sau này ông là một nhà hiển vi, nhà quang học tạo ra kính hiển vi quang học đầu tiên (1595) có thể phóng đại một vật lên gần 9 lần (Hình 1.1) [2]

Cuối thế kỷ XVI, Antony van Leeuwenhoek (1632 -1732) người Hà Lan đã phát hiện ra việc sử dụng thấu kính có thể làm tăng kích thước của hình ảnh và từ đó ông đã bắt đầu đánh bóng và mài thấu kính Ông được coi là cha đẻ của ngành khoa học hiển vi Thấu kính hiển vi mà ông nghĩ ra có thể phóng to hình ảnh vật thể lên rất nhiều lần (~300 lần).[2]

Hình 1.1 Kính hiển vi đầu tiên (1595)

Copies for internal use only in Phenikaa University

Hình 1.2 Kính hiển vi do Antony van Leeuwenhoek phát minh (1668)

Chất lượng thấu kính này có thể nhìn được một số loài vi khuẩn siêu nhỏ, các loài động vật cực nhỏ và các chi tiết phúc tạp của các vật thể thông thường khác, Leeuwenhoek được cho là người đầu tiên đã phát hiện ra vi khuẩn và sinh vật nguyên sinh Từ đó, Leeuwenhoek được coi là nhà vi sinh vật học đầu tiên và cũng được coi là người đã sáng lập và nghiên cứu ra kính hiển vi và đã góp phần vào việc phát triển lý thuyết về tế bào [2] Sau đó ông đã gửi thư cho Viện Hoàng Gia Anh mô tả những gì đã nhìn thấy trong thế giới cực nhỏ nhờ quan sát qua kính hiển vi Viện Hoàng Gia đã giao trách nhiệm kiểm chứng những khám phá của Antony van Leeuwenhoek cho Robert Hooke (1635 – 1703), ông là một nhà vật lý, toán học, và một nhà phát minh người Anh Năm 1665 ông đã chế tạo một loại kính rất hữu dụng là hiển vi kép và đã thực hiện hơn 60 công cuộc khảo sát bằng kính hiển vi này, gồm cả sự khám phá ra tế bào thực vật (Hình 1.3) Như vậy Robert Hooke là người đã phổ biến cách chế tạo và cách sử dụng kính hiển vi, ông là “Cha đẻ của khoa học hiển vi người Anh” [3]

Ban đầu, việc sử dụng kính hiển vi rất khó khăn Ánh sáng bị khúc xạ đi qua thấu kính và làm thay đổi hình ảnh Năm 1729, thấu kính tiêu sắc được phát triển để sử dụng trong kính đeo mắt bởi Chester Moore Hall, chất lượng hình ảnh của kính hiển vi cũng được phát triển lên [4] Đến năm 1774, Benjamin Martin ở London đã cho ra đời một bộ thấu kính có thể điều chỉnh màu sắc cho kính hiển vi

Copies for internal use only in Phenikaa University

Hình 1.3 Các phiên bản kính hiển vi thời xưa

Vào đầu thế kỷ 19, Joseph von Fraunhofer đã giảm thiểu được quang sai của ảnh nhờ những cải tiến chất lượng của các loại vật liệu thuỷ tinh dùng để chế tạo kính hiển vi quang học Giữa thế kỷ 19, Giovanni Amici đã phát triển thêm các vật kính ngâm dầu và ngâm nước Đến năm 1873, Ernst Abbe đã đặt nền móng cho sự phát triển và sản xuất kính hiển vi về sau Ông cũng là người đã phát minh ra một hệ thống thấu kính apochromatic, thấu kính này thậm chí còn có khả năng chỉnh màu tốt hơn thấu kính vô sắc Được sản xuất vào cuối thế kỷ 19, kính hiển vi sử dụng ánh sáng đã đạt được hiệu quả cao của kính hiển vi quang học.[4]

Năm 1903, Richard Zsigmondy (1865 -1929), Áo – Hung, đã chế tạo ra siêu kính hiển vi có thể quan sát được vật nhỏ hơn bước sóng ánh sáng (Hình 1.4) Ông đã đạt giải Nobel hoá học năm 1929.[4]

Năm 1932, Frits Zernike (1888 – 1966), Hà Lan, đã phát minh ra kính phản pha

Năm 1933, Ernst Ruska (1906 – 1988), ông là người đầu tiên phát minh ra kính hiển vi điện tử

Copies for internal use only in Phenikaa University

Hình 1.4 Siêu kính hiển vi (1903)

Hình 1.5 Kính hiển vi điện tử do Ernst Ruska làm năm 1933

Marvin Minsky đã phát minh ra kính hiển vi đồng tụ vào năm 1957 – 1961 (Hình 1.6).[5]

Copies for internal use only in Phenikaa University

Hình 1.6 Kính hiển vi đồng tụ

Năm 1981, Gerd Binnig, Heinrich Rohrer đã đồng phát minh ra kính chui hầm

Thế kỷ 20, đã khám phá và cho ra đời rất nhiều các loại kính hiển vi hiện đại Kính hiển vi đã được phát triển mạnh mẽ với sự xuất hiện của kính hiển vi điện tử, kính hiển vi quét đầu dò, kính hiển vi huỳnh quang Các kỹ thuật và kính hiển vi này đã mở ra cánh cửa cho việc quan sát các cấu trúc vô cùng nhỏ và phức tạp, từ nguyên tử cho đến các tế bào và mô

Những bước phát triển từ kính hiển vi từ đơn giản cho đến sự phát triển của các loại kính hiển vi hiện đại, tiên tiến góp phần lớn cho những nhà nghiên cứu khoa học mang lại tính chính xác cao.[5]

Phân loại kính hiển vi

Những thế kỷ gần đây, khoa học và công nghệ phát triển mạnh mẽ, nhiều loại kính hiển vi mới được ra đời với nhiều tính năng khác nhau Một số loại kính hiển vi có thể được nói đến như sau: Kính hiển vi quét đầu dò (kính hiển vi lực nguyên tử - AFM, kính hiển vi quét chui hầm – STM ), kính hiển vi quang học (kính hiển vi ánh sáng truyền qua, kính hiển vi phản pha, kính hiển vi phân cực, kính hiển vi soi ngược, kính hiển vi huỳnh quang, kính hiển vi đồng tụ, ), kính hiển vi điện tử ( kính hiển vi điện tử truyền qua – TEM, kính hiển vi điện tử quét - SEM)

Kính hiển vi quét đầu dò (Scanning probe microscopy – SPM): Grend Binnig và Heinrich Rohrer đã phát minh ra nhóm kính hiển vi này vào năm 1981 (về kính hiển vi quét chui hầm) và đã dành giải thưởng Nobel Vật lý năm 1986 cho phát

Copies for internal use only in Phenikaa University minh này Kính hiển vi quét đầu dò là một công nghệ quan trọng trong việc quan sát và nghiên cứu các mẫu ở mức độ nano (Hình 1.7) SPM hoạt động bằng cách sử dụng đầu dò cảm biến rất nhỏ quét trên bề mặt của mẫu Đầu dò này thường được làm từ vật liệu như silic, có đầu nhọn và có thể tạo ra hình ảnh với độ chính xác cực cao [6] Ưu điểm: Hiện tượng nhiễu xạ không ảnh hưởng tới độ phân giải của kính, tuy nhiên bị giới hạn bởi kích thước giữa sự tương tác giữa mẫu và đầu dò, có thể nhỏ tới cấp picomet ( 10 !"# m) Kỹ thuật khắc nano – nanolithography, tương tác giữa mẫu và mũi dò được sử dụng để làm công cụ thao tác trên bề mặt, nhằm tạo ra các chi tiết nhỏ trong công nghệ nano [6]

Nhược điểm: Quá trình quét đòi hỏi thời gian lớn nên quá trình ghi ảnh thường rất chậm Kích thước ảnh không lớn và chỉ cho ảnh vi cấu trúc bề mặt [6]

Hình 1.7 Kính hiển vi quét đầu dò

Copies for internal use only in Phenikaa University

Hình 1.8 Kính hiển vi quang học

Kính hiển vi quang học (Optical Microscope): là một loại kính hiển vi sử dụng ánh sáng khả kiến để quan sát hình ảnh các vật thể nhỏ được phóng đại nhờ một hệ thống các thấu kính thuỷ tinh (Hình 1.8) Đây là loại kính hiển vi đơn giản, lâu đời, và phổ biến nhất Kính hiển vi quang học hoạt động hoàn toàn dựa trên nguyên tắc khúc xạ ánh sáng qua hệ các thấu kính thuỷ tinh [6]

Kính hiển vi điện tử (Electron Microscope): kính hiển vi điện tử có độ phóng đại và độ phân giải cao hơn nhiều so với kính hiển vi quang học Kính hiển vi điện tử hoạt động dựa trên việc sử dụng chùm điện tử (chùm các electron) hẹp quét trên bề mặt mẫu Có hai loại chính của kính hiển vi điện tử là:

Kính hiển vi điện tử quét (Scanning Electron Microscope – SEM): Sử dụng electron để tạo ra hình ảnh của bề mặt mẫu Khi electron chạm vào bề mặt mẫu, các tia phản xạ được thu thập và biểu diễn dưới dạng hình ảnh, tạo ra hình ảnh có độ phân giải cao về bề mặt của mẫu

Kính hiển vi điện tử quét có thao tác đơn giản, không cần phá huỷ mẫu, dễ sử dụng và có giá thành thấp hơn so với kính hiển vi điện tử truyền qua.[6]

Kính hiển vi điện tử truyền qua (Transmission Electron Microcopy- TEM):

Sử dụng electron để tạo ra hình ảnh có cấu trúc nội bộ của mẫu Electron được điều chỉnh và chiếu qua mẫu, các electron này sau đó được thu thập thông qua mẫu để

Copies for internal use only in Phenikaa University tạo ra hình ảnh về cấu trúc nội bộ với độ phân giải cực cao TEM được sử dụng rộng rãi trong vật lý chất rắn, công nghệ nano, sinh học, y học, khoa học vật liệu,…

TEM có nhiều điểm mạnh: có thể tạo ra ảnh cấu trúc vật rắn với độ phân giải và độ tương phản cao, cho hình ảnh thật của các cấu trúc bên trong vật rắn do đó đem lại nhiều thông tin hơn, dễ dàng tạo ra hình ảnh ở cấp độ nguyên tử.[6]

Tuy nhiên, TEM có giá thành cao, sự ổn định về điện, điều kiện làm việc cao, nhiều phép xử lý mẫu phức tạp cần phải phá huỷ mẫu Việc điều khiển TEM phức tạp và cần thực hiện các bước với độ chính xác cao

Hình 1.9 Kính hiển vi điện tử quét -

SEM Hình 1.10 Kính hiển vi điện tử truyền qua -TEM

Copies for internal use only in Phenikaa University

Kính hiển vi huỳnh quang soi nổi

Kính hiển vi soi nổi là một loại kính hiển vi quang học Là loại kính hiển vi quang học sử dụng ánh sáng huỳnh quang và lân quang để tạo ra hình ảnh của các vật thể nhỏ Nguyên lý hoạt động của nó dựa trên việc sử dụng ánh sáng khả kiến để chiếu qua mẫu vật và sau đó tiếp tục qua một hệ thống quang học (ống kính) để tạo ra hình ảnh được phóng đại trên một trục quang học

1.3.2 Kính hiển vi huỳnh quang soi nổi

Kính hiển vi huỳnh quang soi nổi là một thiết bị hiển vi dùng tín hiệu huỳnh quang phản xạ và hấp thụ để thực hiện nghiên cứu các phân tử cụ thể trong mẫu y sinh học

Nguyên lý hoạt động của kính hiển vi huỳnh quang soi nổi:

Nguyên lý hoạt động của kính dựa trên khả năng của các mẫu phát quang (huỳnh quang) khi được kích thích bởi ánh sáng có bước sóng ngắn, thường là ánh sáng tia cực tím (UV)

- Ánh sáng kích thích: Mẫu nghiên cứu được chiều nguồn ánh sáng tia cực tím (UV), có bước sóng ngắn hơn so với bước sóng của ánh sáng thông thường Bằng cách sử dụng ánh sáng kích thích

- Hiện tượng phát quang: Các phân tử trong mẫu hấp thụ ánh sáng tia cực tím và sau đó phát quang ở một bước sóng dài hơn, thường là ánh sáng có màu sắc khác nhau Hiện tượng này được gọi là phát quang

- Kính hiển vi huỳnh quang soi nổi thu nhận ánh sáng phát quang từ mẫu và tạo ra hình ảnh, cho phép người quan sát có thể quan sát mẫu qua thị kính hoặc qua camera

Thêm chức năng huỳnh quang vào kính hiển vi soi nổi:

NIGHTSEA %& là một công ty được hình thành nhờ sự yêu thích, đam mê quan sát và chụp ảnh các huỳnh quang tự nhiên ở dứoi nước Các protein huỳnh quang được sử dụng rộng rãi trong công nghệ sinh học cùng họ tạo ra huỳnh quang trong san hô và hải quỳ, nên NIGHTSEA %& phân nhánh thành cung cấp thiết bị cho phòng thí nghiệm là điều hiển nhiên Hệ thống bộ điều hợp huỳnh quang hiển vi

Copies for internal use only in Phenikaa University soi nổi (SFA) mới được mô tả ở đây là một bổ sung gần đây cho dòng thiết bị của công ty

Sau khi nghiên cứu họ cho rằng san hô con là động lực ban đầu để tiến hành phát triển phương pháp thêm huỳnh quang vào kính hiển vi soi nổi với mức chi phí thấp Hầu hết, san hô đều chứa các protein huỳnh quang, với việc sử dụng ánh sáng thích hợp vào ban đêm có thể giúp nhận diện được ngay cả những mẫu vật nhỏ nhất [7]

Trong quá trình nghiên cứu, Tiến sĩ Alina Szmant của Đại học Carolina- Wilmington đã cho rằng việc thêm huỳnh quang vào kính hiển vi soi nổi thật sự đem lại hiệu quả

Với ánh sáng trắng khi chiếu vào san hô, rất khó thể nhìn thấy độ tương phản, tuy nhiên khi thêm huỳnh quang, việc nhận diện trở nên dễ dàng hơn.[7]

Hình 1.11 San hô khi được chiếu ánh sáng trắng

Hình 1.12 San hô dưới khi được xem trong huỳnh quang với sự kích thích của màu xanh

Copies for internal use only in Phenikaa University

Với kỹ thuật hiển vi huỳnh quang soi nổi sẽ kết hợp với phương pháp miễn dịch huỳnh quang để nhận diện các phân tử cụ thể và việc sử dụng đèn huỳnh quang để tạo ra hình ảnh.[7]

Mẫu sinh học được tiếp xúc với các kháng thể chuyên chế (antibodies) hoặc dấu huỳnh quang (fluorophores) có khả năng gắn kết chọn lọc với các phân tử cụ thể mà chúng muốn xác định

Kính hiển vi huỳnh quang soi nổi hoạt động dựa trên nguyên lý sử dụng ánh sáng có bước sóng ngắn, và năng lượng cao để kích thích điện tử nội tại trong các phân tử của mẫu nhảy lên quỹ đạo cao hơn Khi những điện tử này quay lại quỹ đạo cũ (có mức năng lượng ban đầu trước khi bị kích thích), chúng phát ra một ánh sáng với bước sóng dài hơn và năng lượng thấp hơn (thường nằm trong phổ ánh sáng có thể nhìn thấy) để tạo nên hình ảnh huỳnh quang Ánh sáng phát ra từ các dấu huỳnh quang sẽ được thu thập thông qua hệ thống quang học trong kính hiển vi và sau đó được chuyển thành hình ảnh trên màn hình hoặc ghi lại bằng máy ảnh Các đặc điểm của dấu huỳnh quang sẽ tạo ra hình ảnh với độ sáng và màu sắc khác nhau, tùy thuộc vào loại dấu hiệu và các thông số kỹ thuật của hệ thống quang học.

Phát huỳnh quang và kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang

Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang (Immunofluorescence – IF) là một phương pháp sinh học phân tử phổ biến, được dùng để xác định, quan sát và hình dung các phân tử cụ thể trong mẫu y sinh học, như tế bào hoặc mô Với nguyên lý chung là phản ứng kháng nguyên và kháng thể kết hợp với sự phát màu huỳnh quang ở bước sóng thích hợp Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang có thể sử dụng nhiều loại mẫu khác nhau Kỹ thuật này có thể sử dụng trên các tế bào và nuôi cấy tế bào, các mẫu mô hoặc toàn bộ sinh vật Các mảnh sinh thiết được sử dụng trong IF không nên cố định bằng bất kỳ loại hoá chất nào Để mảnh sinh thiết tươi không bị khô, nên gói bệnh phẩm trong gạc tẩm ướt bằng nước muối 0,9‰ và để vào Nitơ lỏng sớm

Nếu trong trường hợp không có Nito lỏng, mảnh sinh thiết có thể dùng trong nghiên cứu IF nếu được đông lạnh nhanh hoặc được giữ trong môi trường vận

Copies for internal use only in Phenikaa University chuyển Michel ở nhiệt độ 4°C và vận chuyển đến phòng thí nghiệm tối đa 72 giờ.[8]

Cách làm đông lạnh nhanh:

- Đông lạnh trong nito lỏng: để mẫu bệnh phẩm trong ống sạch, khô, có thể sử dụng ống nhựa, ống tráng nhôm hoặc để trong nang gelatin trước khi cho vào nito lỏng [8]

- Phương pháp khác có thể sử dụng để làm đông lạnh mẫu bệnh phẩm là vùi bệnh phẩm vào chất vùi có tên là OCT làm đông lạnh và giữ bệnh phẩm ở nhiệt độ −70 ° 𝐶 cho tới khi đem ra làm phản ứng.[8]

Môi trường vận chuyển bệnh phẩm: cần để bệnh phẩm trong dung dịch cố định Michel, dung dịch này cho phép vận chuyển bệnh phẩm dễ dàng trong điều kiện nhiệt độ bình thường Môi trường này tránh cho các mảnh mô không bị thoái hoá, không gây ức chế các men của phản ứng miễn dịch Khi lấy mẫu bệnh phẩm ra khỏi môi trường Michel, cần rửa trong môi trường Buffer (PBS) trong 30 phút và làm đông lạnh giữ trong ở nhiệt độ −70 ° 𝐶 cho tới khi đem ra làm phản ứng.[8]

Cố định mẫu là bước đầu tiên thiết yếu trong quá trình thực hiện kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang, để đảm bảo hình thái, ngăn ngừa sự phân huỷ, thối rữa mà vẫn duy trì tính của kháng nguyên Phương pháp cố định là phương pháp lý tưởng để cố định các kháng nguyên đích mà không làm thay đổi cấu trúc của tế bào để cho phép các kháng thể có thể kết hợp với bất kỳ các thành phần của tế bào mục tiêu nào Có thể sử dụng một chất cố định nhất định để có thể đảm bảo đầy đủ khả năng phản ứng miễn dịch của một yếu tố quyết định kháng nguyên Vì không có cố định chung cho mọi kháng nguyên, các phương pháp cố định và cố định tối ưu có thể được xác định dựa trên loại kháng nguyên đó và mẫu được sử dụng trong phản ứng Các chất cố định hoá học dùng trong cố định mẫu bao gồm thuốc thử liên kết chéo và các dung môi hữu cơ Thuốc thử liên kết chéo liên kết với các tế bào và mô bằng các cách tạo các liên kết chéo methylene giữa các phân tử Các dung môi hữu cơ (phổ biến là methanol và acetone) loại bỏ lipit, làm biến tính và kết tủa các thành phần tế bào [8]

Sau khi cố định, các mẫu bệnh phẩm được nhúng vào parafin để đông đặc mẫu và có thể cắt lát Các lát mỏng cho phép nhuộm huỳnh quang và các kháng thể có

Copies for internal use only in Phenikaa University thể tiếp cận mà không bị cản trở bởi các lớp tế bào Mẫu sau khi được nhúng parafin có thể bảo quản ở nhiệt độ phòng, tuy nhiên cần phải giữ trong bóng tối và có độ ẩm thích hợp Các mẫu này có thể coi là vật truyền nhiễm, vì thế khi thực hiện các phản ứng cần phải đảm bảo an toàn, sử dụng các thiết bị bảo hộ cá nhân khi xử lý và làm việc với mẫu Tuy nhiên, một phần parafin đã được cắt cần phải được khử trùng và bù nước để chỉ còn lại phần mô trên slide cho các quy trình thu hồi kháng nguyên và IF tiếp theo Môi trường phổ biến nhất để khử parafin là xylene, sau đó rửa qua ethanol và sử dụng nước cất để bù nước [8]

Việc thực hiện thu hồi kháng nguyên là cần thiết Các mô đã được bảo quản bằng hợp chất có tính phản ứng cao, chứa nhiều các chất hoá học có thể làm giảm khả năng phát hiện protein trong các quy trình y sinh như miễn dịch huỳnh quang

Có hai phương pháp thực hiện thu hồi kháng nguyên chính là: Thu hồi epitope do nhiệt (HIER) và thu hồi epitope do protease gây ra (PIER).[8]

- Thu hồi epitope do nhiệt (HIER): nhiệt và áp suất được sử dụng trong việc thu hồi kháng nguyên để làm thay đổi cấu trúc của mẫu, giúp mở ra và tái tổ chức epitope Quá trình này có thể được thực hiện bằng cách sử dụng nhiệt độ cao trong điều kiện kháng thể (antibody) không thể nhận diện epitope một cách hiệu quả

Có một số cách tiến hành HIER, phổ biến nhất là dùng nhiệt độ cao (thường là khoảng 95-100°C) kết hợp với các dung môi và các chất phục hồi sinh học như citrate, EDTA (Ethylene Diamine Tetraacetic Acid), hoặc urea

Quá trình này có thể được thực hiện thông qua việc đặt mẫu vào dung dịch phục hồi hoặc sử dụng các thiệt bị như lò vi sóng hoặc lò nhiệt

- Thu hồi epitope do protease gây ra (PIER): là một phương pháp sử dụng enzym protease để khôi phục epitope trên mẫu sinh học trong quá trình chuẩn bị cho kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang (IF) Protease là một loại enzyme có khả năng phá hủy các liên kết peptide trong các protein Khi mẫu được xử lý bằng protease, các phản ứng hydrolysis có thể xảy ra, làm giảm hoặc thay đổi cấu trúc của protein, kể cả epitope Quá trình này giúp mở ra và tái tổ chức epitope, làm cho nó trở nên dễ dàng hơn để kháng thể có thể nhận diện và gắn kết.Cách tiến hành PIER thường bao gồm việc tiếp xúc

Copies for internal use only in Phenikaa University mẫu với một enzyme protease như trypsin, proteinase K, hoặc trypsin-like enzyme trong điều kiện thích hợp Thời gian và nồng độ enzyme được điều chỉnh để đảm bảo việc khôi phục epitope mà không gây tổn thương quá mức đối với cấu trúc của mẫu.PIER giúp tăng cường khả năng nhận diện của kháng thể và cải thiện hiệu suất của kỹ thuật IF hoặc IHC bằng cách làm cho epitope trở nên dễ dàng hơn để gắn kết Tuy nhiên, việc sử dụng enzyme protease cần được kiểm soát cẩn thận để tránh tác động quá mạnh lên mẫu, có thể gây tổn thương đến các cấu trúc sinh học quan trọng khác.[8]

IF cho phép độ nhạy và khuếch đại tín hiệu cao so với hoá mô miễn dịch và có thể sử dụng trên nhiều loại kính hiển vi khác nhau Có hai phương pháp miễn dịch huỳnh quang: phương pháp trực tiếp (phương pháp chính) và gián tiếp (phương pháp phụ)

Việc sử dụng các phương pháp tuỳ thuộc đối tượng kháng thể được dùng và tuỳ thuộc vào phạm vi thí nghiệm

Ứng dụng của kỹ thuật hiển vi huỳnh quang soi nổi trong y sinh

Kính hiển vi huỳnh quang soi nổi có rất nhiều ứng dụng trong y sinh học

Kính hiển vi huỳnh quang soi nổi có thể xác định các mầm bệnh, xác định các cấu trúc phân tử có trong tế bào Ứng dụng quan trọng trong kỹ thuật hiển vi huỳnh quang là miễn dịch huỳnh quang, được sử dụng để xác định một số vi khuẩn hay mẫu bệnh phẩm nhất định Kỹ thuật này có hai phương pháp: phương pháp miễn dịch huỳnh quang trực tiếp (DIF) và phương pháp miễn dịch huỳnh quang gián tiếp (IIF) Trong DIF, các kháng thể đặc hiệu có thể được nhuộm huỳnh quang bằng fluorochrome Sau khi quan sát mẫu bệnh phẩm dưới kính hiển vi huỳnh quang có thể quan sát các kháng thể liên kết với các mẫu bệnh phẩm Trong IIF, các kháng thể thứ cấp được nhuộm bằng fluorochrome Các kháng thể thứ cấp không gắn trực tiếp vào sinh vật mà liên kết với các kháng thể chính Khi các kháng thể sơ cấp không nhuộm liên kết với mầm bệnh, các kháng thể thứ cấp huỳnh quang có thể được quan sát liên kết với các kháng thể chính Do đó, các kháng thể thứ cấp được gắn gián tiếp vào mầm bệnh Vì nhiều kháng thể thứ cấp thường có thể gắn vào kháng thể chính, IIF làm tăng số lượng kháng thể huỳnh quang gắn vào mẫu vật, giúp dễ dàng hình dung các đặc điểm của nó

Với kính hiển vi huỳnh quang soi nổi tín hiệu huỳnh quang luôn luôn được phát sáng Công nghệ TripleBeam của kính hiển vi huỳnh quang soi nổi Leica đem lại tín hiệu huỳnh quang trên mẫu bệnh phẩm một cách rõ ràng, sắc nét trên nền đen mà không bị ảnh hưởng bởi các yếu tố khác bên ngoài

Copies for internal use only in Phenikaa University

Hình ảnh 3D có các chi tiết rõ ràng và tốt nhất, công nghệ FusionOptics của Leica khắc phục những hạn chế về quang học Cung cấp hình ảnh có độ phân giải cao, do đó có thể cảm nhận hình ảnh với sự phong phú vượt trội về chi tiết và độ phân giải ảnh Hình ảnh 3D: Hệ thống quan sát lập thể cung cấp chế độ xem 3D của mẫu, cho phép các nhà nghiên cứu hình dung cấu trúc và thành phần của mẫu theo ba chiều

Hình ảnh có độ phân giải cao: Độ phóng đại và độ phân giải cao của kính hiển vi soi nổi cho phép chụp ảnh mẫu chi tiết và chính xác

Tính linh hoạt: Kính hiển vi soi nổi huỳnh quang epi có thể được sử dụng với nhiều loại thuốc nhuộm và nhãn huỳnh quang khác nhau, cho phép các nhà nghiên cứu nghiên cứu nhiều loại mẫu sinh học và phi sinh học

Không xâm lấn: Quá trình chụp ảnh không xâm lấn và không gây hại cho mẫu, cho phép chụp ảnh theo thời gian trôi đi trong thời gian dài

Trong đồ án này chỉ tập trung vào kỹ thuật huỳnh quang soi nổi đối với mẫu y sinh học tự phát huỳnh quang dưới ánh sáng kích thích và cải tiến hệ thống quan sát bằng cách thiết kế một buồng tối mini chuyên dụng nhằm đảm bảo an toàn cho người sử dụng và tăng cường chất lượng hình ảnh

Copies for internal use only in Phenikaa University

PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM

Thiết bị và nguyên liệu

Kính hiển vi huỳnh quang soi nổi M165FC, LEICA với hệ thống quang học thu phóng 16,5:1 (xem hình 2.1) Thiết bị này được trang bị tại phòng thí nghiệm của Viện Nghiên cứu Nano Trường Đại học Phenikaa

Hình 2.1 Hệ thống kính hiển vi quang học M165FC, Leica

2.1.2 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật và chủng vi sinh vật a) Môi trường nuôi cấy vi sinh vật

Môi trường nuôi cấy vi sinh vật: Nutrient Broth để pha môi trường lỏng kết hợp Agar để tạo ra môi trường có độ rắn, đặc b) Một số chủng vi khuẩn phòng thí nghiệm Escherichia coli

- Escherichia coli (E.coli) hay còn gọi là vi khuẩn đại tràng E.coli là vi khuẩn hiếu khí hay kỵ khí tuỳ tiện hiện diện trong đường ruột của người và các loài động vật máu nóng E.coli đóng vai trò quan trọng trong việc ổn định sinh lí đường ruột và hầu hết không gây hại [9]

- E.coli là trực khuẩn Gram (-), rất ít chủng E.coli có vỏ, chủ yếu sẽ có lông

Copies for internal use only in Phenikaa University

- Đặc điểm nuôi cấy: trên môi trường thạch thường, qua 24 giờ nuôi cấy, khuẩn lạc E.coli có đường kính 1 - 1,5 mm, dạng S: tròn, đều, nhẵn bóng, màu trắng đục.[9]

Pseudomonas aeruginosa (Trực khuẩn mủ xanh)

- Pseudomonas aeruginosa (P aeruginosa) được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1872 bởi Schroeter Vi khuẩn P aeruginosa có khả năng làm cho vết thương sinh ra một loại mủ đặc biệt có màu xanh.[10]

- P aeruginosa là vi khuẩn hiếu khí, gram âm, hình que thẳng hoặc hơi cong nhưng không xoắn, hai đầu tròn, có một lông đầu, không sinh nha bào Vi khuẩn P aeruginosa cú kớch thước 0,5 – 1 àm x 1,5 – 5 àm, đứng riờng lẻ thành đôi hoặc kết hợp thành chuỗi ngắn, có khả năng di chuyển nhờ có một lông ở một cực.[10]

- Đặc điểm nuôi cấy: dễ dàng nuôi cấy ở môi trường bình thường, thích hợp nhất ở pH = 7,2 – 7,5, nhiệt độ = 37 °C.[10]

Staphylococcus aureus (Tụ cầu vàng)

- Staphylococcus aureus thuộc họ Staphylococcus caceae, do Robert Koch (1843 – 1910) phân lập từ mủ ung nhọt vào năm 1878 và được Loius Pasteur (1880) nghiên cứu từ thời kì đầu của lịch sử ngành vi sinh vật học.[11]

- S.aureus là vi khuẩn Gram dương, hiếu khí hay kị khí, không di động, hình cầu, đường kớnh 0,8 – 1 àm, tế bào xếp thành chựm và khụng hỡnh thành bào tử.[11]

- Đặc điểm nuôi cấy: dễ phát triển ở môi trường nuôi cấy thông thường, từ 10 - 45°C, nhiệt độ cực thuận 30 - 45°C Môi trường thạch thường vi khuẩn

S.aureus tạo thành khuẩn lạc S, đường kính 1-2 mm nhẵn, khuẩn lạc thường có màu vàng chanh.[11]

- Samonella typhi (S.typhi) gây nên bệnh thương hàn, là một loại vi khuẩn gây bệnh thương hàn, một bệnh truyền nhiễm cấp tính và lây bằng đường tiêu hoá.[12]

- Samonella là trực khuẩn Gram (-), kớch thước từ (1-3)x(0,5-0,7) àm, cú lông, di động và có sức đề kháng cao ở ngoại cảnh.[12]

Copies for internal use only in Phenikaa University

Mẫu vi khuẩn phân lập từ đất

Mẫu đất được lấy từ 3 địa điểm khác nhau và phân lập để tìm ra chủng vi khuẩn tự phát quang Quy trình kỹ thuật phân lập và nuôi cấy được trình bày trong mục 2.3.5

Mẫu đất 1: Được lấy trong khuôn viên trường Phenika

Mẫu đất 2 : Hồ Văn Quán,Hà Đông,Hà Nội

Mẫu đất 3: Chung cư Xuân Mai,Yên Nghĩa,Hà Đông,Hà Nội

2.1.3 Các mẫu sinh học khác

Vitamin A: là một loại vitamin tan trong chất béo thiết yếu cho sức khỏe của cơ thể con người Đóng vai trò quan trọng trong nhiều quá trình sinh học

Chất trong vitamin A có khả năng phát quang khi tác động với ánh sáng được gọi là retinol Retinol là dạng chất hoạt động của vitamin A và có thể gắn kết với các protein để tạo thành các phân tử như rhodopsin Khi retinol kết hợp với protein để tạo rhodopsin, nó có khả năng hấp thụ ánh sáng và kích thích chuỗi phản ứng hóa học đặc biệt trong tế bào võng mạc, tạo ra sự phát quang đặc biệt quan trọng để chúng ta nhìn thấy trong điều kiện ánh sáng yếu

Vitamin A sử dụng trong thực nghiệm là Vitamin A 5000 IU, trong đó gồm các thành phần: Retinol acetate 5000 IU Tá dược : Lactose, màu Tartrazine, màu Sunset yellow, Colloidal silicon dioxide, Crospovidone, Talc, Microcrystalline cellulose, Tinh bột sắn

Vitamin B: Nhóm vitamin B bao gồm nhiều loại vitamin khác nhau như Vitamin B1 (thiamine), Vitamin B2 (riboflavin), Vitamin B3 (niacin), Vitamin B5 (pantothenic acid), Vitamin B6 (pyridoxine), Vitamin B7 (biotin), Vitamin B9 (folate hoặc folic acid), và Vitamin B12 (cobalamin)

Trong nhóm các vitamin B, không có chất nào tạo ra hiện tượng phát quang tương tự như retinol trong Vitamin A Các loại vitamin B không thường được biết đến với khả năng gây phát quang khi tác động của ánh sáng

Mô mỡ (Lipit): Mô mỡ gồm các tế bào mỡ, ngoài ra còn có chứa nhiều thành phần khác trong mạch máu như nguyên bào sợi, các tế bào nội mô mạch máu, đại thực bào mô mỡ

Copies for internal use only in Phenikaa University

Mô mỡ thường không phát quang trong điều kiện tự nhiên Tuy nhiên, có một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng một số loại mỡ, đặc biệt là mỡ nâu, có khả năng phát quang ở mức độ thấp khi tiếp xúc với ánh sáng.Mô mỡ phát quang trong một số trường hợp có thể liên quan đến hiện tượng được gọi là "autofluorescence" hay tự phát quang Tuy nhiên, mức độ và cơ chế phát quang này không phải lúc nào cũng rõ ràng và phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau Ánh sáng UV hoặc laze có thể kích thích mô mỡ phát quang Khi chúng tiếp xúc với loại ánh sáng này, các phân tử trong mô mỡ có thể hấp thụ năng lượng và sau đó phát ra ánh sáng ở bước sóng dài hơn, tạo ra hiện tượng phát quang

Hoá chất, dung môi, thiết bị, dụng cụ

Bảng 2.1 Hoá chất, dung môi sử dụng trong nghiên cứu

STT Nguyên liệu Công thức

2 Nước muối NaCl 0,9 % thanh trùng 3 Ba loại mẫu đất b) Thiết bị

Bảng 2.2 Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

STT Thiết bị Model / xuất sứ

1 Nồi hấp tiệt trùng Jeio tech

3 Tủ cấy vi sinh Model: HMRTC-

Copies for internal use only in Phenikaa University

Bảng 2.3 Thiết bị sử dụng trong cải tiến buồng tối mini

3 Vải nhung đen c) Dụng cụ

Bảng 2.4 Dụng cụ thí nghiệm sử dụng trong nghiên cứu

STT Dụng cụ STT Dụng cụ

1 Bình định mức 100 ml 7 Pipet Pasteur 2 Cốc thuỷ tinh 100 ml, 250 ml 8 Nhiệt kế

3 Đèn cồn 9 Pipet vạch, micro pipet

4 Đĩa peptri 10 Phễu thuỷ tinh

5 Đũa thuỷ tinh 11 Que trang thuỷ tinh

6 Ống nghiệm 12 Que cấy vi khuẩn

Copies for internal use only in Phenikaa University

Phương pháp thực nghiệm

Hình 2.2 Các bộ phận chủ yếu của kính hiển vi huỳnh quang soi nổi M165FC

Leica a) Sơ đồ khối chung b) Nguồn sáng

Bảng 2.5 Bộ phận và thông số kỹ thuật của nguồn sáng

Bộ phận Thông số kỹ thuật

Hộp đèn 106z, nguồn Hg 100W, 4 thấu kính, dây dài 1,5m

Hộp đèn 106z cho ánh sáng phản xạ có bộ phận gắn cho đèn Hg 100W, hệ thống tụ quang sử dụng 4 thấu kính có bộ lọc nhiệt, cáp nguồn dài 1,5 m

Nguồn sáng (3 nguồn sáng thường, 1 nguồn sáng kích thích huỳnh quang)

Thân máy Hiển thị (Thị kính hoặc qua camera)

Nguồn sáng Núm chỉnh độ hội tụ

Bộ nguồn Chỉnh độ phóng đại

Công tắc đóng mở tấm chắn tia sáng từ điot phát quang Điều chỉnh khe chiếu sáng, độ tụ quang

Copies for internal use only in Phenikaa University Đèn đốt áp lực cao khí Hg 103 W/2 Đèn đốt áp lực cao 103 W/2 cho tuổi thọ dài hơn

Nguồn cấp EBQ 100-0-4L Nguồn cấp cho đèn Hg 100W Nguồn tự động tắt bật, điện áp 90V-250V, 50/60Hz, có hiển thị giờ hoạt động, kèm dây nguồn

Bộ bảo vệ khỏi ánh sáng tán xạ 105-106Z

Bộ bảo vệ khỏi ánh sáng tán xạ cho hộp đèn 105Z và 106Z kết hợp với MZ16 F và MZ16 FA

Bộ lọc ET UV LP M205FA/M165FC

- Bộ lọc kích thích AT350 / 50xnm

- Bộ lọc phát xạ ET 420 nm LP c) Thân máy chính

Bảng 2.6 Bộ phận và thông số kỹ thuật của thân máy chính

Bộ phận Thông số kỹ thuật

Giá đỡ bộ phận quang học Leica M165 FC

Giá đỡ bộ phận quang học Leica M165 FC với tỷ lệ phóng đại 16.5: 1

Khoảng phóng đại: 7.3x-120x (vật kính 1.0x, thị kính 10x)

Núm điều chỉnh độ phóng đại với các vị trí dừng Công nghệ Triple Beam: Tạo riêng 1 kênh cho nguồn chiếu sáng huỳnh quang Ống lọc huỳnh quang 4 vị trí Chức năng mã hóa: phóng đại, bộ lọc huỳnh quang và màng chắn con ngươi

Hệ quang học hiệu chỉnh màu apochromatic toàn phần

Thích hợp khi sử dụng với các vật kính PlanApo đồng tiêu: 0.63x, 1x, 1.6x, 2x

Copies for internal use only in Phenikaa University

Bộ phận Thông số kỹ thuật

Thị kính 10x/23B, có thể điều chỉnh, thế hệ 2

Thị kính 10x/23B, đi-ốp tùy chỉnh được, thị kính dành cho người đeo kính mắt, được thiết kế để sử dụng trắc vi, với cốc rửa mắt mềm thay đổi được Ống quan sát 3 đường truyền quang

Bộ tách đường chùm tia có thể chuyển đổi: 100% camera hoặc 100% thị kính

Phạm vi điều chỉnh khoảng cách giữa 2 mắt 5177mm Góc quan sát: 30°

Vật kính Planapo 1.0x cho dòng kính M

Khoảng cách làm việc: 61.5 mm Ren kết nối kiểu M65 Đường kính ngoài 80 mm dành cho nguồn sáng hình xuyến hoặc các phụ kiện

Cần điều khiển lấy nét tinh/thô 420mm cho dòng kính M

Thích hợp cho bệ đỡ ánh sáng truyền qua và ánh sáng tới

Tải được tối đa 15 kg Cổng USB và 3 cổng CAN tới các phụ kiện chẳng hạn như nguồn sáng dòng LED5000

Bệ đỡ ánh sáng tới, cỡ lớn với chân đỡ chống sốc

Với vòng gá bàn mẫu trắng/đen (120 mm), cấu trúc dạng tổ ong cho độ cứng cao hơn

Chân đỡ chống sốc Kích thước 320 mm (w) x 417,3 mm (d) x 24 mm (h) Bộ chuyển đổi bàn mẫu XY

Bộ chuyển đổi bàn mẫu XY cho các bệ đỡ ánh sáng tới XY 10447342 và 10450049

XY điều khiển bằng tay

Bàn mẫu IsoPro 6x4" XY điều khiển bằng tay (9,6 x 14,7 inch) (24,4 x 37,4 cm)

Khoảng dịch chuyển 6x4 inch (15,24 x 10,16 cm) Trọng lượng tối đa 0,5 kg

Copies for internal use only in Phenikaa University d) Khối hiển thị

Bảng 2.7 Bộ phận và thông số kỹ thuật của khối hiển thị

Bộ phận Thông số Kỹ thuật

Camera Camera đơn sắc độ nhạy cao kỹ thuật số với kết cấu làm mát thụ động Thích hợp cho các ứng dụng huỳnh quang Dựa trên cảm biến Sony(R) ICX455 interline CCD với công nghệ CCD HAD EXview 1,3 MPixel với kích thước pixel 3,75 μm

Tốc độ khung hình/giây (fps) tối đa (full frame):

1x1:31 fps; 2x2:54 fps; 3x3:72 fps Leica DFC3000 G có tính năng quay số 8, 12 và 16 bit e) Phần mềm điều khiển

Capta Vision + là một phần mềm được phát triển để tích hợp với kính hiển vi M165FC Phần mềm này cung cấp khả năng điều chỉnh máy ảnh chính xác, thu thập hình ảnh, quản lý hình ảnh, xử lý hình ảnh, đo lường và đếm f) Bảo dưỡng

- Đặt kính ở phòng khô thoáng, không bị ẩm mốc

- Thực hiện kiểm tra định kỳ (3-6 tháng/ 1lần)

- Sau khi sử dụng, cần tắt nguồn và để cho nguồn sáng và camera nguội hẳn rồi mới che đậy thiết bị

- Vật kính và thị kính, các phin lọc ánh sáng cần được lau chùi cẩn thận, trách gây xước, khi không sử dụng cần đặt trong hộp có chứa chất hút ẩm và để nơi khô thoáng

- Cần phải che đậy khi không sử dụng kính để tránh bụi bẩn

- Sử dụng đúng các công cụ để vệ sinh kính

- Vệ sinh lăng kính, ống chia sáng trên đầu có camera

- Tra dầu mỡ vào các vị trí thanh trượt, rãnh bi, các bánh răng ăn khớp của bàn di mẫu, trục kính và các núm chỉnh tiêu cự

Copies for internal use only in Phenikaa University

- Sử dụng dung dịch tẩy mốc chuyên dụng để xử lý các vết mốc trên bề mặt thấu kính hoặc trên thân kính

2.3.2 Cải tiến hệ thống quan sát của kính hiển vi quang học soi nổi Để đảm bảo an toàn cho người sử dụng cũng như cải thiện chất lượng ảnh huỳnh quang quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang soi nổi, tôi đã thực hiện thiết kế và chế tạo một buồn tối mini phù hợp kính hiển vi Leica M165 FC, các bước được tiến hành như sau:

Bước 1: Tìm kiếm và chuẩn bị một số loại mẫu sinh học có khả năng tự phát quang khi chiếu ánh sáng kích thích

Bước 2: Xây dựng một số quy trình kỹ thuật phù hợp để chuẩn bị mẫu sinh học tự phát quang cho quá trình quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang soi nổi

Bước 3: Quan sát mẫu sinh học dưới kính hiển vi huỳnh quang soi nổi và đánh giá chất lượng hình ảnh quan sát được với hình ảnh soi nổi thông thường

Bước 4: Thiết kế và chế tạo hệ thống buồng tối mini tiện ích chuyên dụng cho kính hiển vi huỳnh quang soi nổi để đảm bảo an toàn cho người sử dụng và cải thiện chất lượng hình ảnh trong quá trình quan sát và ghi nhận hình ảnh

Bước 5: Kiểm chứng chất lượng hình ảnh mẫu sinh học thông qua mẫu vi khuẩn phân lập từ đất sử dụng hệ thống buồng tối được cải tiến cho kính hiển vi huỳnh quang soi nổi

Copies for internal use only in Phenikaa University

2.3.3 Quy trình thực nghiệm đánh giá chất lượng hình ảnh của mẫu sinh học tự phát quang dưới kính hiển vi duỳnh quang soi nổi

Mẫu sinh học khác (vitamin A, Vitamin B,

Vi khuẩn phòng thí nghiệm

Vi khuẩn tự nhiên Kính hiển vi soi nổi

Kính hiển vi huỳnh quang soi nổi

Hiển vi soi nổi Hiển vi huỳnh quang soi nổi

Hiển vi điện tử quét

Copies for internal use only in Phenikaa University

Quy trình chuẩn bị mẫu sinh học của các phương pháp bổ trợ

a) Quy trình kỹ thuật chuẩn bị mẫu sinh học tự phát quang cho hiển vi huỳnh quang soi nổi

Quy trình kỹ thuật chuẩn bị mẫu sinh học tự phát huỳnh quang gồm các bước sau:

Bước 1: Chuẩn bị mẫu vitamin A 5000 IU, Vitamin B 250 mg; mô mỡ và mô sụn Bước 2: Sử dụng cồn 90 0 để làm sạch mẫu, loại bỏ các bẩn ở trên mẫu mô sụn và mô mỡ Các mẫu vitamin A và B được nghiền thành dạng bột mịn

Bước 3: Đặt mẫu lên lam kính Bước 4: Khởi động máy tính và kính hiển vi Bước 5: Đặt mẫu lên bàn trượt, điều chỉnh vị trí mẫu Bước 6: Điều chỉnh cường độ sáng, độ phóng đại, khẩu độ, tiêu cự Bước 7: Sau khi quan sát mẫu từ ánh sáng thông thường, chuyển sang kính lọc ánh sáng tia UV tiến hành quan sát mẫu

Bước 8: Quan sát mẫu qua kính hiển vi, qua camera nối với máy tính

Bước 9: Ghi lại kết quả trên màn hình vi tính b) Quy trình kỹ thuật phân lập và nuôi cấy vi khuẩn

Phân lập vi khuẩn là quá trình tách riêng các loài vi sinh vật từ một quần thể ban đầu để tạo thành dòng vi khuẩn thuần khiết được gọi là khuẩn lạc Quy trình phân lập vi khuẩn gồm các bước sau:

Bước 1: Chuẩn bị mẫu: chuẩn bị mẫu có vi khuẩn từ các nguồn như môi trường tự nhiên, mẫu sinh học, thực phẩm

Bước 2: Kỹ thuật cấy phân lập: Sử dụng đĩa thạch petri để cấy phân lập vi khuẩn

Bước 3: Dùng que cấy vô trùng để lấy mãu vi khuẩn muốn phân lập bằng cách chạm vào mẫu vi khuẩn Sử dụng ria que để cấy vi khuẩn theo đường ziczac vào đĩa petri trong môi trường thạch thích hợp

Bước 4: Lật ngược đĩa và ủ ở thời gian, nhiệt độ thích hợp trong tủ ấm

Bước 5: Sau khi vi khuẩn tăng trưởng sẽ nuôi trên bề mặt đĩa thạch để có thể tạo ra những khuẩn lạc c) Quy trình kỹ thuật khuyếch tán đĩa thạch (Agar disk – diffusion method)

Copies for internal use only in Phenikaa University

Bước 1: Pha môi trường, đổ thạch vào đĩa petri (toàn bộ quy trình đổ thạch đều thực hiện trong tủ an toàn sinh học cấp 2)

Bước 2: Cấy vi sinh vật vào đĩa petri chứa môi trường thạch Nutrient Broth vô khuẩn Bước 3: Dùng que cấy vô trùng dàn đều vi khuẩn trong đĩa môi trường

Bước 4: Ủ đĩa petri ở môi trường thích hợp (37°C) trong khoảng từ 18 đến 20 giờ

Bước 5: Quan sát dưới kính hiển vi d) Quy trình kỹ thuật nhuộm Gram vi khuẩn

Nguyên tắc: Cấu trúc vách tế bào của vi khuẩn có sự khác nhau vì thế sau khi sử dụng phức hợp Gentian – lod vi khuẩn Gram (+) giữ được màu tím của phức hợp không bị tẩy màu bởi alcohol Trong khi đó, vi khuẩn Gram (-) không giữ lại được màu của phức hợp này và bị khử bằng alcohol

Thuốc thử cung cấp: Cryshtal Violet, Lugol, Alcohol 95%, Safranine

Quy trình thực hiện nhuộm Gram vi khuẩn gồm các bước sau:

Bước 1: Lấy mẫu vi khuẩn và để trên lame kính sạch Để vi khuẩn khô tự nhiên hoặc cố định vi khuẩn bằng cách hong khô qua ngọn lửa đèn cồn

Bước 2: Nhỏ vài giọt Cryshtal Violet cho phủ đều lên bề mặt vi khuẩn và để yên trong vòng 1 phút

Bước 3: Rửa nhanh bằng nước

Bước 4: Nhỏ vài giọt Lugol cho phủ đều lên bề mặt vi khuẩn và để yên trong vòng 1 phút

Bước 5: Rửa nhanh bằng nước

Bước 6: Tẩy màu bằng cách nghiêng lam và nhỏ từ từ Alcohol lên bề mặt phết nhuộm Khi giọt Alcohol rời khỏi lame không có màu tím thì ngưng ngay

Bước 7: Rửa nhanh bằng nước

Bước 8: Nhỏ vài giọt Safranine cho phủ đều lên bề mặt vi khuẩn và để yên trong vòng 1 phút

Bước 9: Rửa nhanh bằng nước

Bước 10: Thấm khô phết nhuộm và quan sát dưới kính hiển vi e) Quy trình kỹ thuật chuẩn bị mẫu sinh học cho kính hiển vi điện tử quét

Copies for internal use only in Phenikaa University

Mẫu vi khuẩn tự phát quang phân lập từ đất được chuẩn bị để quan sát hình thái dưới kính hiển vi điện tử tiến hành theo các bước sau:

Bước 1: Mẫu vi khuẩn sau khi phân lập và nuôi cấy trên đĩa thạch được nạo bằng que cấy vi khuẩn chuyên dụng đã được vô trùng để đưa sang týp eppendorf

Bước 2: Cố định mẫu bằng 2,5-3 % glutaraldehyte /cacodylate 0,1M ; pH = 7,2 –

7,4 trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng

Bước 3: Rửa mẫu bằng dung dịch cacodylate 0,1 M (5 phút / lần x3 lần) Bước 4: Hút nước trong mẫu bằng cồn ở các dải nồng độ 50°, 70°, 80°, 90°, 100°

Bước 5: chuẩn bị đế gắn mẫu, sử dụng giấy bạc Bước 6: Hoà loãng mẫu với nồng độ thích hợp trong cồn tuyệt đối, nhỏ mẫu lên giấy bạc gắn sẵn trên đế, để khô mẫu hoàn toàn trong không khí

Bước 7: Phủ mẫu bằng một lớp vàng (Au) dẫn điện bằng máy phún xạ ion chuyên dụng cho mẫu hiển vi điện tử quét, thời gian phún xạ diễn ra trong 40 giây

Bước 8: Mẫu được đưa vào buồng kính hiển vi điện tử quét để quan sát hình thái và xác định kích thước vi khuẩn (xem hình 2.2 và hình 2.3)

Hình 2.3 Kính hiển vi điện tử quét Hình 2.4 Sinh viên đang thực hành quan sát trên kính hiển vi điện tử quét

Copies for internal use only in Phenikaa University