luận án tiến sĩ nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính chống ung thư của hai loài xương quạt dianella ensifolia và côm hải nam elaeocarpus hainanensis

Kết quÁ nghiên cứu sẽ giÁi thích mát cách khoa hác về tác dāng sinh d°ÿc hác căa nguồn tài nguyên, từ đó sẽ giúp đßnh h°ãng các nghiên cứu tiếp theo để đ¿y nhanh kết quÁ nghiên cứu vào ứ

Táng quan về chi Dianella

Đặc điểm thực vật

Dianella là mát chi căa há Liliaceae, gồm 30 loài phân bố từ Đông Nam châu

Phi đến Đông Nam Á, Hawaii, các đÁo nam Thái Bình D°¡ng, Úc và New Zealand [14,15] Các loài trong chi này là các lo¿i thÁo mác mác thành chùm vãi nhiều hoặc ít các lá thẳng và hoa l°ỡng tính vãi ba lá đài nhiều h¡n hoặc ít h¡n giống vãi ba cánh hoa và mát bầu nhāy cÃp trên, quÁ máng [16]

X°Ăng qu¿t (D ensifolia) là loài phổ biến nhÃt trong chi, đ°ÿc tỡm thÃy ỗ nhiều n¡i khác nhau, và đ°ÿc các nhà khoa hác tập trung vào nghiên cứu nhiều nhÃt so vói cỏc loài cũn l¿i D ensifolia là loài cú thõn rò nằm ngang, thõn cao chừng 40-

50 cm, có thể tãi 1m Lá mác so le, ôm lÃy thân theo hai bên thân hình nan qu¿t giÃy trụng nh° chiếc qu¿t Loài cõy này phõn bố chă yếu ỗ Ân Đỏ, Nam Nhật BÁn, Trung Quốc, và cỏc n°óc Đụng Nam Á, Australia Nepan, Chõu Phi ổ Viỏt Nam, chỳng phõn bố hầu hết từ Bắc vào Nam, tập trung chă yếu ỗ Thỏi Bỡnh, Thanh Húa, Nghỏ

Ngoài ra, mát số loài phổ biến khác thuác chi Dianella nh°: D caerulea, D amoena, D ensifolia, D revoluta, D tasmanica, D longifolia cũng đã đ°ÿc nghiên cứu về thành phần hóa hác và ho¿t tính sinh hác.

Công dụng trong y học cổ truyền

Các loài thuác chi Dianella phân bố ráng rãi trên khắp thế giãi Kinh nghiám dõn gian cho rằng cỏc loài thÁo d°ÿc này cú tỏc dāng rÃt tốt trong viỏc điều trò cỏc bỏnh ngoài da nh° nhiòm nÃm, nhiòm khu¿n món tớnh Rò và lỏ cõy D ensifolia dựng đ°ồng uống để chữa cỏc bỏnh viờm đ°ồng tiờu húa, tiết niỏu và đ°ồng hụ hÃp [6, 9,

18, 19] Theo ph°Ăng thuốc chữa bỏnh truyền thống căa ng°ồi dõn Australia thỡ n°óc sắc rò t°Ăi từ loài D longifolia đ°ÿc dựng để trò cÁm l¿nh QuÁ chớn căa loài D caerulea đ°ÿc sử dāng để chữa viêm loét [20]

Hình 1.1 Ành minh háa mát số loài điển hình thuác chi Dianella

Thành ph ầ n hóa h ọ c

Đó cú nhiều cụng bố về thành phần húa hỏc và tỏc dāng sinh hỏc căa dòch chiết cũng nh° căa các chÃt s¿ch phân lập đ°ÿc nhằm giÁi thích tác dāng căa các bài thuốc cổ truyền từ cỏc loài căa chi Dianella dựa trờn cĂ sỗ khoa hỏc Cỏc cụng bố từ năm 1961 đến nay tập trung vào 9 loài đó là D ensifolia, D caerulea, D tasmanica,

D nigra, D.revoluta, D callicarpa, D longifolia, D amoena, D sandwicensis Theo khÁo sát tài liáu, đã có trên 40 hÿp chÃt đ°ÿc phân lập từ chi Dianella, bao gồm các lãp chÃt flavonoid, quinone, naphthalen, triterpenoid, steroid, và mát số hÿp chÃt khác Trong đó các chÃt quinone, flavonoid naphthalen, và triterpenoid là những nhóm chÃt chính căa chi này

Các flavonoid là nhóm chÃt chính căa các loài D ensifolia, D nigra, D tasmanica, D revoluta và D longifolia, vãi 14 flavonoid, bao gồm 1 flavone, 4 anthocyanin, 6 flavan, và 2 flavanone, trên tổng số 42 chÃt đã đ°¡c phân lập và xác đònh cÃu trỳc từ chi này Trong đú, cú ba hÿp đ°ÿc phỏt hiỏn đầu tiờn là: farrerol (10),

(2S)-2′,4′-dihydroxy-7-methoxy-8-methylflavan (13), và (2S)-2′-hydroxy-4′,7- dimethoxy-8-methylflavan (14)

BÁng 1.1 Các hÿp chÃt flavonoid đ°ÿc phân lập từ chi Dianella

(ch¿t) Tờn ch¿t Loài/bò ph¿n TLTK

1 (-)-4'-Hydroxy-7- methoxyflavan Rò loài D ensifolia [21]

2 Chrysosplenol C Phần trên mặt đÃt loài D longifolia [22, 23]

QuÁ chín căa loài D nigra và D tasmanica

QuÁ chín căa loài D nigra và D tasmanica

O-p-coumaroyl-β-glucoside) QuÁ chín căa loài D nigra và D tasmanica

6 Delphinidin 3,7,3',5'- tetraglucoside QuÁ chín căa loài D nigra và D tasmanica

5-methoxy-8-methylflavan Rò loài D ensifolia

Rò căa loài D revoluta và rò loài D ensifolia [21, 22]

13 (2S)-2′,4′-Dihydroxy-7- methoxy-8-methylflavan Rò loài D ensifolia

14 (2S)-2′-Hydroxy-4′,7- dimethoxy-8-methylflavan Rò loài D ensifolia

Hỡnh 1.2 CÃu trỳc mỏt số flavonoid đ°ÿc tỡm thÃy ỗ chi Dianella

Quinone là nhóm chÃt chính thứ 2 căa chi Dianella , có 8 quinone đ°ÿc xác đònh trong 5 loài đú là D ensifolia, D longifolia, D revoluta, D caerulea, D laevis

Có 3 chÃt lầ đầu tiên phát hián là armandinol (15), dianellinone (18), và imbricatonol

(20) [26 – 28] Các hÿp chÃt quinone trong chi này thuác ba nhóm gồm naphthaquinone (15-17, 19-21), dinaphthaquinone (18), và triquinone (22)

Hỡnh 1.3 CÃu trỳc mỏt số quinone đ°ÿc tỡm thÃy ỗ chi Dianella

BÁng 1.2 Cỏc quinone đ°ÿc tỡm thÃy ỗ chi Dianella

(ch¿t) Tờn ch¿t Loài/bò ph¿n TLTK

(2-hydroxyethyl) -2, 3- dihydronaphtoquinone 1-4 Lá căa loài D ensifolia [26]

Chrysophanic acid (hoặc 1,8- dihydroxy-3- methylanthraquinone)

Phần trên mặt đÃt loài D longifolia

17 Chrysophanol Lá căa loài D ensifolia [26]

18 Dianellinone Rò căa loài D revoluta [27, 28,

19 5-Hydroxy-2-methyl-1,4- naphthoquinon Rò căa loài D caerulea và D laevis [31]

20 Imbricatonol (hoặc stypandrol) Rò căa loài D revoluta [28, 30]

21 Stypandrone (hoặc 6-Acetyl-5- hydroxy-7-methylnaphtho-1,4- quinone) Rò căa loài D revoluta [27, 28, 30,

22 Trianellinone Rò căa loài D revoluta [33]

Naphthalen là nhóm chÃt đặc tr°ng căa chi nh° chÃt mãi dianellidin (24) và glycoside căa nó là dianellin (23) Các naphthalen cũng đ°ÿc tìm thÃy trong 4 loài khỏc nhau căa chi này, vớ dā ba naphthalen glycoside (25, 26, và 28) chỉ khỏc nhau ỗ phần đ°ồng [28, 30, 31, 34, 35]

BÁng 1.3 Cỏc naphthalene đ°ÿc tỡm thÃy ỗ chi Dianella

(ch¿t) Tờn ch¿t Loài/bò ph¿n TLTK

QuÁ chín căa loài D nigra và D tasmanica [24]

Rò căa loài D ensifolia, D laevis, D revoluta và D callicarpa

Rò căa loài D ensifolia, D caerulea, D laevis và D callicarpa

26 Dianellose Rò căa loài D callicarpa

27 5-Hydroxydianellin Rò căa loài D callicarpa

28 Stellalderol Rò căa loài D callicarpa

Hỡnh 1.4 CÃu trỳc mỏt số naphthalene đ°ÿc tỡm thÃy ỗ chi Dianella

Hoạt tính sinh học

Cặn chiết và chÃt s¿ch căa mát số loài thuác chi này có tác dāng chống oxy hóa, ức chế vi sinh vật, chống viêm, chống vi rut, chống ung th° và ức chế ho¿t đáng căa mát số enzym [3-10, 26]

Dòch chiết thụ căa loài D Callicarpa cú khÁnăng ức chế cỏc tếbào ung th° kém, tuy nhiên ba chÃt tách ra từ loài này là dianellin (25), stelladerol (28), naphthalene glycoside dialellose (26) cú ho¿t tớnh khỏng tế bào ung th° ỗ mức trung bình [35]

D°ãi đây luận án sẽ tổng quan chi tiết về loài Dianella ensifolia, là loài đ°ÿc lựa chán để nghiên cứu.

Tổng quan về loài Dianella ensifolia

Loài Dianella ensifolia (L.) DC (tên đồng nghĩa Dianella nemorosa Lam Ex

Schiler f.), tên Viát Nam là X°¡ng qu¿t, H°¡ng lâu hay Huá rừng, BÁ chuát, há Hành (Liliaceae) [17, 26] Cõy thõn thÁo sống lõu năm cao tói 1-2m, và cú thõn rò nằm ngang Lỏ hẹp hỡnh thỏi dài tói 0,70 m, rỏng 3cm, khụng cú cuống, cỏi mỏc từ rò, cỏi mác trên thân xếp hai dãy, các lá trên có d¿ng lá bắc và có kích th°ãc nhỏ h¡n Cām hoa chùy gồm nhiều xim ngắn, mang nhiều hoa mác gần nhau; cuống hoa có thể dài tói 1cm, hoa màu trắng, vàng hay tim tớm, bao hoa cú 6 mÁnh, nhò 6, bầu 3 ụ QuÁ nang màu lam hay màu tớm sÁm, hỡnh cầu nhẵn, to cỡ 1cm, mòi ụ quÁ chớn chứa 1-3 h¿t trũn Ra hoa vào mựa hố NĂi sống ỗ vựng nhiỏt đói chõu Á và chõu Úc Cú phõn bố ỗ Ân Đỏ, Trung Quốc, Viỏt Nam ổ n°óc ta, D ensifolia là loài duy nhÃt trong chi Dianella [36] cõy th°ồng mỏc hoang trong rừng, đÃt trồng, cỏc savan cỏ từ bỡnh nguyên đến cao nguyên [26, 37]

1.1.5.2 Āng dụng trong y học cổ truyền ổ Malaixia, dựng cõy nÃu n°óc xụng, tro rò và tro lỏ chế thuốc bỏt dẻo chữa mān rỏp mỏc vũng Trung Quốc dựng rò cõy chữa mān s°ng lỗ, ghẻ ngứa, đau hỏng, phong thÃp tờ đau [37] Cõy đ°ÿc dựng trong điều trò nhiòm khu¿n da món tớnh, viờm b¿ch huyết, nÃm da và ỏp xe vết loột ỗ đốt sống [18] ổ Viỏt Nam cõy này mói chỉ đ°ÿc trỏn cựng mỏt số vò khỏc nh° quế, hồi làm h°Ăng cũn về sử dāng trong cỏc bài thuốc dân tác thì ch°a đ°ÿc đề cập đến [17]

X°Ăng qu¿t (D ensifolia) là loài phổ biến nhÃt trong chi, đ°ÿc tỡm thÃy ỗ nhiều n¡i khác nhau, đ°ÿc tập trung nghiên cứu về thành phần hóa hác nhiều nhÃt so vãi các loài còn l¿i Theo tài liáu đã công bố, các nhóm chÃt quinone, flavonoid, naphthalen, triterpenoid là những thành phần chính căa loài này

Từ rò loài D ensifolia, hai flavan mói (2S)-2′,4′-dihydroxy-7-methoxy-8- methylflavan (13), (2S)-2′-hydroxy-4′,7-dimethoxy-8-methylflavan (14), mát số flavan đã biết (-)-4'-hydroxy-7-methoxyflavan (1), (-)-4'-hydroxy-7-methoxy-8- methylflavan (11), (2S)-3',4'-dihydroxy-7-methoxyflavan (7), (2R)-7,4'-dihydroxy-5- methoxy-8-methylflavan (8), tupichinol A (12) ) [21, 25] và hai flavanone khác là naringenin (9), farrerol (10) đ°ÿc tinh s¿ch và chứng minh cÃu trúc [21]

Cỏc hÿp chÃt quinone vói tỏc dāng d°ÿc lý vụ cựng phong phỳ Từ lỏ và rò căa loài D ensifolia chứa các hÿp chÃt quinone Mãi chỉ có hai quinone đ°ÿc phân lập từ loài này là armandinol (hoặc 2 - hexyl -3 - (2-hydroxyethyl) -2, 3- dihydronaphtoquinone 1-4 (15) và chrysophanol (17)

Naphthalene là nhóm chÃt điển hình căa chi này, trong số 6 naphthalene tách đ°ÿc từ chi này thì riêng loài D ensifolia đã phát hián đ°ÿc hai chÃt là dianellidin

TÃt cÁ cỏc bỏ phận căa loài D ensifolia đó xỏc đònh đ°ÿc ba triterpene cựng khung cycloartane gồm cycloneolitsol (29), cyclopholidonol (30), và chÃt mãi 22- hydroxy-cyclolaudenol (31)

Hình 1.5 CÃu trúc các hÿp chÃt triterpenoid đ°ÿc phân lập từ loài D ensifolia

Ngoài các nhóm chÃt trên, trong thành phần hóa hác loài D ensifolia còn có năm mono-phenol: Rhizinoic acid (32) [27], 2,4-dihydroxy-6-methoxy-3- methylacetophenone (33), methyl 2,4-dihydroxy-3,5,6-trimethylbenzoate 36), methyl β-orcinolcarboxylate (39), và methyl orsellinate (40) [34]; hai mono-phenol glycoside mãi: methyl 2-hydroxy-3,6-dimethyl benzoate-4-O-β-D-glucopyranosyl- (1→6)-β-D-glucopyranoside (37), và methyl 2-methoxyl-6-methylbenzoate-4-O-β- D-glucopyranoside (38) [10] mát diarylpropane mãi 1-(2,4-dihydroxyphenyl)-3- (2,4-dimethoxy-3-methylphenyl) propane (đ°ÿc biết đến vãi tên DP hoặc UP302)

(34) [9]; và hai chromone: 5,7-dihydroxy-2,6,8-trimethylchromone (35), và isoeugenitol (41) [34]

BÁng 1.4 Các hÿp chÃt khác đ°ÿc phân lập từ loài D ensifolia

TT ch¿t Tờn ch¿t Bò ph¿n/cặn chi¿t TLTK

36 Methyl 2,4-dihydroxy-3,5,6- trimethylbenzoate Rò/ chloroform

Hình 1.6 CÃu trúc các hÿp chÃt khác đ°ÿc phân lập từ loài D ensifolia

Tinh dầu căa phần trên mặt đÃt loài D ensifolia đ°ÿc tách chiết bằng ph°¡ng phỏp tr°ng cÃt hĂi n°óc Thành phần cỏc chÃt căa nú đ°ÿc xỏc đònh bằng ph°Ăng phỏp GC-FID và GC-MS Cỏc thành phần chớnh đ°ÿc xỏc đònh trong tinh dầu gồm allo-aromadendrene (7,3%) (42), geranylacetone (6.2%) (44), perhydrofarnesyl acetone (4,4%) (45), longifolene (4,2%) (46) và β-caryophyllene (4,0%) (43) trong tổng số có 63 hÿp chÃt đ°ÿc phát hián (chiếm 97,2% tinh dầu) [6]

BÁng 1.5 Thành phần chính trong tinh dầu loài D ensifolia

STT (ch¿t) Tên ch¿t Tỷ lá (%) Tài liáu

Hình 1.7 CÃu trúc căa các chÃt trong tinh dầu căa loài D ensifolia

Các nghiên cứu về ho¿t tính sinh hác căa loài D ensifolia từ những năm 2000 trỗ l¿i đõy đó làm sỏng tỏ cụng dāng căa loài này trong y hỏc cổ truyền Ho¿t tớnh sinh hác căa loài D ensifolia gồm: chống oxy hóa, kháng vi sinh vật, kháng viêm, ức chế enzym, gây đác tế bào ung th° [2-10]

Theo Tang và cáng sự năm 2016, chÃt mãi 22-hydroxy-cyclolaudenol (31) phân lập từ loài D ensifolia có khÁ năng kháng các dòng tế bào ung th° hắc sắc tố da B16-F10, ung th° phổi A549, ung th° vỳ MDA-MB-231 vói giỏ trò IC50 t°Ăng ứng là 3,92; 10,39; 25,08 àM [38]

Dòch chiết methanol căa lỏ loài D ensifolia (D nemorosa) cú tỏc dāng gõy đỏc tế bào ung th° Hela vói giỏ trò IC 50 sau 48 giồ là 506,43 àg/mL [39] Tinh dầu căa loài cũng đ°ÿc nghiên cứu ho¿t tính gÃy đác tế bào dòng ung th° gan HepG2 và ung th° vỳ MCF7 và cú tỏc dāng trung bỡnh vói giỏ trò IC50 ỗ khoÁng 56,53 - 61,35 àg/mL [6].

Táng quan về chi Côm (Elaeocarpus)

Đặc điể m th ự c v ậ t

Chi Côm (Elaeocarpus), là chi lãn nhÃt thuác há Elaeocarpaceae, bao gồm xÃp xỉ 360 loài sinh tr°ỗng ỗ vựng cận nhiỏt đói và nhiỏt đói là chă yếu [40] Theo

Ph¿m Hoàng Hỏ, chi Cụm cú 38 loài đ°ÿc tỡm thÃy ỗ Viỏt Nam [41] Cỏc loài thuỏc chi Cụm đa phần cú kớch th°óc lón và trung bỡnh, cõy th°ồng xanh cú lỏ đĂn, th°ồng mỏc so le, đụi khi mỏc đối hay mỏc vũng, th°ồng cām l¿i ỗ đầu cành, th°ồng mộp lỏ cú khớa nh°ng đụi khi tiờu giÁm thành vÁy Hoa mỏc ỗ nỏch lỏ, đĂn đỏc hay thành cām, đối xứng tỏa tia Hoa th°ồng l°ỡng tớnh, mÁu 4 hoặc 5, gồm 4-5 lỏ đài và 4-5 cánh hoa, quÁ nang, quÁ h¿ch hay quÁ máng [42]

Côm hÁi nam (E.hainanensis) Côm xanh (E sylvestris)

Côm nhiều hoa (E floribundus) Côm tầng (E griffithii)

Hình 1.8 Mát số loài điển hình thuác chi Côm phân bố t¿i Viát Nam

Ā ng d ụ ng trong y h ọ c c ổ truy ề n

Trong y hác cổ truyền, các loài thuác chi Côm đ°ÿc biết đến nh° d°ÿc liáu vói nhiều cụng dāng nh° trò loột, viờm phổi và bỏnh phong, tăng huyết ỏp, trầm cÁm, đỏng kinh và cỏc bỏnh về gan, cÁi thiỏn l°u thụng mỏu [43-48] ổ Viỏt Nam, loài E floribundus đ°ÿc sử dāng điều trò mỏt số bỏnh nh° kiết lỵ, tiểu đ°ồng, viờm n°óu, sỏt trựng và điỏu trò nhiòm trựng [49].

Thành phần hóa học

Viác nghiên cứu hóa hác về chi Elaeocarpus đ°ÿc thực hián từ những năm 60

(1969), cho đến năm 2022 đã có h¡n 90 hÿp chÃt, bao gồm terpenoid, flavonoid, alkaloid, phenol các hÿp chÃt khác đ°ÿc tìm thÃy từ 16 loài căa chi này

Terpenoid đ°ÿc đánh giá là nhóm chÃt chính trong chi và cho nhiều ho¿t tính quan tráng Hián t¿i, đã có 39 hÿp chÃt terpenoid (47-84) đ°ÿc tìm thÃy từ chi Elaeocarpus Các hÿp chÃt này thuác các phân nhóm nh° sesquiterpenoid (47), diterpenoid (48-50), triterpenoid (51-83) và steroid (84) Trong đó, triterpenoid là phân nhóm chính vãi các khung điển hình nh° oleane, cucurbitane và lanostane Theo đó, 15 triterpenoid mãi tìm thÃy từ chi

Elaeocarpus gồm 3 triterpenoid glycoside khung oleane: (53), (54), (55) [12, 13]; và 12 triterpenoid khung cucurbitane: (64-71), (74), (75), (76), (77); 4 chÃt petiolaticins A-D (79-

BÁng 1.6 Cỏc terpenoid đ°ÿc tỡm thÃy ỗ chi Elaeocarpus

(ch¿t) Tờn ch¿t Loài/bò ph¿n TLT

Tetrahydro-4³-hydroxy-2,6,7,8³- tetramethyl-2- (4,8,12- trimethyltridecyl)-2H-chromene-

51 Epifriedelanol Lá và thân cành E floribundus

52 Friedelin Lá và thân cành E floribundus

53 1³-Hydroxy-olean-12-en-3-O-³-L- arabinopyranoside Cành E hainanensis

54 1³-Hydroxy-olean-12-en-3-β-D- xylopyranoside Cành E hainanensis

O-β-L-arabinopyranoside Phần trên mặt đÃt E hainanensis [12]

56 25-O-acetylcucurbitacin F QuÁ và thân cành E chinensis [51]

QuÁ và thân cành E chinensis, phần trên mặt đÃt

Thân cành E dolichostylus, phần trên mặt đÃt E hainanensis, cành E hainanensis

59 Cucurbitacin G Phần trên mặt đÃt E hainanensis [11]

QuÁ và thân cành E chinensis, phần trên mặt đÃt

62 Cucurbitacin O Phần trên mặt đÃt E hainanensis [11]

64 Elaeocarpucin A QuÁ và thân cành E chinensis

65 Elaeocarpucin B QuÁ và thân cành E chinensis

66 Elaeocarpucin C QuÁ và thân cành E chinensis

67 Elaeocarpucin D QuÁ và thân cành E chinensis

68 Elaeocarpucin E QuÁ và thân cành E chinensis

69 Elaeocarpucin F QuÁ và thân cành E chinensis, lá E petiolatus

70 Elaeocarpucin G QuÁ và thân cành E chinensis

71 Elaeocarpucin H QuÁ và thân cành E chinensis

72 3-epi-Isocucurbitacin D QuÁ và thân cành E chinensis

73 3-epi-Isocucurbitacin G Phần trên mặt đÃt E hainanensis [11]

QuÁ và phần trên mặt đÃt E chinensis, phần trên mặt đÃt

Phần trên mặt đÃt E hainanensis [11]

Hỡnh 1.9 CÃu trỳc mỏt số terpenoid tỡm thÃy ỗ chi Elaeocarpus

Phần trên mặt đÃt E hainanensis, lá E petiolatus

77 Hexanorcucurbitacin F Thân cành E dolichostylus, lá E petiolatus

78 19-Norlanosta-5,24-dien-11-one Phần trên mặt đÃt E hainanensis [11]

84 β-Sitosterol Lá và quÁ E floribundus, lá và thân cành E floribundus

Nhóm chÃt alkaloid chỉ đ°ÿc tìm thÃy trong 5 loài căa chi gồm E sphaericus,

E fuscoides, E ganitrus, E grandis, và E densiflorus 18 alkaloid (85-102), đ°ÿc tìm thÃy trong chi Elaeocarpus, trong đó có 15 chÃt mãi Ngo¿i trừ hÿp chÃt elaeocarpidine (101) thuác phân nhóm indol alkaloid, và eustifoline B (102) thuác phân nhóm carbazole alkaloid, còn l¿i 16 hÿp chÃt thuác phân nhóm indolizidine alkaloid Đáng chú ý là alkaloid chỉ đ°ÿc tìm thÃy trong lá căa các loài Elaeocarpus

Hỡnh 1.10 CÃu trỳc mỏt số alkaloid tỡm thÃy ỗ chi Elaeocarpus

BÁng 1.7 Cỏc alkaloid đ°ÿc tỡm thÃy ỗ chi Elaeocarpus

(ch¿t) Tờn ch¿t Loài/bò ph¿n TLTK

88 (±)-Elaeocarpine Lá E fuscoide, lá E ganitrus [56, 58]

98 (±)-Isoelaeocarpine Lá E fuscoides, lá E ganitrus [56, 58,]

99 (-)-Isoelaeocarpiline Lá E grandis, lá E sphaericus [57, 59]

Từ chi Elaeocarpus cú 10 flavone và dÁn xuÃt gắn vói đ°ồng glucose và rhamnose (103-112) đ°ÿc xỏc đònh [56, 61] Trong đú, flavone mearnsetin (107), myricetin (108), myricitrin (109) và quercetin (112) là những flavone phổ biến trong chi và đ°ÿc phỏt hiỏn ỗ nhiều loài khỏc nhau nh° E oblong, E floribundus, E serratus và E tuberculatus [56]

Hỡnh 1.11 CÃu trỳc cỏc flavonoid đ°ÿc tỡm thÃy ỗ chi Elaeocarpus

BÁng 1.8 Cỏc flavonoid đ°ÿc tỡm thÃy ỗ chi Elaeocarpus

(ch¿t) Tờn ch¿t Loài/bò ph¿n TLTK

107 Mearnsetin Lá E oblong, lá E floribundus, lá

108 Myricetin Lá E oblong, lá E floribundus, lá

109 Myricitrin Lá E floribundus, lá E serratus

112 Quercetin Lá E ganitrus, lá E tuberculatus [56]

 Phenol và nhóm chất khác

Ngoài các nhóm chÃt chính là terpenoid, alkaloid, flavonoid, các nghiên cứu cho thÃy rằng các loài trong chi này còn có hÿp chÃt phenol, trong số 17 chÃt có 3 polyphenol mãi là 4-O-methylellagic acid 3'-(3''-O-acetyl)-³-rhamnoside (113), 4-O- methylellagic acid 3'-(4''-O-acetyl)-α-rhamnoside (114), và 4-O-Methylellagic acid 3'-³-rhamnoside (115) đều đ°ÿc phân lập từ thân cành loài E parvifolius [62]

Ngoài ra, còn có 24 hÿp chÃt thuác nhiều nhóm khác còn đ°ÿc tìm thÃy trong chi Côm Trong đó, hai hÿp chÃt lần đầu tiên đ°ÿc phát hián 6'-O-galloylsambunigrin

(116) và từ lá E sericopetalus [63] và elaeocarpionoside (117) phân lập từ lá E japonicus [64]

Hỡnh 1.12 CÃu trỳc cỏc chÃt khỏc tỡm đ°ÿc ỗ chi Elaeocarpus

Ho ạ t tính sinh h ọ c

Nghiên cứu đã công bố cho thÃy các nhóm chÃt flavonoid, alkaloid, terpenoid, phenol trong chi này đều có ho¿t tính sinh hác phong phú, nh° tác dāng chống oxy húa, khỏng vi sinh vật, khỏng virut, khỏng viờm, khỏng nÃm, chống tiểu đ°ồng và ho¿t tính chống ung th° Đáng chú ý, hầu hết công bố về ho¿t tính chống ung th° căa các chÃt tách từ chi này đều thuác nhóm chÃt cucurbitane

Ba triterpene khung cucurbitane gồm cucurbitacin F (58), 23,24- dihydrocucurbitacin F (63) và hexanorcucurbitacin F (77) đ°ÿc phân lập từ thân cành loài E dolichostylus có ho¿t tính gây đác lên tế bào ung th° biểu mô (KB) và ung th° b¿ch cầu kháng thuốc (P388) Trong đó, cucurbitacin F (58) thể hián ho¿t tớnh ức chế m¿nh lờn cÁ hai tế bào ung th° KB và P388 vói giỏ trò ED 50 t°Ăng ứng là 0,074 và 0,04 μg/mL [50] Nghiên cứu sau này công bố cucurbitacin D (57) và cucurbitacin I (61) có khÁ năng ức chế lên các tế bào ung th° phổi (A549/ATCC) và ung th° gan (BEL-7402) vói giỏ trò IC50< 1 μM [11]

Kết quÁ thử nghiám 13 hÿp chÃt phân lập từ loài E chinensis cho thÃy triterpene cucurbitacin D (57), 3-epi-isocucurbitacin D (72), 25-O-acetylcucurbitacin

F (56), cucurbitacin I (61) có ho¿t tính ức chế tế bào ung th° biểu mô đ¿i trực tràng (HT-29) m¿nh vãi IC 50 từ 0,039 đến 0,54 μM, trong khi elaeocarpucin C (66) (IC 50 0,41 μM) [51]

Theo Sukari và công sự năm (2013) đã công bố cặn chiết chloroform lá E floribundus có tác dāng ức chế khá m¿nh lên tế bào ung th° b¿ch cầu cÃp tính (CEM-

SS) vói IC 50 = 25,6 ± 0,06 àg/mL, trong khi hÿp chÃt friedelin (52) phõn lập từ dòch chiết này l¿i cho ho¿t tính m¿nh chống l¿i tế bào ung th° biểu mô cổ tử cung (HeLa) vãi IC 50 = 3,54 ± 0,30 μg/mL [54]

Ho¿t tính chống ung th° căa petiolaticin A, B, và D (79-82) phân lập từ lá E petiolatus cho thÃy petiolaticin A (79) có tác dāng gây đác tế bào m¿nh nhÃt đối vãi dòng tế bào ung th° vú MDA-MB-468, MDA-MB-231, MCF-7 và ung th° đ¿i trực tràng SW48 vói giỏ trò IC50t°Ăng ứng là 7,4; 9,2; 9,3, và 4,6 μM [52]

D°ãi đây tổng quan chi tiết h¡n về loài Elaeocarpus hainanensis là loài đ°ÿc nghiên cứu trong luận văn này.

Tổng quan về loài Elaeocarpus hainanensis

Côm hÁi nam (Elaeocarpus hainanensis), hay Rì rì, Nang tai, Mành tang thuác chi Côm (Elaeocarpus), há Côm (Elaeocarpaceae) là cây đ¿i mác nhỏ, nhánh gần nh° khụng lụng Lỏ chām ỗ ngỏn, phiến thon hẹp, dài 10-14 cm, bỡa cú răng nhỏn, lâu nhÿt lúc khô, cuống 11-15 mm Chùm có lá hoa ráng, bìa có răng, hoa trắng th¡m, cánh hoa dài 1,5 cm, quÁ nhân cứng hình thoi dài 2,5 cm Cây phân bố chă yếu ỗ Viỏt Nam và Trung quốc ổ Viỏt Nam, cõy này th°ồng phõn bố bờn suối vựng Cao l¿ng, QuÁng Bình, Thừa Thiên Huế, Đà Nẵng [65, 66]

1.2.5.2 Thành phần hóa học và ho¿t tính sinh học

Loài E hainanensis mói đ°ÿc tỡm thÃy ỗ Trung Quốc và Viỏt Nam Loài này ch°a có nhiều công bố, từ năm 2008 đến nay có mát công bố về thành phần hóa hác và ho¿t tớnh chống ung th° căa cỏc chÃt từ cỏc phần trờn mặt đÃt căa cõy phõn bố ỗ Trung Quốc, và hai cụng bốỗ Viỏt Nam về thành phần húa hỏc Về thành phần húa hỏc đó tỡm thÃy ỗ loài E hainanensis 16 chÃt đều thuỏc nhúm terpenoid Trong đú, có 1 diterpenoid, 3 triterpen-oleane và còn l¿i là các triterpen cucurbitane

Meng và cụng sự đó cụng bố m°ồi hÿp chÃt đó đ°ÿc phõn lập từ loài

E.hainanensis, trong đó có 3 chÃt mãi là 16³,23³-epoxy-3β,20β-dihydroxy- 10³H,23βH-cucurbit-5,24-dien-11-one (74), 16³,23³-epoxy-3β,20β-dihydroxy-

10³H,23βH-cucurbit-5,24-dien-11-one 2-O-β-D-glucopyranoside (75), 16³,23³- epoxy-20β,25-dihydroxy-10³H,23βH-cucurbit-5- ene-11-one 3-O-β-D- glucopyranoside (76) và bÁy chÃt đã biết là 19-norlanosta-5,24-dien-11-one (78), cucurbitacin D (57), cucurbitacin F (58), cucurbitacin G (59), cucurbitacin I (61), cucurbitacin O (62), 3-epi-isocucurbitacin G (73) [11]

Cũng trong nghiên cứu này, tác giÁ đã công bố ho¿t tính gây đác tế bào ung th° phổi A549 và ung th° gan BEL-7042 căa các chÃt đã phân lập đ°ÿc Đáng chú ý, cucurbitacin D (57) và cucurbitacin I (61) cú ho¿t tớnh khỏ m¿nh thể hiỏn ỗ giỏ trò

Năm 2018, Nga và cáng sự đã công bố hai chÃt mãi thuác khung triterpenoid oleane 1³-hydroxy-olean-12-en-3-O-³-L-arabinopyranoside (53), là 1³-hydroxy- olean-12- en-3-O-β-D-xylopyranoside (54), cùng vãi 6 chÃt trong đó có mát chÃt thuác khung diterpenoid và 5 chÃt thuác khung triterpene cucurbitacin đó là cucurbitacin D (58), cucurbitacin F (58), cucurbitacin I (61), 3-epi-isocucurbitacin D

(72), cucurbitacin H (60) đ°ÿc phân lập từ cành căa E hainanensis [13]

Năm 2020, Tung và cáng sự đã tiếp tāc nghiên cứu và đã công bố thêm mát chÃt mãi cũng thuác khung triterpenoid oleane đó là 1³-hydroxy-olean-11-oxo-12- en-3-O-β-L-arabinopyranoside (55) [12]

BÁng 1.9 Các chÃt đ°ÿc tìm thÃy từ loài E.hainanensis

Tờn ch¿t Bò ph¿n/cặn chi¿t TLTK Sesquiterpenoid

Blumenol A Phần trên mặt đÃt/Diclomethane [13]

1³-Hydroxy-olean-12- en-3-O-β-D- xylopyranoside (54) Phần trên mặt đÃt/Butanol

1³-Hydroxy-olean-12-en-3-O-³-L- arabinopyranoside (53) Phần trên mặt đÃt/Butanol

1³-Hydroxy-olean-11-oxo-12-en-3-O-β-L- arabinopyranoside (55) Phần trên mặt đÃt/Butanol [12]

16³,23³-Epoxy-20β,25-dihydroxy-10³H,23βH- cucurbit-5- ene-11-one 3-O-β-D-glucopyranoside

Phần trên mặt đÃt/Butanol

16³,23³-Epoxy-3β,20β-dihydroxy-10³H,23βH- cucurbit-5,24-dien-11-one 2-O-β-D- glucopyranosid (75)

Phần trên mặt đÃt/Butanol

16³,23³-Epoxy-3β,20β-dihydroxy-10³H,23βH- cucurbit-5,24-dien-11-one (74) Phần trên mặt đÃt/Ethylacetat

19-Norlanosta-5,24- dien-11-one (78) Phần trên mặt đÃt/Ethylacetat

Cucurbitacin D (57) Phần trên mặt đÃt/Ethylacetat [11, 13]

Cucurbitacin F (58) Phần trên mặt đÃt/Diclomethane [11, 13]

Cucurbitacin I (61) Phần trên mặt đÃt/Diclomethane [13]

Cucurbitacin O (62) Phần trên mặt đÃt/Butanol

[11] 3-epi-isocucurbitacin G (73) Phần trên mặt đÃt/Butanol

Cucurbitacin H (60) Phần trên mặt đÃt/Diclomethane

[13] 3-epi-isocucurbitacin D (72) Phần trên mặt đÃt/Diclomethane

Về hoạt tính chống ung thư của các cucurbitane

Triterpenoid thực vật là mát lãp chÃt tự nhiên lãn, đa d¿ng về cÃu trúc và phổ tác dāng sinh hác ráng Trong đó chống ung th° là ho¿t tính đ°ÿc quan tâm nhiều nhÃt đặc biát là các cucurbitacin

Cucurbitane là triterpenoid bốn vòng, có nhiều trong các cây thuác há Bầu bí (Cucurbitaceae) nh° d°a chuát, bí ngô, và d°a hÃu Cho đến nay, h¡n 100 cucurbitacine và các dÁn xuÃt căa chúng đã đ°ÿc phân lập từ khoÁng 30 chi thuác há Cucurbitaceae, Elaeocarpacae, Euphorbiaceae [67]

Hình 1.13 CÃu trúc hóa hác khung cucurbitane

Nghiên cứu cho thÃy có khoÁng 17 cucurbitacin chính đ°ÿc ký hiáu từ A đến

T Trong đó có cucurbitacin B, -D, -E, -I và các dÁn chÃt căa chúng có ho¿t tính chống ung th° m¿nh nhÃt, sau đó là cucurbitacin F, -O, -P, -Q và các dÁn chÃt căa chúng đều cú ho¿t tớnh đỏc tế bào ung th° ỗ mức trung bỡnh Ho¿t tớnh chống ung th° căa các cucurbitacin này trên nhiều dòng tế bào ung th° khác nhau nh°: tiền liát tuyến, vú, phổi, da, gan, não, ruát kết, tử cung, vòm háng& [68]

Hình 1.14 CÃu trúc hóa hác căa cucurbitacin có tác dāng gây đác tế bào ung th°

CĂ chế gõy đỏc tế bào ung th° ỗ mức đỏ phõn tử căa cỏc cucurbitacin đó đ°ÿc nghiờn cứu khỏ sõu, nh° ức chế phõn chia tế bào ỗ pha phõn bào G1/M và G2/M, ức chế các tín hiáu kích ho¿t phiên mã nh° JAK/STAT3, làm gián đo¿n tổng hÿp F-actin (làm thay đổi hình d¿ng tế bào trong phân bào) [67]

Cucurbitacin B và -I đ°ÿc báo cáo có tác dāng ức chế sự phát triển căa tế bào ung th° ruỏt kết HCT116, SW480, DLD1 vói giỏ trò IC 50 từ 0,5 – 7,8 àM CÁ cucurbitacin B và -I đều tác đáng vào pha phân bào G2/M và gây hián t°ÿng tế bào chết theo ch°Ăng trỡnh (apotosis), đồng thồi ức chế sự hỡnh thành khối tế bào gốc ung th° (CSC) Thêm nữa cucurbitacin B và -I điều khiển giÁm các tín hiáu liên quan đến sự phát triển CSC đó là DCLK1, CD44, LGR5 và Notch [69]

Cucurbitacin D có khÁ năng ức chế tế bào ung th° cổ tử cung CaSki và SiHa vói IC 50 khỏ thÃp là 400 nM và 500 nM, đồng thồi cũng cú khÁ năng ngăn chặn sự xõm lÃn và di căn căa các tế bào này [70] Cucurbitacin D, -I và dÁn xuÃt căa cucurbitacin

D (3-epi-isocucurbitacin D) có ho¿t tính kháng dòng tế bào ung th° ruát kết HT-29 vãi

IC50 0,12 và 0,19 àM cũn 3-epi-isocucurbitacin D m¿nh hĂn vói giỏ trò IC50 là 0,039 àM [51] Cucurbitacin D và -I cú ho¿t tớnh gõy đỏc tế bào ung th° phổi (A549) và ung th° gan (BEL-7042) khỏ m¿nh vói giỏ trò IC 50 nhỏ hĂn 1àM [11]

Các cucurbitacin còn có tác dāng hiáp đồng khi kết hÿp vãi các tác nhân hóa trò liỏu nh°: imatinib mesylate, paclitaxel, docetaxel, và gemcitabine [71] Cucurbitacin B đ°ÿc thử nghiám tác dāng hiáp đồng vãi cisplatin trên dòng tế bào ung th° biểu mụ bàng quang (MB49) Kết quÁ cho thÃy giỏ trò IC 50 căa cisplatin sau

48 giồ xử lý vói tế bào là 20 àM, cũn cucurbitacin B là 0,25 àM, trong khi ỗ liều kết hÿp IC50 là 10 àM cisplatin và 0,1 àM cucurbitacin B [72]

Cucurbitacin B, -E, -D, -I cũng đ°ÿc nghiên cứu tác dāng hiáp đồng vãi các phõn tử thuốc nhỏ làm tăng hiỏu quÁ và giÁm tế bào khỏng thuốc đồng thồi ức chế sự xâm lÃn, di căn căa tế bào ung th° [73] Cucurbitacin B đ°ÿc Yuang và cáng sự báo cáo về ho¿t tính chống ung th° phổi NSCLC theo c¡ chế gây chết pyrotosis (cũng là mát ch°¡ng trình chết căa tế bào) Cucurbitacin B còn đ°ÿc thử nghiám tác dāng chống khối u trờn chuỏt ỗ liều 0,75 mg/kg cho hiỏu quÁ tốt hĂn so vói chÃt đối chiếu gefitinib ỗ liều 40 mg/kg [74, 75] Cucurbitacin cú tỏc dāng chống ung th° thụng qua nhiều c¡ chế, bao gồm ức chế sựtăng sinh căa tếbào ung th°, thúc đ¿y quá trình bắt giữ chu kỳ tế bào và quá trình làm chết tế bào theo ch°¡ng trình (apoptosis), ức chế sự xõm lÃn và di căn, đồng thồi phỏ hăy bỏ x°Ăng protein Cucurbitacin kớch ho¿t mitogen (STAT và MAPK kinase protein) và ức chế di căn căa các tế bào ung th° [73]

So vói cỏc nhúm chÃt tự nhiờn khỏc, cucurbitacin th°ồng cú đỏc tớnh m¿nh h¡n Ng°ỡng gây đác căa chúng là từ 2-12,5 mg/kg, cucurbitacin D, -E, -C, -I có tính đác m¿nh h¡n các cucurbitacin còn l¿i Đác tính căa các cucurbitacin tăng khi có sự liờn kết đụi xuÃt hiỏn ỗ C-23 và nhúm acetyl ỗ C-25 Tuy cú đỏc nh°ng cucurbitacin cú nhiều °u thế nh° cú ho¿t tớnh ỗ nồng đỏ khỏ thÃp và thÃp hĂn nhiều so vói ng°ỡng gây đác [67]

Ngoài ho¿t tính chống ung th°, các cucurbitacin còn thể hián ho¿t tính kháng viêm, chống vi rut, bÁo vá gan Bên c¿nh đó, các cucurbitacin còn có tác dāng hiáp đồng khi kết hÿp vói cỏc hÿp chÃt điều trò ung th° khỏc, nờn gần đõy chỳng đ°ÿc quan tâm nghiên cứu nhiều [73]

Tổng quan về thành phần húa hỏc và ho¿t tớnh sinh hỏc ỗ trờn vói đònh h°óng māc tiêu tìm kiếm các hÿp chÃt có ho¿t tính ung th°, luận án lựa chán nghiên cứu về hóa hác căa loài X°¡ng qu¿t (Dianella ensifolia) và Côm hÁi nam (Elaeocarpus hainanensis) và đánh giá tác dāng gây đác tế bào căa các hÿp chÃt phân lập đ°ÿc

ChÃt cú ho¿t tớnh tốt, sẽ tập trung nghiờn cứu sõu tỏc dāng ỗ mức đỏ phõn tử

CH¯ĂNG 2: ĐịI T¯ỵNGVÀ PH¯ĂNG PHÁP NGHIấN CĄU

MẪU THỰC VắT

MÁu cây X°¡ng qu¿t (Dianella ensifolia) đ°ÿc Th¿c sỹ Trần Thái Vinh, Vián nghiờn cứu khoa hỏc Tõy Nguyờn thu hỏi và đònh danh vào thỏng 5 năm 2017, mÁu l°u t¿i Khoa Húa hỏc, Tr°ồng Đ¿i hỏc Cụng nghiỏp Hà nỏi

Hình 2.1 Ành tiêu bÁn cây X°¡ng qu¿t (D ensifolia)

MÁy cây thân cành và lá đ°ÿc thu thập t¿i Hà Tĩnh, tháng 11 năm 2019 Tên cõy Elaeocarpus hainanensis Oliv do Tiến sỹ Đò Ngỏc Đ¿i, khoa Lõm nghiỏp, tr°ồng Đ¿i hỏc kinh tế Nghỏ An xỏc đònh; tiờu bÁn (ký hiỏu là 40TN/EH) đ°ÿc l°u giữ t¿i Vián Hóa hác, Vián Hàn lâm KHCNVN

Hình 2.2 Ành loài Côm hÁi nam (E hainanensis).

PH¯¡NG PHÁP NGHIÊN CĄU

Phương pháp phân lập các chất

* Sắc ký lớp mỏng (TLC)

Tiến hành sắc ký bÁn mỏng trờn bÁn mỏng nhụm chu¿n bò sẵn silica gel Merck

60 F254, đỏ dày 0,2mm Đốn tử ngo¿i ỗ hai b°óc súng 254 và 365 nm đ°ÿc sử dāng để phỏt hiỏn cỏc hÿp chÃt hoặc hoặc dựng thuốc thử là dung dòch vanilin/H2SO4 10% pha vói ethanol , nung núng ỗ khoÁng 110 0 C cho đến khi hiỏn vết

Sắc ký cỏt đ°ÿc tiến hành vói chÃt hÃp phā là silica gel 60 pha th°ồng vói kớch th°ãc h¿t 0,06-0,2 mm và 0,040-0,063 mm (Merck) , và sephadex LH-20, sắc ký cát pha đÁo RP-18

* Sắc ký lớp mỏng điều chế

Sắc ký lãp mỏng điều chế đ°ÿc thực hián trên bÁn mỏng tráng sẵn silica gel 60G F254 (Merck), phỏt hiỏn cỏc hÿp chÃt bằng đốn tử ngo¿i ỗ hai b°óc súng 254 và

365 nm Hoặc cắt hai mép ngoài căa bÁn mỏng để phun thuốc thử vanilin/H2SO4 gia nhiỏt khoÁng 110 0 C đến khi phỏt hiỏn vết, ghộp l¿i bÁn mỏng nh° cũ để xỏc đònh vùng chÃt phân bố, sau đó c¿o lãp silica gel đã hÃp phā chÃt, giÁi hÃp phā chÃt bằng dung môi phù hÿp.

Phương pháp xác định cấu trúc hóa học

Sử dāng các ph°¡ng pháp phân tích thông số vật lý và phân tích phổ hián đ¿i kết hÿp vãi tra cứu tài liáu tài liáu tham khÁo để chứng minh cÃu trúc hóa hác căa các chÃt s¿ch phân lập đ°ÿc

Sử dāng cỏc ph°Ăng phỏp và thiết bò sau:

* Độ quay cực ([³] D ) Đá quay cực đ°ÿc đo trên máy JASCO P-2000 Polarimeter căa Vián Hóa sinh biển – Vián Hàn lâm KHCNVN

Phổ hồng ngo¿i đ°ÿc đo trên máy Bruker TENSOR 37 FT-IR căa Vián Hóa hác – Vián Hàn lâm Vián Hàn lâm KHCNVN

Phổ khối l°ÿng phun mù đián tử ESI-MS đ°ÿc đo trên máy Agilent 1260 căa Vián Hóa sinh biển – Vián Hàn lâm KHCNVN

Phổ khối l°ÿng phân giÁi cao HR-ESI-MS đo trên máy Q-TOF LC/MS t¿i Vián Hóa hác và Vián Hóa sinh biển - Vián Hàn lâm KHCNVN

* Phổ cộng hưởng từ h¿t nhân (NMR)

Phổ NMR đ°ÿc đo trên máy Brucker Avance 500 MHz, và Brucker NEO 600 MHz, t¿i Vián Hóa hác - Vián Hàn lâm Vián Hàn lâm KHCNVN

Các kỹ thuật NMR đ°ÿc sử dāng bao gồm:

Phổ cỏng h°ỗng từ h¿t nhõn mỏt chiều: 1 H-NMR, 13 C-NMR, và DEPT Phổ cỏng h°ỗng từ h¿t nhõn hai chiều: HSQC, HMQC, COSY và NOESY Dung môi đ°ÿc sử dāng bao gồm: DMSO-d 6 , CD3OD, CDCl3 ChÃt nái chu¿n là tetramethylsilane (TMS) hoặc tín hiáu dung môi.

Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học

2.2.3.1 Đánh giá ho¿t tính gây độc tế bào

* Ph°¡ng pháp dùng thuốc nhuám Sulforhodamine B (SRB)

Nguyên lý căa ph°¡ng pháp:

Xỏc đònh khÁ năng gõy đỏc tế bào bằng ph°Ăng phỏp căa phỏpViỏn Ung th° Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute – NCI) Xỏc đònh khÁ năng sống sút căa tế bào bằng xỏc đònh hàm l°ÿng protein tế bào tổng số dựa vào phộp đo mật đỏ quang hỏc (OD – Optical Density) khi nhuụm tế bào vói SRB Giỏ trò OD đo đ°ÿc sẽ tỷ lỏ thuận vãi l°ÿng SRB gắn vãi phân tử protein L°ÿng tế bào sống càng nhiều thì l°ÿng protein càng nhiều thỡ giỏ trò OD sẽ càng lón

Tếbào và các b°ãc tiến hành:

A549, T24, Huh-7, 8505, SNU-1, đ°ÿc mua từ ngân hàng tế bào ATCC và đ°ÿc tặng bỗi GS John M Pezzuto, tr°ồng đ¿i hỏc Long-Island (Hoa Kỳ)

Thu tế bào bằng ph°¡ng pháp trypsin hóa và đếm tế bào bằng buồng đếm để xỏc đònh số l°ÿng tế bào và gieo tế bào vào giếng vói mật đỏ nhÃt đònh Chu¿n bò chÃt thử thành mát dãy các nồng đá vào đĩa 96 giếng Giếng đối chứng ngày 0 là giếng chỉ có 190 L tế bào ung th° thử nghiám và không có chÃt thử Giếng đối chứng ngày

0 sẽ đ°ÿc cố đinh bằng Trichloracetic acid – TCA 20% sau 1 giồ Đĩa thớ nghiỏm tiếp tāc đ°ÿc nuụi trong điều kiỏn 37 0 C, 5% CO2, 72 giồ Sau đú cố đònh bằng Trichloracetic acid – TCA 20% trong 1 giồ, nhuỏm SRB 30 phỳt ỗ điều kiỏn 37 o C Rửa acetic acid 3 lần, để khụ ỗ điều kiỏn phũng thớ nghiỏm Hũa tan SRB bằng unbuffered Tris base 10 mM, lắc nhẹ 10 phỳt rồi đỏc kết quÁ OD ỗ b°óc súng 540 nm trên máy ELISA Plate Reader (Biotek) [76]

Xỏc đònh % ức chế sự phỏt triển căa tế bào khi xử lý vói chÃt thử bằng cụng thức d°ãi đây:

Lặp l¿i thí nghiám 3 lần để đÁm bÁo đá tin cậy Đối chứng d°¡ng đ°ÿc sử dāng là ellipticine vãi nồng đá là 10; 2; 0,4; 0,08 g/mL

Sử dāng phần mềm TableCurve 2Dv4 để tớnh toỏn giỏ trò IC50

* Ph°¡ng pháp dùng thuốc thử MTT

Nguyên lý căa ph°¡ng pháp:

Ph°¡ng pháp MTT (3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) là ph°Ăng phỏp so màu MTT bò chuyển húa thành cỏc tinh thể formazan bỗi cỏc enzim oxy húa khử trong ty thể Cú thể dựng mỏt số dung mụi hữu cĂ (isopropanol) để vừa phá huỷ màng tế bào và hoà tan các tinh thể formazan, sau đó đo đỏc kết quÁ OD ỗ 570 nm

Tếbào và các b°ãc tiến hành:

Cỏc dũng tế bào ung th° A549, Hep3B, Hela, MCF-7 đ°ÿc cung cÃp bỗi GS Jeong-Hyung Lee, tr°ồng Đ¿i hỏc quốc gia Kangwon, Hàn Quốc Tế bào ung th° đ°ÿc nuôi cÃy in vitro theo ph°¡ng pháp Mosmann và cáng sự [77]

Cỏc dũng tế bào này đ°ÿc duy trỡ ỗ 37 o C trong mụi tr°ồng RPMI 1640 hoặc DMEM có bổ sung huyết thanh nhau thai bò 10% (FBS), 100U/mL penicillin và 100 àg/mL streptomycin trong tă nuụi cÃy ỗ điều kiỏn 5% CO2, 37 0 C trong 48 giồ Tiếp tāc chuyển sang đĩa 96 giếng 200 àl dung dòch tế bào, mật đỏ 2-5 x 10 5 tế bào/giếng (tuỳ từng lo¿i tế bào) Sau 24 giồ, thờm chÃt thử đ°ÿc pha ỗ nồng đỏ thớch hÿp, DMSO thờm vào giếng đối chứng vói nồng đỏ bằng vói giếng thử Sau 72 giồ, thờm 0,5 mg/mL MTT, ă 4 giồ ỗ 37 o C và 5% CO2, rỳt hết mụi tr°ồng, sử dāng isopropanol để hòa tan kết tăa formazan Đo đá hÃp thā (OD) t¿i b°ãc sóng 570 nm Đối chứng d°¡ng đ°ÿc sử dāng trong phép thử này là camptothecin

Xỏc đònh giỏ trò CS % (% tế bào sống sút)

Giỏ trò CS: là khÁ năng sống sút căa tế bào ỗ nồng đỏ ban đầu căa mÁu thử, mÁu nào cho giỏ trò CS f 50% thỡ đ°ÿc cho là cú ho¿t tớnh

Giỏ trò CS(%) đ°ÿc tớnh theo cụng thức:

�㔶�㕆% = [OD (mẫu thử) – OD (blank)

OD (DMSO) – OD (blank) × 100] ± �㔎 Trong đó: OD: mật đá quang σ: đá lách tiêu chu¿n σ đ°ÿc tính theo công thức:

�㕛 2 1 xi: giỏ trò OD t¿i giếng i x ̅ : giỏ trò OD trung bỡnh n: số giếng thử lặp l¿i

Các mÁu có ho¿t tính (CS f 50% ± σ) sẽ đ°ÿc lựa chán thử nghiám tiếp theo hũa tan trong isopropanol Đỏ hÃp thā (OD) đ°ÿc đo ỗ 570 nm

2.2.3.2 Phương pháp phân tích số lượng tế bào, chu trình tế bào, xác định cÁm āng tế bào chết theo chương trình apoptosis.

* Nuôi tế bào OCI-AML3

Dũng tế bào ung th° tăy x°Ăng cÃp OCI-AML3 đ°ÿc nuụi trong mụi tr°ồng RPMI 1640 bổ sung 10% huyết thanh thai bũ và hòn hÿp 100à/ml penicillin,100 àg/mL streptomycin ỗ điều kiỏn 37 0 C, 5% CO2 Tế bào đang phỏt triển ỗ pha logarith đ°ÿc chuyển sang đĩa 24 giếng vãi nồng đá tế bào 2x10 5 tế bào/ml DMSO đ°ÿc thêm vào sao cho nồng đá t°¡ng đ°¡ng vãi nồng đá pha chÃt thử nghiám, chÃt thử nghiỏm đ°ÿc pha sao cho đ¿t đ°ÿc nồng đỏ mong muốn bằng DMSO và mụi tr°ồng nuụi cÃy [78] Xỏc đònh số l°ÿng tế bào bằng buồng đếm tế bào theo ph°Ăng phỏp buồng đếm

Tính tỉ lá tế bào sống theo công thức:

Phân tích sốl°ÿng tế bào, tế bào chết theo ch°¡ng trình apoptosis và chu trình tế bào

Phõn tớch chu trỡnh tế bào bằng kỹ thuật phõn tớch dũng chÁy để xỏc đònh hàm l°ÿng DNA trong nhân đ°ÿc nhuám bằng PI (propidium iodide) Tế bào đ°ÿc thu thập bằng ph°¡ng pháp ly tâm và rửa l¿i bằng đám PBS (phosphate-buffered saline) DNA đ°ÿc nhuỏm bằng PI 50 àg/mL pha trong PBS trong thồi gian 30 phỳt, ỗ 4 0 C Đo huỳnh quang trên máy phân tích dòng chÁy sử dāng Coulter Epics XL-MCL (Beckman Coulter Inc., Brea, CA, USA), phân tích bằng phần mềm FlowJo [79]

2.2.3.3 Phương pháp xác định biểu hiện một số gen liên quan đến ung thư bằng phương pháp Real-time PCR

* Thu nhận mARN từ mÁu (Qiagen RNeasy Plus Micro kit)

Dòng tế bào OCI-AML3 đ°ÿc xử lý vãi chÃt thử, và không xử lý vãi chÃt thử sau 24 giồ (nồng đỏ tối đa 5x10 5 tế bào) Ly tõm thu tế bào, thờm 350 àL đỏm RLT plus (đỏm ly giÁi mARN) Đỏm RLT plus đ°ÿc pha từ 1ml đỏm RLT thờm 10 àl β- mercaptoethanol (β-ME) hoặc 20 àL 2 M dithiothreitol (DTT) cho 1 ml RLT

Chuyển dòch ly giÁi sang cỏt gDNA, ly tõm 30 giõy trờn 10.000 vũng/phỳt, lo¿i bỏ cỏt giữ l¿i dòch Bổ sung thờm 350 àL ethanol 70% trỏn đều sau đú chuyển sang cỏt Rneasy MinElute, ly tõm ỗ >8000 vũng/phỳt, 15 giõy, lo¿i bỏ dòch và giữ cỏt

Bổsung 700 àl đỏm RW1 vào cỏt Rneasy MinElute, ly tõm >8000 vũng/phỳt

15 giõy, lo¿i dòch giữ cỏt Bổ sung 500 àL đỏm RPE vào cỏt Rneasy MinElute, ly tõm 15 giõy ỗ >8000 vũng/phỳt, lo¿i dòch thu cỏt Tiếp tāc thờm 500 àL ethanol 80% vào cỏt Rneasy MinElute, ly tõm 2 phỳt ỗ > 8000 vũng/phỳt, bỏ dòch thu cỏt Ly tõm tốc đỏ tối đa trong 5 phỳt, bỏ dòch thu cỏt Thờm 14 àL n°óc khử RNAse, ly tõm 1 phút, tốc đá tối đa thu ARN

* Tổng hÿp cDNA (ADN phiên mã ng°ÿc) theo QuantiTect Reverse Transcription kit (Qiagen)

Lo¿i ADN căa bỏ gen bao gồm: 2 àL đỏm lo¿i ADN, ARN (mÁu) t°Ăng đ°Ăng 1àg, n°óc khụng cú Rnase, tổng thể tớch 14 àL Ă 40 o C trong 2 phỳt, sau đú ă trờn đỏ PhÁn ứng sao mó ng°ÿc gồm: 1 àL (Quantiscript Reverse Transcriptase), 4 àL đỏm RT 1 àL mồi RT, 14 àL ARN mÁu Ă 15 phỳt ỗ 42 0 C, ă 3 phỳt ỗ 95 0 C Đ°ÿc sÁn ph¿m cDNA, để dùng cho phÁn ứng RT-PCR tiếp theo

* PhÁn ứng RT-PCR (theo TagMan assay): Tổng thể tớch 20 àL bao gồm 1 àL TagMan Gene Expression assay, 10 àL TagMan Gene Expression Master Mix (mã Hs00998133m1 căa TGF-β, Hs00919915_m1 căa ZNF-217, Hs00174128 m1 căa TNF-α và hs00187848_m1 căa Bcl-2 cung cÃp bỗi Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, United States) 4 àL AND sao mó ng°ÿc căa mÁu, 5 àL n°óc khử RNAse Trán đều và ly tâm, đặt phÁn ứng lên máy RT-PCR ABI-7300 Real-Time Cycler (Applied Biosystems, Foster City, CA, United States) Sử dāng ph°¡ng pháp ΔΔCt để xỏc đònh mức đỏ biểu hiỏn căa cỏc gen TGF-β, ZNF-217, TNF-α, Bcl-2 [80 – 82]

Loài X°¢ng qu¿t ( D ensifolia)

Chiết phân lớp các hoạt chất

Phần trên mặt đÃt căa cây X°¡ng qu¿t đ°ÿc thái nhỏ, sÃy khô, nghiền thô đ°ÿc

3 kg Bỏt này đ°ÿc ngõm chiết vói EtOH (4 lần x 10 lớt/lần) ỗ nhiỏt đỏ phũng trong

24 giồ Cỏc dòch chiết đ°ÿc gom l¿i, lỏc lÃy dòch trong, cÃt thu hồi dung mụi d°ói điều kián áp suÃt giÁm thu đ°ÿc cặn EtOH Cặn này đ°ÿc hòa vãi 2 lít n°ãc cÃt và tiến hành chiết phân bố lần l°ÿt bằng n-hexan, dicloromethan, ethyl acetat và butanol thu đ°ÿc cỏc dòch t°Ăng ứng Lần l°ÿt cÃt thu hồi dung mụi d°ói ỏp suÃt giÁm thu đ°ÿc cặn chiết n-hexan ký hiáu DNH (19 g), cặn chiết dicloromethan ký hiáu DNC

(46 g), cặn chiết ethyl acetat ký hiáu DNE (9 g), cặn chiết butanol ký hiáu DNB (62 g).

Chi ế t, tách các h ợ p ch ấ t

Cao chiết n-hexane căa cây X°¡ng qu¿t (DNH) 19g đ°ÿc chuyển lên cát silica gel vãi há dung môi rửa giÁi gradient n-hexane/EtOAc (97/3 đến 85/15, v/v) thu đ°ÿc

Phân đo¿n DNH3 (3,05 g) sẽ phân tách bằng cát sephadex (LH-20) bằng MeOH thu nhận 2 phân đo¿n DNH3.1 và DNH3.2 DNH3.2 (425 mg) tiếp tāc phân tách bằng cát sắc ký silica gel vãi há dung môi n-hexane/EtOAc/MeOH (20/1/0,5, v/v/v) thu đ°ÿc 3 phân đo¿n DNH3.2.1- DNH3.2.3 Phân đo¿n DNH3.2.3 (152 mg) đ°ÿc tinh chế bằng cát sắc ký silica gel vãi há dung môi n-hexane/EtOAc/MeOH (20/1/1, v/v/v) thu đ°ÿc chÃt s¿ch DN3 (5mg)

Phân đo¿n DNH4 (2,62 g) đ°ÿc phân tách trên cát silica gel vãi há dung môi rửa giÁi n-hexane/EtOAc (8/2, v/v) thu đ°ÿc 4 phân đo¿n DNH4.1-DNH4.4 Phân đo¿n DNH4.2 (310 mg) tiếp tāc đ°ÿc phân tách trên cát silica gel vãi há dung môi rửa giÁi n-hexane/Aceton (95/5, v/v) thu đ°ÿc 2 phân đo¿n DNH4.2.1 và DNH4.2.2 Phân đo¿n DNH4.2.2 (178 mg) đ°ÿc tinh chế bằng cát sephadex LH-20 rửa giÁi vãi MeOH thu đ°ÿc chÃt s¿ch DN9 (10 mg)

Cao chiết DCM căa cây X°¡ng qu¿t DNC (46 g) chuyển lên cát sắc ký silica gel vãi há dung môi gradient n-hexane/DCM (95/5 – 0/100, v/v) thu đ°ÿc 10 phân đo¿n ký hiáu từ DNC1 đến DNC10

Phân đo¿n DNC4 (2,13 g) đ°ÿc phân tách trên cát silica gel vãi há dung môi n-hexane/EtOAc/MeOH (8/1/0,5, v/v/v) thu đ°ÿc 3 phân đo¿n ký hiáu DNC4.1 – DNC4.3 Phân đo¿n DNC4.1 (212 mg) kết tinh bằng há dung môi n-hexan/EtOAc (9/1, v/v) thu đ°ÿc chÃt DN10 (21 mg) Phân đo¿n DNC4.3 (157 mg) tiếp tāc đ°ÿc tinh chế bằng cát sephadex (LH-20) dung môi rửa giÁi là MeOH thu đ°ÿc chÃt DN6

Phân đo¿n DNC7 (1,91 g) đ°ÿc phân tách bằng cát silica gel vãi há dung môi n-hexane/EtOAc/MeOH (8/2/1, v/v/v) thu đ°ÿc 3 phân đo¿n DNC7.1 – DNC7.3 Phân đo¿n DNC7.3 (361 mg) phân tách tiếp trên cát sắc ký silica gel vãi há dung môi n-hexane/aceton (80/20, v/v) thu đ°ÿc 2 phân đo¿n DNC7.3.1 và DNC7.3.2 Phân đo¿n DNC7.3.1 (80 mg) tiếp tāc đ°ÿc tinh chế bằng cát sephadex (LH-20) rửa giÁi vãi MeOH thu đ°ÿc chÃt DN4 (10 mg)

Cao chiết ethyl acetat căa cây X°¡ng qu¿t DNE (9 g) đ°ÿc chuyển lên cát sắc ký silica gel vãi há dung môi rửa giÁi n-hexane/EtOAc (95/5 –0/100, v/v) thu đ°ÿc

10 phân đo¿n ký hiáu DNE1-DNE10

Phân đo¿n DNE2 (3,24 g) đ°ÿc phân lập bằng cát sắc ký silica gel vãi há dung môi rửa giÁi DCM/MeOH (95/5 – 85/15, v/v) thu đ°ÿc 4 phân đo¿n DNE2.1 – DNE2.4 Phân đo¿n DNE2.2 (478 mg) tiếp tāc đ°ÿc tinh s¿ch bằng cát sephadex (HL-20) rửa giÁi vãi MeOH thu đ°ÿc chÃt DN8 (18 mg)

Phân đo¿n DNE4 (809 mg) đ°ÿc phân lập trên cát sắc ký silica gel vãi há dung môi rửa giÁi n-hexane/EtOAc/MeOH (8/2/1, v/v/v) thu đ°ÿc 3 phân đo¿n DNE4.1 – DNE4.3 Phân đo¿n DNE4.2 (215 mg) tiếp tāc đ°ÿc phân lập bằng cát sephadex LH-

20 rửa giÁi vãi MeOH thu đ°ÿc chÃt DN2 (10 mg)

Phân đo¿n DNE5 (877 mg) đ°ÿc phân lập trên cát sephadex HL-20 vãi MeOH thu đ°ÿc 2 phân đo¿n DNE5.1 và DNE5.2 Phân đo¿n DNE5.2 (25 mg) đ°ÿc làm s¿ch bằng sắc ký lãp mỏng điều chế vãi há dung môi rửa giÁi n-hexane/EtOAc/MeOH (8/2/1, v/v/v) thu đ°ÿc chÃt DN1 (5 mg)

Phân đo¿n DNE6 (347 mg) đ°ÿc phân lập bằng cát sắc ký silica gel vãi há dung môi rửa giÁi n-hexane/EtOAc/MeOH (50/20/2, v/v/v) thu đ°ÿc 3 phân đo¿n DNE6.1 – DNE6.3 Phân đo¿n DNE6.3 (179 mg) tiếp tāc đ°ÿc tinh chế bằng sắc ký cát silica gel vãi há dung môi n-hexane/EtOAc/MeOH (50/30/2, v/v/v) thu đ°ÿc 3 phân đo¿n DNE6.3.1 – DNE6.3.3 Phân đo¿n DNE6.3.2 (50 mg) đ°ÿc tinh chế bằng cát sephadex (HL-20) rửa giÁi vãi MeOH thu đ°ÿc chÃt DN5 (7 mg)

Cao chiết butanol căa cây X°¡ng qu¿t DNB (62 g) hòa tan trong MeOH chuyển lên cát sắc ký silica gel vãi há dung môi rửa giÁi CH2Cl2/MeOH (95/5 – 70/30, v/v), thu đ°ÿc 7 phân đo¿n DNB1-DNB7

Phân đo¿n DNB1 (3,11 g) đ°ÿc tiến hành sắc ký cát dianion (HP-20) vãi há dung môi MeOH/H2O (1/1 – 9/1, v/v) thu đ°ÿc 6 phân đo¿n DNB1.1 – DNB1.6 Phân đo¿n DNB1.2 (267 mg) đ°ÿc tinh chế tiếp bằng cát sephadex (LH-20) rửa giÁi vãi MeOH thu đ°ÿc 3 phân đo¿n Phân đo¿n DNB1.2.2 (173 mg) đ°ÿc tinh chế trên cát sắc ký pha đÁo RP-18, há dung môi MeOH/H2O (1/1, v/v) thu đ°ÿc phân đo¿n DNB1.2.2.1 (25 mg) Phân đo¿n này đ°ÿc tiếp tāc tinh chế bằng cát sephadex (LH-

20) rửa giÁi vãi MeOH thu đ°ÿc chÃt DN7 (10 mg)

Hình 3.1 S¡ đồ t¿o cao chiết từ loài X°¡ng qu¿t (D ensifolia)

Hình 3.2 S¡ đồ phân lập các chÃt từ cặn chiết n-hexane và buthanol căa loài X°¡ng qu¿t

Hình 3.3 S¡ đồ phân lập các chÃt từ cặn chiết ethyl acetat căa loài X°¡ng qu¿t

Hình 3.4 S¡ đồ phân lập chÃt từ cặn chiết dichloromethan căa loài X°¡ng qu¿t

H ằ ng s ố v ậ t lý và d ữ li ệ u ph ổ

 Hÿp chÃt DN1: 7-acetyl-4R, 8-dihydroxy-6-methyl-1-tetralone (hÿp chÃt mãi)

D¿ng rắn màu vàng Đá quay cực: [�㗼] D 25 = -17 (c = 0.1, CHCl3) CTPT:

C13H14O4, M = 234 Phổ 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3) và 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3): BÁng 4.1 HR-ESI-MS m/z: 233,0814 [M –H] –

 Hÿp chÃt DN2: 2(S)-2′,4′-dihydroxy-7-methoxyflavan (hÿp chÃt mãi) D¿ng lỏng màu vàng Đá quay cực: [�㗼] D 25 = -21 (c = 0.1, MeOH) CTPT:

C16H16O4, M = 272 Phổ 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD), 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3): BÁng 4.2 HR-ESI-MS: m/z 271,0976 [M - H] -

 Hÿp chÃt DN3: 2(S)-7,4′-dimethoxy flavan (lần đầu tiên tách từ thiên nhiên) D¿ng rắn màu trắng Đá quay cực: [�㗼] D 25 = -21 (c = 0.1, CHCl3) Phổ 1 H-NMR

(500 MHz, CDCl3) và 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3): BÁng 4.3

 Hÿp chÃt DN4: Diaensi-biflavan (hÿp chÃt mãi)

D¿ng rắn màu trắng Đá quay cực: [�㗼] D 25 = +29 (c = 0.1, CHCl3)

CTPT: C35H36O8, M = 584 Phổ 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3) và 13 C-NMR

(125 MHz, CDCl3): BÁng 4.4 HR-ESI-MS: m/z 585,2477 [M + H] +

 Hÿp chÃt DN5: Diaensi-biflavan A (hÿp chÃt mãi)

D¿ng rắn màu trắng CTPT: C34H34O8, M = 570 Phổ 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3) và 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3): BÁng 4.5 ESI MS m/z: 569,2187 [M-H] -

 Hÿp chÃt DN6: Methyl β-orcinolcarboxylate

D¿ng rắn màu vàng CTPT: C 10 H12O4, M = 196 Phổ 1 H-NMR (500 MHz,

CD3OD) và 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3): BÁng 4.6 ESI MS m/z: 197,09 [M+H] +

D¿ng rắn màu vàng CTPT: C24H30O12, M = 510 Phổ 1 H-NMR (500 MHz,

CD3OD) và 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD): BÁng 4.7 ESI MS m/z: 511,18 [M+H] +

D¿ng rắn màu vàng sáng CTPT: C30H18O10, M = 538 Phổ 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD): BÁng 4.8 ESI MS m/z: 539,0928

D¿ng rắn màu trắng CTPT: C29H48O, M = 412 Phổ 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3) và 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3): BÁng 4.9

D¿ng tinh thể hình kim màu trắng CTPT: C29H50O, M = 414 Phổ 1 H-NMR

(500 MHz, CDCl3) và 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3).

Loài Côm hÁi nam ( E hainanensis)

Chi ế t phân l ớ p các ho ạ t ch ấ t

Lá và cành cây Côm hÁi nam đ°ÿc thu hái về chặt nhỏ, sÃy khô, nghiền thành bỏt thụ đ°ÿc 5 kg Bỏt này đ°ÿc ngõm chiết vói MeOH (3 lần x 15 lớt/lần), ỗ nhiỏt đỏ phũng trong 24 giồ, dòch chiết đ°ÿc gom l¿i, lỏc lÃy dòch trong, cÃt thu hồi dung mụi d°ãi điều kián áp suÃt giÁm thu đ°ÿc cặn MeOH Cặn đ°ÿc hòa tan vãi 2 lít n°ãc cÃt, chiết phõn bố lần l°ÿt vói n-hexane, dicloromethan, thu đ°ÿc cỏc dòch chiết t°Ăng ứng Cỏc dòch đ°ÿc cÃt thu hồi dung mụi d°ói ỏp suÃt giÁm thu đ°ÿc cỏc cặn t°Ăng ứng ký hiáu EH, ED (60 g) Phần n°ãc còn l¿i sau khi chiết phân bố, cÃt lo¿i n°ãc đến khô đ°ÿc cặn n°ãc, hòa tan cặn n°ãc này vãi MeOH, sau đó cÃt lo¿i dung môi thu đ°ÿc cặn chiết MeOH căa cây Côm hÁi nam ký hiáu EM (20 g).

Chiết, tách các chất

Cặn chiết DCM căa cây Côm hÁi nam ED (60 g) đ°ÿc chuyển lên cát silica gel bằng há dung môi rửa giÁi gradient DCM/MeOH (9/1 – 5/5, v/v), thu đ°ÿc 10 phân đo¿n ED1-ED10

Phân đo¿n ED4 (10 g) đ°ÿc tiến hành sắc ký cát silica gel bằng há dung môi rửa giÁi gradient DCM/Acetone (9/1 – 5/5, v/v) thu đ°ÿc 4 phân đo¿n ED4.1- ED4.4 Phân đo¿n ED4.2 (1,15 g) tiếp tāc đ°ÿc phân tách trên cát silica gel bằng há dung môi gradient DCM/Acetone (9/1 – 5/5, v/v) thu đ°ÿc các chÃt EH14 (12 mg), EH15

Phân đo¿n ED5 (12 g) đ°ÿc tiến hành sắc ký cát silica gel bằng há dung môi gradient DCM/aceton (9/1 – 0/10, v/v) thu đ°ÿc 6 phân đo¿n nhỏ ED5.1 – ED5.6 Phân đo¿n ED5.1 (1,3 g), ED5.2 (320 mg), ED5.3 (350 mg), ED5.4 (230 mg) tiếp tāc đ°ÿc tinh chế bằng cát sephadex (LH-20) bằng há dung môi rửa giÁi DCM/MeOH (1/9, v/v) thu đ°ÿc chÃt EH5 (15 mg) và EH4 (3,5 mg), EH2a (10 mg), EH3 (12 mg)

Cao chiết EM (20 g) đ°ÿc chuyển lên cát silica gel vãi há dung môi gradient EtoAc/MeOH (9/1 – 5/5, v/v), thu đ°ÿc 4 phân đo¿n EM1- EM4

Phân đo¿n EM3 (8,2 g) đ°ÿc phân tách trên cát sắc ký silica gel bằng há dung môi rửa giÁi DCM/Acetone (9/1-5/5, v/v), thu đ°ÿc 5 phân đo¿n EM3.1-EM3.5 Phân đo¿n EM3.1 (254 mg) đ°ÿc phân tách tiếp trên cát sephadex (LH-20) bằng há dung môi rửa giÁi DCM/MeOH (1/9, v/v), kết hÿp vãi sắc ký bÁn mỏng điều chế vãi há dung môi DCM/MeOH (9/1, v/v) thu đ°ÿc chÃt EH6 (6 mg) Phân đo¿n EM3.3 (1,98 g) đ°ÿc phân tách tiếp trên cát silica gel bằng há dung môi gradient DCM/Acetone (95/5 – 85/15, v/v) thu đ°ÿc 6 phân đo¿n Các phân đo¿n EM3.3.4 (214 mg) và EM3.3.6 (195 mg) đ°ÿc tinh s¿ch tiếp trên cát sephadex (LH-20) bằng há dung môi rửa giÁi DCM/MeOH (1/9, v/v) thu đ°ÿc hai chÃt t°¡ng ứng là EH13 (7 mg) và EH9

(6 mg) Phân đo¿n EM3.4 (1,34 g) đ°ÿc phân lập trên cát sắc ký silica gel bằng há dung môi gradient DCM/MeOH (9/1-7/3, v/v), thu đ°ÿc 4 phân đo¿n EM3.4.1-EN3.4.4 Các phân đo¿n EM3.4.2 (196 mg) và EM3.4.3 (214 mg) đ°ÿc tinh s¿ch tiếp trên cát sephadex (LH-20) vãi há dung môi rửa giÁi DCM/MeOH (1/9, v/v) thu đ°ÿc hai chÃt t°¡ng ứng là EH8 (7 mg) và EH7 (6 mg)

Phân đo¿n EM4 (2,1 g) đ°ÿc phân lập trên cát sắc ký silica gel bằng há dung môi gradient DCM/MeOH (9/1-7/3, v/v) thu đ°ÿc 7 phân đo¿n EM4.1-EM4.7 Các phân đo¿n EM4.2 (123 mg), EM4.4 (201 mg), EM4.6 (178 mg) đ°ÿc tinh s¿ch tiếp trên cát sephadex (LH-20) vãi há dung môi rửa giÁi DCM/MeOH (1/9, v/v) thu đ°ÿc các chÃt t°¡ng ứng là EH10 (12 mg), EH11 (8 mg), EH12 (10 mg)

Hình 3.5 S¡ đồ t¿o cao chiết từ loài Côm hÁi nam (E hainanensis)

Hình 3.6 S¡ đồ phân lập các chÃt từ cặn chiết DCM căa loài Côm hÁi nam

Hình 3.7 S¡ đồ phân lập các chÃt từ cặn chiết methanol căa loài Côm hÁi nam

Hằng số vật lý và dữ liệu phổ

D¿ng rắn, màu trắng CTPT: C 30 H44O7, M = 516 Phổ 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3) và 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3): BÁng 4.11 ESI-MS m/z: 539,3 [M+Na] + ,

 Hÿp chÃt EH2: trong hòn hÿp EH2a (cucurbitacin D + cucurbitacin I (EH2))

D¿ng bát, màu trắng CTPT: C 30 H44O7 M = 516 1 H-NMR (500 MHz,

CD3OD), 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD): BÁng 4.12

 Hÿp chÃt EH3: 3-epi-isocucurbitacin D

D¿ng rắn, màu trắng CTPT: C30H44O7, M = 516 Phổ 1 H-NMR (500 MHz,

CD3OD) và 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD): BÁng 4.13

D¿ng rắn, màu trắng CTPT: C30H46O7, M = 518 Phổ 1 H-NMR (500 MHz,

CD3OD) và 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD): BÁng 4.14

D¿ng rắn, màu trắng CTPT: C30H46O8, M = 534 Phổ 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3) và 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3): BÁng 4.15

 Hÿp chÃt EH6: 16³,23³-epoxy-3β,20R-dihydroxy-10³H,23βH-cucurbit- 5,24-dien-11-one

D¿ng rắn màu trắng CTPT: C 30 H46O4, M = 470 Phổ 1 H-NMR (500 MHz,

CD3OD) và 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD): BÁng 4.16 HR-ESI-MS m/z: 471,3469

 Hÿp chÃt EH7: 16³,23³-epoxy- 3β,20β-dihydroxy-10³H,23βH- cucurbit- 5,24-dien-11-one-3-O-β-D-glucopyranoside

D¿ng bát màu trắng CTPT: C 36 H56O9, M = 632 Phổ 1 H-NMR (500 MHz,

CD3OD) và 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD): BÁng 4.17 HR-ESI-MS m/z: 655,3796 [M+Na] +

 Hÿp chÃt EH8: Elaeohainencin A (16³,23³-epoxy-cucurbit-3β,20β- dihydroxy-10aH,23βH 24-hydroperoxy-5,25-dien-11-one) (Hÿp hÃt mãi)

D¿ng rắn màu trắng CTPT: C30H46O6, M = 502 Phổ 1 H-NMR (500 MHz,

CD3OD) và 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD): BÁng 4.18 ESI-MS m/z: 503,3358 [M + H] + , tính toán lý thuyết, 503,3367 và 537,2989 [M+Cl] -

 Hÿp chÃt EH9: 1ủ,3ũ-dihydroxy-olean-12-ene -1-sulfate (Hÿp chÃt mói) D¿ng rắn màu trắng CTPT: C 30 H50O5S, M = 522 Phổ 1 H-NMR (600 MHz,

CD3OD) và 13 C-NMR (150 MHz, CD3OD ) BÁng 4.19 HR-ESI-MS: m/z 521,3308 [M - H] - HR-ESI-MS: m/z 441,3736 [M + H – SO3H] +

 Hÿp chÃt EH10: 1³-hydroxy-olean-12-en-3-O-³-L-arabinopyranoside D¿ng rắn màu trắng CTPT: C 35 H58O6, M = 574 Phổ 1 H-NMR (500 MHz ,

CD3OD + CDCl3) và 13 C-NMR (125 MHz , CD3OD + CDCl3): BÁng 4.20 HR-ESI-

 Hÿp chÃt EH11: 1ủ-hydroxy-olean-11-oxo-12-en-3-O-ũ-L- arabinopyranoside

D¿ng rắn màu trắng CTPT: C35H56O7, M = 588 Phổ 1 H-NMR (500 MHz,

CD3OD) và 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD): BÁng 4.21 HR-ESI-MS m/z: [M + H] + , 589,4132

 Hÿp chÃt EH12: 1³-hydroxy-olean-12-en-3-O-β-D-xylopyranoside

D¿ng bát màu trắng CTPT: C 35 H58O6, M = 574 Phổ 1 H-NMR (500 MHz,

CD3OD) và 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD): BÁng 4.21 HR-ESI-MS m/z: 619,4212, [M + HCOO] −

 Hÿp chÃt EH13: 1ủ,3ũ-dihydroxy-olean-18-ene 1- sulfate (Hÿp chÃt mói) D¿ng rắn màu trắng CTPT: C 30 H50O5S, M = 522 Phổ 1 H-NMR (500 MHz,

CD3OD) và 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD): BÁng 4.22 HR ESI MS: m/z 521,3296 [M - H] - m/z 545,3274 [M + Na] +

 Hÿp chÃt EH14: 5-(hydroxymethyl)-2-furancarboxaldehyde

D¿ng rắn màu trắng CTPT: C 6 H5O3, M = 125 Phổ 1 H-NMR (500 MHz, DMSO) và 13 C-NMR (125 MHz, DMSO): BÁng 4.23 HR-ESI-MS m/z: 126,0317 [M+H] +

D¿ng rắn, màu trắng CTPT: C 13 H20O3, M = 224 Phổ 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3) và 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3): BÁng 4.24.

Thÿ ho¿t tớnh chòng ung th°

Các hợp chất phân lập từ loài Xương quạt

Các hÿp chÃt DN1, DN2, DN3, DN4 đ°ÿc tiến hành thử nghiám ho¿t tính ức chế tăng sinh lờn bốn dũng tế bào ung th° ng°ồi đú là: A549, Hep3B, Hela, MCF-7 Bằng ph°Ăng phỏp thử nghiỏm MTT đ°ÿc mụ tÁ ỗ māc 2.4.1.2, cỏc hÿp chÃt trờn đ°ÿc xử lý vói cỏc dũng tế bào ung th° ỗ hai nồng đỏ 100 àM, và 30 àM, camptothecin đ°ÿc sử dāng trong phộp thử này là chÃt đối chứng d°Ăng đ°ÿc thử ỗ

2 nồng đỏ 5 và 10 àg/mL.

Các h ợ p ch ấ t phân l ậ p t ừ loài Côm h ả i nam

 Ho ạt tính gây độ c t ế bào ung thư

Các hÿp chÃt EH6, EH7, EH8 đ°ÿc lựa chán để thử nghiám ho¿t tính gây đác tế bào đối vói năm dũng tế bào ung th° ỗ ng°ồi đú là: A549, T24, Huh-7, 8505, SNU-

1 Bằng ph°Ăng phỏp nhuỏm Sulforhodamine B (SRB) đ°ÿc mụ tÁ ỗ māc 2.4.1.1, cỏc hÿp chÃt này đ°ÿc xử lý vói cỏc dũng tế bào ung th° ỗ mỏt dóy cỏc nồng đỏ pha loóng từ 0,8 đến 100 àg/mL, chÃt đối chứng d°Ăng ellipticine đ°ÿc pha loóng ỗ cỏc nồng đỏ từ 0,08 đến 10 àg/mL

 Ho ạt tính gây độ c t ế bào ung thư dòng OCI-AML3

Các hÿp chÃt EH2a, EH3, EH10 đ°ÿc thử nghiám khÁ năng gây đác tế bào dũng OCI-AML3 bằng ph°Ăng phỏp mụ tÁ ỗ māc 2.4.2 Cỏc hÿp chÃt đ°ÿc xử lý vói tế bào ỗ cỏc nồng đỏ khỏc nhau nh°: EH2a (0,1; 1; 10 àg/mL), EH3 (0,05; 0,5; 5 àg/mL) EH10 (5, 10,15 àg/mL)

 Phân tích ảnh hưở ng c ÿ a các h ợ p ch ất đế n chu trình t ế bào

Cỏc hÿp chÃt EH1, EH2a, EH3, EH10 đ°ÿc thử nghiỏm phõn tớch Ánh h°ỗng đến chu trỡnh tế bào dũng OCI-AML3 đ°ÿc mụ tÁ ỗ māc 2.4.2 Cỏc hÿp chÃt này đ°ÿc xử lý tế bào ỗ cỏc nồng đỏ khỏc nhau nh°: EH1 (0,03; 0,3; 3 àg/mL), EH2 (0,1;

1; 10 àg/mL), EH3 (0,05; 0,5; 5 àg/mL), EH10 (5; 10; 15 àg/mL) Đối chứng đ°ÿc sử dāng trong phép thử này là DMSO

 Ho ạ t tính gây c ả m ā ng apoptosis

Hai hÿp chÃt EH1 và EH3 đ°ÿc thử nghiám ho¿t tính gây cÁm ứng apoptosis đối vói dũng tế bào ung th° OCI-AML3 theo ph°Ăng phỏp đ°ÿc mụ tÁ ỗ māc 2.4.2

EH1 đ°ÿc thử nghiỏm ỗ cỏc nồng đỏ 0,03; 0,3 và 3 àg/mL, EH3 ỗ nồng đỏ 0,05; 0,5 và 5 àg/mL

 Nghiên c āu tác động đế n bi ể u hi ệ n gen c ÿ a các cucurbitacin

Hai hÿp chÃt EH1 và EH3 đ°ÿc thử nghiám ho¿t tính gây biểu hián giÁm các gen TNF-α, Bcl-2, TGF-β, ZNF-217 bằng ph°Ăng phỏp mụ tÁ ỗ māc 2.4.3 EH1 đ°ÿc thử nghiỏm ỗ nồng đỏ 0,3 và EH3 là 0,5 àg/mL

CH¯ĂNG 4: KắT QUÀ VÀ THÀO LUắN

Các k¿t quÁ nghiên cąu về thành phÁn hóa hác

Xác định cấu trúc hóa học cÿa các chất phân lập từ loài Xương quạt (Dianella ensifolia)

Từ phần trên mặt đÃt căa loài X°¡ng qu¿t, sử dāng ph°¡ng pháp sắc ký cát, sắc ký bÁn mỏng điều chếđó phõn lập và xỏc đònh đ°ÿc cÃu trỳc húa hỏc căa 10 hÿp chÃt, bao gồm 4 phenolic mãi: 7-acetyl-4R,8-dihydroxy-6-methyl-1-tetralone (DN1); (2S)- 2′,4′-dihydroxy-7-methoxyflavan (DN2); diaensi-biflavan (5-hydroxy-7,4'-dimethoxy- (6,6''-methylen)-biflavan) (DN4); diaensi-biflavan A (5-hydroxy-7,4'-dimethoxy-6,6''- methylen-(5,4'-dihydroxy-7-methoxy) (DN5 ) ; chÃt lần đầu tách từ thiên nhiên (2S)- 7,4′-dimethoxyflavan (DN3) và 5 chÃt đã biết (DN6–DN10), bao gồm methyl ò- orcinolcarboxylate (DN6), dianellose (DN7), amentoflavone (DN8), sitosterone (DN9) và ò-sitosterol (DN10)

 H ợp chất 7-acetyl-4R,8-dihydroxy-6-methyl-1-tetralone (DN1)

Hÿp chÃt DN1 đ°ÿc phõn lập ỗ d¿ng bỏt, màu vàng Phổ HR-ESI-MS căa hÿp chÃt DN1 xuÃt hiỏn pic ion giÁ phõn tử ỗ m/z = 233,0814 [M-H] - cho phộp xỏc đònh đ°ÿc CTPT căa DN1 là C13H14O4 (tính toán C13H13O4, 233,0814)

Phổ 1 H-NMR căa DN1 cho thÃy tớn hiỏu căa mỏt nhúm hydroxy ỗ ã H 12,85 ppm (OH-8, s), mỏt tớn hiỏu proton thĂm ỗ ã H 6,90 (H-5, s), mỏt proton oxymethine ỗ ã H 4,87 (H-4, dd; 4,0, 7,0), hai nhúm methyl ỗ ã H 2,31 (CH3-6, s) và 2,56 (CH3-CO-

7, s) và bốn proton methylene ỗ 2,17–2,98 ppm Phổ 13 C-NMR, cú 13 tớn hiỏu carbon bao gồm hai nhúm carbonyl ỗ ã C 203,5 (C-1) và ã C 203,7 (C=O, C-11), hai nhúm methyl ỗ ã C 20,5 (CH3-6) và 32,0 (C-12), mỏt carbinol ỗ ã C 67,6 ppm (C-4), hai carbon methylene ỗ ã C 31,3 (C-3) và 34,7 (C-2), và sỏu tớn hiỏu carbon vũng thĂm.Từ cỏc tớn hiỏu phổ NMR ỗ trờn và so sỏnh vói phổ căa chÃt 3,4-dihydro-4,8-dihydroxy- 6-methoxy-7-methyl-1(2H)-naphthalenone [83] và 7-acetyl-3, 6-dihydroxy-8- methyl-1-tetralone [84], chÃt DN1 đ°ÿc dự đoán có khung tetralone Tín hiáu nhóm hydroxy ỗ tr°ồng thÃp (ã H 12,85) do t¿o liờn kết hydro nỏi phõn tử vói nhúm carbonyl và carbon thĂm ỗ ã C 160,2 giỳp xỏc nhận đ°ÿc cú nhúm thế hydroxy ỗ C-8 T°Ăng tỏc trờn phổ HMBC giữa tớn hiỏu proton ỗ ã H 2,56 (CH3-C=O) vói carbon ỗ ã C 128,8

(C-7), 203,7 (C=O), cho biết nhóm acetyl gắn vãi C-7 Các nhóm thế căa DN1 rÃt giống vói chÃt 7-acetyl-3,6-dihydroxy-8-methyl-1-tetralone [84], nh°ng khỏc nhau ỗ vò trớ căa chỳng và đ°ÿc xỏc đònh qua t°Ăng tỏc ỗ phổ HMBC Nhúm hydroxy gắn vói C-4 và methyl ỗ C-6 đ°ÿc xỏc đònh dựa trờn t°Ăng tỏc giữa H-5 (ã H 6,90 s) và

CH3–6 (ã C 20,5, C-13), C-4 (ã C 67,6), C-9 (ã C 113,6), C-7 (ã C 128,8), C-10 (ã C 145,6); giữa C-4 (ã C 67,6) và H-5 (ã H 6,90 s), H–2 (ã H 2,98, 2,65), H-3 (ã H 2,17); và giữa

CH3–6 (ã H 2,31, H-13) và C-5 (ã C 119,7), C-6 (ã C 145,2), C-7 (ã C 128,8), C-8 (160,2) trong phổ HMBC CÃu hỡnh tuyỏt đối R ỗ C-4 đ°ÿc xỏc đònh từ hiỏu ứng Cotton d°Ăng ỗ 260–270 nm trong phổ CD và so sỏnh vói cÃu hỡnh căa cỏc chÃt t°Ăng tự shinanolone [85, 86] Từ số liỏu phổ phõn tớch ỗ trờn, cÃu trỳc căa DN1 đ°ÿc xỏc đònh là 7-acetyl-4R,8-dihydroxy-6-methyl-1-tetralone, mỏt hÿp chÃt mói

Hình 4.1 CÃu trúc hóa hác căa chÃt DN1

BÁng 4.1 Dữ liáu phổ 1 H- và 13 C-NMR căa chÃt DN1 δ C a δ H b

OH-8 - 12,85 a: 125 MHz, CDCl3; b: 500 MHz, CDCl3 nd Tínhiáu ghi nhận đ°ÿc trong phổ HMBC, không ghi nhận đ°ÿc trong phổ 13 C NMR

Hình 4.2 Phổ CD căa hÿp chÃt DN1

Hình 4.3 Phổ HR-ESI-MS (negative) căa hÿp chÃt DN1

Hình 4.4 Phổ 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3) căa hÿp chÃt DN1

Hình 4.5 Phổ 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3) căa hÿp chÃt DN1

Hình 4.6 Phổ HMBC cÿa hợp chất DN1

 H ợp chất (2S) -2′,4′-dihydroxy-7-methoxyflavan (DN2)

Hình 4.7 CÃu trúc hóa hác căa hÿp chÃt DN2

Hÿp chÃt DN2 có góc quay cực là [�㗼] D 25 = -21° (CH3OH, c = 0,1), đ°ÿc phân lập ỗ d¿ng lỏng màu vàng CTPT căa DN2 đ°ÿc xỏc đònh là C 16 H16O4, dựa trờn pic ion giÁ phõn tửỗ m/z 271,0976 [M-H] - trong phổ HR-ESI-MS (tớnh toỏn C16H15O4, 271,0970) Phổ 1 H- và 13 C-NMR cho thÃy các tín hiáu điển hình căa khung flavan, bao gồm 12 tớn hiỏu aromatic carbon ỗ ã C 102,6–160,5; 2 nhúm methylene ỗ ã C 29,9 và 25,6 và nhúm oxymethine ỗ ã H 5,27 (dd, J,0; 2,5 Hz) và ã C 74,3 Sự xuÃt hiỏn căa ba tớn hiỏu proton thĂm ỗ ã H 6,96 (d, J=8,5 Hz, H-5), 6,44 (dd, J=8,0; 2,5 Hz, H-

6) và 6,40 (d, J=2,5 Hz, H-8) đặc tr°ng cho hỏ spin ABX T°Ăng tỏc giữa proton ỗ ã H 6,33 (H-3′) vói ã C 120,8 (C-1′), 156,3 (C-2′), 158,8 (C-4′), 107,6 (C-5′); giữa proton ỗ 7,14 (H-6′) vói cỏc carbon ã C 74,3 (C-2), 156,3 (C-2′) và 158,8 (C-4′) trờn phổ HMBC chứng tỏ hai nhúm hydroxy thế t¿i C-2′ (ã C 156,3) và C-4′ (ã C 158,8) Sự hiỏn diỏn căa mỏt nhúm methoxy đ°ÿc khẳng đònh qua cỏc tớn hiỏu ỗ ã H 3,75 và ã C

55,7 ppm Ba proton thĂm ỗ ã C 6,96 ppm (H-5, d, 8,5), 6,44 (H-6, dd, 8,0, 2,5) và 6,40 (H-8, d, 2,5) ỗ vũng A và cỏc t°Ăng tỏc trờn phổ HMBC giữa proton H-6 (ã H

6,44) vói cỏc carbon C-8 (ã C 102,6), C-10 (ã C 115,6), C-7 (ã C 160,5); giữa H-5 (ã H 6,96) vói C-4 (ã C 25,6), C-9 (ã C 157,6), C-7 (ã C 160,5); giữa H-8 (ã H 6,40) và C-6 (ã C

107,9), C-10 (ã C 115,6), C-9 (ã C 157,6), C-7 (ã C 160,5); và giữa proton methoxy (ã H 3,75) và C-7 (ã C 160,5) khẳng đònh vũng A cú nhúm methoxy ỗ C-7 (Hỡnh 4.11) Cỏc flavan đĂn giÁn th°ồng cú gúc quay cực õm nếu chỳng cú cÃu hỡnh tuyỏt đối 2S [87] ChÃt (2S)-3′,4′-dihydroxy-7-methoxy flavan đã đ°ÿc phân lập từ că Crinum bulbispermum [88] và Bauhinia manca [89] có [�㗼] D 25 = -16,7° (CH3OH, c = 0,7) ChÃt

DN2 chỉ khỏc chÃt trờn ỗ vò trớ căa nhúm hydroxy thứ hai và cú cựng gúc quay cực âm ([�㗼] D 25 = -21° (CH3OH, c = 0,1)) Do vậy, cÃu hình căa C-2 là S Từ viác phân tích phổ trên, cÃu trúc căa DN2 đ°ÿc xác đinh là (2S)-2′,4′-dihydroxy-7-methoxyflavan, mát hÿp chÃt mãi

BÁng 4.2 Dữ liáu phổ 1 H- và 13 C-NMR và HMBC căa hÿp chÃt DN2

6′ 128,3 CH 7,14, d (8,0) 1H C-2, C3′ (w), C-2′, C4′ a:125 MHz, CD3OD; b: 500 MHz, CD3OD

Hình 4.8 Phổ HR-ESI-MS (negative) căa hÿp chÃt DN2

Hình 4.9 Phổ 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD) căa hÿp chÃt DN2

Hình 4.10 Phổ 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD) căa hÿp chÃt DN2

Hình 4.11 Phổ HMBC căa hÿp chÃt DN2

Hình 4.12 CÃu trúc hóa hác căa hÿp chÃt DN3

Hÿp chÃt DN3 thu đ°ÿc ỗ d¿ng rắn màu trắng Phổ NMR căa chÃt DN3 cú cỏc tín hiáu đặc tr°ng cho cÃu trúc khung flavan vãi sự hián dián căa 2 vòng th¡m A và

B, bao gồm 12 tớn hiỏu carbon thĂm ỗ ã C 101,6 -159,1 Vũng C cú mỏt proton oxymethine ỗ ã H 4,98 (H-2, dd, J=2,0; 10,0 Hz; ã C 77,7) và 2 nhúm methylen ỗ ã H 2,15 và 2,10 (H-3, m; ã C 30,0), và ã H 2,91 và 2,74 (H-4, m; ã C 24,6) Sự xuÃt hiỏn căa ba tớn hiỏu proton thĂm ỗ ã H 6,97 (d, J=8,5 Hz, H-5), 6,48 (dd, J=8,0; 2,5 Hz, H-6) và 6,46 (s, H-8) đặc tr°ng cho há spin ABX Ngoài ra, sự xuÃt hián tín hiáu methyl singlet ỗ ã H 3,76 và 3,81 (CH3, s) trờn phổ 1 H-NMR, và carbon ỗ ã C 55,3/55,4 trờn phổ 13 C-NMR chứng tỏ sự hiỏn diỏn căa hai nhúm thế methoxy Vò trớ căa hai nhúm methoxy lần l°ÿt gắn ỗ C-7 và C-4′ đ°ÿc xỏc đònh dựa trờn t°Ăng tỏc giữa proton ỗ ã H 3,82 (H-11) vói carbon ã C 159,1 (C-7); giữa proton ã H 3,76 ppm (H-12) vói carbon ã C 159,4 (C-4′) trong phổ HMBC ChÃt DN3 cú gúc quay cực [�㗼] D 25 = -17 (CHCl3, c 0,1) Từ viỏc phõn tớch dữ liỏu phổ và so sỏnh vói tài liỏu [90], đó xỏc đònh đ°ÿc chÃt

DN3 là (2S)-7,4′-dimethoxyflavan Đây là lần đầu tiên chÃt này đ°ÿc phân lập từ nguồn thực vật và đ°ÿc coi là chÃt mãi

BÁng 4.3 Dữ liáu phổ 1 H- và 13 C-NMR căa hÿp chÃt DN3 và 7,4′-dimethoxyflavan

12 55,3 CH3 3,76, s, 3H 55,4 3,79, s, 3H a: 125 MHz, CDCl3; b: 500 MHz, CDCl3

 H ợp chất diaensi-biflavan (5-hydroxy-7,4′-dimethoxy-(6,6′′-methylen)- biflavan) (DN4)

Hình 4.13 CÃu trúc hóa hác căa hÿp chÃt DN4

Hÿp chÃt DN4 thu đ°ÿc ỗ d¿ng bỏt màu trắng, cú gúc quay cực [ �㗼] D 25 = +29 (CHCl3, c 0,1) Phổ 1 H- và 13 C-NMR cho thÃy các tín hiáu điển hình căa khung biflavan qua cầu nối methylen (C17H18O4), và tớn hiỏu căa mỏt nhúm methylene ỗ ã H

3,80 và ã C 16,2 Trờn phổ 13 C-NMR cú tớn hiỏu carbon thĂm căa 2 vũng thĂm A và

B xuÃt hiỏn ỗ ã C 92,0 đến 159,3 Vũng C cú mỏt tớn hiỏu oxymethine ỗ ã H 4,89 (H-2, dd, 2,0, 10,0; ã C 77,7) và 2 nhúm methylene ỗ ã H 2,15 và 1,99 (H2-3, m; ã C 29,5), và ỗ ã H 2,79 và 2,66 (H2-4, m; ã C 19,8) Hai cặp doublet ỗ ã H 7,33 (H-2′/H-6′, dd, 2,0; 8,0) và 6,91 (H-3′/H-5′, dd, 2,0; 8,0) đặc tr°ng cho nhõn benzen cú nhúm thế ỗ C-1' và C-4' Sự hiỏn diỏn căa nhúm hydroxy (ã H 8,17) và hai nhúm methoxy căa mòi đĂn vò đ°ÿc khẳng đònh bằng cỏc tớn hiỏu ỗ ã H 3,81 (ã C 56,1) và ã H 3,94 (ã C 55,3) CTPT căa DN4 đ°ÿc xỏc đònh là C35H36O8 qua pic ion giÁ phõn tử ỗ m/z 585,2477 [M + H] + (tính toán [C35H37O8] + , 585,2483) trong phổ (+)-HR-ESI-MS Từ dữ liáu phổ MS và NMR cho thÃy chÃt DN4 bao gồm hai đĂn vò flavan giống nhau đ°ÿc liờn kết vói nhau qua cầu nối là nhóm methylen

CÃu trỳc căa mòi đĂn vò đ°ÿc khẳng đònh là 5-hydroxy-7,4′-dimethoxy flavan dựa trờn cỏc liờn kết giữa proton H-8 (ã H 6,14) và C-6 (ã C 106,0), C-7 (ã C 155,1), C-

9 (ã C 154,5), C-10 (ã C 104,2); giữa proton OH-8 (ã H 8,17) và C-5 (ã C 154,1), C-6 (ã C 106,0), C-10 (ã C 104,2); giữa H-4 (ã H 2,66) và C-3 (ã C 29,5), C-5 (ã C 154,1), C-10 (ã C 104,2); và giữa H-2 (ã H 4,89) và C-4 (ã C 19,8), C-10 (ã C 133,8), C-2', C-6′ (ã C 127,4) trong phổ HMBC Hai đĂn vò flavan kết nối ỗ C-6 thụng qua mỏt nhúm methylene đ°ÿc xỏc đònh dựa trờn t°Ăng tỏc căa CH 2 (ã H 3,80) vói C-5 (ã C 154,1), C-

Xác định cấu trúc hóa học các chất từ loài Côm hải nam (Elaeocarpus hainanensis)

Từ bá phận lá và cành cây Côm hÁi nam, 15 hÿp chÃt đã đ°ÿc phân lập và xác đònh cÃu trỳc đú là: 13 triterpen, trong đú cú 8 hÿp chÃt khung cucurbitacin (EH1-

EH8) và 5 triterpen có khung oleanen (EH9-EH13), 1 furfural (EH14) và 1 megastigman (EH15) Trong đó, ba chÃt EH8, EH9 và EH13 là các chÃt mãi

Hình 4.31 CÃu trúc hóa hác căa hÿp chÃt EH1

Kết hÿp phổ NMR và pic ion giÁ phõn tử [M+Na] + ỗ m/z 539,3 trong phổ ESI-

MS đó xỏc đònh đ°ÿc CTPT căa EH1 là C30H44O7 (Hỡnh 4.31) Phổ 1 H-NMR căa hÿp chÃt EH1 cho thÃy cỏc tớn hiỏu căa tỏm nhúm methyl từ ã H 0,98 đến 1,39 và hai proton carbinol ỗ ã H 4,34 và 4,45 (H-16 và H-2) Ngoài ra, phổ 1 H-NMR cũn cú mỏt tớn hiỏu căa proton olefin ỗ ã H 5,78 (H-6) và hai tớn hiỏu trans-olefin ỗ ã H 6,63 và 7,13 (H-23 và H-24, d, J,5 Hz) Các tín hiáu proton methine và methylene xuÃt hiỏn ỗ tr°ồng cao trong khoÁng ã H 1,22 đến 2,56; trong khi cỏc tớn hiỏu gần nhúm carbonyl chuyển dòch sang tr°ồng thÃp hĂn, cā thể ã H 3,31 (H-12a, d, J=14,5 Hz) và 2,69 (H-12b, d, J=14,5 Hz) và ã H 2,78 (H-10, br d, J=13,0 Hz)

Phổ 13 C-NMR căa chÃt EH1 cho thÃy cú 30 carbon gồm tỏm nhúm methyl (ã C

19,3 đến 29,5); bốn carbon carbinol ỗ ã C 71,6 (C-2), 71,5 (C-16), 78,1 (C-20) và 71,2 (C-25) và ba carbon carbonyl ỗ ã C 202,5 (C-22), 212,2 (C-11) và 213,0 (C-3), cho thÃy chÃt EH1 là mát triterpene thuác nhóm cucurbitacin Từ số liáu phổ và so sánh vói tài liỏu [101] (BÁng 4.11), cÃu trỳc căa chÃt EH1 đ°ÿc khẳng đònh là cucurbitacin

BÁng 4.11 Dữ liáu phổ 1 H- và 13 C- NMR căa hÿp chÃt EH1 và cucurbitacin D

 Hòn hÿp EH2a (cucurbitacin D (EH1) và cucurbitacin I (EH2))

Phổ 1 H- và 13 C-NMR xỏc đònh EH2a là hòn hÿp 2 chÃt vói tỷ lỏ 1:1, đ°ÿc xỏc đònh qua c°ồng đỏ đ°ồng integral (proton H-6) Dựa trờn sự so sỏnh vói phổ chÃt

EH1, xỏc đònh hòn hÿp cú chứa hÿp chÃt cucurbitacin D (EH1)

Hÿp chÃt cũn l¿i (chÃt EH2) trong hòn hÿp EH2a cho thÃy cú tớn hiỏu căa tỏm nhúm methyl từ ã H 0,95 đến 1,39, mỏt tớn hiỏu proton carbinol ỗ ã H 4,50 (H-16, m) và bốn tớn hiỏu proton olefin ỗ ã H 5,82 (H-6, m), 6,85 (H-23, m), 7,00 (H-24, m) và ã H

5,99 (H-1, m) ổ tr°ồng cao, cỏc tớn hiỏu proton methine và methylene xuÃt hiỏn trong khoÁng ã H 1,41 đến 3,42 ppm Ngoài ra, so vói chÃt EH1, phổ 1 H-NMR căa chÃt EH2 cú tớn hiỏu proton olefin ỗ ã H 5,99 (H-1, m) thay cho tớn hiỏu proton carbinol căa EH1

Hình 4.32 CÃu trúc hóa hác căa hÿp chÃt EH2 (cucurbitacin I) Điều này cũng đ°ÿc khẳng đònh ỗ phổ 13 C-NMR căa chÃt EH2 vói sự xuÃt hiỏn căa cỏc tớn hiỏu carbon olefin ỗ ã C 116,7 (C-1) và 146,8 (C-2) Phổ 13 C-NMR và DEPT căa EH2 cũng cú tớn hiỏu căa 30 carbon bao gồm tỏm nhúm methyl ã C từ 18,9 đến 29,3 ppm; tỏm nhúm methine trong đú cú mỏt oxymethine ỗ ã C 71,7 (C-16) và ba carbon olefin ỗ ã C 121,3 (C-6), 121,7 (C-23) và 155,4 (C-24); m°ồi mỏt carbon bậc bốn trong đú cú ba carbon carbonyl ỗ ã C 204,9 (C-22), 212,0 (C-11) và 216,1 (C-3), ba carbon carbinol ã C 79,9 (C-20) và 71,7 (C-25); và ba carbon methylene Điều này gÿi ý hÿp chÃt EH2 là mát triterpene thuác cucurbitacin và có cÃu t¿o t°¡ng tự cucurbitacin D, chỉ cú sự khỏc biỏt hÿp chÃt EH2 cú thờm mỏt nối đụi ỗ C1 Kết hÿp so sỏnh số liỏu phổ căa EH2 vói tài liỏu [102] (BÁng 4.12), khẳng đònh EH2 là cucurbitacin I

BÁng 4.12 Dữ liáu phổ 1 H- và 13 C- NMR căa hÿp chÃt EH2 vãi cucurbitacin I

30 18,9 1,34, s 18,5 1,38, s a: 125 MHz, CD3OD; b: 500 MHz, CD3OD; c: 75 MHz, CDCl3; d: 300 MHz, CDCl3

 Hÿp chÃt 3-epi-isocucurbitacin D (EH3)

Phổ 13 C-NMR và DEPT căa chÃt EH3 cũng có tín hiáu căa 30 carbon, trong đó có tám nhóm -CH 3 , tám nhóm -CH, bốn nhóm -CH 2 và 10 carbon bậc bốn So sánh số liáu phổ 1 H- và 13 C-NMR căa EH3 và EH1 cho thÃy nhiều sựt°¡ng đồng (BÁng 4.13, bÁng 4.11) và chÃt này đ°ÿc dự đoán là mát triterpene thuác nhóm cucurbitacin, đ°ÿc khẳng đònh thờm khi cú tớn hiỏu ỗ ã H 4,10 (H-3, s)/ã C 79,9 (C-3) ỗ chÃt EH3, thay cho cỏc tớn hiỏu ỗ ã H 4,45 (H-2, dd, J,0; 6,0 Hz)/ã C 71,6 (C-2) ỗ chÃt EH1 Phổ chÃt EH3 chỉ cú sự khỏc biỏt so vói EH1 ỗ sự xuÃt hiỏn căa nhúm carbonyl ỗ C-2 và nhúm hydroxy ỗ C-3, thay cho nhúm carbonyl ỗ C-3 và hydroxy ỗ C-2 căa chÃt EH1 Từ viỏc phõn tớch dữ liỏu phổ trờn kết hÿp so sỏnh vói EH1 và tài liỏu, EH3 đ°ÿc khẳng đònh là 3-epi-isocucurbitacin D [103]

Hình 4.33 CÃu trúc hóa hác căa hÿp chÃt EH3

BÁng 4.13 Dữ liáu phổ 1 H- và 13 C- NMR căa chÃt EH3 và 3-epi-isocucurbitacin D

30 27,6 1,24, s 27,76 1,22, s a: 125 MHz, CD3OD; b: 500 MHz, CD3OD

Hình 4.34 CÃu trúc hóa hác căa hÿp chÃt EH4

Phổ 1 H-NMR căa chÃt EH4 cho thÃy cỏc tớn hiỏu căa tỏm nhúm methyl từ ã H 0,91 đến 1,34, ba proton carbinol ỗ ã H 4,48 (H-16, t, J=8,0 Hz), 3,54 (H-2, m) và 2,87 (H-3, d, J=9,5 Hz) ổ tr°ồng thÃp, xuÃt hiỏn cỏc tớn hiỏu căa proton olefin ỗ ã H 5,76 (d, J=5,5 Hz) và hai tớn hiỏu trans-olefin ỗ ã H 6,83 (H-23, d, J,5 Hz) và 6,98 (H-

24, d, J,5 Hz) ổ tr°ồng cao hĂn xuÃt hiỏn cỏc tớn hiỏu proton methylene ỗ ã H 3,30 (H-12a, m) và 2,57 (H-12b, d, J=14,5 Hz), do Ánh h°ỗng căa nhúm carbonyl gần đú Phớa tr°ồng cao trong khoÁng ã H 1,42-2,49, t°Ăng tự chÃt EH1, xuÃt hiỏn tớn hiáu căa các proton trong nhóm methylene và methine

Phổ 13 C-NMR và DEPT căa chÃt EH4 có 30 tín hiáu carbon, trong đó có tám nhóm -CH3, chín nhóm -CH, bốn nhóm -CH 2 và chín carbon bậc bốn Cā thể, tám carbon methyl từã C 19,8 đến 29,2; năm carbon carbinol ỗ ã C 71,6 (C-2), 81,9 (C-3), 71,7 (C-16), 79,9 (C-20) và 71,5 (C-25) và hai carbon carbonyl ỗ 204,9 (C-22), 216,1 (C-11) So sánh vãi phổ căa chÃt EH1, cho thÃy chÃt EH4 có nhóm hydroxy t¿i C-3 (ã C 81,9/ã H 2,87) thay thế cho nhúm carbonyl (ã C 213,0) trong hÿp chÃt EH1 Điều này chứng tỏ chÃt EH4 là mát cucurbitacin triterpene có hai nối đôi, năm nhóm carbinol và hai nhóm carbonyl Kết hÿp số liáu phổ 1 H-, 13 C-NMR và so sánh số liáu phổ vói tài liỏu [104, 105] (BÁng 4.14), cÃu trỳc căa chÃt EH4 đ°ÿc khẳng đònh là cucurbitacin F

BÁng 4.14 Dữ liáu phổ 1 H- và 13 C- NMR căa hÿp chÃt EH4 và cucurbitacin F

30 20,6 1,31, s 20,7 1,30, s a: 125 MHz, CD3OD; b: 500 MHz, CD3OD; c: 150 MHz, CD3OD; d: 600 MHz,

Hình 4.35 CÃu trúc hóa hác căa hÿp chÃt EH5

Phổ 1 H-NMR căa chÃt EH5 cho thÃy ba tớn hiỏu proton carbinol ỗ ã H 4,42 (H-

2 và H-16, m) và 3,97 (H-24, d, J=9,0 Hz) và mỏt tớn hiỏu proton olefin ỗ ã H 5,78 (H-

6, d, J=5,5 Hz) ổ tr°ồng cao, cỏc tớn hiỏu căa tỏm nhúm methyl xuÃt hiỏn trong khoÁng ã H 0,98 đến 1,44 và cỏc tớn hiỏu methylene, methine trong khoÁng ã H 1,20 đến 2,40 Ngoài ra, chỳng tụi nhận thÃy sự xuÃt hiỏn căa proton methylene ỗ ã H 3,26 (H-12a, d, J=14,5 Hz) và 2,68 (H-12b, d, J=14,5 Hz); ã H 2,57 (H-23a, d, J,0 Hz) và 3,00 (H-23b, dd, J,5; 9,5 Hz) và proton methine ỗ ã H 2,74 (H-10, br d, J,0 Hz); 2,63 (H-17, d, J=7,0 Hz) do Ánh h°ỗng căa nhúm carbonyl, olefin và carbinol gần đú nờn chuyển dòch sang tr°ồng thÃp hĂn.

Phổ 13 C-NMR và DEPT căa chÃt EH5 cho thÃy 30 tín hiáu carbon trong đó có tám nhóm methyl từ 18,9 đến 29,3 ppm; sáu nhóm methine trong đó có ba carbon carbinol ỗã C 71,6 (C-2), 71,7 (C-16) và 74,4 (C-24), mỏt carbon olefin ỗã C 120,3 (C- 6); m°ồi carbon bậc bốn trong đú cú ba carbon carbonyl ỗ ã C 212,9 (C-3), 212,0 (C-

11) và 213,9 (C-22), hai carbon carbinol ỗ ã C 79,9 (C-20) và 71,7 (C-25); và cũn l¿i là carbon methylene Điều này chứng tỏ chÃt EH5 là mát triterpene thuác nhóm cucurbitacin và so vói cucurbitacin D, chÃt EH5 cú thờm mỏt nhúm carbinol ỗ carbon C-24 đồng thồi mÃt đi mỏt nhúm olefin ỗ carbon C-23 và C-24 Số liỏu phổ căa chÃt

EH5 đ°ÿc so sỏnh vói tài liỏu [106], chÃt EH5 đ°ÿc khẳng đònh là cucurbitacin H

BÁng 4.15 Dữ liáu phổ 1 H- và 13 C-NMR căa hÿp chÃt EH5 và cucurbitacin H

30 18,9 1,34, s 18,9 1,30, s a: 125 MHz, CDCl3; b: 500 MHz, CDCl3; c: 125 MHz, CDCl3; d: 500 MH, CDCl3

 Hÿp chÃt 16³, 23α-epoxy-3β, 20R-dihydroxy-10³H, 23βH-cucurbit-5,24- dien-11-one (EH6)

Hình 4.36 CÃu trúc hóa hác căa hÿp chÃt EH6 CTPT C30H46O4 căa hÿp chÃt EH6 đ°ÿc xỏc đònh dựa trờn pic ion giÁ phõn tử trong phổ (+) HR-ESI-MS t¿i m/z 471,3469 [M+H] + (tính toán C30H47O4, 471,3474)

Phổ 1 H-NMR cho thÃy sỏu methyl singlet, hai methyl doublet, hai olefin proton ỗã H

K¿t quÁ nghiờn cąu ho¿t tớnh chòng ung th°

Ho ạ t tính ch ống ung thư củ a các h ợ p ch ấ t phân l ậ p t ừ cây Xương quạ t

Theo cỏc kết quÁ nghiờn cứu tr°óc đõy, dòch chiết methanol căa cõy X°Ăng qu¿t cũng cú ho¿t tớnh gõy đỏc tế bào ung th° ỗ mức trung bỡnh ChÃt mói đó tỡm thÃy ỗ loài này là cỏc triterpenoid cũng đó đ°ÿc bỏo cỏo cú ho¿t tớnh khỏng tế bào ung th° khá m¿nh Do đó, bốn hÿp chÃt mãi DN1, DN2, DN3, DN4 đ°ÿc phân lập từ loài này đ°ÿc tiến hành nghiên cứu ho¿t tính chống ung th° bằng ph°¡ng pháp nghiên cứu khÁ năng ức chế tăng sinh căa các chÃt lên bốn dòng tế bào ung th° đó là ung th° A549, Hep3B, Hela, MCF-7

Kết quÁ mô tÁ ho¿t tính ức chế các dòng tế bào ung th° căa các hÿp chÃt DN1,

DN2, DN3, DN4 đ°ÿc biểu thò bằng phần trăm tế bào sống sút khi xử lý cỏc chÃt thử ỗ hai nồng đỏ 100 àM và 30 àM vói cỏc dũng tế bào ung th° thử nghiỏm Kết quÁ ỗ bÁng 4.26 cho thÃy cÁ ba hÿp chÃt DN2, DN3, DN4 thuác nhóm flavan đều có ho¿t tớnh ức chế cÁ bốn dũng tế bào thử nghiỏm ỗ nồng đỏ 100 àM, cũn DN1 khụng thuỏc nhóm này hầu nh° không ức chế các dòng tế bào ung th° thử nghiám Riêng hÿp chÃt diaensi-biflavan (DN4) thể hiỏn ho¿t tớnh m¿nh hĂn cỏc hÿp chÃt cũn l¿i và ỗ mức yếu đối vãi hai dòng tế bào ung th° A549 và MCF-7 vãi phần trăm tế bào ung th° sống sót thÃp hĂn d°ói 50% ỗ nồng đỏ 100 àM

BÁng 4.26 Kết quÁ thử nghiám ức chế tế bào ung th° căa các chÃt từloài X°¡ng qu¿t

Tờn ch¿t thÿ Nòng đò

% t¿ bào sòng sút (CS%) Hep3B Hela A549 MCF-7

7-Acetyl-4R, 8-dihydroxy-6- methyl-1-tetralone (DN1) 100 79,29 89,78 82,48 66,68

4.2.2 Ho ạ t tính ch ống ung thư cÿ a các h ợ p ch ấ t phân l ậ p t ừ cây Côm h ả i nam

 Ho¿t tính gây độc tếbào ung thư

Chi Côm có thành phần hóa hác khá đa d¿ng bao gồm các terpenoid, flavonoid, alkaloid, phenol, các nhóm này đều có ho¿t tính chống ung th° Tuy nhiên các nghiên cứu tr°ãc đây chỉ công bố các kết quÁ nghiên cứu hoat tính gây đác tế bào ung th° căa các chÃt thuác nhóm terpenoid hay cā thể h¡n là các triterpenoid Đặc biát là các cucurbitacin có ho¿t tính m¿nh h¡n các elaeocarpucin và petiolticin [11, 51, 52] Còn ỗ loài Cụm hÁi nam mói chỉ cú cỏc nghiờn cứu về ho¿t tớnh ức chế tế bào ung th° đối vãi các curcubitacin Do vậy, các hÿp chÃt cucurbitacin tách đ°ÿc từ cây này là nhóm chÃt đ°ÿc lựa chán nghiên cứu thử nghiám ho¿t tính ức chế các dòng tế bào ung th° nh° A549, T24, Huh-7, 8505, SNU-1

Số liỏu thử nghiỏm đ°ÿc thể hiỏn ỗ bÁng 4.27 là cỏc giỏ trò IC50 căa cỏc hÿp chÃt thử trên từng dòng tế bào ung th° Kết quÁ trên cho thÃy các chÃt thử đều có ho¿t tớnh ức chế cỏc dũng tế bào ung th° ỗ cỏc nồng đỏ khỏc nhau, và cỏc chÃt đều cú hoat tớnh ức chế cỏc dũng tế bào ung th° ỗ mức trung bỡnh vói giỏ trò IC 50 từ 63,82 đến 111,17 àM So vói cỏc cucurbitacin khỏc thỡ cỏc hÿp chÃt này cú ho¿t tớnh gõy đác tế bào ung th° yếu h¡n, điều này cũng phù hÿp vãi các kết quÁ đã nghiên cứu tr°ãc đây Kết quÁ này gÿi ý rằng sự hián dián căa nhóm hydroperoxide và vòng epoxide đã làm giÁm ho¿t tính gây đác tế bào ung th° khi so sánh vãi cucurbitacin D và 3-epi-cucurbitacin D [11, 51]

BÁng 4.27 Kết quÁ thử nghiám ức chế tế bào ung th° căa các chÃt từ loài Côm hÁi nam

Nòng đòąc ch¿ 50% dũng t¿bào ung th° (IC 50 àM)

Ghi chú: EH6: 16³,23³-epoxy-3β,20R-dihydroxy-10³H,23βH-cucurbit-5,24-dien- 11-one

EH7: 16³,23³-epoxy- 3β,20β-dihydroxy-10³H,23βH- cucurbit- 5,24-dien-11-one-3-O-β-D-glucopyranoside

EH8: 16³,23³-epoxy-3β,20β-dihydroxy-24³-hydroperoxy-10³H,23βH- cucurbit-5,25-dien-11-one (elaeohainencin A)

 Ho¿t tính āc chế tếbào ung thư OCI-AML3

Dũng tế bào OCI-AML3 là mỏt bỏnh b¿ch cầu cÃp tớnh phổ biến ỗng°ồi lón, đ°ÿc đặc tr°ng bỗi sự tăng sinh vụ tớnh căa cỏc tế bào tiền thõn t¿o mỏu dÁn đến thõm nhiòm mỏu và tăy x°Ăng, hậu quÁ là suy t¿o mỏu [120]

Những năm gần đây, tỷ láung th° máu không chỉ là bánh do b¿m sinh gây ra mà đó xuÃt hiỏn vói tỷ lỏ cao ỗ ng°ồi tr°ỗng thành Nguy hiểm hĂn trò liỏu hầu nh° không có triển váng, không kéo dài tuổi thá căa bánh nhân Do vậy, nghiên cứu phát hián các chÃt ức chế dòng tế bào ung th° này là māc tiêu nghiên cứu mãi đ°ÿc các nhà khoa hác trên thế giãi quan tâm Các hÿp chÃt triterpenoid phân lập đ°ÿc từ cây Côm hÁi nam chă yếu thuác nhóm cucurbitacin và oleanane đã đ°ÿc công bố có tác dāng chống ung th° khá m¿nh và đa c¡ chế tác dāng H¡n nữa, các chÃt tách đ°ÿc từ cây này ch°a từng đ°ÿc nghiên cứu ho¿t tính gây đác tế bào dòng OCI-AML3 Do đó, luận án này đã nghiên cứu khÁ năng ức chế tế dòng OCI-AML3 căa mát số chÃt triterpenoid đ¿i dián cho các nhóm chÃt đ°ÿc phân lập từ cây này

Kết quÁ ỗ (Hỡnh 4.77) cho thÃy EH10 cú khÁ năng ức chế tế bào OCI-AML3 ỗ nồng đỏ 15 àg/mL, EH2a ức chế ỗ nồng đỏ 1 àg/mL, cũn EH3 ức chế ỗ nồng đỏ 0,5 àg/mL So vói cỏc hÿp chÃt triterpenoid khung olean căa loài Cụm hÁi nam, cucurbitacin có khÁ năng ức chế dòng OCI-AML3 m¿nh h¡n nhiều

A: EH10 (5; 10; 15 àg/mL ), B: EH2a (0,1; 1; 10 àg/mL), C: EH3 (0,05;

0,5; 5 àg/mL) Hình 4.77 Kết quÁ ho¿t tính ức chế tế bào OCI-AML3 căa mát số chÃt từ loài Côm hÁi nam

Tế bào sống Tế bào chết

Tế bào sống Tế bào chết

 Phân tích Ánh hưởng cÿa các hợp chất đến chu trình tếbào ung thư dòng OCI-AML3

Nghiên cứu về ho¿t tính chống ung th° theo tác đáng gây đác tế bào ung th° đã đ°ÿc phát triển từ rÃt lâu Các chÃt đ°ÿc phát hián theo tác đáng này cũng đã và đang đ°ÿc sử dāng làm thuốc điều trò ung th° hiỏu quÁ Nh°ng cho đến nay nú cũng đã thể hián khá nhiều nh°ÿc điểm do chúng có tác dāng đác đối vãi c¡ thể và gây nhiều tỏc dāng phā Theo thống kờ, hiỏn nay, tỷ lỏ thÃt b¿i trong điều trò ung th° ngày càng cao do tế bào ung th° kháng thuốc và thay đổi di truyền mà nguyên nhân chính là do tỏc dāng phā căa húa trò liỏu Do vậy, viỏc tỡm kiếm cỏc ho¿t chÃt cú tỏc dāng chống ung th° theo tác đáng ít gây đác tế bào cũng đang và sẽ đ°ÿc quan tâm nghiên cứu phát triển Mát trong các tác đáng đó là t°¡ng tác căa ho¿t chÃt vào các pha phân bào làm trì hoãn sự phân chia căa tế bào ung th°, gây cÁm ứng apoptosis và điều khiển giÁm biểu hián mát số gen liên quan đến ung th° Các nghiên cứu này triển vỏng cho viỏc trò liỏu và kết hÿp trò liỏu ung th° vói tỷ lỏ thành cụng cao, giÁm cỏc tỏc dāng phā căa cỏc thuốc trò liỏu ung th° tr°óc đõy.

Các hÿp chÃt từ cây Côm hÁi nam thuác nhóm triterpenoid là nhóm có tác dāng ức chế tếbào ung th°, tác đáng vào pha phân bào, hay điều hòa mát số gen kiểm soỏt ung th° cũng đó đ°ÿc cụng bố Do cÃu trỳc phức t¿p nờn cỏc hÿp chÃt này th°ồng thể hián đa c¡ chế tác dāng Vì vậy, các hÿp chÃt này đ°ÿc tiếp tāc nghiên cứu tác dāng ức chế tế bào ung th° theo con đ°ồng tỏc đỏng vào cỏc pha phõn chia căa tế bào ung th° OCI-AML3

Kết quÁ đ°ÿc trỡnh bày theo biểu đồ (Hỡnh 4.78) cho thÃy chÃt EH10 ỗ nồng đỏ

15 àg/mL tỷ lỏ tế bào ỗ pha G0/G1 nhiều hĂn đỏng kể so vói đối chứng DMSO Cũn

EH2a ỗ nồng đỏ 1 àg/mL, EH3 0,5 àg/mL, EH1 ỗ nồng đỏ 0,3 và 3 àg/mL đều làm tăng tỷ lỏ tế bào ỗ pha G2/M so vói đối chứng DMSO Cũn EH2a ỗ nồng đỏ cao hĂn là 10 àg/mL và EH3 5àg/mL thỡ tỷ lỏ tế bào ỗ pha G0/G1 l¿i cao hĂn so vói đối chứng DMSO

Có thể kết luận rằng các hÿp chÃt triterpenoid từ cây Côm hÁi nam EH10 (1³- hydroxy-olean-12-en-3-O-β-L-arabinopyranoside), EH1 (cucurbitacin D), EH2a (cucurbitacin D và cucurbitacin I (EH2)), EH3 (3-epi-cucurbitacin D) đều có ho¿t tính ức chế sự phát triển căa tếbào ung th° tăy x°¡ng cÃp (OCI-AML3) theo c¡ chế tác đáng vào các pha G0/G1 và G2/M căa chu trình tế bào Đáng chú ý các chÃt cucurbitacin (EH2a, EH3) có ho¿t tính rÃt tốt Công bố tr°ãc đây cho thÃy tế bào đang ỗ pha phõn bào G2/M và G0/G1 th°ồng nh¿y cÁm vói tỏc nhõn húa trò liỏu, và nh¿y cÁm hĂn nhiều so vói tế bào ỗ pha S [121] Kết quÁ này cung cÃp thờm cĂ sỗ khoa hác cho các công bố tr°ãc đây về tác dāng hiáp đồng căa các cucurbitacin vãi cỏc tỏc nhõn húa trò liỏu khỏc nh°: imatinib mesylate, paclitaxel, docetaxel và gemcitabine làm tăng hiỏu quÁ trong điều trò ung th° [71]

A: EH1 (0,03; 0,3; 3 àg/mL), B: EH10 (5; 10; 15 àg/mL), C: EH2a (0,1; 1; 10 àg/mL), D: EH3 (0,05; 0,5; 5 àg/mL) Hình 4.78 Kết quÁ phân tích chu trình tế bào dòng OCI-AML3 căa mát số hÿp chÃt triterpenoid từ loài Côm hÁi nam

 Ho¿t tính gây cÁm āng apoptosis

Apoptosis là mát hián t°ÿng chết căa tế bào theo ch°¡ng trình Tế bào không tuõn theo apoptosis làm cho tế bào tồn t¿i thồi gian lõu hĂn, dò tớch lũy cỏc đỏt biến, t¿o điều kián thuận lÿi cho ung th° phát triển Do vậy, viác tìm kiếm các ho¿t chÃt chống ung th° theo c¡ chế cÁm ứng apoptosis sẽ ức chế sự phát triển căa tế bào ung th° Cucubitacine cũng đ°ÿc công bố là các hÿp chÃt chống ung th° tiềm năng, cÁ về tỏc dāng gõy đỏc nhiều dũng tế bào ung th° th°ồng, tế bào gốc ung th° và gõy cÁm ứng apoptosis Cucurbitacin D đã đ°ÿc công bố là có tác dāng gây cÁm ứng apoptosis đối vói dũng tế bào ung th° tuyến tāy (Capan-1) ỗ nồng đỏ < 1àM [122]

Cucurbitacin D (EH1) và dÁn xuÃt 3-epi- cucubitacin D (EH3) căa loài Côm hÁi nam là hai ho¿t chÃt có tác dāng chống ung th° m¿nh đ°ÿc luận án lựa chán nghiên cứu ho¿t tính gây cÁm ứng apoptosis trên dòng tế bào ung th° tăy x°¡ng cÃp tính (OCI-AML3)

Kết quÁđ°ÿc trỡnh bày ỗ hỡnh 4.79 cho thÃy cÁ hai hÿp chÃt EH1 và EH3 đều gõy cÁm ứng apoptosis trờn dũng tế bào ung th° tăy x°Ăng cÃp tớnh (OCI-AML3) ỗ nồng đỏ thÃp < 0,5 àg/mL

A: EH1 (0,03; 0,3; 3 àg/mL) B: EH3 (0,05; 0,5; 5 àg/mL) Hình 4.79 Kết quÁ ho¿t tính gây cÁm ứng apoptosis dòng OCI-AML3 căa mát số cucurbitacin từ loài Côm hÁi nam

 Nghiên cāu tác động đến biểu hiện một số gen liên quan đến ung thư cÿa các cucurbitacin