Luận án tiến sĩ ngành nuôi trồng thủy sản nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn bacillus sp đối kháng với vibrio parahaemolyticus trong nuôi tôm công nghiệp

ĐỐI KHÁNG VỚI Vibrio parahaemolyticus TRONG NUÔI TÔM CÔNG NGHIỆP... ĐỐI KHÁNG VỚI Vibrio parahaemolyticus TRONG NUÔI TÔM CÔNG NGHIỆP... Tác nhân gây AHPND là một số chủng Vibrio par

LÊ THẾ XUÂN

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG VI KHUẨN Bacillus sp ĐỐI KHÁNG VỚI Vibrio parahaemolyticus

TRONG NUÔI TÔM CÔNG NGHIỆP

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

LÊ THẾ XUÂN

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG VI KHUẨN Bacillus sp ĐỐI KHÁNG VỚI Vibrio parahaemolyticus

TRONG NUÔI TÔM CÔNG NGHIỆP

TÓM TẮT

Được ghi nhận lần đầu tiên tại Trung Quốc năm 2009, bệnh Hoại tử gan tụy cấp ở tôm (AHPND) đã lan rộng ra nhiều quốc gia nuôi tôm trên thế giới, trong đó có Việt Nam và trở thành mối nguy hại hàng đầu đối với nuôi tôm công nghiệp tại các quốc gia này Tác nhân gây AHPND là một số chủng

Vibrio parahaemolyticus mang plasmid mã hóa cho độc tố nhị thể PirA/PirB

gây hoại tử gan tụy cấp Mục tiêu của nghiên cứu này là nhằm phân lập, ứng

dụng các chủng vi khuẩn Bacillus sp có tính đối kháng mạnh với V

parahaemolyticus để phòng chống AHPND trong nuôi tôm công nghiệp Để

đạt được mục tiêu nghiên cứu kể trên, từ các ao tôm công nghiệp không mắc bệnh và nghi mắc AHPND tại ba tỉnh Bạc Liêu, Sóc Trăng và Cà Mau, 149

chủng vi khuẩn nghi là Bacillus sp và 51 chủng vi khuẩn Vibrio sp đã được

phân lập từ tuyến tiêu hóa tôm, bùn và nước Bằng cách sử dụng kỹ thuật PCR

phát hiện các gen toxR, tdh, trh, pirA và pirB và các quan sát mô bệnh học khi cảm nhiễm trên tôm, 12 chủng V parahaemolyticus đã được xác định, trong đó chủng BĐB1.4v, dương tính với cả hai gen pirA và pirB, chính là tác nhân

gây AHPND Bên cạnh đó, phương pháp phân loại MLST (Multilocus Sequence Typing) đã được sử dụng để phân loại một tập hợp gồm 26 chủng

Bacillus sp Kết quả phân tích cho thấy có bốn loài Bacillus chính là B subtilis

(11 chủng), B velezensis (8 chủng), B siamensis (5 chủng) và B licheniformis

(2 chủng) Tiếp đó, phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch đã được sử dụng để

phân lập hai chủng B subtilis BRB2.1 và B siamensis BĐK2.3 có hoạt tính đối kháng cao với V parahaemolyticus bao gồm cả chủng BĐB1.4v gây

AHPND Ngoài khả năng tiết enzyme protease, amylase và cellulase mạnh, hai chủng này còn có thể thích ứng với các điều kiện rất rộng về nhiệt độ, pH

và độ mặn Mật độ ức chế tối thiểu của hai chủng Bacillus này đối với chủng

trên mô hình nuôi tôm thẻ chân trắng ở quy mô 100 lít, chủng B subtilis BRB2.1 và B siamensis BĐK2.3 giúp phòng chống hiệu quả AHPND với tỷ lệ sống của tôm sau 36 giờ cảm nhiễm V parahaemolyticus BĐB1.4v lần lượt

là 85,56% và 76,67% Ở quy mô 1000 lít trong khoảng thời gian theo dõi đến

35 ngày sau cảm nhiễm với tác nhân gây bệnh, chủng B subtilis BRB2.1

không những cho phép bảo vệ tôm khỏi AHPND mà còn cải thiện tỷ lệ sống và hiệu quả sử dụng thức ăn so với mẫu đối chứng không cảm nhiễm Khả

năng đối kháng của chủng B subtilis BRB2.1 rất có thể liên quan đến sự có

mặt của gen mã hóa subtilosin A, vốn là một loại bacteriocin phổ rộng Do

tính an toàn của B subtilis đã được công nhận nên chủng B subtilis BRB2.1

có thể được ứng dụng trực tiếp để sản xuất các chế phẩm sinh học phòng chống AHPND trong nuôi tôm nước lợ

ABSTRACT

Since its emergence in China in 2009, acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) has been causing massive losses in aquaculture To date, the disease has been recognized as the biggest threat to the shrimp farming industry in many countries (including Vietnam) The causative agent of

AHPND has been identified as Vibrio parahaemolyticus strains that harbor a large plasmid encoding binary toxins PirA/PirB The aim of this study was to isolate and apply Bacillus isolates that are strongly antagonistic against V

parahaemolyticus to prevent AHPND in cultured shrimps To this end, we

have isolated 149 presumptive Bacillus sp isolates and 51 Vibrio sp isolates

from shrimp digestive tract, sediment and water samples from commercial shrimp ponds in Bac Lieu, Soc Trang and Ca Mau provinces By detecting

toxin genes (toxR, tdh, trh, pirA và pirB) with PCR and performing histological observation, we have identified 12 V parahaemolyticus isolates, among which, BĐB1.4v strain, positive for both pirA and pirB, was shown to

be the direct cause of AHPND Furthermore, Multi-locus Sequence Typing (MLST) was used to describe the genetic diversity of a collection of 26

Bacillus isolates The results showed 4 major clusters, corresponding to 4 Bacillus species, namely B subtilis (11 isolates), B velezensis (8 isolates), B siamensis (5 isolates) và B licheniformis (2 isolates) Additionally, agar

diffusion method was used to reveal the strong antagonistic activity of B

subtilis BRB2.1 and B siamensis BĐK2.3 to V parahaemolyticus (including

strain BĐB1.4v causing AHPND) These two Bacillus isolates could not only

secrete high level of protease, amylase, and cellulase, but also adapt to a vast range of temperature, pH and salinity Results showed that when inoculated at

parahaemolyticus BĐB1.4v When tested on Litopenaeus vannamei cultured

in tanks of 100L, B subtilis BRB2.1 and B siamensis BĐK2.3 strains were

proved to be effective against AHPND (shrimps’ survival rates were 85,56% and 76,67% when being cultured with the two isolates) In larger model

(1000L), B subtilis BRB2.1 strain not only protected shrimps from AHPND but also improved their food conversion rate The antagonistic activity to V

parahaemolyticus of this strain may be explained by the presence of the gene

encoding for subtilosin A, which is a wide-spectrum bacteriocin Since B

subtilis is considered as GRAS, B subtilis BRB2.1 could be used directly to

produce probiotics that prevent AHPND in shrimp farming

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT xiii

Chương 1: GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu và phạm vi nghiên cứu 2

1.2.1 Mục tiêu tổng quát 2

1.2.2 Mục tiêu cụ thể 2

1.3 Nội dung nghiên cứu 2

1.4 Ý nghĩa nghiên cứu 3

1.5 Tính mới của luận án: 3

1.6 Thời gian thực hiện 3

Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Khái quát về hiện trạng nuôi tôm sú và tôm thẻ chân trắng (tôm nước lợ) 4

2.1.1 Tình hình nuôi tôm nước lợ trên thế giới 4

2.1.2 Tình hình nuôi tôm nước lợ ở Việt Nam 5

2.2 Tình hình dịch AHPND ở tôm nuôi trên thế giới và Việt Nam 6

2.3 Tác nhân gây AHPND trên tôm nuôi 7

2.4 Chẩn đoán AHPND và các biện pháp phòng, trị bệnh trên tôm nuôi 8

2.4.1 Chẩn đoán AHPND 8

2.4.2 Phòng chống AHPND ở tôm nuôi 9

2.5 Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus 12

2.5.1 Đặc tính chủng V parahaemolyticus 12

2.5.2 Các độc tố của V parahaemolyticus 14

2.5.3 Ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến sự phát triển của V parahaemolyticus 18

2.5.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ 18

2.5.3.2 Ảnh hưởng của pH 18

2.5.3.3 Ảnh hưởng của độ mặn 18

2.6 Khái quát chung về Bacillus subtilis 19

2.6.1 Sơ lược về B subtilis 19

2.6.2 Ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến sự phát triển của B subtilis 202.6.3 Phân loại Bacillus theo phương pháp truyền thống 22

2.6.4 Phân loại Bacillus theo các phương pháp phân tử 22

2.6.5 Ứng dụng của B subtilis trong công nghiệp và nuôi trồng thủy sản 26

2.7 Bacteriocin 29

2.7.1 Khái niệm 29

2.7.2 Phân loại Bacteriocin 31

2.7.3 Ứng dụng của bacteriocin từ Bacillus trong thủy sản 31

2.7.4 Subtilosin A 33

Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35

3.1 Địa điểm nghiên cứu và đối tượng nghiên cứu 35

3.2 Phương pháp nghiên cứu 35

3.2.1 Phương pháp lấy mẫu 36

3.2.2 Phương pháp phân lập Vibrio sp và xác định V parahaemolyticus từ ao

3.2.4 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường (nhiệt độ, pH, độ mặn) đến sự phát triển của V parahaemolyticus 40

3.2.5 Phương pháp phân lập các chủng vi khuẩn Bacillus trong ao nuôi tôm công nghiệp 41

3.2.5.1 Phương pháp lấy mẫu 41

3.2.5.2 Phương pháp phân lập Bacillus từ ao nuôi tôm 41

3.2.6 Phương pháp tuyển chọn các chủng vi khuẩn Bacillus sp 42

3.2.6.1 Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp có hoạt tính đối

3.2.7 Phương pháp tách chiết và tinh sạch DNA hệ gen của Bacillus 43

3.2.8 Phương pháp phát hiện và tách dòng gen mã hóa bacteriocin từ chủng Bacillus BRB2.1 43

3.2.8.1 Thiết kế mồi khuếch đại gen spaS và sboA từ chủng Bacillus BRB2.1 43

3.2.8.2 PCR khuếch đại gen spaS và sboA từ chủng Bacillus BRB2.1 44

3.2.8.3 Tách dòng và giải trình tự gen sboA từ chủng Bacillus BRB 2.1 44

3.2.8.4 Xây dựng cây phả hệ trình tự nucleotide và trình tự axít amin của

3.2.10 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của yếu tố môi trường đến sự phát triển của Bacillus sp 47

3.2.11 Kiểm tra khả năng gây AHPND của các chủng V parahaemolyticus

BĐB1.3v, BĐB1.4v, BNB 3.1v, BRB1.1v, CĐB6v trên TTCT 48

3.2.12 Nghiên cứu độc tính của chủng V parahaemolyticus BĐB1.4v trên tôm 49

3.2.13 Phương pháp thử nghiệm tính đối kháng của Bacillus sp với Vibrio sp ở quy mô phòng thí nghiệm 50

3.2.13.1 Lựa chọn các chủng Bacillus sp có khả năng ức chế vi khuẩn V parahaemolyticus và hoạt tính enzyme ngoại bào cao 50

3.2.13.2 Khảo sát khả năng kháng vi khuẩn V parahaemolyticus của các chủng vi khuẩn Bacillus sp trong hệ thống bể nuôi tôm 100 lít 51

3.2.14 Phương pháp khảo sát khả năng kháng vi khuẩn Vibrio của các chủng vi khuẩn Bacillus trong hệ thống bể nuôi tôm 1000 lít 52

3.2.14.1 Bố trí thí nghiêm: 52

3.2.14.2 Phương thức thực hiện: 52

3.2.14.3 Cho ăn và quản lý 52

3.2.14.4 Các chỉ tiêu theo dõi 53

3.2.15 Phương pháp xử lý số liệu 53

Chương 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN 54

4.1 Phân lập các chủng thuộc chi Vibrio trong ao nuôi tôm công nghiệp 54

4.2 Kết quả phát hiện các gen độc lực ở các chủng Vibrio sp phân lập được bằng PCR 55

4.2.1 Phát hiện gen toxR đặc hiệu cho V parahaemolyticus 55

4.2.2 Phát hiện gen độc lực tdh 58

4.2.3 Phát hiện gen độc lực trh 59

4.2.4 Phát hiện gen độc lực pirA 60

4.2.5 Phát hiện gen độc lực pirB 60

4.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ, độ mặn, pH đến sự phát triển của V

4.4 Phân lập các chủng thuộc chi Bacillus trong ao nuôi tôm công nghiệp 65

4.5 Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp có hoạt tính sinh học ứng dụng trong nuôi tôm công nghiệp 67

4.5.1 Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp có hoạt tính đối kháng V parahaemolyticus 67

4.5.2 Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp có hoạt tính sinh protease cao 684.5.3 Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp có hoạt tính sinh amylase cao 694.5.4 Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp có hoạt tính sinh cellulase cao 70 4.6 Xác định sự có mặt của các gen mã hóa bacteriocin ở chủng BRB2.1 72

4.6.1 Phát hiện và tách dòng gen mã hóa bacteriocin từ chủng BRB2.1 72

4.6.2 Xây dựng cây phả hệ và so sánh trình tự axít amin subtilosin A của chủng BRB2.1 75

4.6.2.1 Xây dựng cây phả hệ trình tự axít amin của subtilosin A từ chủng

BRB2.1 75

4.6.2.2 So sánh trình tự axít amin subtilosin A 76

4.6.3 Xây dựng cây phả hệ và so sánh trình tự nucleotide gen sboA của chủng BRB2.1 với 10 chủng tham chiếu 77

4.6.3.1 Xây dựng cây phả hệ trình tự nucleotide gen sboA 77

4.6.3.2 So sánh trình tự nucleotide gen sboA 77

4.7 Đa dạng di truyền 26 chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus dựa trên trình tự gen mã hóa 16S rDNA và phân tích MLST 78

4.7.1 Phân tích đa dạng di truyền của 26 chủng vi khuẩn Bacillus bằng phương pháp giải trình tự 16S rDNA 78

4.7.2 Phân tích đa dạng di truyền của 26 chủng vi khuẩn nghi là Bacillus bằng

4.10 Nghiên cứu độc tính của chủng V parahaemolyticus BĐB1.4v trên tôm 89

4.11 Thử nghiệm tính đối kháng của Bacillus sp với V parahaemolyticus BĐB1.4v ở quy mô phòng thí nghiệm 91

4.11.1 Nghiên cứu tính đối kháng của chủng B subtilis BRB2.1 và B siamensis BĐK2.3 đối với chủng V parahaemolyticus BĐB1.4v gây AHPND trong môi trường nước nuôi tôm 91

4.11.2 Thử nghiệm khả năng phòng chống AHPND của chủng B subtilis BRB2.1 và B siamensis BĐK2.3 trong thùng nuôi 100 Lít 93

4.12 Thử nghiệm khả năng bảo vệ tôm khỏi sự nhiễm V parahaemolyticus gây bệnh AHPND ở quy mô nuôi 1000 lít 95

4.12.1 Sự biến động của các chỉ tiêu môi trường trong quá trình thử nghiệm 95 4.12.2 Sự biến động của chỉ tiêu vi sinh vật tổng số và mật độ Vibrio trong quá trình thử nghiệm 97

4.12.3 Tỉ lệ sống và sự phát triển của tôm trong quá trình thử nghiệm 99

Chương 5: KẾT LUẬN - ĐỀ XUẤT 101

PHỤ LỤC D: KẾT QUẢ ĐỊNH TÊN CỦA 30 CHỦNG NGHI LÀ BACILLUS BẰNG GIẢI TRÌNH TỰ GEN 16S RDNA 161

PHỤ LỤC E: KẾT QUẢ THỐNG KÊ 164PHỤ LỤC F: MỘT SỐ HÌNH THỰC NGHIỆM 171

Chương 1: GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Nuôi tôm nước lợ ở quy mô công nghiệp hiện đang phát triển rất mạnh ở Đông Nam Á, Nam Á và Châu Mỹ La tinh Các loài tôm nước lợ được nuôi công

nghiệp nhiều nhất là tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) và tôm sú (Penaeus monodon) Nuôi tôm nước lợ công nghiệp là lĩnh vực kinh tế mũi nhọn,

góp phần quan trọng trong tổng giá trị xuất khẩu thủy sản của nước ta, đưa Việt Nam vào nhóm các quốc gia xuất khẩu thủy sản đứng đầu trên thế giới Năm 2017 cả nước có diện tích nuôi tôm nước lợ là 721.100 ha, đạt sản lượng 701.000 tấn Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) chiếm ưu thế về nuôi tôm nước lợ, với hơn 91,8% về diện tích và 82,5% sản lượng thu hoạch so với cả nước (Tổng cục thủy sản, 2018)

Theo Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu Thủy sản Việt Nam (VASEP), năm 2012, nguồn nguyên liệu tôm nuôi nước lợ cho xuất khẩu thiếu hụt nghiêm trọng, do dịch bệnh ở khu vực ĐBSCL; trong đó bệnh hoại tử gan tụy cấp ở tôm (Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease - AHPND) (Flegel, 2012) hay còn gọi là hội

chứng tôm chết sớm (Early Mortality Syndromy - EMS) (Lightner et al., 2012) là

nguyên nhân gây thiệt hại nặng nề nhất Năm 2010, AHPND bắt đầu xuất hiện tại vùng ĐBSCL Đến năm 2011, bệnh này bùng phát thành dịch tôm trên diện rộng, gây thiệt hại trên 97.000 ha tập trung ở các tỉnh: Sóc Trăng, Bạc Liêu, Cà Mau, Bến Tre Năm 2012 dịch bệnh bùng phát thêm các tỉnh Trà Vinh, Kiên Giang, Hải Phòng, Quảng Ninh, Thanh Hóa, Nghệ An, Quảng Ngãi, Bình Định, Khánh Hòa, Ninh Thuận, Bình Thuận Theo báo cáo thống kê của Tổng cục Thủy sản, năm 2012 diện tích tôm nuôi nước lợ bị AHPND là 46.093 ha, chiếm 45,7% diện tích tôm nuôi bị bệnh Trong năm 2017 theo báo cáo của Cục Thú Y, trong cả nước tổng diện tích tôm nuôi thiệt hại do AHPND là 6.793 ha, chiếm hơn 17,9 % tổng diện tích tôm nuôi bị bệnh (Báo cáo tổng kết 2017, Cục Thú Y)

Tháng 5/2013, nhóm nghiên cứu của GS Lightner (Đại học Arizona) đã công bố kết quả xác định tác nhân gây bệnh của hội chứng hoại tử gan tụy cấp ở

tôm chính là một chủng vi khuẩn thuộc loài V parahaemolyticus, chủng Vibrio này bị nhiễm thể thực khuẩn (phage) tiết ra các độc tố gây chết tôm (Tran et al.,

2013) Ngày 12/6/2013, tại Sóc Trăng, Tổng cục Thủy sản đã đưa ra những kết

luận về tác nhân gây AHPND là do nhóm vi khuẩn Vibrio gây ra (chủng V

parahaemolyticus có mang phage, và có thể do các loài Vibrio khác) Bên cạnh