Ứng dụng kỹ thuật hiển vi huỳnh quang soi nổi để phân tích mẫu y sinh học

Chất lượng hình ảnh của một số mẫu vi khuẩn trong phòng thí nghiệm dưới kính hiển vi huỳnh quang soi nổi

Từ thế kỷ XVI đến nay, các nhà khoa học đã phát minh ra nhiều loại kính hiển vi khác nhau có độ phóng đại và độ phân giải cao, những thiết bị này có thể dùng để quan sát những vật thể nhỏ bé mà mắt thường không thể quan sát được, từ cấp độ micro mét (kính hiển vi quang học), nano mét (kính hiển điện tử) hay xuống tới kích thước nguyên tử (kính hiển vi quét đầu dò). Chính vì thế, kính hiển vi đã đóng một phần rất quan trọng trong việc nghiên cứu khoa học, y tế, vật lý, hoá học,…Trong các phòng xét nghiệm, kính hiển vi là thiết bị không thể thiếu, những thiết bị này có thể được sử dụng để quan sát, phân tích các mẫu y sinh học, vi khuẩn, mô hay tế bào. Khoa học Kính hiển vi đã đóng góp rất nhiều cho việc mở ra những cơ hội nghiên cứu mới và đã có những bước phát triển nhanh chóng, tạo ra rất nhiều loại khác nhau như: Kính hiển vi quét đầu dò, kính hiển vi điện tử truyền qua, kính hiển vi điện tử quét, kính hiển vi soi nổi, kính hiển vi quang học…Và đặc biệt là kính hiển vi huỳnh quang soi nổi.

PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM

• Thiết bị và nguyên liệu
• Phương pháp thực nghiệm

Khi retinol kết hợp với protein để tạo rhodopsin, nó có khả năng hấp thụ ánh sáng và kích thích chuỗi phản ứng hóa học đặc biệt trong tế bào vừng mạc, tạo ra sự phỏt quang đặc biệt quan trọng để chúng ta nhìn thấy trong điều kiện ánh sáng yếu. Mô mỡ (Lipit): Mô mỡ gồm các tế bào mỡ, ngoài ra còn có chứa nhiều thành phần khác trong mạch máu như nguyên bào sợi, các tế bào nội mô mạch máu, đại thực bào mô mỡ. Copies for internal use only in Phenikaa University. Mô mỡ thường không phát quang trong điều kiện tự nhiên. Tuy nhiên, có một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng một số loại mỡ, đặc biệt là mỡ nâu, có khả năng phát quang ở mức độ thấp khi tiếp xúc với ánh sáng.Mô mỡ phát quang trong một số trường hợp có thể liên quan đến hiện tượng được gọi là "autofluorescence" hay tự phát quang. Tuy nhiên, mức độ và cơ chế phát quang này không phải lúc nào cũng rừ ràng và phụ thuộc vào nhiều yếu tố khỏc nhau. Ánh sáng UV hoặc laze có thể kích thích mô mỡ phát quang. Khi chúng tiếp xúc với loại ánh sáng này, các phân tử trong mô mỡ có thể hấp thụ năng lượng và sau đó phát ra ánh sáng ở bước sóng dài hơn, tạo ra hiện tượng phát quang. Sụn: là một mô liên kết mềm dẻo tham gia vào cấu tạo của bộ xương. Sụn được cấu tạo từ ba thành phần là tế bào sụn, chất căn bản sụn và sợi liên kết. Sụn tăng trưởng bằng cách sinh sản đắp thêm hoặc sinh sản gian bào. Mô sụn khô có lượng sợi collagen chiếm khoảng 50-70%. Hoá chất, dung môi, thiết bị, dụng cụ a) Hoá chất, dung môi. Hoá chất, dung môi sử dụng trong nghiên cứu. STT Nguyên liệu Công thức. Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu. STT Thiết bị Model / xuất sứ. 1 Nồi hấp tiệt trùng Jeio tech. Copies for internal use only in Phenikaa University. Thiết bị sử dụng trong cải tiến buồng tối mini. STT Chất liệu. Dụng cụ thí nghiệm sử dụng trong nghiên cứu. STT Dụng cụ STT Dụng cụ. 4 Đĩa peptri 10 Phễu thuỷ tinh. 5 Đũa thuỷ tinh 11 Que trang thuỷ tinh. Copies for internal use only in Phenikaa University. Phương pháp thực nghiệm. Các bộ phận chủ yếu của kính hiển vi huỳnh quang soi nổi M165FC Leica. a) Sơ đồ khối chung. Bộ phận và thông số kỹ thuật của nguồn sáng Bộ phận Thông số kỹ thuật. sáng kích thích huỳnh quang). - Vật kính và thị kính, các phin lọc ánh sáng cần được lau chùi cẩn thận, trách gây xước, khi không sử dụng cần đặt trong hộp có chứa chất hút ẩm và để nơi khô thoáng.

Bước 2: Xây dựng một số quy trình kỹ thuật phù hợp để chuẩn bị mẫu sinh học tự phát quang cho quá trình quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang soi nổi. Bước 4: Thiết kế và chế tạo hệ thống buồng tối mini tiện ích chuyên dụng cho kính hiển vi huỳnh quang soi nổi để đảm bảo an toàn cho người sử dụng và cải thiện chất lượng hình ảnh trong quá trình quan sát và ghi nhận hình ảnh. Bước 5: Kiểm chứng chất lượng hình ảnh mẫu sinh học thông qua mẫu vi khuẩn phân lập từ đất sử dụng hệ thống buồng tối được cải tiến cho kính hiển vi huỳnh quang soi nổi.

Mẫu sinh học khác (vitamin A, Vitamin B,. Vi khuẩn phòng thí nghiệm. tự nhiên Kính hiển. vi soi nổi. Kính hiển vi huỳnh quang soi. Hiển vi soi nổi Hiển vi huỳnh quang soi nổi. Hiển vi điện tử quét. Copies for internal use only in Phenikaa University. Quy trình chuẩn bị mẫu sinh học của các phương pháp bổ trợ. a) Quy trình kỹ thuật chuẩn bị mẫu sinh học tự phát quang cho hiển vi huỳnh quang soi nổi. Quy trình kỹ thuật chuẩn bị mẫu sinh học tự phát huỳnh quang gồm các bước sau:. Các mẫu vitamin A và B được nghiền thành dạng bột mịn. Bước 3: Đặt mẫu lên lam kính. Bước 4: Khởi động máy tính và kính hiển vi. Bước 5: Đặt mẫu lên bàn trượt, điều chỉnh vị trí mẫu. Bước 6: Điều chỉnh cường độ sáng, độ phóng đại, khẩu độ, tiêu cự. Bước 7: Sau khi quan sát mẫu từ ánh sáng thông thường, chuyển sang kính lọc ánh sáng tia UV tiến hành quan sát mẫu. Bước 8: Quan sát mẫu qua kính hiển vi, qua camera nối với máy tính. Bước 9: Ghi lại kết quả trên màn hình vi tính. b) Quy trình kỹ thuật phân lập và nuôi cấy vi khuẩn. Phân lập vi khuẩn là quá trình tách riêng các loài vi sinh vật từ một quần thể ban đầu để tạo thành dòng vi khuẩn thuần khiết được gọi là khuẩn lạc. Quy trình phân lập vi khuẩn gồm các bước sau:. Bước 1: Chuẩn bị mẫu: chuẩn bị mẫu có vi khuẩn từ các nguồn như môi trường tự nhiên, mẫu sinh học, thực phẩm. Bước 2: Kỹ thuật cấy phân lập: Sử dụng đĩa thạch petri để cấy phân lập vi khuẩn. Bước 3: Dùng que cấy vô trùng để lấy mãu vi khuẩn muốn phân lập bằng cách chạm vào mẫu vi khuẩn. Sử dụng ria que để cấy vi khuẩn theo đường ziczac vào đĩa petri trong môi trường thạch thích hợp. Bước 4: Lật ngược đĩa và ủ ở thời gian, nhiệt độ thích hợp trong tủ ấm. Bước 5: Sau khi vi khuẩn tăng trưởng sẽ nuôi trên bề mặt đĩa thạch để có thể tạo ra những khuẩn lạc. c) Quy trình kỹ thuật khuyếch tán đĩa thạch (Agar disk – diffusion method). Bước 1: Pha môi trường, đổ thạch vào đĩa petri (toàn bộ quy trình đổ thạch đều thực hiện trong tủ an toàn sinh học cấp 2). Bước 2: Cấy vi sinh vật vào đĩa petri chứa môi trường thạch Nutrient Broth vô khuẩn. Bước 3: Dùng que cấy vô trùng dàn đều vi khuẩn trong đĩa môi trường. Bước 5: Quan sát dưới kính hiển vi. d) Quy trình kỹ thuật nhuộm Gram vi khuẩn. Nguyên tắc: Cấu trúc vách tế bào của vi khuẩn có sự khác nhau vì thế sau khi sử dụng phức hợp Gentian – lod vi khuẩn Gram (+) giữ được màu tím của phức hợp không bị tẩy màu bởi alcohol.

Trong khi đó, vi khuẩn Gram (-) không giữ lại được màu của phức hợp này và bị khử bằng alcohol. Thuốc thử cung cấp: Cryshtal Violet, Lugol, Alcohol 95%, Safranine. Quy trình thực hiện nhuộm Gram vi khuẩn gồm các bước sau:. Bước 1: Lấy mẫu vi khuẩn và để trên lame kính sạch. Để vi khuẩn khô tự nhiên hoặc cố định vi khuẩn bằng cách hong khô qua ngọn lửa đèn cồn. Bước 2: Nhỏ vài giọt Cryshtal Violet cho phủ đều lên bề mặt vi khuẩn và để yên trong vòng 1 phút. Bước 3: Rửa nhanh bằng nước. Bước 4: Nhỏ vài giọt Lugol cho phủ đều lên bề mặt vi khuẩn và để yên trong vòng 1 phút. Bước 5: Rửa nhanh bằng nước. Bước 6: Tẩy màu bằng cách nghiêng lam và nhỏ từ từ Alcohol lên bề mặt phết nhuộm. Khi giọt Alcohol rời khỏi lame không có màu tím thì ngưng ngay. Bước 7: Rửa nhanh bằng nước. Bước 8: Nhỏ vài giọt Safranine cho phủ đều lên bề mặt vi khuẩn và để yên trong vòng 1 phút. Bước 9: Rửa nhanh bằng nước. Bước 10: Thấm khô phết nhuộm và quan sát dưới kính hiển vi. e) Quy trình kỹ thuật chuẩn bị mẫu sinh học cho kính hiển vi điện tử quét.