nghiên cứu sự lưu hành và đặc điểm dịch tễ học phân tử của porcine circovirus type 2 pcv2 ở lợn nuôi tại việt nam

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGHIÊN CỨU SỰ LƯU HÀNH VÀ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC PHÂN TỬ CỦA PORCINE CIRCOVIRUS TYPE 2 PCV2 Ở LỢN NUÔI TẠI VIỆT NAM... HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM PHẠM HỒNG

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

NGHIÊN CỨU SỰ LƯU HÀNH VÀ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC PHÂN TỬ CỦA PORCINE CIRCOVIRUS TYPE 2

(PCV2) Ở LỢN NUÔI TẠI VIỆT NAM

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

PHẠM HỒNG QUÂN

NGHIÊN CỨU SỰ LƯU HÀNH VÀ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC PHÂN TỬ CỦA PORCINE CIRCOVIRUS TYPE 2

(PCV2) Ở LỢN NUÔI TẠI VIỆT NAM

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

Tác giả luận án

Phạm Hồng Quân

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình

Nhân dịp hoàn thành luận án, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc PGS.TS Huỳnh Thị Mỹ Lệ, PGS.TS Phạm Công Hoạt đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Vi sinh vật truyền nhiễm, Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận án

Tôi xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo, cán bộ Cục Thú y, Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung Ương và Ban quản lý dự án CDC đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận án./

Nghiên cứu sinh

Phạm Hồng Quân

1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài 2

1.3 Phạm vi nghiên cứu 2

1.4 Những đóng góp mới của đề tài 3

1.5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3

1.5.1 Ý nghĩa khoa học 3

1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn 3

Phần 2 Tổng quan tài liệu 4

2.1 Tình hình chăn nuôi lợn tại Việt Nam 4

2.2 Giới thiệu về PCV2 và bệnh do PCV2 gây ra ở lợn nuôi 5

2.3 Hiện tượng đồng nhiễm do PCV2 gây ra 22

2.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về PCV2 23

2.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 23

2.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 29

Phần 3 Nội dung – Vật liệu - Phương pháp nghiên cứu 33

3.1 Địa điểm nghiên cứu 33

3.2 Thời gian nghiên cứu 33

3.3 Vật liệu nghiên cứu 33

3.4 Nội dung nghiên cứu 35

3.5 Phương pháp nghiên cứu 35

3.5.1 Phương pháp tính toán dung lượng mẫu 35

3.5.2 Phương pháp điều tra hồi cứu 38

3.5.3 Phương pháp thu thập mẫu 38

3.5.4 Phương pháp chiết tách ADN/ARN 38

3.5.5 Phương pháp Realtime PCR 39

3.5.6 Phương pháp PCR 40

3.5.7 Phương pháp giải trình tự và hoàn thiện trình tự gen 41

3.5.8 Phương pháp phân tích trình tự gen 42

3.5.9 Xây dựng cây phát sinh chủng loại 42

3.5.10 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học phân tử theo không gian - thời gian 42

3.5.11 Phương pháp đo lường tính đa dạng về di truyền 45

3.5.12 Phương pháp xử lý số liệu 45

Phần 4 Kết quả nghiên cứu và thảo luận 46

4.1 Sự lưu hành PCV2 ở lợn nuôi tại Việt Nam 46

4.1.1 Kết quả nghiên cứu sự lưu hành PCV2 theo địa phương 46

4.1.2 Kết quả xác định sự lưu hành PCV2 theo quy mô chăn nuôi 52

4.1.3 Kết quả xác định tỷ lệ lưu hành PCV2 ở đàn lợn thuộc các lứa tuổi 53

4.1.4 Kết quả nghiên cứu sự lưu hành của bệnh do PCV2 gây ra 56

4.2 Đặc điểm dịch tễ học phân tử của PCV2 59

4.2.1 Kết quả giải trình tự bộ gen của PCV2 59

4.2.2 Phân loại genotype PCV2 lưu hành ở Việt Nam 60

4.2.3 Tính đa dạng di truyền của PCV2 lưu hành ở Việt Nam 64

4.2.4 Sự lưu hành của các genotype PCV2 theo không gian và thời gian 66

4.2.5 Đặc điểm dịch tễ học phân tử của genotype PCV2b lưu hành ở Việt Nam 68

4.2.6 Đặc điểm dịch tễ học phân tử của genotype PCV2d lưu hành ở Việt Nam 73

4.3 Hiện tượng đồng nhiễm PCV2 với một số virus 76

4.3.1 Kết quả xác định sự có mặt của một số virus đồng nhiễm 77

4.3.2 Kết quả nghiên cứu hiện tượng đồng nhiễm PCV2 với một số virus 83

4.3.3 Đặc điểm sinh học phân tử của loài virus mới đồng nhiễm với PCV2 87

Phần 5 Kết luận và đề nghị 92

5.1 Kết luận 92

5.2 Đề nghị 92

Những công trình của tác giả công bố có liên quan đến luận án 93

Tài liệu tham khảo 94

Phụ lục 112

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tên đầy đủ

ADN Axit Deoxyribonucleic ARN Axit ribonucleic CI Confidence Interval CS Cộng sự

CSFV Classical Swine Fever Virus

ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay

IPMA Immunoperoxidase monolayer assay NaCl Natri clorua

ORF Open Reading Frame

PBS Phosphate – Buffered - Saline PCR Polymerase chain reaction PCV Porcine circovirus

PCV1 Porcine circovirus type 1 PCV2 Porcine circovirus type 2 PCV3 Porcine circovirus type 3

PCVAD Porcine circovirus type 2-associated disease PDNS Porcine dermatitis and nephropathy syndrome PK15 Pig Kidney 15

PMWS Postweaning multisystemic wasting syndrome PPV Porcine parvovirus

PRRS Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome TTV Torque teno virus

DANH MỤC BẢNG

2.1 Một số loại vắc xin phòng bệnh do PCV2 gây ra được phép nhập khẩu,

lưu hành tại Việt Nam hiện nay 20

3.1 Mồi sử dụng để phát hiện các virus nghiên cứu 34

3.2 Trình tự mồi dùng chẩn đoán và giải trình tự gen PCV2 35

3.3 Trình tự mồi dùng giải trình tự gen PCV3 35

3.4 Tổng hợp tình hình lấy mẫu nghiên cứu 37

3.5 Tóm tắt thông tin trình tự gen ORF2 của các chủng PCV2d dùng phân tích đặc điểm dịch tễ học theo không gian - thời gian 43

3.6 Tóm tắt thông tin trình tự gen ORF2 của các chủng PCV2b dùng phân tích đặc điểm dịch tễ học theo không gian - thời gian 44

4.1 Kết quả xác định sự có mặt của PCV2 từ các địa phương 47

4.2 Tỷ lệ lưu hành PCV2 ở đàn lợn theo các quy mô khác nhau trên địa bàn nghiên cứu 52

4.3 Kết quả xác định tỷ lệ lưu hành PCV2 ở các lứa tuổi lợn 53

4.4 Trình tự gen được đưa trên Genbank 60

4.5 Motif đặc trưng genotype của PCV2 lưu hành ở Việt Nam 64

4.6 Kết quả xác định sự có mặt của virus đồng nhiễm 78

4.7 Kết quả xác định sự đồng nhiễm virus trong mẫu bệnh phẩm 83

DANH MỤC HÌNH

2.1 Phân bố tổng số lợn nuôi theo địa phương năm 2017 4

2.2 Cây phát sinh loài của PCV2 5

2.3 Cấu trúc PCV2 6

2.4 Khả năng bài tiết PCV2 ở lợn bị nhiễm 8

2.5 Phát triển của nhiễm PCV2 biểu hiện thành PCVAD 10

2.6 Một số triệu chứng lâm sàng điển hình ở lợn nghi mắc PMWS 12

2.7 Một số triệu chứng bệnh tích điển hình ở lợn nghi mắc PMWS 13

2.8 Sự phân bố PCV2 trên thế giới 24

2.9 Phân loại genotype của PCV2 ở Việt Nam 31

4.1 Kết quả so sánh về phạm vi lấy mẫu phát hiện PCV2 46

4.2 Tỷ lệ dương tính với PCV2 tại các địa phương thu mẫu 49

4.3 Một số triệu chứng điển hình ở lợn mắc PMWS 57

4.4 Một số bệnh tích điển hình ở lợn mắc PMWS 58

4.5 Sơ đồ đính kèm đánh dấu 20 tỉnh có trình tự được phân tích 61

4.6 Cây phát sinh chủng loại của các chủng PCV2 phân lập ở Việt Nam 62

4.7 Hệ tọa độ 2 chiều biểu diễn mối quan hệ gen giữa các chủng PCV2 phân

4.10 Sự phát tán theo không gian và thời gian của chủng PCV2b nhánh 1 xâm nhập vào Việt Nam 71

4.11 Sự phát tán theo không gian và thời gian của chủng PCV2b nhánh 2 xâm nhập vào Việt Nam 72

4.12 Sự phát tán theo không gian và thời gian của genotype PCV2d 74

4.13 Nguồn gốc, sự phát tán theo không gian và thời gian của genotype PCV2d lưu hành ở Việt Nam 75

4.14 Kết quả PCR xác định sự có mặt của virus đồng nhiễm 77

4.15 Các tỉnh có mẫu dương tính với các virus đồng nhiễm 80

4.16 Sự phân bố theo không gian của virus đồng nhiễm PCV2 86

4.17 Trình tự gen ORF2 của 5 chủng PCV3 phân lập tại Việt Nam 88

4.18 Khoảng cách di truyền giữa các chủng PCV3 của Việt Nam và thế giới 89

4.19 Cây phát sinh chủng loại của PCV3 lưu hành ở Việt Nam 90

4.20 Quan hệ di truyền giữa PCV2 và PCV3 lưu hành ở Việt Nam 91

TRÍCH YẾU LUẬN ÁN

Tên tác giả: Phạm Hồng Quân

Tên luận án: Nghiên cứu sự lưu hành và đặc điểm dịch tễ học phân tử của porcine

circovirus type 2 (PCV2) ở lợn nuôi tại Việt Nam

Chuyên ngành: Dịch tễ học thú y Mã số: 9 64 01 08 Cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Mục đích nghiên cứu:

Xác định tỷ lệ lưu hành, đặc điểm dịch tễ học phân tử của PCV2 ở lợn nuôi tại Việt Nam và xác định sự đồng nhiễm của PCV2 với một số ADN/ARN virus ở lợn nuôi tại Việt Nam

Phương pháp nghiên cứu:

Sử dụng phương pháp lấy mẫu ngẫu nhiên đơn giản nhiều giai đoạn và dựa vào thuật toán thống kê Phân tích mẫu bằng phương pháp realtime PCR/PCR để xác định mẫu nhiễm PCV2

Sử dụng chương trình tin sinh học Bioedit v7.1.3.0 (Hall, 1999) để phân tích trình tự nucleotide Sử dụng chương trình MEGA 7 (Tamura et al., 2013) để xây

dựng cây phát sinh chủng loại Sử dụng phương pháp Principal Coordinate Analysis (PCoA) để phân tích sự đa dạng về trình tự nucleotide gen ORF2 của 64 chủng PCV2 phân lập ở Việt Nam từ 2004 đến 2017

Sử dụng phần mềm Quantum GIS để mô tả mức độ và sự phân bố của PCV2 ở lợn nuôi tại Việt Nam Sử dụng phần mềm BEAST (Drummond et al., 2012) để xây

dựng lại quá trình phát tán (dispersal pathway) của các chủng PCV2d theo không gian và thời gian (spatio-temporal dynamics), với các tham số của mô hình dựa theo kết quả nghiên cứu trước đây (Lemey et al., 2009) Sử dụng chương trình SpreaD3 (Bielejec et al., 2016) để tính toán giá trị Bayes factor (cho biết mức tin cậy của dự

đoán các con đường phát tán) Giá trị BF trong khoảng BF > 150, 3 < BF < 150 và 1 < BF < 3 lần lượt ứng với mức dự đoán có độ tin cậy cao, có căn cứ và chưa đủ căn cứ về con đường phát tán (Kass and Raftery, 1995)

Số liệu được xử lý bằng phần mềm MS Excel 2010; so sánh sự sai khác giữa

Test (phần mềm SAS 9.1).

Kết quả chính và kết luận

* Tỷ lệ lưu hành porcine circovirus type 2 (PCV2) ở Việt Nam:

(i) Tỷ lệ lưu hành PCV2 ở Việt Nam là 41,14% Tỷ lệ lưu hành PCV2 tại 14 tỉnh dao động từ 16% đến 88%; (ii) Ở các đàn lợn nuôi có quy mô khác nhau thì tỷ

lệ dương tính với PCV2 khác nhau, cụ thể tỷ lệ lưu hành PCV2 cao nhất ở những trại có mức quy mô đàn >500 con (47,5%), thấp nhất là trại có quy mô đàn từ 100

– 300 con (27,42%) (iii) Ở các nhóm tuổi lợn đều phát hiện được mẫu dương tính với PCV2, tỷ lệ lưu hành PCV2 ở lợn thịt là cao nhất (45,16%), lợn con theo mẹ và lợn nái tương ứng là 39,58% và 32,35%

* Kết quả nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học phân tử của porcine circovirus type 2 (PCV2) lưu hành ở lợn nuôi tại Việt Nam:

Ở Việt Nam, chỉ có sự lưu hành genotype PCV2b bao gồm nhánh 1A/1B, nhóm tái tổ hợp và genotype PCV2d Ở cả 3 miền Bắc - Trung - Nam, đều thấy sự hiện diện đồng thời nhiều nhóm di truyền của PCV2 ở một tỉnh, trong cùng một khoảng thời gian Các chủng phân lập ở Việt Nam thuộc genotype PCV2b có nguồn gốc từ Trung Quốc và Hàn Quốc, các chủng thuộc genotype PCV2d từ 2004 - 2017 đều có nguồn gốc đầu tiên từ Trung Quốc, nhưng nằm ở các nhánh khác nhau của cây phát sinh chủng loại

* Kết quả xác định sự đồng nhiễm porcine circovirus type 2 (PCV2) với một số virus:

nhiễm PCV2/PPV là cao nhất (35,42%), PCV2/TTV (13,19%), PCV2/PRRS (7,64%) và phát hiện được sự lưu hành của PCV3 với tỷ lệ 4,17% và các chủng PCV3 đều thuộc về nhóm di truyền PCV3a

Kết quả góp phần làm đầy đủ thêm bức tranh dịch tễ về virus PCV2 đang lưu hành tại Việt Nam Đồng thời, đã xác định thêm được sự lưu hành của loài virus mới PCV3 ở lợn nuôi tại Việt Nam Đây là cơ sở khoa học quan trọng để nâng cao các biện pháp phòng chống nhằm giảm nguy cơ lợn mắc PMWS, nâng cao hiệu quả của ngành chăn nuôi lợn

THESIS ABSTRACT

PhD candidate: Pham Hong Quan

Thesis title: Investigating the prevalence and the molecular epidemiology of porcine

circovirus type 2 (PCV2) circulating in pig’s population in Vietnam

Major: Veterinary Epidemiology Code: 9 64 01 08

Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA) Research objective

Determining the prevalence and molecular epidemiological characteristics of PCV2 and the co-infection of PCV2 with other DNA/RNA viruses in pigs in Vietnam

Materials and Methods

In this thesis, a simple multiple-stage random sampling design and statistical algorithms were used The collected samples were tested using rRT/PCR to detect PCV2

Nucleotide sequences was analyzed using Bioedit v7.1.3.0 (Hall, 1999)

Phylogenetic trees of PCV2 was generated using MEGA 7 (Tamura et al., 2013)

The diversity of the ORF2 genomic sequences of the 64 PCV2 viruses collected in Vietnam between 2004 and 2017 was analyzed using Principal Coordinate Analysis (PCoA) method

The extent and distribution of PCV2 viruses circulated in Vietnam were described using Quantum GIS software The dispersal pathway of spatio-temporal dynamics (PCV2d) with the parameters of the model based on the previous study

(Lemey et al., 2009) was reconstructed using BEAST software (Drummond et al.,

2012) The Bayes factor (BF) values (indicating the reliability of predicted pathways)

were calculated using the SpreaD3 program (Bielejec et al., 2016) BF values of 150,

3 and <BF <150 and 1 <BF <3 respectively corresponded to predicted levels of high reliability, evidence and insufficient grounds for spread (Kass and Raftery, 1995)

The data is processed by MS Excel 2010 software; The difference between factors were compared by the χ2 test (Minitab 14.0 software) and the Fisher Exact Test (SAS 9.1 software)

Main findings and conclutions

* The prevalence of PCV2 in Vietnam:

(i) The prevalence of PCV2 in Vietnam was 41,14% The prevalence of PCV2

in the 14 selected provinces ranged from 16% to 88% (ii) In different herd sizes,

pigs farms with herd size > 500 (47,5%), the lowest prevalence of PCV2 was

detected in herd sizes with the scale of 100 - 300 (27,42%) (iii) The PCV2

viruses were detected in all different age groups The highest prevalence of PCV2 was in the fattening pigs (45,16%), followed by piglets and sow groups with 39,58% and 32,35%

* Results of molecular epidemiological characteristics of porcine circovirus type 2 (PCV2) circulating in pigs in Vietnam, 2004 - 2017:

In Vietnam, only the genotype PCV2b circulated including the 1A / 1B arm, the recombinant and the PCV2d genotype In all three regions of North - Central - South, there was a simultaneous presence of several genetic groups of PCV2 in one province at the same time The PCV2 strains isolated in Vietnam of gennotype PCV2b are originally belong to Chinese and Korean PCV2 viruses, the PCV2 strains of genotype PCV2d from 2004 to 2017 are originally belong to Chinese PCV2 viruses, but they were in different branches of the PCV2 phylogenetic tree

* Results of PCV2 co-infection with others viruses in pigs:

Results of PCV2 co-infection with others viruses (PPV, TTV, PCV3, PRRS), co-infection PCV2/PPV was highest at 35,42%, PCV2/TTV at 13,19%,

PCV2/PRRS at 7,64% and identification of new PCV3 virus in Vietnam with a

detection rate of 4,17% and five PCV3 strains in Vietnam were belong to the PCV3a genetic group

This result contributes to the overall epidemiological picture of PCV2 virus in Vietnam At the same time, the prevalence of new PCV3 virus in pigs in Vietnam was further identified This is a very important scientific basis to improve the prevention and control measures of the disease to reduce the risk of PMWS and to improve the efficiency of the pig industry

Key words: PCV2 genotype 2d, molecular epidemiology, spatio-temporal dynamics