Nghiên cứu nuôi cấy in vitro hài hương lan (paphiopelium emersonii koop p jcribb)

Tình hình nghiên c u Lan hài trên thế giới .... 46 Trang 7 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Viết đầy đủ Nghĩa tiếng Việt B5: Gamborg, 1976 BAP : 6 - benzyl amino purine CS: Cộng s

TRƯỜNG ĐẠI HỌCKHOA HỌC

NGUYỄN THỊ MAI UYÊN

NG N C U NU CẤY IN VITRO À ƯƠNG LAN (PAPHIOPEDILUM EMERSONII KOOP & P.J CRIBB)

LUẬN VĂN T ẠC SĨ S N ỌC NG DỤNG

Thái Nguyên - 2023

TRƯỜNG ĐẠI HỌCKHOA HỌC

NGUYỄN THỊ MAI UYÊN

NG N C U NU CẤY IN VITRO À ƯƠNG LAN (PAPHIOPEDILUM EMERSONII KOOP & P.J CRIBB)

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Mã số: 8 42 02 01

LUẬN VĂN T ẠC SĨ S N ỌC NG DỤNG

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS VŨ THỊ LAN

Cơ quan: Trường Đại học Khoa học – Đ Thái Nguyên

Thái Nguyên - 2023

LỜ CAM ĐOAN

T x y tr u t t ệ ƣớ s

ƣớ TS Vũ T ị L Mọ trí tr uậ vă ều rõ uồ

ố Cá số ệu, kết quả u tr uậ vă tru t v ƣ từ

LỜI CẢM ƠN

Lờ ầu t t x ược bày tỏ lòng biết ơ s u sắc tới TS Vũ T ị Lan, Khoa Công nghệ sinh họ , Trườ Đại học Khoa học T á N uy ã tận tình hướng d n, chỉ bảo v úp ỡ tôi trong suốt thời gian th c hiện và hoàn thành luậ vă y

Tôi xin chân thành cả ơ B á ệu Trườ Đại họ K ọ - Đại học Thái Nguyên, Ban ch nhiệm Khoa Công nghệ sinh họ v á t ầy giáo, cán bộ trong Khoa Công nghệ sinh họ , ặc biệt là s qu t , úp ỡ

c á ị k t uật v p t í ệ K ã tạ ều kiệ úp ỡ tôi trong quá trình làm luận vă t ạ sĩ

Tôi xin cảm ơ ình và bạn bè luôn bên cạnh ng hộ, khuyến khích, ộng viên tạ ộng l ể tôi hoàn thành luậ vă y

Trong quá trình làm luậ vă k trá k ỏi những sai sót, tôi mong nhậ ược s ó óp quý báu từ phía thầy cô và bạ bè ể tôi hoàn thành bản luậ vă

Thái Nguyên, ngày tháng năm 2023

Tác giả

Nguyễn Thị Mai Uyên

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấ ề 1

2 Mục tiêu nghiênc u 2

3 Nội dung nghiên c u 2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan về L v H Hươ 3

1.1.1 Tổng quan về Lan hài 3

1.1.2 Tổng quan về H Hươ 4

1.1.3 H ệ trạ á L ở V ệt N 7

1.1.4 Cá ều kiệ ơ bả ể nuôi trồ H Hươ 11

1.2 P ươ p áp ống in vitro 11

1.2.1 Ưu v ượ ểm c p ươ p áp ống in vitro 12

1.2.2 Một số yếu tố ả ưở ế quá tr ống in vitro 12

1.3 Tình hình nghiên c u Lan hài trên thế giớ v tr ước 17

1.3.1 Tình hình nghiên c u Lan hài trên thế giới 17

1.3.2 Tình hình nghiên c u L tr ước 18

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 Đố tượng và vật liệu nghiên c u 21

2.2 Đị ểm và thời gian nghiên c u 21

2.3 Hóa chất và thiết bị nghiên c u 22

2.3.1 Hóa chất 22

2.3.2 Dụng cụ 22

2.3.3 Thiết bị 22

2.4 P ươ p áp u 23

2.4.1 P ươ p áp k ử trùng chồ H Hươ 23

2.4.2 P ươ p áp k ử trùng quả H Hươ 24

2.4.3 Nghiên c u ả ưởng c a tuổi quả v trường tới khả ă ảy mầm c a hạt 25

2.4.4 Nghiên c u ả ưởng BAP và kinetin khả ă s trưởng và tái sinh chồi 25

2.4.5 P ươ p áp u ả ưởng c NAA ến khả ă r rễ c a chồi 26

2.4.6 P ươ p áp u ả ưởng c a giá thể và chế ộ dinh ưỡ ế s trưở H Hươ tạ ưới 27

2.4.7 Đ ều kiện nuôi cấy v p ươ p áp xử lí số liệu 28

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

3.1 Nghiên c u ả ưởng c a chế ộ khử trùng và vật liệu nuôi cấy ến khả ă tạo m u vô trùng 29

3.1.1 Hiệu quả khử trùng c a chồ H Hươ ở á ộ tuổi khác nhau29 3.1.2 Hiệu quả khử trù ối với m u quả H Hươ 34

3.2 Ả ưởng c a tuổi quả v trườ ến khả ă nảy mầm c a hạt Hài Hươ 36

3.2.1 Ả ưởng c a tuổi quả ến khả ă ảy mầm c a hạt H ươ lan 36

3.2.2 Ả ưởng c trườ ến khả ă ảy mầm c a hạt Hài ươ 38

3.3 Ả ưở BAP v k t ế k ả ă s trưở v tá s ồ H Hươ 40

3.3.1 Ả ưởng c BAP ến khả ă s trưởng và tái sinh chồi 40

3.3.2 Ả ưở BAP kết ợp vớ K t ế k ả ă

chồi 43

3.4 N u ả ưở ồ ộ NAA kết ợp vớ t ạt tí ế k ả ă r rễ ồ H Hươ 44

3.5 Nghiên c u ả ưởng c a giá thể và chế ộ ưỡ ế s trưởng H Hươ tạ ưới 46

3.5.1 Nghiên c u ảnh ưởng c a giá thể ế s trưởng và phát triển c a H Hươ 46

3.5.2 Nghiên c u chế ộ ă só ế s trưởng và phát triển c a Hài Hươ lan ở ưới 47

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50

1 Kết luận 50

2 Kiến nghị 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO 51

PHỤ LỤC 57

NAA : Naphthalene acetic acid

SH: Schenk and Hildebrandt,

1972

M trường SH

WPM : Woody Plant Medium –

Lioyd

M trường WPM

DANH MỤC BẢNG

Bả 1.1 Một số ó H V ệt N t t ạ bả tồ Tổ

Bả tồ T Quố tế IUCN 9

Bảng 2.1 Hóa chất nghiên c u 22

Bảng 2.2: Thiết bị nghiên c u 22

Bả 2.3 Cá t t k ử trù ồ H Hươ 23

Bả 2.4 M trường bổ sung BAP và kinetin ến khả ă tá s ồi 26

Bả 3.1 H ệu quả k ử trù ố vớ ồ H Hươ ở á ộ tuổ k á u 30

Bả 3.2 Ả ưở ế ộ k ử trù ố vớ quả H Hươ 35

Bả 3.3 Ả ưở tuổ quả ế k ả ă ảy ầ ạt 36

Bả 3.4 Ả ưở trườ ế k ả ă ảy ầ ạt 38

Bả 3.5 Ả ưở BAP v k t ế k ả ă s trưở v

ồ H Hươ L s u 9 y 41

Bả 3.6 Ả ưở ồ ộ NAA kết ợp vớ t ạt tí ,5 ế k ả ă r rễ H Hươ s u 8 tuầ u ấy 45

Bả 3.7 Ả ưở á t ể ế tỷ ệ số v s trưở H Hươ lan 47

Bả 3.8 Ả ưở ế ộ ă só ế á ỉ t u s trưở H Hươ tạ ướ 48

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cây và hoa H Hươ P rs trồng tạ vườn 5 Hình 2.1 C y H Hươ quả sử dụng trong nghiên c u 21 Hình 3.1 Kết quả khử trù H Hươ bằng các chế ộ khử trùng khác

nhau 32

Hình 3.2 Kết quả khử trùng chồ H Hươ t í ệm 3 bằng dung

dịch HgCl2 0,2% trong 20 + 10 phút 33

Hình 3.3 Gieo hạt H Hươ tr trường ½ MS 40 Hình 3.4 Kết quả nghiên c u ả ưở BAP ế k ả ă tá s v s

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Tr ớ t vật, hoa L ượ ệt v “Vươ ả ” Nó

ỉ p bố ở ữ ơ ó ều k ệ k í ậu át, sạ , t á v ấu trú

y k quá ặ b ệt, ù vớ ấu trú ít á , có u sắ ươ t ơ

ẹ , ư ộ v ạ ã tạ ét t ầ bí, quý p á , s trọ v quyế rũ Lan

Hiện nay trên thế giới, họ Lan (Orchidaceae) chiếm vị trí th hai sau họ Cúc (Asteraceae) trong ngành th c vật hạt kín với khoảng 800 chi và 25.000 – 30.000 loài Việt Nam là ước có khí hậu nhiệt ới gió mùa và là một trong số các quốc gia có số ượng loài lan nhiều nhất, ộ ạng về trường sống

ũ ư ặ ể t á , ặc biệt có nhiều ặc hữu Việt Nam có 137-140 chi gồm trên 800 loài lan rừng, t ườ p bố ở á vù rừ ú

ư C Bằ , Bắ Cạ , T á N uy , Tuy Qu , Sa Pa, Lào Cai, Huế, Hả Vân, Quy N ơ , Kontum, Pleiku, B M T uật, P R , Đ Lạt, D L , v.v

Lan hài (Paphiopedilum vớ k ả 9 ột t uộ ọ L

(Or xư v y ều rất ượ ư uộ bở vẻ ẹp v ấu trú ặ

b ệt Cá t uộ Lan hài (Paphiopedilum t ườ ữ

bả ị , ều ặ ữu, ó ều ở k u v H N , Ấ Độ, Đ N Á

v á ả tr T á B Dươ

Với vẻ ẹp dịu dàng, tao nhã, tinh khiết c a mình, H Hươ

(Paphiopedilum emersonii Koop & P.J Cribb) ã trở thành một trong những

loài cây cảnh quý có giá trị kinh tế cao Tuy nhiên loài này ỏi ngặt nghèo

về ều kiện sống nên phân bố khá hẹp, số ượng cá thể ít, sống trên các vách núi

d ng cao Ở Việt Nam, H Hươ có mặt ở vùng núi một số tỉ ư Thái Nguyên, Cao Bằng, Tuyên Quang, Bắc Cạn, Vĩ P ú H Hươ ã ược liệt kê vào Phụ lục 1 c ước CITES và Danh mục Th c vật rừng, Động vật rừng nguy cấp, quý hiếm (nhóm 1) c a Nghị ịnh số 32 2 6 NĐ-CP

ngày 30/3/2006 c a Chính ph D ó, v ệc nhân giống H Hươ , ặc biệt

là nhân giống in vitro có vai trò rất quan trọng, vừa góp phần vào công tác bảo

tồn nguồn gen, vừ ướng tới mục tiêu nhân giống phục vụ cho nhu cầu ngày càng cao về ẹp, quý hiế y ể có thể áp ng nhu cầu tinh thần c a ười

Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành ề tài “ Nghiên cứu nuôi cấy in vitro

Hài Hương lan (Paphiopelium emersonii Koop &P.J.Cribb)” nhằm phát triển

và ưu trữ, bảo tồn nguồn gen loài hoa ẹp này

2 Mục tiêu nghiêncứu

Nhân giống thành công H Hươ (Paphiopedilum emersonii Koop

&P.J.Cribb) bằng k thuật nuôi cấy in vitro óp p ầ bả tồ v p át tr ể

uồ y V ệt N

3 Nội dung nghiên cứu

3.1 Nghiên c u ả ưởng c a chế ộ khử trùng và vât liệu nuôi cấy ến khả ă tạo m u vô trùng

3.2 Nghiên c u ả ưởng c a tuổi quả và trường tới khả ă ảy mầm c a hạt H ươ

3.3 Nghiên c u ả ưởng BAP và kinetin ến khả ă tái sinh và sinh

1.1.1.2 gu n g c

Paphiopedilum là chi lan hài ó uồ ố từ vù ụ ị Đ N Á

Cá uy t uỷ ất y ƣợ t t ấy yếu ở Tru Quố v

ề Bắ V ệt N , ạ tr y ều ó k u p bố rất ạ ế [2]

V ệt N ã t t ấy 22 t uộ Paphiopedilum: Hài Táo (P appletonianum), Hài Ngọc nữ (P micranthum), Hài Mốc vàng (P armeniacum),

H Đẹp (P bellatulum), Hài Cocci (P coccineum), Hài Trần liên (P tranlienianum), Hài Giáp (P malipoense), H Hươ (P emersonii), Hài

Đu (P gratrixianum), Hài Bắc (P henryanum), Hài Hiệp (P hiepii), Hài

Hằng (P hangianum), Hài Lông (P hirsutissimum), Hài Tía (P purpuratum),

Hài Việt, Hài Bóng (P vietnamense), Hài Vân (P callosum), Hài Gấm (P

concolor), Hài Hồng (P delenatii), Hài Hêlen (P helenae), Hài Râu (P

dianthum), Hài Xuân cảnh (P canhii) và Hài Vàng hay Kim hài (P villosum)

Tr ó ó ều ặ ữu, nhiều bị să ù v bị ạ tuyệt

ch ng [2]

1.1.2 Tổng quan về Hài Hương lan

H Hươ có tên khoa học là Paphiopedilum emersonii Koop & P.J

Cr bb, ược gọi là Hài Trắng – H Hươ uy L H Hươ

thuộc chi Paphiopedilum, t Cypr p , ọ p ụ Epidendroideae, ọ L (Orchidaceae), bộ Mă t y (Asparagales), p ớp H L , ớp Một á

H Hươ ó uồ ố từ Tru Quố Đã từ ó t ờ

2.2 c i m h nh thái của Hài Hương lan

H Hươ ạ y t ỏ, thân mang 4 - 7 á xếp t 2 ãy

Lá ó t u ầu á ơ bầu ụ , k ả 20-25 v rộ từ 3 ế 5

cm Mặt tr á ó u x ụ , ó ữ v ậ ạt x kẽ, ặt ướ á

u x ạt P át từ 15 ế 2 u v ạt, ị Hoa ọ tr ỉ p át , t ườ ột b Lá bắ bầu ụ , rộ

k ả 2,8 - 3 x 1,2 - 2 v , b p bở ớp ắ , u v

ạt H 1 [4], [5]

Hình 1.1 Cây và hoa Hài Hương lan (P emersonii) tr ng tại vườn

A) Cây Hài Hương lan , B) Hoa của Hài Hương lan

H H Hươ có mùi t ơ ịu Hoa to k ả 8 – 8,5 cm; lá

ế 3,5 , ặt tr ó ờ u trắ Cánh hoa có u trắ tr

á ườ ờ ạy từ uố rồ tỏ r p í [5]

Quả H Hươ t uộ ạ quả , k , trụ , ẹp, quả

ó ộ ũ ó rất k ó ảy ầ tr ều k ệ t

H Hươ có rễ ù , ó ột ớp xốp bọ xu qu á rễ t ật,

ớp xốp y ó v tr tr v ệ ữ ướ v ă ặ á sá y ắt

2.3 c i m sinh thái của Hài Hương lan

Ở Việt Nam, H Hươ p bố tr sườ vù ú á v ột số

tỉ p í Bắ V ệt N ó ộ s vớ ặt ướ b ể k ả 4 – 600 m,

tr á k t ít ất á vá ố sườ ầ ỉ ú C ở Tru Quố H Hươ ọ ở ư ừ vá ú á v tạ

b ớ tỉ V N v Quả T y, tr ộ 6 – 700 m [6]

H Hươ V ệt N p bố ở vù ó ượ ư ớ , ộ Độ xu qu rễ, k ểu ất, ộ pH, s ó ặt á ấ rễ, tá

t ụ p ấ v ườ ộ á sá ữ tố rất qu trọ quyết ị s

t v p át tr ể quầ t ể

H Hươ ra hoa vào khoả t á 4 ế t á 6, y ược nảy mầm từ hạt Tuy ặ ểm hạt H Hươ ũ ố ư ạt

c a nhiều loài Lan hài khác, k ó ộ ũ ó rất k ó ảy ầ tr ều

k ệ t Quá tr ảy ầ ạt tr t xảy r ít, t ườ ễ r

ầ ấy ưỡ v ườ từ ấ rễ ữ Đ ều á ó ở y quá tr y

k p ả ú ũ t uậ ợ , ất k quá tr y xảy r ở ầ y trưở t sẽ tă uy ơ ễ bệ D ó, ặ ù số ượ ạt tr quả rất ớ ư H Hươ v ảm mạnh về số ượng và có nguy cơ tuyệt ch ng [6], [7], [8]

Hi n tr ng c c loài Lan hài ở Vi t Nam

L ột quố ó k í ậu ệt ớ ó ù , ộ v ó ều ều

k ệ k á t í ợp s ó ặt v p át tr ể ều t uộ họ Lan (Or ó u v vớ Lan hài ó r Vớ s ó ặt ơ 2

loài trên 90 loài lan Hài, V ệt N trở t ột tr ữ quố ầu

vớ uồ Lan hài t p p ú, tr ó ặ b ệt ấ ạ s ó ặt

8 ặ ữu Hơ t ế ữ , á Lan hài ở V ệt N ều ó ữ ét ẹp ặ

t ù, ổ bật, ư ạ rất ượ xếp v á ó á trị t ĩ

ượ ườ V ệt N ó r v t ế ớ ó u rất ư uộ [4]

Mặ ù V ệt N á ều H , s s ỏ

ặt è về ặ ể ều k ệ s t á á Lan hài số ượ á

t ể quầ t ể k quá ớ , s p bố á quầ t ể ều

á ạ , t ư t ớt Hơ ữ , ạ số á Lan hài k s sả v tí

t s sả bằ ạt, s k ó k ă tr quá tr ảy ầ á

ạt Lan hài ạ ế s ế H

Vố t quy uật t ươ ạ , ữ t ế t sẽ quý

Hơ t ế ữ Lan hài t s ó t vật ó á trị t ĩ , ó á loài Lan hài t ượ sưu tầ , t k ế ể xuất s t ị trườ quố tế

k k ể s át S ễ trườ , s t y ổ ều k ệ k í ậu ù vớ

s k t á t uy rừ k ó kế ạ tá s ã tạ ữ ều

k ệ bất ợ ố vớ số á H N ữ í tr ã ế t trạ ã số ượ á t ể ở á Lan hài t y ả

- Vườn Quốc Gia H L Sơ L C , P Qu H G ,

P C H B bảo tồn hai loài P dianthum, P.micranthum

- Khu bảo tồ N H Tuy Qu bảo tồn loài P emersoii, P hangianum, P malipoense var jackii

- Vườn quố T Đảo, Hoàng L Sơ bảo tồn loài P gratrixianum

- Khu bảo tồn Trùng Khánh (Cao Bằ bảo tồn loài P helanae

- Vườn quốc gia Ba Bể, khu bảo tồn Na Hang, Hữu Liên, Pà Cồ, Phong

N bảo tồn loài P malipoense

Kết quả nghiên c u th ịa về tình trạng th c tế c a m i loài Lan hài trong t nhiên tại Việt N ơ sở ể á á ộ uy ơ a m i loài

Cũ tr ơ sở ó tổ ch c bảo tồn thiên nhiên Quốc tế IUCN ã x y ng danh sách về th hạng cầ ượ ưu t bảo tồn c a các loài Lan hài ở V ệt

N , ượ tổ ợp ở bả 1.1

Bảng 1.1 Một số nh m lan ài Việt Nam theo thứ hạng ảo t n của Tổ

chức Bảo t n Thiên nhiên Quốc tế UCN) [2]

T nh trạng Tên loài tiếng Latinh Tên loài tiếng Việt

H ệ trạ loài H Hươ ở Việt Nam

Mặc dù không phả ặc hữu c a Việt N , ư H Hươ

ột tr ữ ầ ư ặ ữu s ế ú tr

t ế ớ tr t Bả t ột ó xuất ệ ở V ệt N – ột ất

ướ ượ “ ề ất “, ư ữ ặ t ù về ặ ể s t á chúng mà loài H Hươ y ỉ p bố rất ẹp ở ột số sườ ú á

v ở ột số tỉ ư Tuy Qu , T á N uy , Vĩ P ú Hơ

t ế ữ , H Hươ ột ỉ s sả t bằ ạt M ạt

y k ó ộ ũ k t ể t ảy ầ tr t bắt buộ p ả ờ s ộ s vớ ột số ấ rễ

Vớ sắ trắ t k , H Hươ t ũ trở t ột “ ó

ă t t ầ “ ố vớ k á Quố tế, v vậy y bị k t á ều ơ

v bị ọ C í bở ữ ều ó này ạ trở

ế v H Hươ ượ ệt v sá ó uy ơ tuyệt rất cao

N ằ bả tồ v số ượ á t ể á Lan hài nói chung

và H Hươ nói riêng cá k ọ ã ụ ệ u ấy

ệ ạ , ặ b ệt ệ u ấy tế b C ệ y ượ Dươ

Tấ N t v t u ấy t H Hồ ầu t ă 2 5 [9] S u

ó ã ó ều u k á ã u ấy in vitro t ều

Lan h k á ư Hằ , T Đả bằ á p ươ p áp u ấy khá u [10], [11]

Ở Việt N , H Hươ ó ặt ở vùng núi một số tỉ ư T á Nguyên, Cao Bằng, Tuyên Quang, Bắc Cạ , Vĩ P ú H Hươ ã ược liệt kê vào Phụ lục 1 c ước CITES [12] và Danh mục Th c vật rừng, Động vật rừng nguy cấp, quý hiếm (nhóm 1) c a Nghị ịnh số 32 2 6 NĐ-CP ngày 30/3/2006 c a Chính ph [13] D ó, v ệc nhân giống H Hươ , ặc

biệt là nhân giống in vitro có vai trò rất quan trọng, vừa góp phần vào công tác

bảo tồn nguồn gen, vừ ướng tới mục tiêu nhân giống phục vụ cho nhu cầu

ngày càng cao về ẹp, quý hiế y ể có thể áp ng nhu cầu tinh thần c ười

1.1.4 C c điều ki n cơ bản để nuôi trồng Hài Hương lan

N ệt ộ: H Hươ p át tr ể ạ tr ều k ệ k á ướt,

ệt ộ tr k ả 21-24 °C k ó á sá ặt trờ tr t ếp [6]

Ánh sáng: N trá á sá ặt trờ tr t ếp, ó t ể y r vấ ề về á

và cây Tr ù , H Hươ sẽ p át tr ể tốt ếu ượ ếu sá

tạ v ờ Tuy vậy, ếu ó á sá tr t ếp t tỉ ệ r ạ ơ [6]

Độ : Độ vừ p ả ế ượ H Hươ rất ư thích T ườ xuy p u á sẽ úp k k í Cu ấp ưu t

ầu á bị u k t ừ ẳ v ệ tướ p S ậu k á t ể trồ

ó ấu ệu ụ át [14]

1.2 Phương pháp nhân giống in vitro

Nhân giống in vitro hay vi nhân giống (micropropagation) là một trong

nhữ kĩ t uật nhân nhanh c a công nghệ nuôi cấy mô – tế bào th c vật d a trên

ơ sở khoa họ tí t ă a tế bào th c vật Công nghệ y r ời và phát triển mạnh trong thế kỉ XX, ặc biệt phát triển mạnh mẽ từ nhữ ă uối thế kỉ XX ến nay [15], [16]

2 Ưu và nhược điểm của phương ph p nhân giống in vitro

* Ưu i m

 Tạo ra số ƣợng lớ y ồng nhất về mặt di truyền

 Có thể nhân giống từ bất c bộ phận nào c a cây

 Khắc phụ ƣợ ặc tính khó nhân giống, hệ số nhân giống thấp và tính bất thụ ở cây trồng, rút ngắn thời gian nhân giống

 Kiể s át ƣợc các yếu tố gây bệnh cho cây, tạo ra các dòng cây sạch bệnh

 Ứng dụ v ĩ v c di truyền nhằm tạo ra những giống mới mà

p ƣơ p áp truyền thố k ƣợ ƣ: ố ơ bội, giố bộ ,…

 Là công cụ giúp bảo tồn và phát triển nguồn gen th c vật

* hược i m

 Việc nhân giố v tr ỏi có k thuật cao, phòng nuôi cấy yêu cầu về trang thiết bị ắt tiền, yêu cầu cao về m ộ vô trùng

 Kiểu gen th c vật không ổ ịnh trong một số hệ thống nuôi cấy

 Đặc biệt ối với một số loại cây thân g , việc cảm ng rễ rất khó th c hiện

1.2.2 t số u tố ảnh hưởng đ n qu tr nh nhân giống in vitro

Tr quá tr u ấy in vitro, ệu suất u ấy y t ấp ịu ả

ƣở bở rất ều yếu tố [16]

1.2.2 Ảnh hưởng của mẫu nuôi cấy

S ả ƣởng bởi m u nuôi cấy có thể ƣợc chia thành hai khâu chính: s

Kiểu gen: nhiều nghiên c u cho thấy, kiểu gen có ả ưởng rất lớ ến

quá trình nhân giống in vitro thông qua việc ả ưở ến khả ă p át tr ển

c a phôi, số ượng chồ ược hình thành, khả ă tă s a chồ ũ ư

ả ưở ến khả ă tă trưởng c a mô sẹo thông qua số ượ v ường kính c a mô sẹo

Cơ qu ể lấy m u cấy: d v tí t ă a các tế bào th c vật ta có

thể sử dụng m u mô sống c a hầu hết các bộ phận c y ể tiến hành nuôi cấy in vitro Tuy nhiên trong th c tế nghiên c u thấy rằng, tùy từng loài và tùy mụ í

mà nên l a chọn các m u mô thuộ á ơ qu p ù ợp Ngoài ra các nghiên

c u còn cho thấy, nếu sử dụng m u mô lấy từ quá trình nuôi cấy in vitro sẽ có khả

ă tá s ơ s với việc sử dụng m u lấy từ các cây mẹ ồng ruộng

y vườ ươ ; ếu sử dụng m u là hạt phấn thì nên sử dụng các hạt phấn từ cây mẹ tr ồng ruộ , ư vậy tỉ lệ thành công sẽ ơ

Tuổi sinh lí c a m u cấy: nhiều nghiên c u ũ ỉ ra rằng, khả ă tá sinh chồi c a m u phụ thuộc rất nhiều v ộ tuổi c a m u bởi nó ả ưởng

ến khả ă b ệt hóa c a tế bào và khả ă sử dụng thành phần khoáng trong trường Khả ă tá s a m u cấy thuộ á trưởng thành sẽ ơ k ả

ă tái sinh c a m u cấy thuộc lá non, và các m u cấy ược lấy từ lá già sẽ không thể phát sinh rễ Khả ă tá s v p át s á ơ qu a m u cắt

từ cành non sẽ ơ ững m u cắt từ trưởng thành

* Xử lí m u cấy: quá trình xử lí m u cấy cần chú trọ ế p ươ p áp

và loại hóa chất và nồ ộ hóa chất ù ể xử lí Bở ối với m i loại hóa chất

mà ta sử dụng, m i nồ ộ mà ta sử dụng sẽ cho hiệu quả làm sạch m u khác

u Đ ều y ặc biệt chú trọ k t ù ối với m ơ qu k ác nhau cho m u, v ạn xử lí mầm bệ ó t ến hành ở u, tr c tiếp trên cây mẹ hay các bộ phận tách rờ ã ượ ư về phòng thí nghiệ v ũ p ụ thuộc vào m u lấy từ loài nào

1.2.2.2 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy

S ả ưởng c trường ến quá trình nhân giống in vitro bao gồm:

loạ trường sử dụ ể nuôi cấy và các yếu tố vật lí c trường xung quanh trong suốt quá trình nuôi cấy

* Loạ trường sử dụ ể nuôi cấy in vitro

Trong quá trình nuôi cấy in vitro, các nhà nghiên c u ã t ến hành nhiều thí nghiệm trên nhiều loạ trường khác nhau, các kết quả nghiên c u cho thấy các loài cây khác nhau có thể ỏi nhữ trường nuôi cấy khác nhau Tuy nhiên, trong nuôi cấy ỉ s trưở ược dùng phổ biến là môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962), loạ trường này lại không thích hợp cho việc sử dụng các m u nuôi cấy từ cây già

D ó ượng muố ượ trường MS lại có thể gây

ộc cho tế bào in vitro, nhất là tế bào trần Chính vì vậy trong quá trình sử dụng

các nhà nghiên c u ã t ến hành giả 1 3 ến 1/2 một số muối khoáng Ví dụ trườ MS ơ bản hiệ y ược sử dụ ó ượng các khoáng

NH3, NO3, KNO3 chỉ bằ 1 2 ượ b ầu, ư ạ ược bổ sung thêm glutamine 1,55 mg/l, KCl 750 mg/l, loạ trường này sử dụng rất tốt cho quá trình nuôi cấy mô sẹo phôi hóa

Tr trường nuôi cấy, các muối nitơ có vai trò quyết ị ến s tái sinh chồ ỉnh và rễ) Bên cạ ó uồ ưỡ rb ũ ó v tr rất lớn trong quá trình tạo nên các rễ và cây con khỏe, chính vì vậy trong quá trình trường nuôi cấy t ường có bổ sung thêm một ượng ường nhất ịnh,

có thể ường sucrose, glucose hoặc fructose Tùy từng loạ ường mà bổ sung với nồ ộ khác nhau trong khoảng 1-3%

Để tă ệu quả quá trình nuôi cấy, các nhà nghiên c u còn bổ sung thêm một hoặc một vài chất kí t í s trưởng với nồ ộ thấp Các chất

kí t í s trưởng này có thể h trợ tă k ả ă tá s ồ , tă khả ă s trưởng c a chồi Ngoài ra việc sử dụ trường ở trạng thái dung dịch hay trạ t á ặ ũ rất quan trọng Phần lớn quá trình nuôi cấy

ỉ s trưở t ường sử dụ trường thạch agar Tuy vậy ũ ó ột

số loài th c vật việc sử dụ trường dung dịch ể nuôi cấy ỉ s trưởng lại cho hiệu quả cao

* Các yếu tố khác trong phòng thí nghiệm trong khi tiến hành nuôi cấy in vitro

Nhiệt ộ: Đ y tố ả ưởng rất lớn tới kết quả quá trình nuôi cấy

in vitro, vì nó ả ưởng tr c tiếp tới quá trình hô hấp c a cây in vitro Nhiều nghiên c u ã t ấy, nhiệt ộ thích hợp cho quá trình nuôi cấy in vitro trong

khoảng 25- 28oC

Ánh sáng: quá trình nuôi cấy in vitro chịu ả ưởng c a ánh sáng thông

qu ườ ộ chiếu sáng trong suốt thời gian nuôi cấy, thành phần ánh sáng và

qu u k Cườ ộ ánh áng ả ưởng tới quá trình tạo rễ, quá trình quang hợp c a mô mới và chồi mới, từ ó ả ưởng tới khả ă u ấy in vitro Xét ả ưởng c a thành phầ á sá ến khả ă u ấy in vitro, ánh

sá ỏ t ường thích hợp nhất cho quá trình hình thành rễ ũ ư t

và tái sinh chồ Đối với một số cây có tính nghiêm ngặt về quang chu kì (cây ngày dài hay cây ngày ngắn) thì thời gian chiếu sá ũ ả ưởng nhiều ến quá trình nuôi cấy

Các chất khí: Trong bình nuôi cấy ũ ư tr p t í ệm, khu

v c ch a các bình nuôi cấy cầ ảm bảo nồ ộ các chất khí hợp í, ặc biệt là ượng oxygen và carbonic Trong quá trình nuôi cấy in vitro, các cây in vitro cầ ó rb ể s trưởng Bên cạ ó, ty ất khí c chế và làm chậm quá trình nuôi cấy

1.2.2.3 Ảnh hưởng của tính bất ịnh về m t di truyền

T t ường, ngoài mụ í ể ưu ữ giống thì nuôi cấy in vitro còn

có mụ í ớn khác là tạ ượng giống lớ , ồ ều về mặt di truyền và giữ ược nhữ ặc tính c a cây mẹ Tuy nhiên trong th c tế khi tiến hành nuôi cấy

v tr t ường xảy ra hiệ tượng biến dị, có thể ột biế t gãy nhiễm

să t ể, chuyể ạ y ả ạn ), hiệ tường này xảy ra với tần số thấp nếu

ta sử dụng m u nuôi cấy từ ỉ s trưở , ược lại sẽ có tần số biến dị cao khi ta tiến hành lấy m u từ các bộ phận khác c a cây, nuôi cấy mô sẹo hay nuôi

cấy hạt phấ ũ ó tần số biến dị ơ u ấy ỉ s trưởng Tần số biến dị còn phụ thuộc vào số lần cấy truyền (số lần cấy truyền càng nhiều thì tần

số biến dị càng cao), còn phụ thuộc vào thể mẹ cấy truyền (thể bội có tần số

ơ á t ể ưỡng bội)

N ư vậy cùng m u cấy truyề b ầu, ư sau nhiều thế hệ cấy truyền

ể giữ giống thì v n có thể xuất hiện nhiều biến dị soma, mà biến dị thì vô ướng nên có thể sẽ xuất hiện các dòng mới không mong muốn

1.2.2.4 Ảnh hưởng của hiện tượng thủy tinh th

Để tồn tạ ượ tr trường, m i cây phải t hình thành cho mình nhữ ặ ể ể t í ư t ớp ut ể bảo vệ bề mặt lá, hạn chế s mất ước; rễ phải có áp suất th m thấu ể lấy ượ ước từ trường

Trong th c tế nghiên c u cho thấy, nhiều cây con in vitro sau khi chuyển

từ bình nuôi cấy trong phòng thí nghiệ r trường t nhiên chúng nhanh chóng bị héo và chết do mất ước hoặc do không t hấp thụ ượ ước

d ến mất cân bằng về ước Hiệ tượng này trong nghiên c u nuôi cấy in vitro gọ “ ệ tượng th y tinh thể”, ững cây con in vitro do không giữ

ượ ước, mất ước quá nhiều á k t ược lớp cutin bảo vệ hoặc do gặp ườ ộ ánh sáng mạnh, nhiệt ộ cao làm khí khổng mở rộng d n

ế ước mất nhiều và nhanh; hoặc do áp suất th m thấu c a tế bào rễ thấp nên không tạ ược s chênh lệch áp suất th m thấu vớ trườ ất xung quanh,

ộ ánh sáng mạnh, nhiệt ộ ó ều chỉnh từ thấp ến cao ngay trong quá trình tiến hành nuôi cấy

1.3 Tình hình nghiên cứu Lan hài trên thế giới và trong nước

1.3.1 Tình hình nghiên cứu Lan hài trên th giới

St w rt v ộ s (1975) t ế ả ồ b ể tạ r sẹ , rất k ó tá s , s u ột t ờ u ấy ữ sẹ y sẽ ết Cho nên

số á u ố in vitro Paphiopedilum ều sử ụ ạt

n uồ vật ệu b ầu [18]

Nghiên c a khác c a Liu và cộng s (2006) về khoảng thời gian nảy mầm

c a hạt Lan hài P.armeniacum ến khi hình thành cây t ường mất 4 ă [19]

Nhiều nghiên c u về quá trình tạo mô sẹo từ mô, tế bào c ạn thân, gốc, lá c a Lan hài ến hiệ y ư kết quả mong muốn Xong từ hạt tạo

ra protocorms, mô sẹo, chồ ã t tr ều loài Lan hài (tỉ lệ thành công c a Lan hài t nhiên thấp ơ á Lan hài lai) D ó v ệc nhân giống các loài Lan hài ch yếu ạt ược bằng cách tạo ra s cộng sinh c a hạt ể thuận lợi cho s nảy mầm c a hạt trong nuôi cấy mô [20], [21], [22], [23]

Ở Paphiopedilum, ă 2 16, ó 58 công trình về p ươ p áp ảy mầm in vitro [23], ế y ã ó t ều công bố về nhân giống in vitro các

loài lan hài [24], [25], [26], [27] [28], [29] Tuy nhiên, tỷ lệ nảy mầm c a nhiều

loài cây Paphiopedilum là rất thấp và bị ả ưở bở ều yếu tố k xá

ị S t quá tr v ố Paphiopedilum từ á u

ấy ex vitro t tươ ố ạ ế uồ uy ệu ế , ữ k ó k ă

qu ế s ễ b v k u v ấ u ấy v s p át tr ể ké

á u ấy số sót ướ ều k ệ in vitro [25]

Sau nhiều nghiên c u về s nảy mầm c a nhiều loài Lan hài c a Lee (1998), Ding và cộng s (2004) ã ư r kết luận rằng: ả ưởng c a s trưởng thành hạt giố ến s nảy mầm phụ thuộc vào loài D ặ ểm c a hạt Lan hài không có nộ ũ, ó ớp vỏ hạt mỏng nên dễ mất ước nên tỷ lệ nảy mầm c a hạt tươ ối thấp Hơ ữa s hình thành lớp biểu bì bảo vệ phôi qua tiến hóa c a các loài này lại trở thành một trong nhữ k ó k ă k t ến hành nảy mầm trong ống nghiệm [26], [21]

Công trình nghiên c a khác c a Lee và cộng s 2 1 ã thấy có mối quan hệ giữ ượng muố k á tươ ối thấp và nồ ộ N vô ơ tr trường KC và VW (nồ ộ muối khoáng KC: 13,42 mM; WV: 16,3 mM; nồng

ộ N v ơ KC: 12,25 M; VW: 3,78 M ối với s nảy mầm [27]

Khi nghiên c u về ả ưởng c a nguồ rb k á u ến s nảy

mầm c a hạt Lan hài loài P.armeniacum và P.micranthun, Chen và cộng s ã

nhận thấy s nảy mầm c a hạt ạt cao nhất tr trường có bổ sung glucose

và cao gấp 2 lần so vớ trường có saccarose [28]

Quả Lan hài Paphiopedilum villosum var boxallii R b F Pf tz r ó ộ

tuổi từ 15 ế 3 DAP tr á trườ ưỡng khác nhau, có bổ sung các nguồn cacbon hữu ơ k á u, ước dừa, than hoạt tính, NAA và BA ở các nồ ộ kết hợp khác nhau cho thấy hạt từ quả 240 DAP nảy mầm tốt nhất, ạt

6 % tr trường MS có ch su r s 3%, NAA 2 μM v BA 6 μM [29]

1.3.2 Tình hình nghiên cứu Lan hài trong nước

Các nghiên cứu về phân b và a dạng di truyền Lan hài ở Việt Nam

Av ry v v ộ s 2 3 ã u t ị v ều tr t ư tế

t ấy ộ ọ tuyệt á Lan hài rất uy ấp Theo

á tá ả, y y u ượ xếp v ó ữ y ỏ bị ọ ,

ầ ưu t bả tồ ở V ệt N m Nhóm tác giả ã có những nghiên c u về mặt

th c vật họ ối với Lan hài Việt Nam thông qua những chuyến khảo sát th c tế

và ã ới thiệu k á ầy và chi tiết các loài Lan hài có ở Việt Nam cùng với

s á á về th c trạng c a các loài này Nhóm tác ả ã tả t ết ặ

ể t á v p bố c a 17 cây nguyên giống, 8 cây biệt dạng (Varieties)

và 4 cây lai giống t nhiên [1]

Trung và cộng s 2 9 , ã phân tích s ạng di truyền loài Lan hài Đốm

bả ịa c a Việt Nam và cho rằng loài này rất ạng và phong phú [31]

Gầ y có thêm nhiều công bố về nghiên c u hình thái và sử dụng chỉ thị phân tử ể ịnh loại các loài Lan hài c a Việt Nam [5], [32], [33]

Các nghiên cứu nhân gi ng và bảo t n lan hài

Từ ă 2 5 ến 2014, Dươ Tấn Nh t và cộng s ã ống thành

công loài Lan hài Hồng (Paphiopedilum delenatii) một ặc hữu c a Việt

Nam bằng k thuật gây vết t ươ ơ ới, ké ốt thân [9], [34], [35], [36], [11] Trong một nghiên c u tiếp theo, chồi ex vitro tiếp xúc vớ è LED ể kéo dài chồi

và nhân giống in vitro P delenatii từ á ốt ơ ẻ ã ược nghiên c u [37]

Các chồi Hài Vân (P callosum) in vitro ược nuôi cấy trên các môi

trường có bổ sung các chất hữu ơ k á u b ồ ước dừ , ước vo gạo, bột khoai tây, bột chuối và peptone Kết quả cho thấy, trường có bổ

su 2 ước vo gạo là tốt nhất thể hiệ qu quá tr s trưởng

và phát triển c a chồi sau 90 ngày nuôi cấy [38]

Theo Hoàng Thị Giang và cộ s 2 1 [39], trường nhân nhanh protocorm và tạo chồi Lan Hài hằng trường RE + ướ ừ 15 v

uố í 1 g/l (hệ số chồi 4,3 lần) Bổ sung NAA 0,4 mg/l – 0,6 mg/l vào trường phù hợp cho ra rễ N uyễ T ị Cú v ộ s 2 14 [40] ã t ế

[41] P vietnamense ũ ã ược nhân giống thành công từ chồi nách ược

khử trùng bằng HgCl2 0,2% trong 5 ến 10 phút, t u ược 65,55% m u sạch, trường 1/2 MS bổ sung BA 2,0 mg/l và NAA 1,0 mg/l phù hợp cho tái sinh

và nhân chồi (2,85 chồi/m u) Ngoài ra, kết quả ũ ỉ ra rằng NAA 0,5 mg/l

và AC 1,0 g/l cho khả ă tạo rễ tốt nhất (88,89%) [42]

Nguyễ P ú Huy v ộ s [43] ã u ả bộ P villosum từ á ồ in vitro Vũ Quố Luậ v ộ s ã bá á kết quả về

ả ả ưở s tá bỏ ỉ ồ , tạ vết t ươ v á ất ều s

trưở s tá s v p át tr ể y b Lan hài Paphiopedilum là

P callosum, P gratrixianum, P delenatii [44] M trường thích hợp cho s hình thành và phát triển chồi in vitro L Đ Lạt (P dalatense) trường MS

bổ sung chuối 100 g/l kết hợp với khoai tây 100 g/l hoặ trường MS bổ sung peptone 1 g/l M trường thích hợp cho s tạo rễ trường ½ MS bổ sung NAA 0,5 mg/l hoặc bổ sung acid humic 2 mg/l [45]

C ƯƠNG 2

VẬT LIỆU VÀ P ƯƠNG P ÁP NG N C U 2.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu

- Đố tượng nghiên c u: Loài H Hươ khoẻ mạnh, sạch bệ , ã

ượ ịnh danh bởi Nguyễn Thị Hải Yến [5] v ưu ữ tạ vườn lan Khoa Công nghệ Sinh học, Trườ Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên

- Vật liệu nghiên c u: Quả và chồi vớ ộ tuổi khác nhau loài H Hươ lan ược sử dụ ể làm nguồn vật liệu b ầu cho thí nghiệm

Hình 2.1 Cây Hài Hương lan mang quả sử dụng trong nghiên cứu

2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

- Đị ểm: Các nội dung nghiên c u ược tiến hành tại Phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học, Trườ Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên

- Thời gian nghiên c u: Từ 10/2022 ến 10/2023

2.3 Hóa chất và thiết bị nghiên cứu

2.3.1 Hóa chất

Bảng 2.1 Hóa chất nghiên cứu

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2 4 Phương ph p khử trùng chồi Hài Hương lan

Vật liệu là các chồi non hoặ ạn thân mang chồi ng vớ ộ tuổi khác

u ược thu về và mang rửa sạ ất át ướ v ước chảy, ạ bỏ ết p ầ

ất b , ắt bỏ p ầ á, ỉ ấy p ầ ạ t ồ , s u ó rửa bằng xà phòng loãng, tiếp theo rửa sạch xà phòng, trá ạ bằ ướ ất và mang vào box cấy ể khử trùng

Khử trùng: Tiến tr b x ấy v trù M u ược khử trùng trong dung dịch cồn 70% trong 30 giây, tráng lại bằ ước cất vô trùng từ 3 -5 lần, tiếp theo m u ược khử trùng bằng các hóa chất khử trùng theo các lô thí nghiệm khác nhau với các chế ộ khử trùng khác nhau (bảng 2.3):

Bảng 2.3 Các công thức thức khử trùng ch i ài ương lan

Lô thí nghiệm 1: M u là các chồi non có 1-lá thật ược khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1% trong các khoảng thời gian 10 phút, 15 phút, 20 phút ( kí hiệu CT1, CT2, CT3) có bổ sung vài giọt Tw 2 , s u ó rửa lại m u bằng ước cất vô trùng nhiều lần

Lô thí nghiệm 2: M u cấy là các chồ trưởng thành có 4-5 lá thật, các chế

ộ khử trùng sử dụng HgCl2 0,1% , HgCl2 0,2% trong 15 phút hoặc dung dịch

H2O2 3% trong 20 và 30 phút, NaClO 2% trong 20-40 phút

Lô thí nghiệm 3: M u cấy là các mầm chồi mới nhú, các chế ộ khử trùng

sử dụng dung dịch HgCl2 0,2% trong 15 phút, 20 phút và khử trùng kép trong

20 và 10 phút Các chế ộ khử trù ược trình bày cụ thể trong bảng 2.3

M u s u k k ử trù , ượ trá ạ 3-5 ầ bằ ướ ất v trù S u

ó ắp u v ặt ấy t ấ , t ấ k v ắt bỏ p ầ u ấ á ất

v ấy v á ố ệ trường MS M i công th c khử trùng cấy 8

- 10 ống nghiệm, lặp lại 2 lần, tiế t õ v á á ệu quả khử trùng

và khả ă số sót ũ ư ặ ể s trưởng và phát triển c a m u

Tỷ lệ m u sạch sống (%) = số m u sạch sống/ tổng số m u cấy

Tỷ lệ m u nhiễm (%) = số m u nhiễm / tổng số m u cấy

2 4 2 Phương ph p khử trùng quả Hài Hương lan

Quả H Hươ ược thu hái về s u ó rửa sạ ướ v ước chảy, ngâm trong xà phòng loãng khoảng 5 phút, tiếp theo rửa sạch xà phòng và tráng m u bằ ước cất, mang vào box cấy ể khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong 15 phút (chế ộ KT1) hoặc khử trùng bằng NaOC l % trong 40 phút KT2 v N OC 2% tr 3 p út KT3 S u ó rửa lại m u bằ ước cất khử trùng 3 - 5 lần

Quả sau khi khử trùng dùng dao bổ dọc quả, tách lấy hạt và nuôi cấy trên trường MS trong các bình tam giác 250ml M i công th c thí nghiệm cấy 5 bình, lặp lại 3 lần Theo dõi hiệu quả khử trùng quả ở các chế ộ khử trùng

Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ sạch, tỷ lệ nhiễm