Trang 1 KHOA CÔNG NGHỆ ỨNG DỤNG ĐỒ ÁN TỔNG HỢP THIẾT KẾ MỒI DÙNG CHẨN ĐOÁN KHÁNG CLARITHROMYCIN VÀ LEVOFLOXACIN Ở VI KHUẨN HELICOBACTER PYLORI NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Y DƯỢC HỌ VÀ TÊN S
TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU
Giới thiệu
Helicobacter pylori (HP) là trực khuẩn gram âm có hình xoắn Dưới kính hiển vi điện tử, vi khuẩn cú kớch thước dài 2 – 4 àm, đường kớnh 0,5 – 1 àm, với 2 – 6 tiờm mao ở một đầu [42] Hình dạng xoắn và các tiêm mao giúp cho vi khuẩn di chuyển trong lớp nhầy [19, 42] Vi khuẩn sống ở lớp nhầy trên bề mặt niêm mạc dạ dày, một số ít bám trên bề mặt niêm mạc [19] Helicobacter pylori tăng trưởng ở nhiệt độ 34 – 40 0 C, tốt nhất là 37 0 C; nó chịu được môi trường pH từ 5,5 – 8,0, tốt nhất là môi trường trung tính
Hình 2.1.1: Hình dạng vi khuẩn Helicobacter pylori (HP)
- Các đường lây truyền của vi khuẩn Helicobacter pylori (HP)
Người là vật chủ quan trọng nhất với HP [73] Các cơ chế lây truyền của HP gồm lây từ người sang người [23, 31], thông qua nguồn nước bị nhiễm hoặc dịch tiết ở miệng
[31] và lây do chăm sóc y tế [23] Lây truyền HP từ người sang người thông qua các đường: dạ dày – miệng, miệng – miệng, phân – miệng [23, 42]
+ Đường truyền dạ dày – miệng: Đây là đường lây truyền quan trọng bởi vì việc nôn trớ các chất tiết trong dạ dày ra ngoài môi trường là phương tiện để lây nhiễm hay gặp ở trẻ em [2] 62% mẫu dịch dạ dày nuôi cấy thấy HP trong dịch vị dạ dày sau khi lấy 2 giờ, 42% sau 6 giờ và 10% sau 24 giờ [32] Thói quen vệ sinh kém cùng với chất nôn có chứa vi khuẩn là phương tiện để lây truyền [2, 32, 56]
+ Đường truyền miệng – miệng: Vi khuẩn từ dạ dày theo chất nôn hay chất trào ngược lên khoang miệng Miệng trở thành ổ chứa vi khuẩn, nước bọt có thể là nguồn truyền vi khuẩn HP Nghiên cứu tại Anh năm 2002 tìm thấy 68% trẻ nhiễm HP có HP ở cao răng [2, 11, 17, 44]
+ Đường truyền phân – miệng: Một số nghiên cứu dùng phương pháp PCR để phát hiện HP trong phân [43] Nghiên cứu của Laporte 2004, trong vụ dịch viêm dạ dày do HP ở những cộng đồng người trẻ tuổi bằng phương pháp ELISA phát hiện kháng nguyên trong mẫu phân đã chứng minh được đường lây truyền HP qua đường phân miệng [42] Các nghiên cứu khác bằng phương pháp PCR đã chứng minh được đường lây truyền của HP qua đường phân miệng đặc biệt trong điều kiện vệ sinh kém [2]
- Đặc điểm vi sinh vật của vi khuẩn Helicobacter pylori
Helicobacter pylori là vi khuẩn vi ái khí, mọc chậm và cần môi trường nuôi cấy phức tạp trong phòng xét nghiệm Môi trường chọn lọc thường là Helicobacter - agar hoặc thạch máu ngựa hoặc cừu Vi trường tối ưu cho sự phát triển của HP là hỗn hợp khí O2:CO2:N2 với tỷ lệ 5:10:85%, tương ứng Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp nhất là 35 – 37 o C [21, 45, 48] Nuôi cấy HP cần có môi trường chọn lọc và kháng sinh thích hợp (gồm: Vancomycine, Trimethoprim, Cefsulodin, Amphotericin B) để ức chế nấm và tạp khuẩn [21] Mẫu mô niêm mạc dạ dày dùng để nuôi cấy HP không được để quá 2 giờ ở nhiệt độ phòng [45] Khi nuôi cấy có vi khuẩn mọc trên môi trường đặc, các khuẩn lạc nhỏ như đầu đinh ghim, đường kính khoảng 1 mm, trơn láng, hơi mờ [21, 48] thường sẽ xuất hiện từ ngày thứ 2 đến ngày thứ 5 trên bề mặt đĩa thạch [21]
- Đặc điểm các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn Helicobacter pylori
Các yếu tố liên quan sinh cư và gây bệnh của HP bao gồm vai trò của tiêm mao, enzyme urease, yếu tố bám dính và các yếu tố độc lực của vi khuẩn [60]
+ Vai trò các tiêm mao
Cấu trúc cơ bản của các tiêm mao này gồm có vỏ ngoài liên tục với màng tế bào vi khuẩn Bên trong là một lỗ dài được cấu tạo bởi nhiều thành phần Các tiêm mao giúp
HP di chuyển xuyên qua lớp nhầy đến bề mặt niêm mạc, nơi có pH trung tính để sinh sống và xâm nhập vào tế bào biểu mô vật chủ để gây bệnh [14, 60] Phương thức xâm nhập là di chuyển và hóa hướng động hướng về các tế bào niêm mạc dạ dày [64]
Một trong những tính năng nổi bật của HP là có thể xâm nhập môi trường axit dạ dày dù không phải là một vi khuẩn ưa axit Độ pH của niêm mạc dạ dày thay đổi trong khoảng 4 – 6,5, nhưng đôi khi cũng có thể thay đổi đột ngột, do đó đòi hỏi HP phải có các cơ chế để tự bảo vệ Xét theo khía cạnh này, ban đầu HP di chuyển nhanh về phía lớp chất nhầy dạ dày bằng hóa hướng động sử dụng urê và chênh lệch bicarbonate có trong môi trường dạ dày.Việc di chuyển nhanh về phía pH trung tính hơn là cần thiết cho vi khuẩn vì nó có thể mất khả năng vận động trong lòng dạ dày có tính axit [62] Thành phần chính kháng acid của HP là enzyme urease có tác dụng chuyển urê thành amoniac và carbamate, rồi tự phân hủy thành amoniac và carbon dioxide [24] Amoniac có tác dụng gây độc tế bào trên tế bào biểu mô dạ dày, bicarbonate có tác dụng ngăn chặn các tác dụng diệt khuẩn của peroxynitrite, một chất chuyển hóa nitric oxide [63]
+ Các yếu tố bám dính và các protein màng ngoài
Nhiều yếu tố vi khuẩn tham gia vào sự bám dính của vi khuẩn HP với niêm mạc dạ dày
[58] Ở đây chỉ đề cập đến các yếu tố bám dính được nghiên cứu nhiều nhất o BabA (HopS)
Protein BabA 78 kDa là một đại diện cho protein bám dính tốt nhất của HP, được mã hóa bởi gen babA BabA làm trung gian bám dính với kháng nguyên nhóm máu Lewis b của ký chủ (Leb) [22] Có hai alen là babA1 và babA2, nhưng chỉ có babA2 có thể mã hóa protein có khả năng bám dính của vi khuẩn Nghiên cứu ở động vật cho thấy độ bám dính qua trung gian BabA có liên quan đến sự xâm nhập và sinh bệnh học của
Phần lớn các chủng HP có LPS chứa kháng nguyên fucosylated oligosaccharide có cấu trúc và miễn dịch gần giống với các kháng nguyên nhóm máu của con người Các kháng nguyên vi khuẩn (kháng nguyên Lewis) có khả năng tự thay đổi tính kháng nguyên rõ rệt và góp phần vào hiện tượng “trốn miễn dịch” [42] Các biểu lộ kháng nguyên Lewis tăng cường tương tác của vi khuẩn với các tế bào biểu mô và do đó có khả năng tác động đến đáp ứng miễn dịch [48]
+ Vai trò của các yếu tố độc lực của HP
Vi khuẩn Helicobacter pylori có nhiều yếu tố độc lực, trong đó kháng nguyên kết hợp độc tố tế bào cagA (cytotoxin-associated gene A) và độc tố gây không bào vacA (vacuolating cytotoxin) được nghiên cứu nhiều nhất Các độc lực này cùng với DupA, IceA, OipA và BabA của HP có liên quan đến tiên lượng viêm teo dạ dày, dị sản ruột và những bệnh cảnh lâm sàng nặng [3] o Protein CagA
Có những chủng HP có độc lực cao hơn các chủng khác trong quá trình thay đổi hình thái, tạo không bào và thoái hóa trên invitro [46] Ở những chủng có độc lực cao có sự hiện diện của một loại protein được đặt tên là CagA Protein CagA là một loại protein có tính kháng nguyên cao được mã hóa bởi gen cagA [29] Gen này chiếm khoảng 50% đến 70% các chủng vi khuẩn HP
Tại Việt Nam, Lê Văn Nho và cs nghiên cứu 60 bệnh nhân loét tá tràng nhiễm
HP, tỷ lệ CagA (+) là 80% Tỷ lệ này cho thấy HP có CagA (+) khá cao ở bệnh nhân loét tá tràng [7] o Độc tố không bào VacA
Khoảng 50% của các chủng HP tiết VacA, một protein 95 kDa có tính miễn dịch cao gây độc không bào mạnh trong biểu mô tế bào trên invitro [67] Protein VacA đóng một vai trò quan trọng trong sinh bệnh học của cả loét dạ dày và ung thư dạ dày [76]
Các công trình nghiên cứu
Năm 2014, Hồ Đăng Quý Dũng phân lập 34 chủng HP đề kháng Clarithromycin bằng xét nghiệm E-test Thực hiện PCR giải trình tự gen các chủng này cho thấy trong số các chủng đề kháng Clarithromycin có 76,5% có đột biến A2143G, 8,8% có đột biến A3142G và không có chủng nào có đột biến A2142C [6]
Năm 2015, Nguyễn Thúy Vinh thực hiện PCR giải trình tự gen trực tiếp trên mẫu sinh thiết dạ dày 188 bệnh nhân, phát hiện tỷ lệ có đột biến đề kháng Clarithromycin là 36,7% và chỉ có 1 loại đột biến là A2143G, không có đột biến A2142G Nghiên cứu này cũng cho thấy phương pháp PCR giải trình tự gen có độ nhạy 88,8% và độ đặc hiệu 71,9% [12]
Tỷ lệ HP đề kháng LVX nguyên phát trong nghiên cứu của Phan Trung Nam là 39,5% (miền Trung) cao hơn của Trần Thanh Bình là 18,4% (khảo sát vừa ở TP Hồ Chí Minh vừa ở Hà Nội) Tỷ lệ HP đề kháng LVX thứ phát dao động từ 25,5-61,5% [4, 13]
2.2.2 Ngoài nước Được biết trên thế giới bắt đầu từ giai đoạn 2009-2014, tổng hợp của Ghotaslou
R cho thấy tỷ lệ HP đề kháng chung với CLR là 19,74%, với LVX là 18,94% [33]
Theo bài báo nghiên cứu “tỷ lệ cao các chủng Helicobacter pylori kháng Clarithromycin và các yếu tố nguy cơ liên quan đến kháng thuốc ở Madrid, Tây Ban
Nha” Kháng Clarithromycin ở HP chủ yếu là do đột biến điểm trong vùng vòng lặp peptidyltransferase của gen 23S rRNA [16].
CƠ SỞ LÝ THUYẾT
Cơ sở lý thuyết 1: Dựa vào cơ chế đề kháng kháng sinh Clarithromycin của
Clarithromycin là loại kháng sinh nhóm macrolid có công thức phân tử là
C38H69NO13, phân tử lượng: 748,0 Nguồn gốc từ dẫn chất bán tổng hợp bằng cách methyl hóa nhóm 7 - hydroxyl của erythromycin nên có hoạt tính kìm khuẩn bằng cách liên kết với tiểu đơn vị ribosom của vi khuẩn 50S của HP, một bước quan trọng trong quá trình tổng hợp protein để diệt trừ HP Kết quả là sự tắc nghẽn có hiệu quả ngăn chặn và ức chế quá trình tổng hợp protein phụ thuộc RNA [18]
Kháng sinh Clarithromycin gắn kết với vòng peptidyl transferase của domain V phân tử 23S rRNA [68] Sự gắn kết này ngăn chặn việc kéo dài protein trong quá trình tổng hợp, và do đó có tác dụng ngăn chặn tổng hợp protein của vi khuẩn Hoạt tính kháng khuẩn của Clarithromycin là tương tự như của macrolide khác, nhưng clarithromycin được hấp thụ tốt hơn trong lớp niêm dịch dạ dày, ổn định với axit hơn, và do đó hiệu quả hơn với HP Gen 23S rRNA mã hoá cho phân tử 23S rRNA, phân tử này tham gia cấu tạo nên tiểu đơn vị lớn 50S của ribosome cùng với phân tử 5S rRNA và 33 phân tử protein khác nhau Ngoài tiểu đơn vị lớn 50S, ribosome còn có tiểu đơn vị bé 30S được cấu tạo từ phân tử 16S rRNA và 20 đến 21 phân tử protein Ribosome có chức năng tham gia vào quá trình dịch mã để tổng hợp nên phân tử protein
Hình 3.1.1: Cấu trúc phân tử Clarithromycin Đề kháng với Clarithromycin của HP chủ yếu gây ra bởi đột biến điểm trong hai nucleotide liền kề của gen 23S rRNA, cụ thể là ở vị trí 2142 và 2143 Tại đó adenine (A) được thay thế bởi guanine (G) ở một trong những vị trí này hoặc thay thế adenine (A) bởi cytosine (C) ở vị trí 2142 [57, 65] Ở HP những đột biến này làm giảm ái lực của ribosome với một số macrolide, dẫn đến tăng sức đề kháng [71] Đa số các chủng có các đột biến A2143G, A2142G và A2142C có giá trị MIC cao (> 256 mg/ L) Ở kháng sinh Clarithromycin có tác động vào ARN vận chuyển cụ thể là gen 23S rRNA và phần 50s của Ribosome gây cản trở sự kéo dài peptide của vi khuẩn, vi khuẩn bị tiêu diệt Tính kháng của HP xảy ra do đột biến, đặc biệt ở vị trí 2142 (A2142G,
A2142C) và 2143 (A2143G) chiếm hơn 90%, điều này có thể dẫn đến thay đổi sự cấu hình của vị trí đích và giảm sự cố định.
Cơ sở lý thuyết 2: Dựa vào cơ chế đề kháng kháng sinh Levofloxacilin của
Levofloxacin có công thức hóa học là C18H20FN3O4 (M = 361,368), dạng hemihydrate: C18H20FN3O4.ẵH2O (M = 370,368)
Levofloxacin là một fluoroquinolon mới, một đồng phân của ofloxacin có tác dụng đối với nhiều loại vi khuẩn gram dương và gram âm Thuốc hấp thu nhanh, sinh khả dụng 100%, ít bị ảnh hưởng bởi thức ăn, phân bố rộng khắp cơ thể, thâm nhập tốt vào các mô và dịch cơ thể Nồng độ thuốc trong mô và dịch cơ thể cao hơn huyết tương,
Hình 3.1.2: Đột biến thay thế ở vị trí 2142 và 2143 của kháng sinh Clarithromycin thời gian bán hủy 6 – 8 giờ ở người có chức năng thận bình thường [25] Các fluoroquinolon có tác dụng chống vi khuẩn HP [61] Hơn nữa, Tanaka M và cs đã chứng minh rằng Levofloxacin và PPI có tác dụng hiệp đồng chống vi khuẩn HP [66]
Kháng sinh Levofloxacilin có khả năng ngăn chặn DNA gyrase và sự tổng hợp DNA của vi khuẩn Đột biến gyrA thường nằm tại vị trí codon 86, 87, 88, và 91 và đột biến gyrB chủ yếu xảy ra ở vị trí codon 463, 438, 484 Đột biến kháng levofloxacin ngày càng tăng và đột biến trong gyrA và hoặc gyrB chiếm khoảng 83%
Dựa trên các cơ sở lý thuyết đó nhóm chúng tôi đã đưa ra các đoạn gene thích hợp cho việc Thiết kế mồi dùng chẩn đoán kháng Clarithromycin và Levofloxacin ở vi khuẩn Helicobacter pylori”
Từ đây mở ra triển vọng ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong việc chẩn đoán đề kháng Clarithromycin và Levofloxacilin Nổi bật của phương pháp PCR là phương pháp trên invitro để tổng hợp một đoạn DNA đặc thù có độ nhạy và độ đặc hiệu rất cao, phản ứng gồm 3 bước: biến tính, gắn mồi, kéo dài Trong đó mồi (Primers) là một trong những thành phần quan trọng không thể thiếu Mồi (Primers) được định nghĩa là các đoạn oligo-nucleotide dài khoảng 20 nucleotide và bắt cặp bổ sung đặc hiệu cho 2 đầu trình tự mục tiêu cần nhân bản Để thiết kế mồi trải qua 4 giai đoạn và mỗi giai đoạn sẽ có các bước tiến hành khác nhau:
Hình 3.2: Cấu trúc phân tử Levofloxacin
Giai đoạn 1: Xác định mục tiêu – đối tượng
Giai đoạn 2: Thông tin trình tự (được tìm trên các bài báo chính thống, trang web NCBI) Giai đoạn 3: Thiết kế mồi (có thể thiết kế thủ công và sử dụng phần mềm hỗ trợ) Giai đoạn 4: Đánh giá mồi (có thể thiết kế thủ công và sử dụng phần mềm hỗ trợ).
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Phương pháp nghiên cứu
PCR đặc hiệu hai hướng alen có tích hợp công nghệ Amplification refractory mutation system (ARMS) trong đó DNA được khuếch đại bằng các alen mồi tương ứng đặc hiệu Là phương pháp rất hữu ích cho việc xác định các đột biến điểm hoặc đa hình Đóng vai trò quan trọng để xác định kiểu gen là dị hợp tử hay đồng hợp tử nhằm phân biệt bằng cách sử dụng ARMS mồi cho alen đột biến (Mutation) và bình thường (Wild type) được thực hiện trong ống riêng biệt [9, 47]
Thông thường để thực hiện các phản ứng PCR đặc hiệu allele mồi đặc hiệu sẽ bắt cặp bổ sung chính xác với nucleotide đầu tận cùng 3’ tại vị trí nghi ngờ có đột biến, tuy nhiên việc thay đổi 1 nucleotide chỉ làm giảm ái lực đặc hiệu của mồi chứ không triệt tiêu hoàn toàn tính chất bắt mồi của oligo Vì vậy, chúng tôi thay đổi một số vị trí áp chót đầu 3’ của chuỗi mồi đặc hiệu theo quy luật Amplification refractory mutation system - ARMS (C.R.Newton 1989) Việc thay đổi này một mặt làm giảm ái lực không đặc hiệu của mồi đột biến với khuôn thể dại nhưng lại không thay đổi tính đặc hiệu của mồi [55] Đối tượng nghiên cứu là các đoạn gen đột biến biểu hiện sự đề kháng kháng sinh trên vi khuẩn Helicobacter pylori (HP) Cụ thể là các gene gyrA biểu hiện đột biến đề kháng kháng sinh Levofloxacin và gene 23SrRNA biểu hiện đột biến đề kháng Clarithromycin
Thiết kế mồi có sự hỗ trợ bởi các phần mềm online trong lĩnh vực tin sinh học Các phần mềm thiết kế mồi phổ biến và miễn phí như là Primer-Blast, Primer3,
Primer3Plus đều được đánh giá cao bởi các chuyên gia Ngoài ra, phần mềm Primer1 được sử dụng để thiết kế mồi cho phương pháp ARMS PCR [15].
Nguyên tắc thiết kế mồi
Thiết kế mồi cho phản ứng PCR là thiết kế các đoạn oligo-nucleotide xác định mục tiêu – đối tượng trong phản ứng bởi nguyên tắc bổ sung nên trong quá trình thiết kế phải đảm đảm bảo các nguyên tắc về chiều dài primer, nhiệt độ nóng chảy (Tm), thành phần Nu và một số tiêu chí khác
Nguyên tắc chung của thiết kế mồi PCR cũng được áp dụng với các cặp mồi ARMS Các ARMS – PCR đòi hỏi 1 cặp mồi bao gồm 1 mồi xuôi (F) và 1 mồi ngược Mồi ARMS có tính năng đặc biệt sau đây:
1 Các mồi thông thường có chiều dài 20 – 30 base
2 Các nucleotid ở đầu 3’ của mồi sẽ bổ sung với các nucleotid mục tiêu nghĩa là
C – G, G – C, A – T, T – A Sự không phù hợp ở vị trí này có thể làm giảm đáng kể khả năng khuếch đại
3 Nếu thêm một điểm không bắt cặp ở 1 trong 5 nucleotid cuối cùng trong mồi ARMS làm tăng thêm tính đặc hiệu cho phản ứng
4 Có rất nhiều nguyên nhân gây ra sự âm tính giả ví dụ như quá ít hoặc quá nhiều DNA, chất lượng mẫu DNA kém, thất bại trong việc thêm mồi, enzyme Taq, hoặc thuốc thử khác và sự xuất hiện của yếu tố ức chế PCR
5 Độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng ARMS có thể kiểm soát được bởi các điều kiện phản ứng nghiêm ngặt, thiết kế mồi tốt, và giới hạn số lượng các chu kỳ là rất quan trọng để tránh kết quả sai Số lượng chu kỳ chỉ phải đủ để tạo ra một kết quả dương tính chắc chắn, việc tăng số lượng chu kỳ không cần thiết có thể gây ra kết quả dương tính giả [47].
Tổng quan các bước cần thực hiện
Bước 1: Thu thập thông tin trình tự
Truy cập trang chủ của NCBI tại địa chỉ: ( https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) Trang NCBI là một số các trang trong hệ thống cung cấp các thông tin Tra cứu trên GenBank, đối tượng là các đoạn gen Helicobacter pylori biểu hiện đề kháng kháng sinh, tập trung cụ thể ở 2 đối tượng: gen 23S rRNA và gyrA
+ Đối tượng thứ 1 là Gen 23S rRNA (số truy cập: AB088062.2 và AB088065.1)
Vị trí đột biến gây ra kháng là 2142 và 2143 [16, 59]
+ Đối tượng thứ 2 là gyrA (số truy cập: NZ_CP071982.1) VỊ trí đột biến gây ra kháng là thường nằm tại vị trí 259A > T , 271G > A, 271G > T and 272A > G [78]
Sau khi xác định đúng đối tượng cần nghiên cứu, ta tiến hành tải trình tự về dưới dạng file FASTA
Hình 4.2.1: Tra cứu gen 23S rRNA vi khuẩn Helicobacter pylori
Hình 4.2.2: Tra cứu gen gyrA vi khuẩn Helicobacter pylori (HP)
Phần mềm được sử dụng là Primer1 có địa chỉ: http://primer1.soton.ac.uk/primer1.html Chọn trình tự đã tìm vào khung công cụ Primer1 Chọn vị trí SNP và alen cần xác định đột biến Các thông số còn lại theo yêu cầu của thiết kế Sau khi điều chỉnh xong, ta nhấn “Pick primers” để tiến hành thiết kế Kết quả gồm 2 cặp mồi, cặp mồi ngoài (outer Fo và outer Ro) và cặp mồi trong (inter Fi và inter Ri) [30]
Bước 3: Kiểm tra độ đặc hiệu Độ đặc hiệu của đoạn mồi là khả năng mồi chỉ bắt cặp duy nhất với đối tượng cần nhân bản mà không bắt cắp với các tác nhân khác Đảm bảo độ chính xác cao trong quá trình thực hiện PCR Để kiểm tra độ đặc hiệu, ta vẫn truy cập vào trang chủ Primer-BLAST Nhập các thông số ở phần “Primer pair specificity checking parameters” theo yêu cầu Sau cùng là ấn vào ô “Get Primers” để nhận được kết quả cần kiểm tra [28]
Hình 4.2.3: Thiết kế các đoạn mồi bằng Primer1
PCR silico là một phương pháp bổ sung hữu ích và hiệu quả để đảm bảo tính đặc hiệu của mồi cho nhiều ứng dụng PCR Là công cụ thực nghiệm pcr trên máy tính Truy cập trang (http://insilico.ehu.es/PCR/) là trang dùng để in-silico cho prokaryote Chọn đối tượng và nhập đoạn mồi cần in-silico Sau cùng là ấn ampllify và nhận kết quả
Hình 4.2.4: Kiểm tra độ đặc hiệu của đoạn mồi bằng Primer-Blast
Hình 4.2.5: Công cụ in silico PCR đối với các sinh vật nhân sơ
Hình 4.2.6: Các thông số cần thiết để in silico đoạn mồi