luận án tiến sĩ sự lưu hành và khả năng ly giải của thực khuẩn thể tả vibriophage ở môi trường nước ngoại cảnh tại một số tỉnh miền bắc việt nam

Trong nghiên cąu tỷ lệ thực khuẩn thể tÁ trong môi tr°áng n°ßc ngo¿i cÁnh và mßi liên quan căa chúng vßi vi khuẩn tÁ ã Calcutta Ân Đá, các nhà khoa học ã nh¿n thÃy tỷ lệ mÁc và tử vong c

Bà GIÁO DĀC VÀ ĐÀO T¾O Bà Y T¾

VIÆN VÆ SINH DÊCH TÄ TRUNG ¯¡NG

-* -

L¾I Vi KIM

SĀ L¯U HÀNH VÀ KHÀ NNG LY GIÀI

TR¯äNG N¯âC NGO¾I CÀNH T¾I MàT SÞ TÈNH MIÀN BÂC VIÆT NAM

LUÀN ÁN TI¾N S) Y T¾ CÔNG CàNG

HÀ NàI – 2023

Bà GIÁO DĀC VÀ ĐÀO T¾O Bà Y T¾

VIÆN VÆ SINH DÊCH TÄ TRUNG ¯¡NG

-* - L¾I VŨ KIM

LäI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cąu khoa học căa riêng tôi, tÃt cÁ các k¿t quÁ và sß liệu trong lu¿n án do chính tôi thực hiện TÃt cÁ các sß liệu trình bày trong lu¿n án là trung thực, mát phần ã °ÿc công bß trên t¿p chí khoa học trong n°ßc Phần còn l¿i trong lu¿n án ch°a °ÿc ai công bß trong bÃt kỳ công trình nghiên cąu nào khác

Tác giÁ căa luÁn án

L¿i Vj Kim

LäI CÀM ¡N

Lái ầu tiên tôi mußn bày tỏ lòng bi¿t ¢n sâu sÁc nhÃt tßi TS Nguyễn Đáng Tú, Khoa Vi khuẩn, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung °¢ng, và PGS TS Đặng Đąc Nhu, Khoa Y t¿ công cáng, Tr°áng Đ¿i học Y D°ÿc, Đ¿i học Qußc gia Hà Nái là những ng°ái thầy h°ßng dẫn khoa học, ã luôn giúp ỡ tôi, t¿n tình truyền ¿t những ki¿n thąc và kinh nghiệm quý báu ể tôi có thể hoàn thành lu¿n án

Tôi xin chân thành cÁm ¢n các Thầy/Cô trong các Hái áng khoa học chÃm ề c°¢ng, chÃm các chuyên ề và lu¿n án ã óng góp nhiều ý ki¿n quý báu ể tôi có thêm ki¿n thąc và hoàn thiện lu¿n án ¿t chÃt l°ÿng tßt h¢n

Tôi xin bày tỏ lái cÁm ¢n chân thành tßi Trung tâm Đào t¿o và QuÁn lý Khoa học, Bá môn Y t¿ công cáng căa Viện Các Thầy/Cô căa Trung tâm và Bá môn ã h°ßng dẫn, giúp ỡ tôi tć khi bÁt ầu khoá học Nghiên cąu sinh, trong quá trình học t¿p và ¿n khi hoàn thành lu¿n án này

Tôi xin bày tỏ lái cÁm ¢n sâu sÁc ¿n các anh chị và các b¿n căa Phòng thí nghiệm Vi khuẩn °áng ruát, Khoa Vi khuẩn, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung °¢ng ã luôn quan tâm, giúp ỡ, hß trÿ tôi trong quá trình thực hiện nghiên cąu và hoàn thành lu¿n án

Cußi cùng con xin khÁc ghi công ¢n sinh thành, nuôi d°ỡng, d¿y dß căa cha mẹ hai bên gia ình; sự ăng há, áng viên, th°¢ng yêu, chăm sóc, khích lệ căa vÿ và các con; các anh, chị, em, áng nghiệp, những ng°ái luôn bên tôi và là chß dựa vững chÁc ể tôi yên tâm học t¿p và hoàn thành lu¿n án

Nghiên cąu đ°ÿc hß trÿ kinh phí tć các đÁ tài/dā án:

- Đề tài quỹ phát triển khoa học và công nghệ qußc gia (Nafosted) <Nghiên cąu sÁn xuÃt ch¿ phẩm sinh học dùng trong iều trị và xử lý các nguán n°ßc nhiễm các chăng vi khuẩn tÁ a kháng thußc= (Mã sß: 108.06-2017.04) do TS Nguyễn Đáng Tú chă nhiệm

- Đề tài nhánh <Nghiên cąu ặc iểm dịch tễ học phân tử và ặc tính kháng kháng sinh căa các chăng vi khuẩn tÁ O1, O139 và V parahaemolyticus

phân l¿p tć bệnh nhân tiêu chÁy và môi tr°áng n°ßc ngo¿i cÁnh= thuác dự án <Nghiên cąu nâng cao năng lực nghiên cąu các bệnh truyền nhiễm ã Việt Nam và chuyển giao kỹ thu¿t, công nghệ: 2020-2025= giữa Viện Vệ sinh dịch tễ Trung °¢ng vßi Tr°áng Đ¿i học Nagasaki, Nh¿t BÁn do TS Nguyễn Đáng Tú chă nhiệm

CH¯¡NG 1 TàNG QUAN TÀI LIÆU 3

1.1 Mát sß khái niệm liên quan 3

1.2.1.4 Phòng bệnh tÁ và vÁc xin 9

1.2.1.5 Kháng kháng sinh 10

1.2.2 Tình hình dịch tÁ trên th¿ gißi và Việt Nam 12

1.2.2.1 Tình hình dịch tÁ trên th¿ gißi 12

1.2.2.2 Tình hình dịch tÁ t¿i Việt Nam 13

1.3 Tình hình nghiên cąu về sự l°u hành căa thực khuẩn thể tÁ 13

1.3.1 Đặc iểm hình thái, cÃu trúc căa thực khuẩn thể tÁ 14

1.3.1.1 Thực khuẩn thể tÁ hình cầu (spherical phages) 14

1.3.1.2 Thực khuẩn thể tÁ d¿ng sÿi 18

1.3.2 Sự l°u hành căa thực khuẩn thể và thực khuẩn thể tÁ 20

1.3.3.1 Sự l°u hành căa thực khuẩn thể 20

1.3.3.2 Sự l°u hành căa thực khuẩn thể tÁ 21

1.4 Tình hình nghiên cąu về khÁ năng ly giÁi căa thực khuẩn thể tÁ 23

1.4.1 Các ph°¢ng pháp phát hiện và ánh giá khÁ năng ly giÁi căa thực khuẩn thể tÁ 23

1.4.1.1 Ph°¢ng pháp phân l¿p thực khuẩn thể tÁ tć mẫu n°ßc 23

1.4.1.2 Ph°¢ng pháp phân l¿p filamentous phage 23

1.4.1.3 Ph°¢ng pháp xác ịnh hình d¿ng thực khuẩn thể tÁ d°ßi kính hiển vi iện tử 24

1.4.1.4 Kỹ thu¿t PCR 24

1.4.1.5 Kỹ thu¿t Southern blot 26

1.4.1.6 Cách xác ịnh khÁ năng ly giÁi căa thực khuẩn thể tÁ 26

1.4.2 Liệu pháp phage 27

1.4.2.1 Liệu pháp phage là gì? 28

1.4.2.2 Áp dāng liệu pháp phage 29

1.4.3 Ąng dāng trong dự phòng, kiểm soát bệnh/dịch tÁ 35

1.5 Đặc iểm chung ịa bàn nghiên cąu 37

CH¯¡NG 2 PH¯¡NG PHÁP NGHIÊN CĄU 39

2.1 Đßi t°ÿng, ịa iểm, thái gian nghiên cąu 39

2.1.1 Đßi t°ÿng nghiên cąu 39

2.6 Xử lý, phân tích sß liệu 53

2.7 VÃn ề ¿o ąc trong nghiên cąu 54

2.8 S¢ á nghiên cąu 55

CH¯¡NG 3 K¾T QUÀ NGHIÊN CĄU 56

3.1 Sự l°u hành căa thực khuẩn thể tÁ trong môi tr°áng n°ßc ngo¿i cÁnh t¿i mát sß tỉnh miền BÁc Việt Nam, 2018 3 2019 56

3.1.1 Mát sß ặc iểm chung căa các mẫu n°ßc ngo¿i cÁnh thu th¿p 56

3.1.2 K¿t quÁ xét nghiệm mẫu n°ßc, mái g¿c tôm bằng ph°¢ng pháp nuôi cÃy phân l¿p 57

3.1.3 K¿t quÁ xét nghiệm mẫu n°ßc bề mặt, mái g¿c tôm bằng ph°¢ng pháp PCR 65

3.2 KhÁ năng ly giÁi căa thực khuẩn thể tÁ trong phòng thí nghiệm và trên thực ịa cáng áng ã các môi tr°áng n°ßc khác nhau 73

3.2.1 K¿t quÁ thử nghiệm khÁ năng ly giÁi căa thực khuẩn thể tÁ vßi mát sß chăng vi khuẩn tÁ và vi khuẩn °áng ruát khác 73

3.2.2 KhÁ năng ly giÁi căa thực khuẩn thể ã các iều kiện pha loãng m¿t

4.1 Sự l°u hành căa thực khuẩn thể tÁ trong môi tr°áng n°ßc ngo¿i cÁnh 86

4.1.1 Mát sß ặc iểm chung về mẫu nghiên cąu 86

4.1.2 Sự l°u hành căa thực khuẩn thể tÁ trong môi tr°áng n°ßc ngo¿i cÁnh

5.1 Sự l°u hành căa thực khuẩn thể tÁ trong môi tr°áng n°ßc ngo¿i cÁnh t¿i mát sß tỉnh miền BÁc Việt Nam 110 5 KhÁ năng ly giÁi căa các thực khuẩn thể tÁ 110

KHUY¾N NGHÊ 112 CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN Đ¾N LUÀN ÁN Đà CÔNG BÞ 113 TÀI LIÆU THAM KHÀO

PHĀ LĀC

CÁC TĆ VI¾T TÂT

Vi¿t đ¿y đă ti¿ng Anh GiÁi ngh*a ti¿ng ViÇt

ATCC American Týp Culture Collection

Bá s°u t¿p chăng chuẩn Mỹ

CIP Ciprofloxacin Kháng sinh Ciprofloxacin CsCl Ceessi Clorua

Fs1 Filamentous phage 1 Thực khuẩn thể d¿ng sÿi FS1 Fs2 Filamentous phage 2 Thực khuẩn thể d¿ng sÿi FS2

Náng á kháng sinh tßi thiểu ąc ch¿ sự phát triển căa vi khuẩn

NAG Non-agglutinable Vibrios Chăng phẩy khuẩn không

Trung tâm Thông tin Công nghệ Sinh học Qußc gia, Hoa Kỳ

NICED National Institute of Cholera and Enteric

DANH MĀC BÀNG

BÁng 2 1 Sß l°ÿng cặp mẫu n°ßc bề mặt mẫu mái g¿c tôm thu th¿p 45 BÁng 3 1 Sß l°ÿng mẫu n°ßc theo cặp mẫu (mẫu n°ßc bề mặt và mẫu mái g¿c tôm) thu th¿p °ÿc trong giai o¿n 2018-2019 56 BÁng 3 2 Tỷ lệ phân bß mẫu n°ßc bề mặt, mẫu mái g¿c tôm theo thể lo¿i mẫu, 2018 - 2019 56 BÁng 3 3 K¿t quÁ nuôi cÃy phân l¿p thực khuẩn thể tÁ theo mẫu n°ßc 57 BÁng 3 4 K¿t quÁ nuôi cÃy phân l¿p thực khuẩn thể tÁ theo mẫu mái g¿c tôm, BÁng 3 9 K¿t quÁ xét nghiệm PCR mẫu n°ßc bề mặt theo thái gian, 67 BÁng 3 10 K¿t quÁ xét nghiệm PCR mẫu mái g¿c tôm theo thái gian, BÁng 3 13 Thử nghiệm khÁ năng ly giÁi căa các thực khuẩn thể vßi mát sß lo¿i vi khuẩn gây bệnh tiêu chÁy khác 76

BÁng 3 14 KhÁ năng ly giÁi căa thực khuẩn thể ã các iều kiện pha loãng khác nhau 77 BÁng 3 15 KhÁ năng ly giÁi căa thực khuẩn thể vßi các iều kiện pH môi tr°áng khác nhau 78 BÁng 3.16 K¿t quÁ thử nghiệm khÁ năng ly giÁi căa các thực khuẩn thể ã các iều kiện nhiệt á khác nhau 80 BÁng 3 17 Thái gian tán t¿i căa thực khuẩn thể VP04 trong môi tr°áng n°ßc ngo¿i cÁnh cáng áng, năm 2020 81

DANH MỤC HÌNH/S¡ Đà

Hình 1 1 Hình Ánh Myoviridae quan sát d°ßi kính hiển vi iện tử 16

Hình 1 2 Hình Ánh Syphoviridae quan sát d°ßi kính hiển vi iện tử 17

Hình 1 3 Hình Ánh Podoviridae d°ßi kính hiển vi iện tử 18

Hình 1 4 Hình Ánh kappa phage gÁn vào các gen nßi giữa flaA và flaC căa vi khuẩn tÁ O1 và O139 19

Hình 1 5 Hình Ánh ¿i diện căa filamentous phage 20

Hình 1 6 Hình vệt tan (plaque) ể phát hiện thực khuẩn thể MJ1 27

Hình 1 7 Hình Ánh vệt tan căa thực khuẩn thể tÁ t¿i HÁi Phòng và Thái Bình năm 2007-2008 27

S¢ á 2 1 Vị trí lÃy mẫu t¿i Nam Định 40

S¢ á 2 2 Vị trí lÃy mẫu t¿i Thái Bình 40

S¢ á 2 3 Vị trí lÃy mẫu t¿i HÁi Phòng 41

S¢ á 2 4 Vị trí lÃy mẫu t¿i Hà Nái 41

S¢ á 4 1 S¢ á giám sát cÁnh báo dịch tÁ dựa trên xét nghiệm mẫu n°ßc ngo¿i cÁnh 105

DANH MỤC BIàU Đà

Biểu á 1 1 Mßi liên quan giữa các lo¿i vi khuẩn và môi tr°áng ngo¿i cÁnh9 Biểu á 1 2 Tình hình dịch tÁ và tiêu chÁy cÃp tính trên toàn cầu ¿n 01/2/2023 12 Biểu á 1 3 Các ca bệnh tÁ trên toàn cầu °ÿc báo cáo tć 1989 - 2021 13 Biểu á 3 1 K¿t quÁ nuôi cÃy phân l¿p thực khuẩn thể tÁ theo lo¿i mẫu n°ßc Biểu á 3 4 K¿t quÁ PCR thực khuẩn thể tÁ theo lo¿i nguán mẫu n°ßc 69 Biểu á 3 5 K¿t quÁ PCR thực khuẩn thể tÁ theo chăng, 2018-2019 (n=186) Biểu á 3 8 K¿t quÁ thử nghiệm khÁ năng ly giÁi căa thực khuẩn thể VP04 ßi vßi các nguán n°ßc ngo¿i cÁnh cáng áng, năm 2020 85

Đ¾T VÂN ĐÀ

Bệnh tÁ là mát hái chąng lâm sàng 3 dịch tễ gây ra bãi chăng vi khuẩn tÁ nhóm O1 hoặc O139 °ÿc ghi nh¿n lần ầu tiên năm 1817 t¿i áng bằng

sông Hằng căa tiểu lāc ịa Ân Đá Tć khi phát hiện ra bệnh tÁ, trên th¿ gißi ã xÁy ra 07 vā ¿i dịch Dịch tÁ ã trã thành mát bệnh dịch nguy hiểm và bÁt buác phÁi báo cáo toàn cầu [6]

Dự phòng và iều trị bệnh tÁ bằng vÁc xin tiêm (1880) và nay °ÿc thay th¿ bằng vÁc-xin tÁ ußng là mát biện pháp dự phòng °ÿc sử dāng phổ bi¿n hiện nay Sử dāng kháng sinh ể iều trị tÁ là mát biện pháp quan trọng; tuy nhiên, ngày càng xuÃt hiện nhiều báo cáo về tình tr¿ng kháng thußc căa vi khuẩn tÁ ßi vßi các lo¿i kháng sinh thông th°áng; ngay cÁ nhóm quinolone - mát nhóm kháng sinh rÃt có hiệu quÁ trong iều trị tÁ cũng ã °ÿc báo cáo bị vi khuẩn tÁ kháng thußc [11], [15]

â Việt Nam, bệnh tÁ °ÿc ghi nh¿n là nguyên nhân gây tiêu chÁy hàng ầu tć h¢n mát th¿ kỷ qua vßi nhiều ÿt dịch xÁy ra trong lịch sử Mặc dù ã có nhiều thành tựu trong phòng và iều trị bệnh tÁ nh°ng tỷ lệ mÁc tÁ có những diễn bi¿n bÃt th°áng, không theo quy lu¿t Năm 2007, dịch tiêu chÁy cÃp bùng phát ầu tiên ã thă ô Hà Nái sau ó lan ra 13 tỉnh, thành phß phía BÁc Viện Vệ sinh dịch tễ Trung °¢ng ã phân l¿p °ÿc phẩy khuẩn tÁ trong n°ßc cßng, n°ßc há quanh nhà ng°ái bệnh Điều ó chąng tỏ vi khuẩn tÁ ã có mặt trong môi tr°áng n°ßc ã khu vực dân c° qua ó làm ô nhiễm nguán n°ßc và các lo¿i thực phẩm [18], [17]

Trong iều kiện xuÃt hiện nhiều chăng vi khuẩn kháng vßi nhiều lo¿i kháng sinh kể cÁ các kháng sinh th¿ hệ mßi, các nhà nghiên cąu bÁt ầu nghiên cąu trã l¿i về thực khuẩn thể (bacteriophage) [74] Thực khuẩn thể là vi rút ặc biệt bao gám 02 nhóm: thực khuẩn thể tan (lytic) và tiềm tan (lysogenic) và l°u hành ráng rãi trong tự nhiên vßi sß l°ÿng lßn [83], [46], [63] Nghiên cąu sự l°u hành căa

thực khuẩn thể tÁ trong môi tr°áng n°ßc có ý nghĩa quan trọng trong giám sát môi tr°áng, phát hiện và ịnh týp chăng tÁ qua ó góp phần kiểm soát bệnh tÁ [60], [87] Liệu pháp thực khuẩn thể vßi ặc tr°ng là khÁ năng ly giÁi căa thực khuẩn thể ßi vßi vi khuẩn ặc hiệu ã °ÿc nghiên cąu tć ầu th¿ kỷ 19 Trong nghiên cąu tỷ lệ thực khuẩn thể tÁ trong môi tr°áng n°ßc ngo¿i cÁnh và mßi liên quan căa chúng vßi vi khuẩn tÁ ã Calcutta (Ân Đá), các nhà khoa học ã nh¿n thÃy tỷ lệ mÁc và tử vong cao căa bệnh nhân mÁc tÁ ầu vā dịch ã giÁm nhanh chóng khi thực khuẩn thể tÁ °ÿc phân bß ráng rãi trong môi tr°áng ngo¿i cÁnh Tuy nhiên, chúng ít °ÿc quan tâm khi có sự xuÃt hiện căa nhiều lo¿i kháng sinh T¿i các n°ßc phát triển thực khuẩn thể ã và ang °ÿc sử dāng hiệu quÁ trong công nghệ sinh học hiện ¿i, bên c¿nh ó thực khuẩn thể còn °ÿc bi¿t ¿n nh° mát lo¿i vi sinh v¿t có vai trò dự báo dịch; chẩn oán các vi khuẩn gây bệnh và tham gia vào sÁn xuÃt vÁc xin [19]

Việc l°u hành căa thực khuẩn thể tÁ trong môi tr°áng n°ßc ngo¿i cÁnh có ý nghĩa th¿ nào trong việc phát hiện, cÁnh báo nguy c¢ bùng phát dịch tÁ và có thể sử dāng chăng thực khuẩn thể tÁ nào t¿i Việt Nam ể xử lý nguán n°ßc ô nhiễm cũng nh° khßng ch¿ vi khuẩn tÁ ßi vßi các chăng tÁ a kháng thußc? Để nghiên cąu sự l°u hành, ti¿n hành phân l¿p cũng nh° ánh giá khÁ năng ly giÁi căa thực khuẩn thể tÁ ã môi tr°áng n°ßc ngo¿i cÁnh t¿i những tỉnh ã tćng xÁy ra dịch tÁ ã miền BÁc Việt Nam, chúng tôi triển khai nghiên cąu ề tài: <Sự lưu hành và khả năng ly giải cÿa thực khuẩn thể tả (Vibriophage) ở môi trường nước ngoại cảnh tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam=

Với các mục tiêu như sau:

Mục tiêu 1: Mô tÁ sự l°u hành căa thực khuẩn thể tÁ (Vibriophage) trong

môi tr°áng n°ßc ngo¿i cÁnh t¿i mát sß tỉnh miền BÁc Việt Nam, 2018-2019

Mục tiêu 2: Đánh giá khÁ năng ly giÁi căa thực khuẩn thể tÁ trong phòng

thí nghiệm và trên thực ịa cáng áng ã các môi tr°áng n°ßc khác nhau.

CH¯¡NG 1 TàNG QUAN TÀI LIÆU 1.1 Mát sß khái niÇm liên quan

1.1.1 Bệnh tả

Bệnh tÁ là mát hái chąng lâm sàng - dịch tễ gây ra bãi phẩy khuẩn tÁ

(Vibrio cholerae) Mát ca bệnh tÁ nặng iển hình có ặc iểm i ngoài phân nhiều n°ßc, màu phân gißng nh° n°ßc vo g¿o và nhanh chóng dẫn ¿n tình tr¿ng mÃt n°ßc Bệnh tÁ hiện nay vẫn còn xÁy ra t¿i nhiều n¢i trên th¿ gißi Theo sß liệu căa Tổ chąc Y t¿ th¿ gißi, còn khoÁng 36 n°ßc vẫn còn có bệnh tÁ Bệnh tÁ n¿u không °ÿc iều trị kịp thái và úng cách th°áng có tỷ lệ mÁc/ch¿t rÃt cao, khoÁng 40% Mßi năm °ßc tính có trung bình khoÁng 1 triệu tr°áng hÿp bị mÁc bệnh tÁ, sß tử vong là khoÁng 200.000 ã châu Phi và khoÁng 100.000 ã châu Á Mát phần ba sß tử vong ó là trẻ em d°ßi 05 tuổi, mát phần

t° là trẻ em tć 5-14 tuổi, và sß còn l¿i là ng°ái lßn [6]

Theo Quy¿t ịnh sß 4283/QĐ-BYT ngày 08/8/2016 căa Bá tr°ãng Bá Y t¿ ban hành tài liệu <Định nghĩa tr°áng hÿp bệnh truyền nhiễm=[4] thì bệnh tÁ là bệnh truyền nhiễm thuác nhóm A trong Lu¿t Phòng, chßng bệnh truyền nhiễm năm 2007 Mát tr°áng hÿp bệnh tÁ xác ịnh °ÿc ịnh nghĩa nh° sau:

<Là trường hợp bệnh nghi ngờ hoặc trường hợp bệnh có thể, có ít nhất một trong các kết quả xét nghiệm sau:

- Phân lập được phẩy khuẩn tả V cholerae nhóm huyết thanh 01 hoặc 0139 từ mẫu phân hoặc chất nôn của bệnh nhân tiêu chảy cấp, hoặc

- Xác định được đoạn gen đặc hiệu của vi khuẩn tả bằng kỹ thuật sinh học phân tử=

1.1.2 Phẩy khuẩn tả

Phẩy khuẩn tÁ (Vibrio cholerae) là vi khuẩn hình cong dÃu phẩy, không

bÁt mầu gram, không sinh nha bào, di áng nhanh nhá có mát lông Phẩy khuẩn

tÁ dễ nuôi cÃy trong môi tr°áng nghèo dinh d°ỡng, pH kiềm (pH tć 8,5-9,0) và mặn

Phẩy khuẩn tÁ có khoÁng 140 nhóm huy¿t thanh ã °ÿc xác nh¿n, nh°ng chỉ có nhóm huy¿t thanh O là gây °ÿc bệnh tÁ Phẩy khuẩn tÁ °ÿc chia thành vi khuẩn tÁ O1 và không O1 (vi khuẩn tÁ không ng°ng k¿t vßi O1 còn °ÿc gọi là chăng NAG) Vi khuẩn tÁ gám 2 týp sinh học (biotype) là vi khuẩn tÁ cổ iển và vi khuẩn tÁ El tor Mßi týp sinh học l¿i °ÿc chia thành các týp huy¿t thanh nh° Ogawa, Inaba và Hikojima Vi khuẩn tÁ cổ iển °ÿc Robert Koch phát hiện năm 1883 và là nguyên nhân gây ra 6 vā ¿i dịch tÁ trên th¿ gißi tć 1816-1926 Vi khuẩn tÁ El tor do Gotschlich tìm ra năm 1905 ã khu vực El tor 3 Ai C¿p, ây là nguyên nhân gây ra ¿i dịch tÁ lần thą 7 bÁt ầu tć 1961 ¿n nay Tć cußi năm 1992, chăng tÁ O139 lần ầu tiên °ÿc phát hiện trong mát vā dịch tÁ lßn ã miền nam Ân Đá và Bangladesh (trong 3 tháng có 100.000 ng°ái mÁc) Đ¿n cußi năm 1994, ng°ái ta cũng ã phát hiện ra vi khuẩn tÁ O139 trong mát vài vā dịch tÁ ã mát sß n¢i khác (Pakistan, Nepal, Malaysia, Thái Lan, và miền tây Trung Qußc) [7]

1.1.3 Dịch lưu hành

Là dịch luôn có ã ịa ph°¢ng hay mát nhóm dân sß nào ó vßi tỷ suÃt hiện mÁc và tỷ suÃt mßi mÁc t°¢ng ßi cao so vßi ịa ph°¢ng, nhóm dân sß khác [1]

1.1.4 Thực khuẩn thể

Thực khuẩn thể (Bacteriophage) th°áng gọi tÁt là phage, °ÿc Twort

phát hiện năm 1915 và d9Herelle ặt tên là <bacteriophage= năm 1917 Bacteriophage °ÿc ghép bãi <bacterium= (vi khuẩn) và <phagein= (ăn, nußt)

hay là thực khuẩn thể là vi rút mà t¿ bào cÁm thā là vi khuẩn, nghĩa là nó có khÁ năng ly giÁi vi khuẩn, do ó ng°ái ta còn gọi thực khuẩn thể là vi rút căa

vi khuẩn [125]

1.1.5 Thực khuẩn thể tả

Thực khuẩn thể tÁ (Vibriophage) là vi rút có khÁ năng ly giÁi vi khuẩn

thuác họ Vibrionaceae Những vi rút này ¿i diện cho mát nhóm vi rút dị d°ỡng a d¿ng về mặt di truyền và trao ổi chÃt, có mặt khÁp n¢i trong các ¿i d°¢ng Chúng có thể sßng tự do, tuy nhiên, chúng có nhiều h¢n trong trầm tích hoặc k¿t hÿp vßi các sinh v¿t biển hoặc các h¿t hữu c¢ khác H¢n nữa, nhóm này

bao gám mát sß mầm bệnh, bao gám V anguillarum, V parahaemolyticus, V

harvey và V vulnificus Những mầm bệnh này lây nhiễm sang h¢n 50 loài cá,

áng v¿t thân mềm và áng v¿t giáp xác Chúng có thể gây ra bệnh Vibriosis, mát căn bệnh ác tính Ánh h°ãng ¿n ngành nuôi tráng thăy sÁn trên toàn cầu và gây ngá ác thực phẩm ã những ng°ái tiêu thā hÁi sÁn sßng bị nhiễm bệnh K¿t quÁ là, các thể thực khuẩn tiêu hăy °ÿc ặc biệt quan tâm do tiềm năng sử dāng căa chúng trong liệu pháp thể thực khuẩn, nh° là ph°¢ng pháp iều trị bệnh vibriosis [126]

1.1.6 Ly giải

Ly giÁi hay chu trình tan (lytic cycle) căa thực khuẩn thể (phage) là chu trình phân rã vi khuẩn và phóng thích phage tr°ãng thành BÁt ầu là phage bám vào vách t¿ bào vi khuẩn và phân giÁi nhá hệ thßng enzyme ể xâm nh¿p vào bên trong, phá hăy ADN t¿ bào vi khuẩn Ti¿p theo là quá trình sinh tổng hÿp, t¿o ra các tiểu thể vi rút mßi, làm phân rã vi khuẩn và phóng thích các phage tr°ãng thành Các phage có khÁ năng phân rã vi khuẩn trong thái gian ngÁn gọi là phage ác, là tác nhân diệt khuẩn chính xác, ặc hiệu và không Ánh h°ãng ¿n vi khuẩn không phÁi v¿t chă

1.1.7 Môi trường

Theo khoÁn 1, Điều 3, Lu¿t BÁo vệ môi tr°áng sß 72/2020/QH14 ngày 17/11/2020 căa Qußc hái, có hiệu lực kể tć ngày 01/01/2022 thì môi tr°áng

bao gám các y¿u tß v¿t chÃt tự nhiên và nhân t¿o quan hệ m¿t thi¿t vßi nhau, bao quanh con ng°ái, có Ánh h°ãng ¿n ái sßng, kinh t¿, xã hái, sự tán t¿i, phát triển căa con ng°ái, sinh v¿t và tự nhiên [16]

1.1.8 Môi trường nước ngoại cảnh

Trong nghiên cąu này, môi tr°áng n°ßc ngo¿i cÁnh °ÿc hiểu là n°ßc bề mặt t¿i các nguán n°ßc: n°ßc sông, sußi; n°ßc ao, há, ầm; n°ßc gi¿ng; n°ßc máy; n°ßc m°a

1.1.9 Nguồn truyền nhiễm

Là tác nhân gây ra các bệnh truyền nhiễm bao gám vi khuẩn, vi rút hoặc vi sinh v¿t [42]

Nguán truyền nhiễm có thể là ng°ái bệnh, ng°ái mang trùng, hay áng v¿t Mát tiêu iểm dịch hay ổ dịch trong cáng áng hay mát ổ dịch trong thiên nhiên có thể là iểm khãi phát căa nhiễm trùng [1]

1.1.10 Đường truyền nhiễm

C¢ ch¿ truyền nhiễm căa mát bệnh nhiễm trùng ặc tr°ng bằng °áng truyền nhiễm vßi lßi ra căa tác nhân gây bệnh khỏi ký chă và lßi vào căa tác nhân ó ã ký chă mßi, cùng vßi ph°¢ng thąc tán t¿i căa tác nhân ã bên ngoài c¢ thể ký chă Các y¿u tß truyền nhiễm nh°: không khí, Ãt, n°ßc, thực phẩm, ti¿t túc có vai trò trung gian trong mát khoÁng thái gian nào ó giúp vi sinh v¿t gây bệnh sßng sót khi ra khỏi c¢ thể ký chă và °a vi sinh v¿t gây bệnh xâm nh¿p vào c¢ thể ký chă mßi [1]

1.2 Táng quan bÇnh tÁ

1.2.1 Bệnh tả

Phẩy khuẩn tÁ (V cholerae) là tác nhân gây bệnh tÁ bằng bằng ác tß ruát

Đác tß ruát gÁn vào niêm m¿c ruát non, ho¿t hoá enzyme adenylcyclase dẫn ¿n tăng AMP vòng, làm giÁm hÃp thu Na+, tăng ti¿t Cl- và n°ßc gây tiêu chÁy

cÃp tính Phẩy khuẩn tÁ dễ bị tiêu diệt bãi nhiệt á (800C/5 phút), bãi hoá chÃt (Clo 1 mg/lít) và môi tr°áng axit Khô hanh, ánh nÁng mặt trái cũng làm ch¿t phẩy khuẩn tÁ Nó có thể tán t¿i lâu trong phân, Ãt ẩm, n°ßc, thực phẩm [7]

1.2.1.1 Phương thức lây truyền

N°ßc là y¿u tß lây truyền dịch tÁ; phÁy khuẩn tÁ theo n°ßc bị nhiễm bẩn bãi phân ng°ái hoặc phân áng v¿t và qua thực phẩm bị nhiễm các tác nhân gây bệnh trong quá trình ch¿ bi¿n hoặc bÁo quÁn, bãi n°ßc bẩn, qua bàn tay bẩn và ruái, nhặng nhiễm phÁy khuẩn tÁ Những y¿u tß làm tăng nguy c¢ lan truyền bệnh tÁ là ái sßng kinh t¿ xã hái và dân trí thÃp, phong tāc t¿p quán sinh ho¿t l¿c h¿u, thái ti¿t nóng ẩm, thi¿u n°ßc s¿ch và nhà tiêu hÿp vệ sinh, không Ám bÁo các iều kiện về vệ sinh an toàn thực phẩm ặc biệt là thąc ăn °áng phß, tình tr¿ng mÃt vệ sinh ã những vùng sau lũ lāt, thÁm họa, tr¿i tị n¿n [7], [6]

1.2.1.2 Tính cảm nhiễm và miễn dịch

Phẩy khuẩn tÁ chỉ gây bệnh ã ng°ái Mọi ląa tuổi ều có thể mÁc bệnh tÁ Tuy nhiên, tính cÁm nhiễm bệnh phā thuác vào mßi cá thể và liều nhiễm khuẩn C¢ thể sau khi mÁc bệnh hoặc nhiễm khuẩn không triệu chąng ều có miễn dịch ặc hiệu vßi chăng tÁ gây bệnh có thể ¿n 3 năm Nhìn chung, miễn dịch thu °ÿc trong bệnh tÁ là vững chÁc nh°ng không lâu bền nh° trong th°¢ng hàn và sãi Không có miễn dịch chéo giữa các chăng phẩy khuẩn tÁ nhóm O1 và O139, giữa các týp huy¿t thanh (Ogawa và Inaba), giữa các týp sinh học (cổ iển và El tor) [7].

1.2.1.3 Dịch tễ học

a Ngußn truyÁn nhiÅm

Ng°ái bệnh và ng°ái lành mang vi khuẩn tÁ là nguán truyền nhiễm chă y¿u Vi khuẩn tÁ tìm thÃy chă y¿u trong phân ng°ái bệnh, ít tìm thÃy trong chÃt nôn Phân căa ng°ái bệnh gây ô nhiễm thąc ăn, n°ßc ußng, các v¿t dāng, bàn

tay, tć ó lây lan tć ng°ái này sang ng°ái khác qua °áng tiêu hóa [12] Ng°ái lành mang vi khuẩn gám ng°ái nhiễm khuẩn không triệu chąng và ng°ái khỏi bệnh mang vi khuẩn tÁ Ng°ái nhiễm tÁ không triệu chąng là nguán truyền nhiễm nguy hiểm, làm lây lan bệnh tć ịa ph°¢ng này tßi ịa ph°¢ng khác và làm dịch lan ráng tć mát n°ßc ra nhiều n°ßc [10]

Vi khuẩn tÁ có thể tán t¿i trong nhiều lo¿i áng v¿t sßng ã các vùng n°ßc ngọt, n°ßc lÿ và n°ßc mặn, ặc biệt là trong tôm, cua, ßc, h¿n, sò v.v Mát sß nghiên cąu cho thÃy sự tán t¿i ổ chąa vi khuẩn tÁ ngoài môi tr°áng ã các áng v¿t thăy sinh, các sinh v¿t phù du sßng trong vùng n°ßc cửa sông [10]

Trong 20 năm qua, những nghiên cąu ã Australia và Mỹ ã chąng minh cÁ hai lo¿i chăng vi khuẩn tÁ O1 không sinh ác tß và sinh ác tß là những thành viên căa hệ sinh thái n°ßc Vi khuẩn tÁ O1 trong môi tr°áng ngo¿i cÁnh dễ bị ly giÁi khi gặp iều kiện không thu¿n lÿi hoặc d¿ng sßng nh°ng không thể nuôi cÃy °ÿc (Viable but non culture 3 VNBC), khi gặp iều kiện thu¿n lÿi có thể gây dịch Tình tr¿ng VNBC có thể giÁi thích mát phần tính chÃt ngÁt quãng căa các vā dịch tÁ, trong iều kiện có ít chÃt dinh d°ỡng, các t¿ bào vi khuẩn gram âm trong ó có vi khuẩn tÁ trÁi qua những thay ổi hình thể, nhỏ i và chuyển thành hình cầu Mát sß nghiên cąu căa các tác giÁ cũng ề c¿p ¿n những thay ổi về hình thể t¿ bào căa vi khuẩn tÁ [48], [58], [68]

Biểu đồ 1 1 Mối liên quan giữa các loại vi khuẩn và môi trường ngoại cảnh

b Đường truyền nhiễm

N°ßc là y¿u tß lây truyền bệnh chă y¿u trong dịch tễ học bệnh tÁ ã °ÿc John Snow khẳng ịnh năm 1854 Tć ó ¿n nay ã có nhiều nghiên cąu dịch tễ học khẳng ịnh vai trò quan trọng căa n°ßc ßi vßi sự lan truyền dịch tÁ Sử dāng n°ßc không hÿp vệ sinh và không °ÿc khử trùng óng vai trò chă y¿u trong lan truyền bệnh tÁ K¿t quÁ iều tra các mẫu n°ßc trong khu vực ang có dịch nh° ã Bangladesh cho thÃy có 12% mẫu n°ßc có vi khuẩn tÁ O139 và 1% mẫu n°ßc có vi khuẩn tÁ O1 Vi khuẩn tÁ có trong môi tr°áng n°ßc chă y¿u là do nhiễm phân căa bệnh nhân tÁ [6], [59]

1.2.1.4 Phòng bệnh tả và vắc xin

Phòng bÇnh tÁ: (1) Tuyên truyền giáo dāc cáng áng trên các ph°¢ng

tiện thông tin ¿i chúng các ki¿n thąc về bệnh tÁ và tiêu chÁy cÃp, các biện pháp thực hành vệ sinh cá nhân, vệ sinh môi tr°áng; an toàn vệ sinh thực phẩm; bÁo vệ nguán n°ßc và dùng n°ßc s¿ch; khi có ng°ái bị tiêu chÁy cÃp, nhanh chóng

báo cáo cho c¢ sã y t¿ gần nhÃt ể °ÿc h°ßng dẫn và iều trị kịp thái; (2) Tăng c°áng cung cÃp n°ßc s¿ch và vệ sinh môi tr°áng; (3) Tăng c°áng việc thanh kiểm tra an toàn vệ sinh thực phẩm, ặc biệt là t¿i các c¢ sã ch¿ bi¿n thực phẩm, chÿ, nhà hàng, b¿p ăn t¿p thể, tr°áng học, thąc ăn °áng phß ; (4) Duy trì th°áng xuyên việc giám sát các tr°áng hÿp tiêu chÁy cÃp, ặc biệt chú ý các vùng trọng iểm và vào mùa dịch, kịp thái phát hiện các ca bệnh ầu tiên; (5) Luôn sẵn sàng có ái c¢ áng phòng chßng dịch ã tćng tuy¿n Chuẩn bị các c¢ sß dự trữ cho chßng dịch tÁ; (6) Gây miễn dịch chă áng bằng vÁc xin [7]

VÃc xin phòng bÇnh tÁ: Tổ chąc Y t¿ Th¿ gißi chính thąc khuy¿n nghị

sử dāng vÁc xin tÁ trong những khu vực khẩn cÃp (thiên tai, ịch họa) nh° là biện pháp y t¿ công cáng bổ trÿ cho các biện pháp phòng bệnh nh° cÁi thiện hệ thßng cÃp n°ßc hÿp vệ sinh và giáo dāc sąc khoẻ Cần ti¿n hành song song vßi các biện pháp tăng c°áng giám sát và cÁnh báo sßm [7]

Tuy nhiên, theo Lopez và cáng sự (2014), vÁc xin tÁ °áng ußng không nên °ÿc coi là biện pháp phòng ngća duy nhÃt trong việc kiểm soát bệnh tÁ tách biệt khỏi các biện pháp khác [25].

1.2.1.5 Kháng kháng sinh

Kháng sinh dùng cho iều trị tÁ có tác dāng rút ngÁn quá trình bệnh và rút ngÁn thái gian ào thÁi vi khuẩn qua °áng phân Nhóm quinolon th¿ hệ mßi nh° norfloxacin và ciprofloxacin có tác dāng rÃt tßt trong thực t¿ iều trị bệnh tÁ [6]

Tuy nhiên, theo Phùng ĐÁc Cam, tình tr¿ng kháng thußc căa vi khuẩn tÁ ngày mát tăng, gen kháng thußc nằm ã Plasmid IncC Việc kháng thußc không chỉ xÁy ra ã tetracyclin mà còn ßi vßi chloramphenicol, trimethoprim-sulfamethoxazol [6] K¿t quÁ cho thÃy phẩy khuẩn tÁ ã kháng mąc á vća vßi tetracycline và chloramphenicol; kháng ã mąc á m¿nh vßi sulfamethoxazole-trimethoprim [55]

Nguyễn Thị ĐÃu và cáng sự (2015) ã nghiên cąu sự nh¿y cÁm và ề kháng kháng sinh căa các chăng vi khuẩn tÁ phân l¿p °ÿc t¿i tỉnh Trà Vinh thì thÃy rằng vi khuẩn tÁ kháng vßi vancomycin (67%), steptomycin (50%), tetracycline (33%) [11]

Nghiên cąu về kháng kháng sinh căa vi khuẩn tÁ phân l¿p °ÿc ã miền BÁc Việt Nam tć năm 2007 ¿n 2010 thÃy rằng vi khuẩn tÁ kháng tetracycline (29%), nh¿y cÁm vßi chlorampenicol (100%) [144]

K¿t quÁ nghiên cąu căa Devarati Dutta và cáng sự (2013) cho thÃy hầu h¿t những chăng không ng°ng k¿t (NAG) ều ề kháng vßi nalidixic acid (57.6%), ampicillin (55.5%); nh¿y cÁm vßi gentamicin (96%), tetracycline (80%) và chloramphenicol (80.4%) [54]

Brain (2011) cho rằng kháng kháng sinh là vÃn ề lßn ßi vßi việc phòng, chßng bệnh tÁ do ch°a có nhóm kháng sinh mßi °ÿc phát triển và do ó ngày càng có nhu cầu về mát giÁi pháp thay th¿ kháng sinh [35] Theo Barrow (2001), Matsuzaki Uchiyama và cáng sự (2014), mát ph°¢ng pháp iều trị thay th¿ nh° v¿y là kiểm soát vi khuẩn tÁ bằng cách sử dāng thể thực khuẩn ặc hiệu ßi vßi v¿t chă [28], [93] Không gißng kháng sinh phổ ráng có tác dāng tiêu diệt các vi khuẩn có lÿi trong °áng ruát, thể thực khuẩn chỉ tiêu diệt vi khuẩn māc tiêu Nghiên cąu căa Weinbauer (2004) cho thÃy các thực khuẩn thể tan (lytic) h¿n ch¿ sß l°ÿng vi khuẩn trong môi tr°áng n°ßc lên tßi 80% [151] Các nghiên cąu căa Faruque, Islam và cáng sự (2005), Jensen, Faruque và cáng sự (2006), Nelson, Chowdhury và cáng sự (2008) cho thÃy bằng chąng về việc vi khuẩn tÁ trong môi tr°áng n°ßc °ÿc kiểm soát bãi các thực khuẩn thể tÁ tan [57], [77], [105]

Các báo cáo tr°ßc ây căa Asheshow, Saranjam và cáng sự (1930), Morison (1932), Monsur, Rahman và cáng sự (1970), Marcuk, Nikiforov và cáng sự (1971) về việc sử dāng liệu pháp thể thực khuẩn cho bệnh tÁ cho thÃy

có sự thành công nhÃt ịnh [26], [97], [96], [92]

1.2.2 Tình hình dịch tả trên thế giới và Việt Nam

1.2.2.1 Tình hình dịch tả trên thế giới

Theo báo cáo căa WHO, năm 2021 có 23 qußc gia báo cáo dịch tÁ bùng phát, chă y¿u ã khu vực Châu Phi và Đông Địa Trung HÁi Năm 2022, có 30 qußc gia trên 5 trong sß 6 khu vực trên th¿ gißi báo cáo các tr°áng hÿp mÁc bệnh tÁ hoặc bùng phát dịch tÁ; trong ó có 14 qußc gia không báo cáo năm 2021 Tính ¿n ngày 01/02/2023, có ít nhÃt 18 qußc gia ti¿p tāc báo cáo các tr°áng hÿp mÁc tÁ (Hình 1, 2) Theo mô hình thái vā, phần lßn các qußc gia có tr°áng hÿp mÁc tÁ hiện ang trong giai o¿n lây truyền thÃp hoặc giữa các ÿt dịch Tỷ xuÃt ch¿t thô (Crude fatality rate 3 CFR) t¿i nhiều qußc gia báo cáo cao h¢n những năm tr°ßc Tỷ lệ CFR °ÿc báo cáo trên toàn cầu năm 2021 là 1,9% (2,9% ã Châu Phi) [158].

Biểu đồ 1 2 Tình hình dịch tả và tiêu chảy cấp tính trên toàn cầu đến 01/2/2023

Biểu đồ 1 3 Các ca bệnh tả trên toàn cầu được báo cáo từ 1989 - 2021

1.2.2.2 Tình hình dịch tả tại Việt Nam

Bệnh tÁ lần ầu tiên xuÃt hiện ã Việt Nam năm 1850 vßi 2 triệu tr°áng hÿp bệnh °ÿc thông báo Tć năm 1910-1938, hàng năm sß bệnh nhân mÁc tÁ °ÿc thông báo dao áng tć 5.000 - 30.000 ng°ái Bệnh tÁ El tor lần ầu tiên xuÃt hiện ã miền Nam năm 1964 vßi 20.009 ng°ái mÁc bệnh trong ó 821 ng°ái tử vong Tć ó ¿n năm 1975, ã miền Trung và miền Nam, bệnh tÁ xÁy ra d°ßi d¿ng dịch l°u hành Hàng năm có hàng trăm bệnh nhân bị bệnh tÁ °ÿc thông báo Năm 1994, bệnh tÁ xuÃt hiện ã khu vực Tây Nguyên vßi 1.459 bệnh nhân Sau năm 1975, do việc thông th°¢ng giữa hai miền Nam, BÁc, bệnh tÁ ã lây lan ra miền BÁc và gây ra những vā dịch tÁ rÁi rác ã HÁi Phòng Tć năm 1993 -2004, dịch xÁy ra ã cÁ ba miền BÁc, Trung, Nam vßi khoÁng vài nghìn ca bệnh °ÿc báo cáo hàng năm Tuy nhiên, bệnh không bùng phát thành dịch lßn, có rÃt ít tr°áng hÿp tử vong Các năm 2005-2006, cÁ n°ßc không ghi nh¿n tr°áng hÿp nào Tć cußi năm 2007, dịch l¿i bùng phát ã 19 tỉnh/thành phß phía BÁc, hàng ngàn tr°áng hÿp mÁc nh°ng không có tr°áng hÿp nào tử vong [7]

1.3 Tình hình nghiên cąu vÁ sā l°u hành căa thāc khuÁn thà tÁ

Thực khuẩn thể tÁ (Vibriophage) °ÿc Felix8d Herelle phát hiện ầu tiên

vào những năm 1920 [141] Tuy nhiên, tr°ßc ó 20 năm, Enest Hankin, nhà sinh v¿t học ng°ái Anh phát hiện thÃy có 1 nguán ch°a xác ịnh rõ có khÁ năng chßng l¿i vi khuẩn tÁ trên sông Ganges và Jumne t¿i Ân Đá Năm 1919, Felix8d Herelle ã sử dāng thực khuẩn thể ể kiểm soát quần thể vi khuẩn và sự lây lan căa các bệnh truyền nhiễm Ông và cáng sự ã thực hiện liệu pháp thể thực khuẩn ã nhiều n°ßc trên th¿ gißi vßi những nß lực lßn ã Ân Đá, Ai C¿p, Hoa Kỳ và Liên Xô Nhiễm khuẩn ã °ÿc khßng ch¿ thành công khi sử dāng liệu pháp thể thực khuẩn căa các vi khuẩn Shigella, Staphylococcus, Streptocooccus,

Klebsiella, E coli, Salmonella, V cholerae, Pesudomonas và Proteus [52], [51],

[137]

1.3.1 Đặc điểm hình thái, cấu trúc cÿa thực khuẩn thể tả

Phân lo¿i thực khuẩn thể tÁ chă y¿u dựa vào hình thái bên ngoài Có hai nhóm chính ó là: thực khuẩn thể hình cầu và thực khuẩn thể gÁn vào filamentous

Các thực khuẩn thể tÁ ¿n các vị trí thā thể ặc hiệu trên thành t¿ bào vi khuẩn â các vi khuẩn gram (-) các thā thể °ÿc phát hiện là các protein và lipopolysacharide cÃu t¿o nên màng ngoài bao quanh lßp vỏ peptidoglican Các thực khuẩn thể tÁ sg ¿n gÁn vào các vị trí ặc hiệu căa t¿ bào vi khuẩn Các thực khuẩn thể tÁ chỉ ho¿t áng ặc hiệu trên các t¿ bào vi khuẩn ích căa nó [47] các thực khuẩn thể tÁ khác nhau sg °ÿc gÁn vào các vị trí khác nhau căa t¿ bào vi khuẩn Do v¿y, trên bề mặt t¿ bào vi khuẩn có nhiều d¿ng thā thể khác

nhau, mßi d¿ng thā thể °ÿc gÁn nhiều các bÁn sao căa thực khuẩn thể tÁ [122]

Thực khuẩn thể tÁ có 2 d¿ng: (1) Thực khuẩn thể tÁ hình cầu (2) Thực khuẩn thể tÁ d¿ng sÿi

Thực khuẩn thể tÁ hình cầu °ÿc phân theo 3 họ chính:

- Hình thái: Thực khuẩn thể tÁ bao gám mát ầu và mát uôi, không có vỏ bao quanh Phần ầu °ÿc nßi vßi uôi bãi phần cổ rái ¿n phąc hÿp uôi, phần uôi bao gám mát ßng trung tâm và mát vỏ có thể co rút °ÿc, nßi vßi mát cổ, ĩa c¢ bÁn, 6 gai ngÁn và 6 sÿi dài Sự co rút căa thực khuẩn thể tÁ là cần thi¿t ể cung cÃp ATP Thực khuẩn thể tÁ này có mát uôi d¿ng xoÁn ßc và mát ầu vßi ßi xąng hai m°¢i mặt hoặc ßi xąng bÁt nguán tć mát cÃu trúc hai m°¢i mặt c¢ bÁn thêm vào hàng các ¢n vị căa lßp vỏ capsid (capsomer) lßp vỏ protein căa vi rút (capsid) (T=13) Đầu là d¿ng áng phân ể kéo dài về hình d¿ng và có °áng kính 50 3 110nm Lßp vỏ capsid có hình lāc lăng bên ngoài, bao gám 152 ¢n vị capsome Phần uôi cąng, dài và dầy, phần ßng co rút °ÿc và °ÿc ngăn cách bằng dÃu chữ th¿p, hoặc có các v¿t nhăn có hình d¿ng các °áng dÃu chéo có chiều dài (80-) 95-111(-455)nm vßi chiều ráng 16-20nm

Hình 1 1 Hình ảnh Myoviridae quan sát dưới kính hiển vi điện tử

- Đặc tính hóa lý: Các h¿t virion này có tỉ trọng nổi trong CsCl là 1.41 3 1.51 gcm-3

- Axit nucleic: Khßi l°ÿng phân tử căa genome hình thành 48% trọng l°ÿng căa h¿t virion Genome không bị cÁt tćng o¿n và chąa mát ¢n phân tử chußi kép ADN Genome hoàn chỉnh chi¿m 33600 3 170000 nucleotid chiều dài Genome có guanin + cytosin chi¿m 35 % Chußi kép ADN °ÿc hoán vị tròn

- Protein: Genome vi rút mã hóa các protein cÃu trúc và các protein không cÃu trúc

b Họ Siphoviridae [129]

- Hình thái: Thực khuẩn thể tÁ bao gám mát ầu và mát uôi, không có vỏ Thực khuẩn thể tÁ có ầu ßi xąng 20 mặt và mát uôi vßi mát ßi xąng 6 ã uôi và ßi xąng 20 mặt ã ầu (T=7) Đầu có °áng kính 60nm Lßp vỏ capsid có hình lāc lăng bao quanh, gám 72 capsomer Đuôi không co rút °ÿc là d¿ng filamentous, t¿p hÿp thành dÃu th¿p vßi mát chiều dài (65-) 150 (-570)nm và mát chiều ráng (7-) 8 (-10)nm Đuôi có d¿ng sÿi, ngÁn, các sÿi ã phần cußi hoặc nửa cußi

- Đặc tính hóa lý: Các h¿t virion có tỉ trọng nổi trong CsCl là 1.46 3 1.56 gcm-3

- Axit nucleic: Khßi l°ÿng phân tử căa genome hình thành 54% trọng l°ÿng căa virion Genome không phân o¿n và chąa mát ¢n phân tử chußi kép ADN Genome hoàn chỉnh có chiều dài 48500 nucleotit Genome chąa tổng l°ÿng guanin + cytosin chi¿m 52% Chußi kép ADN không hoán vị, trình tự genome có iểm cußi cùng vßi ầu dính liền

- Protein: Genome vi rút mã hóa các protein cÃu trúc và không cÃu trúc - Các vi rút Siphoviridae có mát capsid vßi °áng kính khoÁng 55 3 60nm và mát uôi dài tßi 570nm Chußi kép ADN căa nó d¿ng thẳng Họ này bao gám: phage λ, phage χ, phage φ80

Hình 1 2 Hình ảnh Syphoviridae quan sát dưới kính hiển vi điện tử

c Họ Podoviridae [128]

- Hình thái: Thực khuẩn thể tÁ bao gám mát ầu, mát uôi và không có vỏ Thực khuẩn thể tÁ có mát ầu ßi xąng 20 mặt và mát uôi ßi xąng 6 c¿nh, °ÿc biểu hiện ã d¿ng ßi xąng 20 mặt (T=7) Phần ầu có °áng kính 60nm Đầu có d¿ng lāc lăng bên ngoài và bao gám 72 capsomer Phần uôi thẳng ngÁn và dầy, không co rút °ÿc, uôi có 6 sÿi ngÁn và các sÿi ã nửa cußi

- Đặc tính hóa lý: Khßi l°ÿng phân tử viron khoÁng 48 x 106 Các h¿t virion có tỉ trọng nổi trong CsCl là 1.44 3 1.51gcm-3 Các h¿t virion không nh¿y

cÁm khi xử lý vßi ether và chloroform

- Axit nucleic: Khßi l°ÿng phân tử căa genome hình thành 50% trọng l°ÿng căa virion Genome không bị phân o¿n và chąa mát ¢n phân tử căa chußi kép ADN Genome ã °ÿc giÁi trình tự hoàn toàn vßi chiều dài nucleotit là 42000 nucleotid Genome có guanine và cytosine chi¿m 50% Chußi kép ADN không hoán vị

- Protein: Các protein hình thành khoÁng 50% trọng l°ÿng căa h¿t virion - Genome vi rút mã hóa các protein cÃu trúc và không cÃu trúc Các h¿t virion bao gám ít nhÃt 9 protein cÃu trúc nằm trong vỏ capsid

Hình 1 3 Hình ảnh Podoviridae dưới kính hiển vi điện tử

1.3.1.2 Thực khuẩn thể tả dạng sợi

Thực khuẩn thể tÁ d¿ng sÿi bao gám kappa phage, filamentous 1 (fs1) và filamentous 2 (fs2)

Kappa phage có thể k¿t nßi vßi chăng vi khuẩn tÁ O1 El tor hoặc chăng tÁ O139 gây dịch Phát hiện kappa phage gián ti¿p qua việc phát hiện iểm nßi căa phage kappa nằm giữa gen flaA và flaC và v¿t chă là vi khuẩn tÁ; các v¿t chă vi khuẩn tÁ sg bị ly giÁi, vßi vi khuẩn tÁ O1 týp El tor và chăng tÁ O139

°ÿc quá trình này °ÿc thực hiện dễ dàng, chính xác h¢n

Hình 1 4 Hình ảnh kappa phage gắn vào các gen nối giữa flaA và flaC cÿa vi khuẩn tả O1 và O139

Kappa phage gÁn vào nhiễm sÁc thể nằm giữa các gen flaA và flaC và v¿t chă là vi khuẩn tÁ, v¿t chă vi khuẩn tÁ gÁn vßi mát kappa phage sg bị ly giÁi S¢ á mô tÁ trên cho thÃy chỉ có các chăng tÁ El tor và các chăng tÁ O139 có thể gÁn vßi kappa phage còn chăng cổ iển không gÁn

Thực khuẩn thể tÁ mßi là fs1 và fs2 mßi °ÿc phân l¿p tć chăng vi khuẩn tÁ O139 MDO14 [55] Thực khuẩn thể tÁ fs2 là các h¿t sÿi dài 1200nm và ráng

7nm Ho¿t áng hình thành các vòng vệt tan ổn ịnh ã nhiệt á 700C nh°ng bị

ąc ch¿ khi xử lý vßi chloroform Thực khuẩn thể tÁ fs2 có hệ gen là chußi ¢n

ADN, °ÿc chuyển thành chußi kép và sao chép trong t¿ bào v¿t chă Hầu h¿t các chăng tÁ O139 và O1 týp sinh học El tor nh¿y cÁm vßi thực khuẩn thể tÁ này, nh°ng phần lßn các chăng tÁ O1 cổ iển và non-O1 hay non-O139 kháng

l¿i thực khuẩn thể tÁ fs2 Các nhà nghiên cąu cho rằng trình tự CTXΦ cần thi¿t

cho thực khuẩn thể tÁ gÁn vào nhiễm sÁc thể căa vi khuẩn tÁ ã vị trí ặc hiệu Về hình d¿ng, fs1 không thể phân biệt vßi fs2 do kích cỡ hoàn toàn gißng

nhau (7nm chiều ráng và 1.0 3 1.2 �㕛m chiều dài); hầu h¿t fs1 và fs2 °ÿc t¿o

ra là polyphage Hệ gen căa fs1 °ÿc mã hóa hình thành ác tß ruát mßi tiềm

năng áng nhÃt vßi ác tß ZOT (zonula occludens toxin) Týp 4 fimbriae căa vi khuẩn tÁ O1 nh¿y vßi D 3 glucose và D 3 mannose °ÿc giÁ thi¿t là thā thể

căa fs1 và fs2 [58]

Hình 1 5 Hình ảnh đại diện cÿa filamentous phage 1.3.2 Sự lưu hành cÿa thực khuẩn thể và thực khuẩn thể tả

1.3.3.1 Sự lưu hành của thực khuẩn thể

Thực khuẩn thể là những vi rút ký sinh trên vi khuẩn Gißng nh° tÃt cÁ các lo¿i vi rút khác, chúng bÁt buác phÁi ký sinh trong nái bào căa vi khuẩn, không có sự trao ổi chÃt nái bào và òi hỏi bá máy chuyển hóa căa v¿t chă hß trÿ cho quá trình sinh sÁn căa chúng Thực khuẩn thể có mặt khÁp n¢i trên trái Ãt và °ÿc tìm thÃy vßi sß l°ÿng lßn trong tự nhiên [46], [63], [83] Có °ßc tính 1031 thực khuẩn thể, chúng phân bổ gần nh° khÁp n¢i, trong bÃt cą n¢i nào có vi khuẩn; °ÿc tìm thÃy trong hầu h¿t mọi môi tr°áng cũng nh° trong ruát áng v¿t và con ng°ái [99], [113], [139], [44] Theo Jonczyk E và cáng sự (2011) trong môi tr°áng bÃt lÿi, các thực khuẩn thể vẫn tán t¿i [81].

Theo Miller và Day (2008), các thực khuẩn thể có 03 chu kỳ: tan (lytic cycle), tiềm tan (lysogen cycle) và giÁ tiềm tan (pseudolysogen cycle) [94] Trong chu kỳ tan, thực khuẩn thể lây nhiễm vào t¿ bào, nhân lên và thoát khỏi

t¿ bào ể tiêu hăy t¿ bào vi khuẩn Trong chu kỳ tiềm tan, thực khuẩn thể không sao chép nh°ng bá gen căa nó bi¿n thành tr¿ng thái không ho¿t áng, gọi là prophage và tích hÿp vào bá gen căa v¿t chă hoặc °ÿc duy trì nh° mát plasmid ngo¿i bào [83] (Guttman, Raya et al, 2003) Trong chu kỳ giÁ tiềm tan, thực khuẩn thể không trÁi qua quá trình tan, quá trình tiềm tan nh°ng nó vẫn ã tr¿ng thái không ho¿t áng [120] (Ripp and Miller, 1997) Chu kỳ giÁ tiềm tan xÁy ra trong iều kiện khi nguán cung cÃp chÃt dinh d°ỡng không ă, khi ă nguán, thực khuẩn thể có thể quay l¿i chu kỳ tan hoặc tiềm tan

Nh° v¿y, có thể thÃy thực khuẩn thể l°u hành rÃt phổ bi¿n trong tự nhiên, theo sự có mặt căa v¿t chă

1.3.3.2 Sự lưu hành của thực khuẩn thể tả

Năm 1896, Ernest Hankin ã báo cáo về sự hiện diện căa mát chÃt kháng khuẩn rõ rệt, chßng l¿i vi khuẩn tÁ quan sát thÃy ã vùng n°ßc sông Hằng và sông Yamuna, Ân Đá [71] Hai năm sau ó, vào năm 1898, Gamaleya ã quan

sát thÃy hiện t°ÿng t°¢ng tự khi ang thử nghiệm vßi vi khuẩn Bacilus subtilis

[123] Năm 1915, Frederick Twort ã báo cáo mát hiện t°ÿng t°¢ng tự và °a ra giÁi thuy¿t nó có thể là vi rút [145] Tuy nhiên, ng°ái chính thąc phát hiện và ặt tên cho thực khuẩn thể là Felix d9Herelle vào năm 1917 [53], [51], [52] Madico, G và cáng sự (1996) khi nghiên cąu về sự hiện diện căa vi khuẩn tÁ O1 và thực khuẩn thể tÁ trong nguán n°ßc thÁi t¿i Peru tć năm 1993 ¿n năm 1996 trong ch°¢ng trình giám sát dịch tÁ t¿i thă ô Lima ã nh¿n thÃy khÁ năng dịch tÁ bùng phát cao h¢n 7,6 lần khi vi khuẩn tÁ O1 có mặt trong n°ßc thÁi trong bßn tuần tr°ßc ó so vßi khi không có KhÁ năng bùng phát dịch bệnh

cao gÃp 2,4 lần khi có thực khuẩn thể tÁ trong n°ßc thÁi trong 04 tuần tr°ßc so

vßi khi không có Nh° v¿y, việc phát hiện vi khuẩn tÁ O1 và thực khuẩn thể tÁ trong n°ßc thÁi 01 tháng tr°ßc khi bùng phát dịch có thể có tính dự báo sự bùng

phát căa dịch tÁ sau ó [91]

â nhiều qußc gia n¢i có dịch tÁ hoành hành, thực khuẩn thể tÁ °ÿc phát hiện trong n°ßc thÁi và °ÿc coi nh° là dÃu hiệu chỉ iểm sự có mặt căa thực

khuẩn thể tÁ và giúp cho việc ịnh týp chăng tÁ O1 và O139 Sự có mặt căa

thực khuẩn thể tÁ trong môi tr°áng n°ßc bị nhiễm vi khuẩn tÁ O1 phā thuác vào khÁ năng thực khuẩn thể tÁ gây nhiễm và ly giÁi t¿ bào vi khuẩn tÁ [77] â nhiều n°ßc có dịch tÁ l°u hành theo mùa, giám sát môi tr°áng óng vai trò quan trọng trong kiểm soát bệnh tÁ [60], [87]

Faruque, S.M và cáng sự (2005), Naser, I.B và cáng sự (2017) ã tìm thÃy thực khuẩn thể tÁ trong mẫu n°ßc t¿i Bangladesh [59], [103], ã °ÿc Seed, K.D và cáng sự (2011) xác ịnh là thể thực khuẩn chi¿m °u th¿ trong các mẫu phân căa bệnh nhân tÁ kể tć năm 2001 [130] Angermeyer, A và cáng sự (2018) ã ti¿n hành phân tích bá gen căa các thực khuẩn thể tÁ ã °ÿc bÁo tán tć năm 2001 ¿n năm 2012 ể nghiên cąu về sự áng ti¿n hóa căa các thực khuẩn thể tÁ °ÿc bÁo tán vßi vi khuẩn tÁ góp phần trong việc xác ịnh sự bùng phát căa dịch tÁ [24]

Năm 2014, Al-Fendi, A và cáng sự ã phân l¿p °ÿc 03 thể thực khuẩn tÁ tan họ Myoviridae tć các nguán n°ßc khác nhau (há, ao, sông, m°¢ng và n°ßc thÁi) ã Kelantan, Malaysia; các thực khuẩn thể tÁ phân l¿p °ÿc ã nghiên cąu này có ph¿m vi v¿t chă hẹp và chỉ có khÁ năng lây nhiễm ßi vßi vi khuẩn tÁ O1 El tor Inaba [23]

Solis-Sanchez, A và cáng sự (2016) khi lÃy mẫu n°ßc t¿i mát con ¿p ã Mexico ã phân l¿p °ÿc 16 thực khuẩn thể nh°ng chỉ có thực khuẩn thể ØVC8 là có khÁ năng ly giÁi chßng l¿i vi khuẩn tÁ O1 T¿i thái iểm phát hiện ra các thực khuẩn thể tÁ này, ịa iểm ó không có dịch tÁ l°u hành; tuy nhiên sự hiện diện căa vi khuẩn tÁ non-O1/O139 gÿi ý về khÁ năng căa chăng vi khuẩn tÁ có thể tán t¿i mát khoÁng thái gian dài trong nguán n°ßc thÁi bị ô nhiễm [134]

1.4 Tình hình nghiên cứu vß khả năng ly giải của thực khuẩn thá tả

1.4.1 Các phương pháp phát hiện và đánh giá khả năng ly giải cÿa thực khuẩn thể tả

1.4.1.1 Phương pháp phân lập thực khuẩn thể tả từ mẫu nước

- Nguyên lý: dựa vào khÁ năng thích ąng căa vi khuẩn tÁ có men chitinase có khÁ năng phân huỷ lßp vỏ chitin căa các loài giáp xác trong ó có tôm chúng tôi ti¿n hành sử dāng g¿c tôm làm mái ể tăng khÁ năng tóm bÁt vi khuẩn tÁ trong môi tr°áng n°ßc ngo¿i cÁnh

Mẫu gạc tôm

- Các mẫu g¿c tôm °ÿc ặt qua êm t¿i vị trí giám sát, sáng hôm sau thu th¿p vào ßng pép tôn kiềm

- Ă tć 6 3 8 h/ 370C, sử dāng chloroform ể gi¿t vi khuẩn

- Nhỏ lên ĩa th¿ch dinh d°ỡng và nhỏ thực khuẩn thể tÁ chuẩn, ĩa th¿ch dinh d°ỡng có láng vi khuẩn chỉ iểm ể tìm thực khuẩn thể tÁ

M¿u n°ãc: 500ml n°ßc bề mặt thu th¿p vào buổi sáng

Tăng sinh mẫu n°ßc bằng pepton kiềm 10X, ă qua êm, sau ó °ÿc xử lý chloroform ể gi¿t vi khuẩn, nhỏ lên ĩa th¿ch dinh d°ỡng có láng vi khuẩn chỉ iểm ể tìm thực khuẩn thể tÁ

1.4.1.2 Phương pháp phân lập filamentous phage

- Mẫu phân: lÃy 1ml mẫu phân, ly tâm 15.000 vòng/5 phút/40C - Tć dịch nổi nuôi cÃy

nổi ã 40C

+ Chuẩn bị mát chăng chỉ thị, là chăng Vibrio nào không t¿o ra filamentous phage

+ Nuôi cÃy chăng này ã 370C trong 4-5h lÁc m¿nh

+ Pha loãng dịch nuôi cÃy (canh khuẩn) khoÁng 100 lần vßi canh thang AT.

+ Trán 0,3 ml căa canh thang (canh khuẩn) pha loãng vßi 3ml th¿ch mềm ổ lên ĩa th¿ch, ÿi tć 10-15 phút cho ¿n khi th¿ch mềm cąng l¿i

- Phát hiện filamentous phage

+ Nhỏ 15 3 20µl dịch nuôi cÃy hoặc dịch nổi căa phần trên ĩa th¿ch vća phă th¿ch mềm

+ Phân biệt các vệt tan: Vệt tan trong °ÿc hình thành bãi mát sß các thực khuẩn thể tÁ có d¿ng hình cầu; d¿ng vệt tan āc °ÿc hình thành bãi các thực

- Sau khi thực khuẩn thể tÁ °ÿc phân l¿p bằng ph°¢ng pháp nuôi cÃy Gặt thực khuẩn thể tÁ vào n°ßc mußi sinh lý Các mẫu °ÿc gÁn lên lên l°ßi vàng, mặt trên l°ßi dùng ể thÃm mẫu, sau ó rửa qua n°ßc cÃt 02 lần, thÃm lên giÃy thÃm, nhuám bằng Uranyl acetat 2% (pH = 4,5) trong n°ßc cÃt 02 lần tć 1-2 phút, thÃm l¿i trên giÃy thÃm mẫu, chuyển sang ĩa ể ặt mẫu, ể khô trong 05 phút, ặt lên giá ể soi d°ßi kính hiển vi iện tử

1.4.1.4 Kỹ thuật PCR