Nghiên cứu phương pháp gộp mẫu lớn ứng dụng trong sàng lọc covid 19 bằng real time pcr

Nghiên cứu và phát triển sinh phẩm chẩn đoán COVID-19 tại Việt Nam Đầu tháng 2 năm 2020, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương ng bố nuôi cấy thành công chủng virus SARS-CoV-2, giúp Việt Nam t

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Phú Hùng

TS.BS Lê Thị Hương Lan

THÁI NGUYÊN - 2022

LỜI CAM ĐOAN

T i xin m o n y l ng tr nh nghi n ứu ủ t i th hiện ư i

s hư ng n ủ PGS.TS Nguyễn Phú Hùng và TS.BS L Thị Hương L n Mọi trí h n trong luận văn ều ghi rõ nguồn gố Cá số liệu, kết quả nghi n ứu trong luận văn l trung th v hư từng i ng bố trong một công trình nào khác

Thái Nguyên, ngày tháng năm 2022

Tác giả

LỜI CẢM ƠN

Lời ầu ti n t i xin ược bày tỏ lòng biết ơn s u sắc t i PGS.TS Nguyễn Phú Hùng, Khoa Công nghệ sinh họ , Trường Đại học Khoa họ , Đại học Thái Nguyên và v TS.BS L Thị Hương L n, Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên ã tận tình hư ng d n, chỉ bảo v giúp ỡ tôi trong suốt thời gian th c hiện và hoàn thành luận văn n y

Tôi xin chân thành cảm ơn B n giám hiệu Trường Đại họ Kho họ Đại học Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm Khoa Công nghệ sinh học, phòng Sinh hóa th c vật, Viện cộng nghệ sinh họ v á thầy giáo, án bộ trong Khoa Công nghệ sinh họ , ặc biệt là s qu n t m, giúp ỡ củ á nh hị k thuật viên phòng thí nghiệm kho ã tạo iều kiện giúp ỡ tôi trong quá trình làm luận văn thạ sĩ

-Tôi xin cảm ơn gi ình và bạn bè luôn bên cạnh ủng hộ, khuyến khích, ộng viên tạo ộng l ể tôi hoàn thành luận văn n y

Trong quá trình làm luận văn kh ng tránh khỏi những sai sót, tôi mong nhận ược s óng góp quý báu từ phía thầy cô và bạn bè ể tôi hoàn thành bản luận văn

Thái Nguyên, ngày tháng năm 2022

Tác giả

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn ề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu: 3

3 Nội dung nghiên cứu 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Đặ iểm của virus SARS-CoV-2 4

1.1.1 Đặ iểm genome của virus SARS-CoV-2 4

1.1.2 Phương thức xâm nhập và gây bệnh 5

1.1.3 Biến ổi di truyền của virus SARS-CoV-2 7

1.2 Tổng quan tình hình dịch bệnh virus SARS-CoV-2 trong nư c và thế gi i 10

1.2.1 Tình hình dịch bệnh trên thế gi i 10

1.2.2 Tình hình dịch bệnh tại Việt Nam 11

1.3 Tổng quan về á phương pháp xét ghiệm SARS-CoV-2 14

1.3.1 Cá phương pháp hẩn oán virus SARS-CoV-2 14

1.3.2 Kit chuẩn oán virus SARS-CoV-2 16

1.3.3 Tổng quan về ánh giá hất lượng sinh phẩm kit chẩn oán 17

1.4 Tình hình nghiên cứu về á phương pháp xét nghiệm trong sàng lọc COVID-19 20

1.4.1 Hư ng d n lấy m u, gộp m u và xét nghiệm của Bộ y tế 20

1.4.2 Các nghiên cứu về phương pháp gộp m u trên thế gi i 23

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Đối tượng, thời gi n, ị iểm nghiên cứu 25

2.2 Vật liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu 25

2.2.1 Vật liệu nghiên cứu 25

2.2.2 Hoá chất và thiết bị nghiên cứu 25

2.3 Phương pháp nghi n ứu 27

2.3.1 Phương pháp thu thập và bảo quản m u lâm sàng 27

2.3.2 Phương pháp tá h hiết RNA từ m u bệnh phẩm bằng bộ sinh phẩm

QIAamp Viral RNA Mini Kit 27

2.3.3 Phản ứng Realtime RT-PCR 29

2.3.4 Xây d ng quy trình gộp m u v ánh giá quy tr nh gộp m u 29

2.3.5 Xá ịnh ộ nhạy l m s ng, ộ ặc hiệu lâm sàng, LOD 30

2.3.6 Phương pháp tiến hành thử nghiệm th c tế 31

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 32

3.1 Thu nhân các m u bệnh phẩm 32

3.1.1 M u bệnh phẩm ương tính v i SARS-CoV-2 32

3.1.2 M u chứng âm 33

3.2 Nghiên cứu xây d ng phương pháp gộp m u l n trong sàng lọc COVID-19 35

3.2.1 Ph n tí h ộ nhạy lâm sàng của quy trình gộp m u 35

3.2.2 Ph n tí h ộ ặc hiệu lâm sàng của quy trình gộp m u thông qua làm giàu m u 39

3.2.3 Ph n tí h ộ lặp lại và tái lặp của quy trình gộp m u 42

3.2.4 Ngưỡng phát hiện của quy trình gộp m u 44

3.2.5 Đánh giá s th y ổi trong chi phí và công xuất xét nghiệm 46

3.3 Xây d ng quy trình th c hiện phương pháp gộp m u l n trong sàng lọc COVID-19 46

3.3.1 Quy trình th c hiện 46

3.3.2 Sơ ồ hư ng d n th c hiện Error! Bookmark not defined BÀN LUẬN 47

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52

1 Kết luận 52

2 Kiến nghị 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Trình t mồi và m u dò 26 Bảng 2.2 Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 26 Bảng 3.1 Danh sách m u bệnh phẩm ương tính ược thu thập 33 Bảng 3.2 Độ nhạy của quy trình gộp m u trên các m u bệnh phẩm ương tính 35 Bảng 3.3 Đánh giá ộ ặc hiệu của quy trình gộp m u trên các m u bệnh

phẩm âm tính 39 Bảng 3.4 Độ lặp lại của quy trình trên m u ương tính 42 Bảng 3.5 Độ tái lặp của quy trình trên m u ương tính 44 Bảng 3.6 Gi i hạn phát hiện ối v i m u chứng ương tổng hợp (CDTH) 45 Bảng 3.7 Gi i hạn phát hiện ối v i m u chuẩn do NIHE cung cấp 45 Bảng 3.8 Bảng so sánh tương ối về s th y ổi chi và công xuất xét nghiệm

so v i xét nghiệm m u ơn 46 Bảng 3.9 S th y ổi chi phí so v i xét nghiệm m u ơn theo từng hạng mục 46

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Bản ồ phân bố các gene trong genome của virus SARS-CoV-2

(Trình t tham chiếu NCBI: NC_045512.2) 5 Hình 1.2 Quá trình xâm nhập và giải phóng SARS-CoV-2 khỏi tế bào chủ 6 Hình 1.3 Biểu ồ phân bố số lượng ột biến trên genome của virus SARS-

CoV-2 [27] 8

H nh 1.4 Đột biến D614G và s phân bổ về s lưu h nh ủa chủng G614 ở

châu Âu theo thời gian [4] 9 Hình 1.5 Biến ổi trên gen S mã hóa cho protein kháng nguyên Spike của

chủng Omicron so v i chủng Delta 10 Hình 3.1 Hình ảnh khuế h ại tín hiệu huỳnh quang của các m u ương tính

bằng phương pháp Re ltime PCR huẩn theo quy trình khuyến cáo của WHO 34

H nh 3.2 So sánh ường tín hiệu huỳnh quang giữa quy trình chuẩn theo

WHO và quy trình gộp m u trong nghiên cứu này 38 Hình 3.3 So sánh giá trị Ct giữ phương pháp Re ltime PCR huẩn và PCR

gộp m u trên các m u bệnh phẩm 38 Hình 3.4 Phân bổ m u ương theo giá trị Ct trong gộp m u 100 39

H nh 3.5 Sơ ồ quy trình sàng lọc bằng phương pháp gộp m u 100 46

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

COVID-19 là bệnh vi m ường hô hấp cấp gây ra bởi virus CoV-2, lần ầu ti n ượ xá ịnh tại Vũ Hán, Trung Quốc vào giữa tháng 12 năm 2019 Chỉ trong một thời gian ngắn, ăn bệnh n y ã trở thành một ại

SARS-dịch mang tính toàn cầu Tính ến nay, trên toàn thế gi i ã ó trên 640 triệu

người bị nhiễm Đại dịch COVID-19 ược coi là s khủng hoảng l n nhất của nhân loại kể tử sau chiến tranh thế gi i lần thứ hai, ư p i sinh mạng gần 7 triệu người trên thế gi i

Tình hình COVID-19 trên thế gi i v n rất phức tạp, hư ổn ịnh, tại nhiều quốc gia, số ca mắc m i v n ở mức cao, nhiều loại biến chủng m i, biến chủng phụ, tiềm ẩn khả năng l y l n nhanh và khó d oán ược mứ ộ nguy hiểm Ủy ban Khẩn cấp của Tổ chức Y tế thế gi i (WHO) ánh giá:

“Thế gi i v n trong tình trạng ại dịch COVID-19 v á nư c v n phải tiếp

tụ tăng ường hệ thống giám sát và mở rộng năng l iều trị, vắc-xin cho

á ối tượng nguy ơ o, ồng thời tiếp tục cập nhật kế hoạch chuẩn bị và ứng phó quốc gia v i ại dịch COVID-19”

Việt N m ũng l một trong những quốc gia bị ảnh hưởng nghiêm trọng bởi dịch bệnh v i trên 40 ngh n người chết Mặc dù gi i oạn nghiêm trọng nhất ã qu i xong việc ề phòng ho á ợt bùng phát m i là rất cần thiết Thời gian gần y, nhiều người dân bắt ầu chủ qu n, lơ l trong việc

th c hiện các biện pháp phòng bệnh s u khi ã ti m á mũi vắc-xin ơ bản hoặ ã từng mắc COVID-19 Đặc biệt là việ hư tí h c tham gia tiêm

vắ xin mũi 3, mũi 4 v ti m vaccine cho trẻ em Người ã từng mắc

COVID-19 v n có khả năng bị tái nhiễm và mắc các biến chứng của bệnh, bao gồm cả trẻ em v người l n Nguy ơ xuất hiện biến chủng m i, thoát khỏi tá ộng của vaccine và thuố iều trị là mối lo ngại của nhiều quốc gia trên thế gi i, trong ó ó Việt Nam

Việc tầm soát ánh giá tỷ lệ mắc trong cộng ồng óng v i trò qu n trọng trong s phát triển kinh tế - xã hội củ ất nư c, ví dụ như sàng lọc

ng u nhiên ho ối tượng học sinh, sinh viên trong các trường học của hệ thống giáo dục, cho l lượng vũ tr ng, n ninh quốc phòng và cho những ơ quan trọng yếu của Chính phủ Công việc này v n ng ược các trung tâm kiểm soát bệnh tật (CDC) vùng th c hiện theo hư ng d n của Bộ Y tế

Những thách thức l n ặt r l khó khăn ho việc sàng lọ thường xuyên và trên diện rộng do chi phí l n, là gánh nặng ối v i ngân sách quốc

gia Gộp m u trong PCR rất quan trọng ể giúp tăng ng xuất xét nghiệm,

cho phép sàng lọc diện rộng, giảm thời gian xét truy vết, giảm chi phí Tuy nhiên, gộp m u trong PCR hiện nay phổ biến là 5 m u, các loại gộp m u cao hơn (10, 20, 30…) ó nguy ơ n t i âm tính giả, iều n y ã ược báo cáo trong nhiều nghiên cứu khác nhau trên thế gi i Độ nhạy của gộp m u 5 ược báo cáo là giảm xuống còn khoảng 70 – 80% so v i 95 – 98% ở PCR m u

ơn Do ó, khó khăn trong gộp m u th ng thường v n còn nhiều hạn chế khả năng tầm soát dịch bệnh trong cộng ồng B i toán ặt ra trong xét nghiệm, tầm soát dịch bệnh là làm thế n o ể có thể th c hiện ược xét nghiệm gộp

m u lượng l n từ vài chụ ến v i trăm m u trong xét nghiệm bằng PCR nhưng v n ảm bảo ộ hính xá o, n ng ược công xuất xét nghiệm, giảm

thời gian sàng lọc trên quy mô l n và giảm nhiều về giá thành xét nghiệm

Đã ó một số nghiên cứu trên thế gi i về lượng gộp m u l n hơn từ 10

- 30 m u ũng như nghi n ải thiết ộ nhạy của chẩn oán Re ltime PCR Tuy nhiên, việc nghiên cứu tăng lượng m u gộp lên t i h ng trăm m u ồng thời tăng ả ộ nhạy của phản ứng thì còn rất hạn chế Nhằm hư ng t i việc nâng cao hiệu quả của việc tầm soát dịch trong trạng thái b nh thường m i hiện n y, ũng như d phòng phương án xét nghiệm diện rộng trong cộng

ồng nếu dịch bùng phát trở lại, chúng tôi tiến ề tài nghiên cứu này

2 Mục tiêu nghiên cứu:

- Thiết lập ƣợc quy trình gộp m u lƣợng l n, ảm bảo ƣợ ộ nhạy

v ộ ặc hiệu cao ể nâng hiệu xuất sàng lọc, chẩn oán SARS-CoV-2

3 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Thu thập bộ m u bệnh phẩm nghiên cứu

Nội dung 2: Xây d ng quy trình sàng lọc gộp m u

Nội dung 3: Đánh giá hiệu quả gộp m u trên các bộ m u l a chọn

Nội dung 4: Đề xuất quy trình chuẩn ể áp dụng th c tế

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm của virus SARS-CoV-2

1.1.1 Đặc điểm genome của virus SARS-CoV-2

SAR-CoV-2 là một trong 7 chủng oron virus ược phát hiện là có khả năng g y bệnh ở ộng vật có vú Ở người, coronavirus gây nhiễm trùng nhẹ ường hô hấp nhưng ũng g y tử vong nếu người mắ ã ó sẵn các bệnh lý nền Giống như á hủng coronavirus khác, SARS-CoV-2 có hình cầu v i các protein hình gai nhọn trên bề mặt Những gai protein này giúp SARS-CoV-2 liên kết v i thụ thể trên màng tế bào chủ củ người, s u ó biến ổi cấu trúc cho phép quá trình dung hợp màng tế bào virus v i màng tế

b o người

Virus SARS-CoV-2 ũng như á virus khá trong họ corona có vật chất di truyền là RNA sợi ơn (single-str n ribonu lei i ), kí h thư c bộ gene khoảng 30 kb [32] Khi so sánh v i các chủng oron ã từng gây nên các bệnh tr n người như hủng SARS-CoV 2003 (gây ra Hội chứng suy hô hấp cấp tính nặng năm 2003) h y hủng virus MERS-CoV (gây ra hội chứng

hô hấp vùng Trung Đ ng năm 2012), hủng virus m i này có trình t tương ồng l n ến 79,5%; tuy nhiên SARS-CoV-2 v n có những ặ iểm riêng biệt về mặt di truyền [7] SARS-CoV-2 và SARS-CoV cùng thuộc họ Coronavirus thế hệ B (Betacoronavirus Lineage B, Sarbecovirus) [14] Vì vậy, trình t hệ gene của chúng có nhiều iểm tương ồng và gồm 4 gene chính mã hóa cho 4 protein cấu trú ược liệt k ư i y:

- Gene S: Mã hóa cho protein spike (S) tạo th nh á g i ặ trưng trong cấu trúc vỏ củ oron virus ó h nh "vương miện" Các protein này có thể bị glycosyl hóa mạnh tạo thành dạng homotrimer, một thụ thể giúp virus gắn vào màng tế bào vật chủ Các thành phần của protein S là kháng nguyên chính kích thích kháng thể trung hò , ồng thời y ũng l một mục tiêu quan trọng của tế b o lympho g y ộc tế bào

- Gene M: Mã hóa cho protein M là protein màng (M - Membrane) chiếm số lượng nhiều nhất trong số 4 protein cấu trú Protein M thường tồn tại ở dạng dimer, chúng tạo thành cấu trúc hình cầu ặ trưng ủa họ coronavirus [22]

- Gene N: Mã hóa cho protein nucleocapsid liên kết v i bộ gene RNA

ể tạo thành nucleocapsid Nó có thể tham gia vào quá trình iều hòa tổng hợp RNA của virus và có thể tương tá v i protein M trong quá trình nảy chồi của virus

- Gene E: Gene E có trình t nucleotide ngắn mã hóa cho protein vỏ (E

- Envelope) Chứ năng ủa protein này hiện v n hư ược phát hiện, mặc

dù ở virus SARS-CoV, protein E cùng v i M và N là cần thiết ể lắp ráp và giải phóng virus [38] Một nghiên cứu ã hỉ ra rằng, coronavirus tái tổ hợp bị thiếu gene E thường không tồn tại ược dù chúng có mặt trong vật chủ [23]

Hình 1.1 Bản đồ phân bố các gene trong genome của virus SARS-CoV-2

(Trình tự tham chiếu NCBI: NC_045512.2) 1.1.2 Phương thức xâm nhập và gây bệnh

SARS-CoV-2 có thể truyền từ người s ng người thông qua các giọt bắn trong quá trình tiếp xúc [31] Vòng ời của SARS-CoV-2 giống như hầu hết các chủng virus oron ã ược phát hiện bao gồm 5 bư c: Gắn vào vật chủ, Xâm nhập, Sinh tổng hợp, Lắp ráp, Giải phóng (Hình 1.2)

Hình 1.2 Quá trình xâm nhập và giải phóng SARS-CoV-2 khỏi tế bào chủ

(https://neurosciencenews.com/coronavirus-genetic-mapping-16130/)

Sau khi truyền sang vật chủ m i, các protein gai của SARS-CoV-2 gồm hai tiểu phần S1 và S2 th c hiện nhiệm vụ: tiểu phần S1 bám vào thụ thể ACE2 trên màng tế bào chủ và tiểu phần S2 dung hợp màng virus v i màng tế

b o người Cấu trúc vỏ của SARS-CoV-2 th y ổi cho phép giải phóng RNA virus vào tế bào chất của tế b o người Hệ gene của SARS-CoV-2 là RNA sợi

ơn n n ược sử dụng tr c tiếp làm khuôn tổng hợp các protein cấu trúc tạo nên phức hệ phiên mã

Từ ó, quá tr nh tổng hợp mRNA virus ược diễn r theo phương thức không liên tục nhằm tạo ra tất cả các protein cấu trúc của SARS-CoV-

2 (protein gai S, protein vỏ E, protein màng M, protein nucleocapsid N) Các protein này di chuyển t i mạng lư i nội chất ể lắp ráp v ượ óng gói thành virion hoàn chỉnh ở bộ máy Golgi ồng thời giải phóng khỏi tế bào chủ nhờ các túi tiết [3]

Ở người, các tế bào biểu bì phổi có mứ ộ biểu hiện thụ thể ACE2

o, y l lí o v s o SARS-CoV-2 có thể dễ dàng xâm nhập và phá hủy các

tế bào này, gây nên chứng viêm phổi cấp [16] Bên cạnh ó, trong quá tr nh lắp ráp, nhiều trường hợp các hạt virion thiếu protein S d n ến tình trạng các virion này không gắn vào thụ thể ACE2 Vì vậy, hệ thống miễn dịch không nhận diện ược kháng nguyên d n t i s hình thành các tế b o nh n khổng

lồ Các tế bào này chứa một lượng l n virus và tồn tại trong ơ thể người mà không bị hệ thống miễn dịch phát hiện và tiêu diệt [29]

Các triệu chứng của bệnh viêm phổi cấp COVID-19 ược báo cáo bao gồm: 90% trường hợp mắc bệnh có biểu hiện sốt, 80% trường hợp có biểu hiện mệt mỏi và ho khan, 20% bị khó thở và suy hô hấp chiếm 15%, những trường hợp nặng có thể d n ến tử vong chiếm 5% tổng số ca nhiễm Các triệu chứng của bệnh sẽ bắt ầu trung bình sau khoảng từ 2 ến 14 ngày tính

từ thời iểm nhiễm virus Một th c tế ó l hầu hết bệnh nhân COVID-19 là những người l n tuổi và có bệnh lí nền, ó 2 lí o ượ ư r ể giải thích cho hiện tượng này Thứ nhất, mứ ộ biểu hiện thụ thể ACE2 là khác nhau giữ người trưởng thành và trẻ em Một nghiên cứu ã hỉ ra rằng, ACE2 ược biểu hiện theo cụm ở các tế bào biểu bì biệt hóa cao Sau khi phân chia, các tế bào biểu mô ở phổi tiếp tục phát triển Thứ h i, á áp ứng củ ơ thể trẻ nhỏ ối v i SARS-CoV-2 khác biệt so v i người trưởng thành Ở người

l n tuổi, s kí h thí h ối v i kháng nguyên và tuyến ức d n t i s phân bố của quần thể các tế bào T [30] Điều này d n t i s biểu hiện giảm của CD27

và CD28, hai phân tử có vai trò trong việ tăng ường tính nhạy cảm ối v i tác nhân gây bệnh [24]

1.1.3 Biến đổi di truyền của virus SARS-CoV-2

Sử dụng tất cả dữ liệu giải trình t sâu của toàn bộ genome của virus SARS-CoV-2 trên toàn thế gi i (kho dữ liệu NCBI), Naveen Vankadari ã

xá ịnh ượ h ng trăm ột biến iểm hoặ á h nh ơn nu leoti e trong

genome của virus SARS-CoV-2 [27] Đ y ó thể là nguyên nhân d n t i s

th y ổi liên tục về khả năng l y nhiễm ũng như ộc l v l m gi tăng tỷ lệ mắc và tỷ lệ tử vong bởi SARS-CoV-2 Từ dữ liệu về genome virus SARS-CoV-2 phân lập từ 12 quốc gia khác nhau, nhóm nghiên cứu ã hỉ ra rằng, trong số h ng trăm biến ổi di truyền có thể có t i 47 ột biến có ảnh hưởng

t i ộc l ũng như khả năng áp ứng các thuố iều trị kháng virus sử dụng trong iều trị Covid-19 Đặc biệt chú ý, gene mã hóa cho protein gai của virus (spike glycoprotein) hay còn gọi l protein S tăng ột biến Cùng v i ó á gene Nsp1, R Rp v vùng ORF8 ã bị biến ổi nặng nề trong vòng 3 tháng, trong quá trình lây truyền từ người s ng người Mứ ộ ột biến ược mô tả trong Hình 1.3 [27], [25]

Hình 1.3 Biểu đồ phân bố số lượng đột biến trên genome của virus

SARS-CoV-2 [27]

Đặc biệt hú ý, ột biến D614G tr n gene mã hó ho protein S, y l protein có chứ năng giúp virus bám ính v o tế bào chủ (Hình 1.4) Các nghiên cứu khá nh u ều chỉ ra rằng, ột biến n y ng hiếm phổ biến ở các quốc gia hiện nay [2], [35]

Hình 1.4 Đột biến D614G và sự phân bổ về sự lưu hành của chủng G614 ở

châu Âu theo thời gian [4]

Đột biến tại vị trí 614 tr n gen S ã l m th y ổi amino acid aspartic thành glycine Biến ổi n y ã giúp ho virus tương tá hiệu quả v i thụ thể ACE2 của tế bào chủ v l m tăng khả năng l y nhiễm gấp nhiều lần so v i chủng ầu tiên phân lập tại Vũ Hán Th m v o ó, bằng các chẩn oán Realtime RT-PCR, các bệnh nhân mắc COVID-19 m ng ột biến n y ều cho thấy virus ược phát hiện ở chu kỳ PCR s m hơn [4] Đột biến này giúp cho chủng G614 dần thay thế chủng D614 ở nhiều quốc gia khác nhau trên thế

gi i trong ó iển hình là tại M

Những th y ổi liên tục trên genome của virus SARS-CoV-2 ã v

ng tạo ra thách thức nhất ịnh ối v i việc chẩn oán bằng k thuật Realtime PCR Nếu những m u ò ược thiết kế vào vùng gene có nhiều ột biến như gene ORF hoặ gene S, gene N ều ó nguy ơ bỏ sót á ột biến

không bắt cặp v i các m u dò hoặc trình t mồi [12], [15] Th m v o ó, th y

ổi tr n á gene mã hó kháng nguy n ặ trưng ủ virus ũng sẽ tạo ra những khó khăn nhất ịnh cho việc nghiên cứu và sản xuất vacxin phòng bệnh Covid-19 [17], [10]

Nhưng th y ổi ồng loạt nhiều vị trí khá nh u tr n gen S ã ư ến một biến chủng m i siêu lây nhiễm và có nguy ơ kháng v ine Chủng này lần ầu ti n ược phát hiện tại Nam Phi và t i n y ã l n s ng nhiều quốc gia khác nhau trên toàn thế gi i Omi ron ã l lỗi lo lắng của toàn thế gi i

Hình 1.5 Biến đổi trên gen S mã hóa cho protein kháng nguyên Spike của

chủng Omicron so với chủng Delta

1.2 Tổng quan tình hình dịch bệnh virus SARS-CoV-2 trong nước và thế giới

1.2.1 Tình hình dịch bệnh trên thế giới

COVID-19 là bệnh vi m ường hô hấp gây ra bởi virus SARS-CoV-2, lần ầu ti n ượ xá ịnh tại Vũ Hán, tỉnh Hồ Bắc, Trung Quốc vào cuối năm 2019 Ng y s u ó, ng y 30 tháng 1 năm 2020 WHO ã tuy n bố COVID-19 là một trường hợp khẩn cấp về sức khỏe cộng ồng và chính thức tuyên bố là một ại dịch vào giữa tháng 3 năm 2020 Gi i oạn ầu của dịch bệnh, Trung Quố l t m iểm củ ại dịch s u ó ị h ã l n rộng sang châu

Âu, châu M và các châu lục khác Đặc biệt, số trường hợp COVID-19 ã

tăng nh nh hóng tại Hoa Kỳ v ư nư c này trở thành vùng dịch l n nhất thế gi i Theo thống kê của Tổ chức Y tế thế gi i, châu lục có tỉ lệ nhiễm và

tử vong l n nhất là châu M , chiếm 50% về tổng số ca mắc và số ca tử vong Theo ư c tính của các chuyên gia thì tỷ lệ nhiễm và tỷ lệ tử vong th c tế có thể cao gấp vài lần so v i các con số ã ược thống kê ở các quốc gia Một số quốc gia có tỷ lệ nhiễm và chết cao nhất thế gi i phải kể t i Hoa Kỳ, Brazil,

Ấn Độ Do ảnh hưởng của dịch bệnh, nhiều nư ã phải ban bố tình trạng phong tỏ á ị iểm công cộng như s n b y, nh g , trường học, cửa hàng gây nên nhiều thiệt hại to l n về kinh tế, xã hội Theo thống kê của WHO, tính ến ngày 15/11/2022 trên thế gi i ghi nhận 620.211.783 ca nhiễm, số ca

tử vong 6.612.315 (chiếm 1.07%) Ch u Á ứng ầu trong tổng ca mắc m i trong 24 giờ, trung bình có khoảng 100.000 người mắc m i Trung Quốc hiện nay v n phải áp dụng chiến lượ “Zero Covi ” ể thoát khỏi tình trạng khủng hoảng của COVID-19

Các triệu chứng iển hình của của bệnh viêm phổi cấp COVID-19 bao gồm mệt mỏi, ho khan và bị khó thở Một số trường hợp bị suy hô hấp nặng có thể d n ến tử vong Nguyên nhân khác d n ến tử vong do mắc COVID-19 là hội chứng rối loạn chứ năng ơ qu n, tỷ lệ tử vong lên t i 66% ở nam gi i [5] Các triệu chứng này có thể xuất hiện trong 2 ến 14 ngày sau khi bị nhiễm virus SARS-CoV-2, một số trường hợp triệu chứng xuất hiện muộn hơn ũng ã ược báo cáo COVID-19 th c s ã trở thành cuộc khủng hoảng l n nhất của nhân loại kể từ sau chiến tranh thế gi i lần thứ 2 ến nay

1.2.2 Tình hình dịch bệnh tại Việt Nam

1.2.2.1 Tình hình dịch bệnh

Ng y 22 tháng 01 năm 2020, Việt Nam ghi nhận 02 trường hợp mắc COVID-19 ầu tiên tại Bệnh viện Chợ R y, các bệnh nhân này có quốc tịch Trung Quốc và xuất phát từ thành phố Vũ Hán T nh h nh ịch bệnh COVID-

19 tại Việt N m ượ hi l m á gi i oạn hính như s u: Gi i oạn 1 gồm

16 bệnh nh n ầu tiên, ều ó li n qu n ến lịch sử di chuyển và tiếp xúc gần

v i các ca bệnh tại Vũ Hán, Trung Quố ; Gi i oạn 2 gồm các bệnh nhân lây nhiễm từ các quốc gia ngoài Trung Quốc nhập cảnh vào Việt N m qu ường

h ng kh ng; Gi i oạn 3 l gi i oạn chống lây nhiễm trong cộng ồng, y

l gi i oạn ối phó v i dịch bệnh quan trọng nhất nhằm ngăn hặn tình trạng bùng phát các ổ dịch trong cộng ồng Đợt dịch lần thứ 4 kể từ tháng 5 cho

t i n y ã ể lại hậu quả rất nặng nề cho Việt Nam, hàng triệu người ã bị nhiễm và hàng chụ ngh n người ã bị tử vong Thành phố Hồ Chí Minh là nơi hịu tổn thất nặng lề nhất v i hơn 30 ngh n người chết

Theo thống kê của WHO, kể từ ầu dị h ến nay Việt Nam có 11.509.473 ca nhiễm, ứng thứ 13/230 quốc gia và vùng lãnh thổ, trong khi

v i tỷ lệ số ca nhiễm/1 triệu dân, Việt N m ứng thứ 117/230 quốc gia và vùng lãnh thổ (bình quân cứ 1 triệu người có 116.312 ca nhiễm)

Hiện nay dịch bệnh lan rộng ra và bao phủ tất cả các tỉnh thành trên cả

nư c Từ tháng 04/2022 cho t i nay, mặc dù số ca nhiễm tăng nh nh nhưng tỷ

lệ tử vong hoặc diễn biến lâm sàng nặng ã giảm rất rõ rệt Kết quả này có ược là nhờ chiến lược bao phủ vaccine của Việt N m ã phát huy tá ụng Theo thống kê của BYT, tính ến ngày 14/11/2022 tổng số liều vắc-xin ã ược tiêm là 262.719.806 liều, trong ó: số liều ti m ho người từ 18 tuổi trở lên là 222.256.111 liều, số liều tiêm cho trẻ từ 12-17 tuổi là 23.588.672 liều,

số liều tiêm cho trẻ từ 5-11 tuổi là 16.875.023 liều

Tại thời iểm này, xét nghiệm kháng thể kháng SARS-CoV-2 không cho biết ơ thể có thể miễn dịch chống lại COVID-19 Kết quả xét nghiệm kháng thể kháng SARS-CoV-2 ương tính kh ng ó nghĩ l ơ thể miễn nhiễm hoặc có miễn dịch có thể chống lại COVID-19 Các kháng thể trung

hò ó tương qu n v i việc bảo vệ nhiễm SARS-CoV-2 ở người có triệu chứng [6] [28] Dữ liệu cho thấy rằng các kháng thể kháng lại SARS-CoV-2 tồn tại ít nhất 6 tháng sau khi tiêm vắ xin Đã ó á báo áo về việc giảm

kháng thể trung hòa [1] Chư rõ liệu giảm hiệu giá kháng thể có giảm khả năng bảo vệ không Hiện tại, hư rõ mứ ộ kháng thể trung hòa hoặc các dấu hiệu miễn dịch khác có liên quan v i việc bảo vệ của vắc xin khỏi nhiễm bệnh, tiến triển bệnh nặng hay lây truyền

Ngoài ra, việc chủ quan, không tiêm vắc-xin mũi nhắc hoặc những người ã từng mắc COVID-19 v n có khả năng bị tái nhiễm và mắc các biến chứng của bệnh ũng l m tăng nguy ơ ịch bệnh có thể quay trở lại bất cứ lúc nào Đ y l thách thức l n ối v i hệ thống y tế của bất kỳ một quốc gia nào trên thế gi i trong ó ó Việt Nam

1.2.2.2 Nghiên cứu và phát triển sinh phẩm chẩn đoán COVID-19 tại Việt Nam

Đầu tháng 2 năm 2020, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương ng bố nuôi cấy thành công chủng virus SARS-CoV-2, giúp Việt Nam trở thành một trong

số rất ít 13 quốc gia phân lập ược virus corona chủng m i tại thời iểm ó,

mở r ơ hội thuận lợi cho nghiên cứu về dịch tễ họ ũng như phát triển các

bộ sinh phẩm chẩn oán SARS-CoV-2 của Việt N m Đầu tháng 3, Nguyễn Thu Anh và cộng s ã ng bố trên tạp chí Lancet, một tạp chí uy tín hàng

ầu về Y học ã thông tin về s lây truyền của virus SARS-CoV-2 tại miền Bắc Việt Nam Cùng v i ó, Phạm Thị Lan và nhóm nghiên cứu tại viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh ã ng bố trên tạp chí New England Journal

of Medicine về trường hợp virus SARS-CoV-2 truyền từ người cha 57 tuổi sống tại tâm dị h Vũ Hán - Trung Quố ho người con trai 26 tuổi ng l m việc tại thành phố Hồ Chí Minh Nghiên cứu này cùng v i một số công bố quốc tế trư ó hỉ ra cho thấy, virus này có khả năng truyền từ người sang người [13], [19] Nghiên cứu dịch tễ học gần y ã hỉ ra rằng, trường hợp

ầu tiên của Việt Nam bị mắc COVID-19 là do lây truyền từ Trung Quố , nơi ược coi là khởi phát củ ại dịch COVID-19 [20] Genome ầy ủ của chủng SARS-CoV-2 phân lập ầu tiên tại Việt N m ũng ã ược các nhóm

nghiên cứu của Viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh công bố trên ngân hàng gene quốc tế Bên cạnh ó, nhiều trình t gene khác nhau gồm gene E, gene

N, gene M trên chủng lưu h nh ở Việt N m ũng ã ược bổ sung vào ngân hàng gene [21] Ngày 4/3, Bộ Y tế ã ó Quyết ịnh số 774/QĐ-BTY về việc

ban hành danh mục 02 sinh phẩm chẩn oán in vitro xét nghiệm virus Corona

(SARS-CoV-2) ược cấp số ăng ký o Học viện Quân y nghiên cứu ể phục

vụ kịp thời công tác phòng chống dịch bệnh COVID-19 Đ y l bộ kit step Realtime RT - PCR phát hiện virus SARS-CoV-2 d a trên công nghệ Realtime RT - PCR Bộ kit d a trên trình t hệ gen í h N v i ộ chuẩn xác cao Bộ kit này là sản phẩm củ ề tài nghiên cứu khoa học cấp nh nư c Tháng 6 năm 2020, Việt Nam chính thức có thêm 02 bộ sinh phẩm phát hiện SARS-CoV-2 mang tên One-step RT-PCR COVID-19 kit và RT-LAMP COVID-19 ược nghiên cứu, phát triển bởi Viện Kiểm ịnh Quốc gia vắc xin

One-và sinh phẩm y tế v trường Đại học Bách khoa Hà Nội, chuyển giao cho Công ty cổ phần S o Thái Dương

Tại Thái Nguy n, ể góp phần vào công tác phòng chống dịch bệnh COVID-19, nhóm nghiên cứu của trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên ã tiến hành nghiên cứu phát triển bộ sinh phẩm chẩn oán virus SARS-CoV-2 bằng k thuật Realtime PCR sử dụng chất phát tín hiệu huỳnh quang Sybr Green, ề tài thuộc nhiệm vụ khoa học cấp tỉnh “Nghi n ứu và phát triển

bộ sinh phẩm phát hiện SARS-CoV-2 virus bằng k thuật Re ltime PCR”

1.3 Tổng quan về các phương pháp xét ghiệm SARS-CoV-2

1.3.1 Các phương pháp chẩn đoán virus SARS-CoV-2

H i nhóm phương pháp ược sử dụng trong sàng lọc, chẩn oán COVID-19 hiện n y l phương pháp a trên nguyên lý miễn dịch (kháng nguyên – kháng thể) v phương pháp phát hiện acid nucleic của virus Các phương pháp s ng lọc kháng thể cho phép phát hiện nhanh trong vòng vài phút t i vài chụ phút, tuy nhi n phương pháp n y thường ho ộ ặc hiệu

không cao, có thể xuất hiện âm tính hoặ ương tính giả Một số công ty tại

M và Nhật Bản ã hế tạo thành công kit phát hiện virus SARS-CoV-2 d a trên phản ứng miễn dị h (phương pháp ELISA) giữa kháng thể IgG, IgM và kháng nguyên N hoặc S của virus, có thể phát hiện virus trong thời gian từ 10

ến 15 phút [17], [18], [39] Trong ó, việc sử dụng phương pháp ELISA a

tr n kháng nguy n N ho ộ nhạy o hơn hẳn so v i sử dụng kháng nguyên

S của SARS-CoV-2 Tuy nhi n ho ến thời iểm hiện tại, một số kit ã bộc

lộ một số hạn chế về ộ nhạy, ộ ặc hiệu khi các kết quả trả về ó á trường hợp ương tính giả và âm tính giả Vào ngày 27/03/2020, chính quyền Tây

B n Nh ã ghi nhận 640.000 bộ kit mua từ một công ty Trung Quốc ã bị phát hiện l thiếu hính xá v kh ng phát hiện ượ ầy ủ những trường hợp nhiễm oron virus V i ặ iểm của chủng SARS-CoV-2 có hệ gene là RNA kém bền vững, tần số ột biến cao, khả năng biến chủng ạng, việc nghiên cứu và chế tạo bộ kit sinh phẩm phát hiện SARS-CoV-2 là hết sức cần thiết và khẩn cấp khi tình hình dịch bệnh trên thế gi i v n ng iễn biến phức tạp và việc phát minh vắc-xin v n ng trong quá tr nh thử nghiệm

Hệ gene hoàn chỉnh của virus corona SARS-CoV-2 ã ược các nhà khoa học tại Bệnh viện Trung t m Vũ Hán v Đại học Khoa học và Công nghệ Hoa Trung giải trình t vào ngày 05/01/2020 và công bố trên ngân hàng gen NCBI (ID: NC_045512.2) Ngoài ra, các biến thể của chủng virus này ũng ược các nhà khoa học từ Úc, M và nhiều quốc gia khác giải trình t và công bố trên m u bệnh phẩm mà họ thu ược D a trên các trình t này, hai phương pháp phổ biến nhất ã ược sử dụng ể phát hiện s có mặt của SARS-CoV-2 là Realtime PCR và giải trình t gene thế hệ m i Tuy nhiên, phương pháp giải trình t ược sử dụng gi i hạn vì òi hỏi nhiều trang thiết bị

và giá thành cao Vì vậy, Re ltime PCR ược sử dụng phổ biến hơn tại nhiều quốc gia trên thế gi i nhằm phát hiện virus trong các m u máu và dị h ường

hô hấp Những bộ kit phát hiện nh nh ầu ti n ã ược các nhà khoa học và các công ty Trung Quốc phát triển d a trên k thuật RT-PCR Trung tâm

kiểm soát v ngăn ngừa bệnh tật Trung Quốc (China CDC) khuyến cáo việc

sử dụng mồi ặc hiệu và m u dò ORFlab cùng gene N nhằm phát hiện CoV-2 [8] Ngoài Trung Quốc, một số nư khá ũng ã phát triển thành công bộ kit phát hiện nhanh SARS-CoV-2 như H n Quốc, Nhật Bản Phương

SARS-pháp chẩn oán SARS-CoV-2 sử dụng chất phát huỳnh quang Sybr Green:

Sybr Green là hóa chất nhuộm huỳnh quang sử dụng trong các thí nghiệm sinh học phân tử vì khả năng li n kết v i DNA Sybr Green ược sử dụng phổ biến trong việc phát hiện s có mặt của DNA/RNA bằng phương pháp Realtime PCR, ứng dụng trong các phân tích và chẩn oán bệnh [22] Việc sử dụng Sybr Green nhằm phát hiện s có mặt của RNA SARS-CoV-2 trong

m u bệnh phẩm ã ược nghiên cứu Ưu iểm của Sybr Green ó l ho phép chẩn oán th ng qu ph n tí h ường cong nóng chảy Tm, giúp phát hiện chính xác chủng virus trong m u bệnh phẩm [9] Hạn chế l n nhất của Realtime PCR là khả năng tạo sản phẩm phụ do các mồi sẽ tạo ra tín hiệu ương tính giả Chính vì vậy, việc thiết kế, sàng lọc l a chọn các cặp mồi òi hỏi thời gian và nhiều thử nghiệm ể tối ưu iều kiện phản ứng [26]

1.3.2 Kit chuẩn đoán virus SARS-CoV-2

Khi dịch bệnh gây ra bởi virus SARS-CoV-2 ược công bố, CDC Hoa

Kỳ ã phát triển bộ kit xét nghiệm ầu tiên có tên „„Centers for Disease Control and Prevention (CDC) 2019-Novel Coronavirus (2019-ncoV) Real-Time Reverse Transcriptase (RT)-PCR Di gnosti P nel‟‟ Bộ xét nghiệm

n y ược sử dụng cho các phòng thí nghiệm ượ CDC ánh giá l ủ iều kiện, có thể th c hiện các xét nghiệm ó ộ phức tạp [41]

S u ó, do tình hình dịch bệnh diễn r ăng thẳng ở nhiều nư c trên toàn thế gi i, có rất nhiều ng ty ã nghi n ứu và phát triển sản phẩm phục

vụ công tác xét nghiệm Tính ến ngày 16/08 ã ó 16 bộ kit Real-time PCR ược WHO khuyến cáo sử dụng và 99 bộ sinh phẩm ược cấp số ăng ký bởi FDA (Food and Drug Administration), trong ó ó 66 bộ sinh phẩm sử dụng phương pháp Real-time PCR [41]; [43]

Cá gene ược l a chọn l m gene í h trong các bộ sinh phẩm sử dụng phương pháp RT-PCR chủ yếu là các gene (E, N, N1, N2, RdRp, ORF1ab, ORF1a, ORF 1b, RpRd, S, P) Trong ó, các kit sử dụng gene í h là gene E như: TIB MOLBIOL real time-RT-PCR assay sử ụng gene E v gene R Rp (TB MOLBIOL, Đức); Novel Coronavirus (SARS-CoV-2) Real Time Multiplex RT-PCR Kit (Shanghai ZJ Bio-Tech Co., Ltd, Trung Quốc) sử dụng gene E, gene N và ORF1ab; Diagnostic kit for SARS-CoV-2 Nucleic Acid (Shanghai Kehua bio-engineering Co., Ltd (Trung Quốc)) Ngoài ra còn

có 14 bộ kit ược cấp số ăng ký bởi FDA ũng sử dụng gene í h l gene E Gene E ũng l gene hư phát hiện ột biến [2], vì vậy việc sử dụng gene E

l gene í h là một trong những iều kiện quan trọng ảm bảo chất lượng bộ sinh phẩm

1.3.3 Tổng quan về đánh giá chất lượng sinh phẩm kit chẩn đoán

1.3.3.1 Khái quát về sinh phẩm chẩn đoán

Trang thiết bị Y tế chẩn oán in vitro bao gồm thuốc thử, chất hiệu

chuẩn, vật liệu kiểm soát, dụng cụ, máy, thiết bị hoặc hệ thống ược sử dụng riêng rẽ hoặc kết hợp theo chỉ ịnh của chủ sở hữu ể phục vụ cho việc kiểm tra các m u vật có nguồn gốc từ ơ thể on người (Nghị ịnh 36/2016/NĐ-CP) Sinh phẩm chẩn oán ược sử dụng v i mụ í h hẩn oán, hỗ trợ chẩn oán, s ng lọ , ti n lượng xu hư ng bệnh Trong gi i oạn nghiên cứu hay trư khi ư v o lưu h nh tr n thị trường, sinh phẩm chẩn o n ần ược ánh giá hất lượng ể ảm bảo ộ an toàn và hiệu quả khi sử dụng Các sinh phẩm chẩn oán ược phân loại rõ ràng d a trên mứ ộ rủi ro tiềm ẩn liên

qu n ến thiết kế k thuật và sản xuất các trang thiết bị y tế ó Sinh phẩm chẩn oán ược phân loại nhóm khác nhau theo các tiêu chí về mụ í h sử dụng ( ịnh tính h y ịnh lượng, sàng lọc hay khẳng ịnh), nguy n lí kĩ thuật

áp dụng (ELISA h y phương pháp sinh học phân tử hay công nghệ khác), phạm vi áp dụng (loại bệnh phẩm khá nh u, người sử dụng khác nhau, môi

trường sử dụng khác nhau), ặ iểm sinh bệnh học của bệnh cần chẩn oán)

Vì vậy, mỗi phân loại nhóm khá nh u ó á ti u hí ánh giá hất lượng phù hợp v i sinh phẩm chẩn oán ó

1.3.3.2 Một số tiêu chí đánh giá trong xét nghiệm sinh học phân tử

a Xác định độ đặc hiệu phân tích

Độ ặc hiệu là khả năng kh ng phát hiện một chất phân tích khi có các thành phần khá ược cho là có mặt trong chất phân tích: các tạp chất, chất nền, sản phẩm phân hủy, các yếu tố nhiễu, các chất khá …

Cá h xá ịnh ộ ặc hiệu phân tích: Độ ặc hiệu phân tích ược xác ịnh thông qua kết quả phát hiện úng RNA/DNA của sinh vật cần xá ịnh

mà không phát hiện nhầm l n vật liệu di truyền của các vi sinh vật khác tồn tại trong m u xét nghiệm Cần có bộ m u chuẩn xá ịnh ộ ặc hiệu phân tích gồm RNA/DNA của các chủng vi sinh vật khác có mặt trong bệnh phẩm lâm sàng

b Xác định độ đặc hiệu lâm sàng

Trong phân tích m u bệnh phẩm: ộ ặc hiệu lâm sàng của một xét nghiệm là tỷ lệ những trường hợp th c s không có bệnh và có kết quả xét nghiệm âm tính trong toàn bộ á trường hợp không bị bệnh

Độ ặ hiệu l m s ng là khả năng xá ịnh úng số m u âm tính trong tổng số m u ược khẳng ịnh âm tính v i RNA/DNA của sinh vật cần phân tích C ng thứ tính ộ ặ hiệu l m s ng: Độ ặ hiệu = Số trường hợp m tính thật/ (số trường hợp m tính thật + số trường hợp ương tính giả) x 100%

Mỗi thí nghiệm ượ lặp lại 3 lần

c Xác định hiệu quả nhân bản

L phương pháp ùng kiểm tr hiệu suất ủ phản ứng PCR th ng qua thiết lập ường huẩn ể ịnh lượng á m u hư xá ịnh nồng ộ

Phương pháp ánh giá hiệu quả nh n bản: Sử ụng bộ m u huẩn ã biết trư nồng ộ Ngo i những m u huẩn quố tế h y m u huẩn quố gi ,

th ũng ó thể sử ụng m u l m s ng ã biết trư nồng ộ hoặ m u tá h hiết từ ị h nu i ấy virus ương tính ượ o nồng ộ Sử ụng tối thiểu 4 nồng ộ ph loãng v mỗi nồng ộ ượ lặp lại 3 lần C ng thứ tính hiệu quả

nh n bản ( theo ộ ố ủ ường huẩn): E = 10-1/ ộ ố ủ ường huẩn (E: effi iency – Hiệu quả nh n bản)

Phương pháp xá ịnh gi i hạn phát hiện: Sử dụng bộ m u chuẩn ã biết trư c nồng ộ Pha loãng ra các nồng ộ từ nồng ộ gốc Sử dụng tối thiểu 4 nồng ộ pha loãng Mỗi nồng ộ ược lặp lại ít nhất 6 lần Kết quả thử nghiệm ạt yêu cầu khi ít nhất một nồng ộ không cho kết quả ương tính hoàn toàn và một nồng ộ cho kết quả ương tính ho n to n Đơn vị nồng ộ phải thống nhất trong các lần thử nghiệm, ví dụ copy/ml, copy/phản ứng,…Căn ứ vào mụ í h sử dụng của kit trên loại bệnh khác nhau, LOD cần ượ ánh giá tr n những loại bệnh phẩm tương ứng

Phương pháp xá ịnh ộ bền: khảo sát tính ổn ịnh của bộ sinh phẩm trong iều kiện vận chuyển mô phỏng Từ nồng ộ chất phân tích gốc, pha loãng thành các nồng ộ khác nhau, l a chọn 4 nồng ộ chất phân tích thấp gần v i gi i hạn phát hiện của quy trình Mỗi nồng ộ lặp lại 6 lần v i cả iều kiện trư c và sau vận chuyển mô phỏng (72 giờ) Sử dụng ối chứng l iều kiện vận chuyển tối ưu Kết quả xá ịnh ộ bền bộ sinh phẩm ượ ánh giá

d a vào kết quả d o ộng giữ iều kiện mô phỏng v iều kiện tối ưu

1.4 Tình hình nghiên cứu về các phương pháp xét nghiệm trong sàng lọc COVID-19

1.4.1 Hướng dẫn lấy mẫu, gộp mẫu và xét nghiệm của Bộ y tế

1.4.1.1 Nguyên tắc áp dụng

Hư ng d n n y ược áp dụng trong thời gian có dịch COVID-19, th c hiện tại các phòng xét nghiệm COVID-19 ủ năng l c và có thể th c hiện ược k thuật này Căn ứ tình hình dịch bệnh, s lưu h nh, tỷ lệ xét nghiệm ương tính, ơ sở xét nghiệm xem xét, quyết ịnh l a chọn hình thức gộp, số lượng gộp m u phù hợp s u khi ã ánh giá ảm bảo các giá trị chẩn oán ( ộ nhạy, ộ ặc hiệu) Sử dụng quy trình xét nghiệm Realtime RT-PCR ể phát hiện vật chất di truyền (ARN) của SARS-CoV-2 Khi th c hiện giám sát dịch

tễ tại cộng ồng ối v i nhóm nguy ơ thấp hoặc không có triệu chứng Bộ y

tế khuyến cáo không áp dụng ối v i những trường hợp có triệu chứng, người tiếp xúc tr c tiếp ó nguy ơ o Hoặc các m u bệnh phẩm thu thập từ người

ã xét nghiệm chẩn oán SARS-CoV-2 nhưng hư ó kết quả xá ịnh, các

m u bệnh phẩm thu thập từ bệnh nhân COVID-19 ng iều trị

Falcon 50 ml (chứ 5ml m i trường vận chuyển) ể sử dụng trong trường hợp gộp 6-10 que m u vào một ống Ống 15 ml sạch, vô trùng, không chứa môi trường; túi nylon ể óng gói bệnh phẩm; băng, gạc có tẩm chất sát trùng; cồn sát trùng, bút ghi; quần áo bảo hộ; kính bảo vệ mắt; găng t y kh ng bột; khẩu trang y tế chuyên dụng (N95 hoặ tương ương); bình lạnh bảo quản m u

* Sử dụng phương tiện bảo hộ cá nhân Tuân thủ nghiêm ngặt thao tác

an toàn khi th c hành mặc, cởi phương tiện bảo hộ á nh n theo quy ịnh

* Thu thập m u bệnh phẩm: Theo hư ng d n tại Quyết ịnh số 3468/QĐ-BYT ngày 07/8/2020 của Bộ Y tế v á hư ng d n liên quan

1.4.1.3 Gộp mẫu bệnh phẩm

a Các hình thức gộp mẫu

Gộp dung dịch m u bệnh phẩm từ các ống m i trường chứa m u bệnh phẩm ơn: Lấy một thể tích m u nhất ịnh từ các ống m i trường có chứa

m u bệnh phẩm ơn v o hung một ống

Gộp que: Gộp ngay các que m u bệnh phẩm khi lấy m u vào chung một ống m i trường vận chuyển Xem xét hình thức gộp n y trong trường hợp

á ối tượng lấy m u ượ ánh giá ó ùng ặ iểm dịch tễ, nguy ơ thấp,

ở cùng một ị iểm (ở cùng nhà, ở ùng trường học, ở cùng khu công nghiệp, ở ùng khu n ư…)

b Gộp dung dịch mẫu bệnh phẩm từ các ống môi trường chứa mẫu bệnh phẩm đơn (gộp dung dịch)

* Gộp 5 mẫu bệnh phẩm

Que m u bệnh phẩm ược thu thập riêng biệt cho vào mỗi ống chứa

2-3 ml m i trường vận chuyển, lập danh sách m u ể gộp 5 m u riêng biệt thành 1 nhóm (nhóm m u gộp), mỗi nhóm m u gộp ược mã hoá riêng M u ược xếp từng nhóm m u theo thứ t ã mã hoá Trộn ều từng m u ơn ã ược thu thập bằng máy votex (máy trộn m u) Thu 200 µl dung dịch của mỗi

m u ơn trong nhóm 05 m u vào ống m u gộp (ống sạ h v trùng) S u ó

trộn ều m u gộp ã ược thu thập bằng máy votex (máy trộn m u) trong khoảng 30 giây Các m u ơn trong nhóm (m u gốc) ược bảo quản tại nhiệt

ộ 2 - 8ºC trong vòng 72 giờ, sau 72 giờ bảo quản tại nhiệt ộ -70ºC Tiến hành tách chiết vật liệu di truyền từ m u gộp và xét nghiệm m u gộp bằng phương pháp Re ltime RT-PCR theo qui trình của phòng xét nghiệm

* Gộp từ 6-10 mẫu bệnh phẩm

M u bệnh phẩm s u khi ã ược thu thập riêng biệt ược cho vào ống chứa 2-3 ml m i trường vận chuyển và lập danh sách m u ể gộp 6-10 m u thành 1 nhóm (nhóm m u gộp), mỗi nhóm m u gộp ược mã hoá riêng Xếp từng nhóm m u theo thứ t ã mã hoá Trộn ều từng m u ơn ã ược thu thập bằng máy votex (máy trộn m u) Chuyển 100 µl dung dịch của mỗi m u

ơn trong nhóm m u gộp vào ống m u gộp (ống sạch vô trùng) Trộn ều

m u gộp ã ược thu thập bằng máy votex (máy trộn m u) trong khoảng 2 phút Tiến hành bảo quản m u gộp tại phòng xét nghiệm tại nhiệt ộ 2 – 8ºC trong vòng 72 giờ, sau 72 giờ bảo quản tại nhiệt ộ -70ºC Tiến hành tách chiết vật liệu di truyền từ m u gộp và xét nghiệm m u gộp bằng phương pháp Realtime RT- PCR theo qui trình của phòng xét nghiệm

c Gộp que mẫu bệnh phẩm ngay sau khi lấy mẫu (gộp que)

* Gộp 5 mẫu bệnh phẩm

Que lấy m u bệnh phẩm của từng ối tượng ược cho vào cùng một ống có chứ 3 ml m i trường vận chuyển ngay sau khi lấy (05 que m u bệnh phẩm vào 1 ống m i trường vận chuyển), ảm bảo tất cả ầu que lấy m u ngập trong m i trường (m u gộp), lập danh sách từng ối tượng trong m u gộp, mỗi m u gộp ược mã hóa riêng Đóng gói, bảo quản, vận chuyển m u gộp theo quy ịnh Bảo quản nhóm m u gộp trong phòng xét nghiệm tại nhiệt

ộ 2 – 8ºC trong vòng 72 giờ, sau 72 giờ bảo quản tại nhiệt ộ -70ºC Tiến hành tách chiết vật liệu di truyền từ m u gộp và xét nghiệm m u gộp bằng phương pháp Realtime RT-PCR theo quy trình của phòng xét nghiệm

* Gộp từ 6-10 mẫu bệnh phẩm

Que lấy m u bệnh phẩm của từng ối tượng ược cho vào cùng một ống có chứ 5 ml m i trường vận chuyển (ống Falcon) ngay sau khi lấy (6- 10 que m u bệnh phẩm vào 1 ống môi trường vận chuyển), ảm bảo tất cả ầu que lấy m u ngập trong m i trường (m u gộp), lập danh sách từng ối tượng trong m u gộp, mỗi m u gộp ượ mã hó ri ng Lưu ý: Ống chứa 5 ml môi trường vận chuyển chỉ áp dụng ối v i m u bệnh phẩm là dịch tỵ hầu, trong trường hợp sử dụng m u ngoáy họng, phải t ánh giá thể tí h m i trường ể

ảm bảo chất lượng xét nghiệm M u ượ óng gói, bảo quản, vận chuyển

m u gộp theo quy ịnh Tại phòng xét nghiệm, tiến hành chuyển toàn bộ dung

dị h m i trường của m u gốc sang ống m u riêng biệt sử dụng trang thiết bị (như Pipet P steur…) v phương pháp phù hợp (chuyển m u trong tủ an toàn sinh học cấp II) vào 01 ống riêng (m u gộp) Bảo quản nhóm m u gộp trong phòng xét nghiệm tại nhiệt ộ 2 - 8ºC trong vòng 72 giờ, sau 72 giờ bảo quản tại nhiệt ộ -70ºC Tiến hành tách chiết vật liệu di truyền từ m u gộp và xét nghiệm m u gộp bằng phương pháp Re ltime RT-PCR theo quy trình của phòng xét nghiệm

1.4.2 Các nghiên cứu về phương pháp gộp mẫu trên thế giới

Đại dịch m i nổi của bệnh virus corona 2019 (COVID-19) ã ảnh hưởng ến hơn 200 quốc gia và d n ến tình trạng thiếu nguồn l c chẩn oán trên toàn cầu Chẩn oán nh nh COVID-19 là rất quan trọng ể kiểm soát s lây lan của bệnh, tuy nhi n, iều n y ng bị thách thức bởi hiệu quả phát hiện còn thấp và chi phí giá thành còn cao ở nhiều nơi tr n thế gi i Thử nghiệm gộp có thể mang lại một cách tiếp cận tiết kiệm và hiệu quả ể tăng khả năng xét nghiệm virus của các phòng thí nghiệm y tế mà không yêu cầu nhiều nguồn l c phòng thí nghiệm hơn như nh n vi n phòng thí nghiệm, thuốc thử xét nghiệm và thiết bị Xét nghiệm COVID-19 gộp ược áp dụng cho những ối tượng lấy m u tại vùng nguy ơ thấp, ó ùng ặ iểm dịch tễ

và ở cùng một ị iểm Chẳng hạn như ở cùng một ơn vị/ ơ qu n l m việc,

ở ùng tò nh / hung ư, ở chung một nh ,…Việc xét nghiệm gộp m u

không hoặc hạn chế áp dụng cho những vùng ó nguy ơ o Đặc biệt, không

áp dụng cho những ối tượng lấy m u ã tiếp xúc tr c tiếp v i F0 hoặ ng

có các triệu chứng như ng bị nhiễm virus SARS-CoV-2 (sốt, ho, u họng, khó thở,…) Ngo i r , những m u bệnh phẩm từ bệnh nh n ng iều trị COVID-19 hay từ những người ng l m xét nghiệm chẩn oán SARS-CoV-

2 nhưng hư ó kết quả ũng sẽ kh ng ược gộp v i các m u bệnh phẩm khác Một nghiên cứu về phương pháp gộp m u gồm 6 ến 10 bệnh phẩm,

m u gộp này ược th c hiện xét nghiệm RT-PCR v i gen mục tiêu là gen ORF1ab và N sàng lọc cho bệnh nhân mắc hô hấp cấp tính nặng do SARS-CoV-2 [11] Mỗi nhóm bao gồm 5 hoặc 9 m u SARS-CoV-2 âm tính và một

m u ối chứng ương tính v i nồng ộ vi rút khác nhau Hai nhóm m u khác

nh u ã ược nghiên cứu và kết quả ược so sánh một cách toàn diện Nhóm một, gộp m u ơn lẻ tại phòng xét nghiệm bằng cách trộn 200 µl các m u lại

v i nhau Nhóm hai, gộp tr c tiếp các m u tăm b ng trong quá tr nh thu thập vào một ống Đối v i nhóm m u gộp tăm b ng, á kết quả ịnh tính của SARS-CoV-2 RNA, các xét nghiệm về gen ORF1ab và N, v n ổn ịnh cao hơn Nghiên cứu này chứng minh rằng phương pháp gộp m u tăm b ng ó thể óng v i trò l một phương pháp hiệu quả và kinh tế ể sàng lọ á trường hợp nhiễm SARS-CoV-2 trong quần thể l n, ặc biệt là ở các quốc gia và khu

v nơi nguồn l c y tế bị hạn chế trong ại dịch, qua ó ó thể là tiềm năng

ho á phương pháp iều trị lâm sàng

Trên thế gi i, nhiều nghiên cứu th c hiện v i m u gộp 5, gộp 10 Tuy nhiên việc ảnh hưởng của các chất ức chế hay các m u có nồng ộ virus thấp ũng l m giảm ộ nhạy của chẩn oán Trong nghi n ứu của Zavaleta và cộng s th c hiện tổng số 42 m u gộp 10, trong ó ó rải rác các m u gộp có một hoặc hai m u bệnh nh n ương tính Trong phân tích cho thấy m u gộp chứa m u ó Ct ≤ 25, ộ nhạy là 100% (95% CI; 90-100%), trong khi v i các

m u gộp chứa m u ó Ct ≥ 31, ộ nhạy giảm là là 80% (95% CI 100%) [40] Nghiên cứu n y ã hỉ ra, v i việc gộp 10, ộ nhạy phản ứng giảm i 20% v i những m u ó Ct ≥ 31

,34,94-CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng, thời gian, địa điểm nghiên cứu

- Đối tượng nghi n ứu: Quy tr nh gộp m u lượng l n

- Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 2/2021 ến tháng 6/2022

- Đị iểm nghiên cứu:

+ Khoa Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên: Nghiên cứu quy trình và thử nghiệm trên các chứng ương tổng hợp,

m u chứng âm và m u chuẩn do NIHE cung cấp

+ Khoa Miễn dịch - Di truyền phân tử, Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên và ơn nguy n Sinh học phân tử, Bệnh viện A Thái Nguyên: Thu thập và tách chiết m u bệnh phẩm, thử nghiệm trên các m u lâm sàng

2.2 Vật liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu

2.2.1 Vật liệu nghiên cứu

Cá hứng ương b o gồm: 04 m u hứng ương (do Viện Vệ sinh

Dị h tễ Trung ương ung ấp); 01 m u hứng ương từ Roche (Cat – No 776-96) và 01 m u hứng ương tổng hợp ạng DNA ượ nh n òng trong plasmid PUC19 o PHUSA Bio hem tổng hợp (mã sản phẩm: GC.04142020)

ượ sử ụng l m hứng ương ho bộ kit

Các m u bệnh gồm 100 m u bệnh phẩm ương tính v i SARS-CoV2 bằng phương pháp Re ltime PCR theo quy tr nh khuyến cáo của WHO

12000 trường hợp m tính (tương ứng v i 240 m u gộp 5) v i k thuật Realtime-PCR thường quy thu thập tại bệnh viện

2.2.2 Hoá chất và thiết bị nghiên cứu

2.2.2.1 Hoá chất

Kit tách chiết RNA: QIAamp Viral RNA Mini Kit loại 250 test

(Qiagen) Cồn tuyệt ối (Sigma)