Trang 1 NGUYỄN THỊ TÌNH NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG VÀ PHÁT TRIỂN NGUỒN GEN MỘT SỐ LOÀI LAN HÀI Paphiopedilum ĐẶC HỮU KHU VỰC MIỀN NÚI PHÍA BẮC VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ NƠNG NGHIỆP Trang 2 BỘ G
NGUYỄN THỊ TÌNH NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG VÀ PHÁT TRIỂN NGUỒN GEN MỘT SỐ LOÀI LAN HÀI (Paphiopedilum) ĐẶC HỮU KHU VỰC MIỀN NÚI PHÍA BẮC VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI – 2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN THỊ TÌNH NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG VÀ PHÁT TRIỂN NGUỒN GEN MỘT SỐ LOÀI LAN HÀI (Paphiopedilum) ĐẶC HỮU KHU VỰC MIỀN NÚI PHÍA BẮC VIỆT NAM Ngành: Di truyền Chọn giống trồng Mã số: 962.01.11 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Ngô Xuân Bình TS Trần Ngọc Hùng HÀ NỘI – 2024 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan, cơng trình nghiên cứu tơi Các số liệu kết nghiên cứu luận án trung thực chưa công bố cơng trình khác Tơi xin cam đoan rằng, giúp đỡ, hợp tác cho việc thực luận án cám ơn thông tin trích dẫn luận án dẫn rõ nguồn gốc Tác giả luận án Nguyễn Thị Tình ii LỜI CẢM ƠN Để hồn thành luận án này, nhận quan tâm giúp đỡ nhiệt tình Thầy, Cơ giáo, tập thể, cá nhân bạn bè đồng nghiệp gia đình Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Ngơ Xn Bình - Bộ khoa học Công nghệ, TS Trần Ngọc Hùng - Viện Nghiên cứu Rau Quả Hai Thầy tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, động viên tạo điều kiện tốt cho tơi suốt q trình thực đề tài hồn thành luận án Tơi xin chân thành cảm ơn Viện Nghiên cứu Rau Quả, bạn bè đồng nghiệp Viện Nghiên cứu Rau Quả tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình học tập thực nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn Thầy, Cô giáo, anh, chị, em Ban Đào tạo sau đại học, Viện Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam tận tình giúp đỡ bảo tơi suốt q trình học tập thực nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể, cá nhân, Khoa CNSH – CNTP trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên hợp tác giúp đỡ chia sẻ thông tin, kinh nghiệm quý báu, cung cấp mẫu giống lan hài trình thực nghiên cứu Đặc biệt cảm ơn tác giả có tên báo khoa học công bố hỗ trợ giúp đỡ q trình tiến hành thí nghiệm luận án Nghiên cứu nhận tài trợ Bộ khoa học Công nghệ thông qua Đề tài cấp Nhà nước Mã số: NVQG.ĐT.04 Nghiên cứu sinh xin trân trọng cảm ơn Bộ khoa học Công nghệ Cuối vơ biết ơn thành viên gia đình ln bên cạnh, động viên khích lệ, tiếp thêm sức mạnh nghị lực để tơi hồn thiện cơng trình nghiên cứu Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 02 tháng 02 năm 2024 Tác giả Nguyễn Thị Tình iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Diễn giải ABI Applied Biosystems Incorporated AFLP BA BLAST Amplified Fragment Length Polymorphism (Đa hình chiều dài đoạn nhân bản) Benzyladenine Basic Local Alignment Search Tool (Công cụ tìm kiếm gióng cột phần bản) CTAB Cetyltrimethylammonium bromide (Dung dịch đệm) CV Coefficient of Variation (Hệ số biến động) EDTA Ethylenediamine tetraacetate EtBr Ethidium bromide GA3 Gibberellin (Hormone sinh trưởng thực vật) IAA Indole - - acetic acid (Hormone sinh trưởng thực vật) IBA Indole - - butyric acid (Hormone sinh trưởng thực vật) ISSR Inter - Simple Sequence Repeat (Đoạn lặp trình tự đơn) ITS Internal transcribed spacer LSD Least Significant Difference Test matK Maturase K (Gen maturase K NCBI National Center for Biotechnology Information (Trung tâm Thông tin Công nghệ sinh học Quốc gia) PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi Polymerase) QTLs Quantitative trait locus RAPD Random Amplified Polymorphic DNAs (DNA đa hình nhân ngẫu nhiên rbcL Ribulose - bisphosphate carboxylase RCB Randomized Completely Block (Khối Ngẫu nhiên đủ) RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism (Đa hình chiều dài đoạn DNA) SSR Simple Sequence Repeats (Trình tự lặp lại đơn giản) Taq Thermus aquaticus TBE Tris/Borate/EDTA THT Than hoạt tính α NAA α - Naphthalene acetic acid (Hormone sinh trưởng thực vật) iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iii MỤC LỤC iv DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH ix MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu luận án Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn 3.1 Ý nghĩa khoa học 3.2 Ý nghĩa thực tiễn Những đóng góp đề tài luận án Đối tượng phạm vi nghiên cứu đề tài 5.1 Đối tượng nghiên cứu 5.2 Phạm vi nghiên cứu CHƯƠNG TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Khái quát chung lan hài 1.1.1 Phân loại lan hài 1.1.2 Sự phân bố lan hài 1.1.3 Sự đa dạng loài lan hài 1.2 Nghiên cứu đa dạng di truyền lan hài giới Việt Nam 1.2.1 Nghiên cứu đa dạng di truyền lan hài giới 10 1.2.2 Nghiên cứu đa dạng di truyền lan hài Việt Nam 12 1.3 Đặc điểm sinh học lan hài .16 1.3.1 Đặc điểm hình thái lan hài 16 1.3.2 Đặc điểm sinh thái lan hài 18 1.4 Tình hình sản xuất tiêu thụ lan hài giới Việt Nam 19 1.4.1 Tình hình sản xuất tiêu thụ lan hài giới 19 1.4.2 Tình hình sản xuất tiêu thụ lan hài Việt Nam 20 v 1.5 Nghiên cứu trạng giải pháp nhằm mục đích bảo tồn lan hài giới Việt Nam 22 1.5.1 Hiện trạng giải pháp bảo tồn lan hài giới 22 1.5.2 Hiện trạng giải pháp bảo tồn lan hài Việt Nam 23 1.5.3 Nghiên cứu khả nhân giống lan hài giới Việt Nam 26 1.6 Các kết luận qua phân tích tổng quan 32 CHƯƠNG VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.1 Vật liệu nghiên cứu 33 2.1.1 Vật liệu thực vật 33 2.1.2 Phân bón, hố chất, dụng cụ thiết bị 34 2.2 Nội dung nghiên cứu 35 2.2.1 Đánh giá số đặc điểm thực vật học loài lan hài thu thập khu vực miền núi phía Bắc 35 2.2.2 Đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen lồi hài khu vực miền núi phía Bắc Việt Nam 35 2.2.3 Đánh giá khả lai tạo số tổ hợp có tiềm nhằm tạo dịng hài có triển vọng 36 2.2.4 Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống số lồi hài có giá trị đánh giá khả tái sinh lai 36 2.3 Phương pháp nghiên cứu 36 2.3.1 Thu thập nguồn gen loài lan hài trồng phân bố khu vực miền núi phía Bắc 36 2.3.2 Phương pháp mơ tả, đánh giá đặc điểm hình thái loài lan hài 37 2.3.3 Phương pháp đánh giá đa dạng di truyền dựa vào kiểu hình- 38 2.3.4 Phương pháp kỹ thuật đánh giá đa dạng di truyền dựa vào thị phân tử 38 2.3.5 Phương pháp lai tạo lan hài 42 Thành phần dinh dưỡng loại phân bón sau: 44 2.3.6 Phương pháp nghiên cứu nhân giống in vitro lan hài Việt Nam sản phẩm lai 45 2.3.7 Phương pháp nghiên cứu nhân giống tách chồi lan hài Điểm Ngọc 50 2.4 Điều kiện thí nghiệm Các tiêu theo dõi .53 vi 2.4.1 Điều kiện thí nghiệm 53 2.4.2 Các tiêu theo dõi 53 2.5 Phương pháp xử lý số liệu .55 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 56 3.1 Thu thập, đánh giá thực trạng giá trị lồi lan hài khu vực miền núi phía Bắc 56 3.1.1 Thu thập đánh giá đặc điểm sinh thái nguồn gan lồi lan hài khu vực miền núi phía Bắc 57 3.1.2 Tình hình khai thác, sử dụng nuôi trồng 58 3.1.3 Khả bảo tồn phát triển 59 3.2 Đặc điểm hình thái đa dạng di truyền loài lan hài thu thập 59 3.2.1 Đặc điểm hình thái loài lan hài phân bố trồng khu vực miền núi phía Bắc 59 3.2.2 Đa dạng di truyền nguồn gen loài lan hài phân bố ni trồng khu vực miền núi phía Bắc Việt Nam 82 3.3 Đánh giá, xác định số lồi lan hài có triển vọng, tiềm phát triển đề xuất hướng bảo tồn phát triển 96 3.3.1 Xác định nguồn gen ưu tú để thiết lập cặp bố mẹ phục vụ công tác lai tạo 97 3.3.2 Đánh giá khả lai tạo cặp bố mẹ lan hài 98 3.4 Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống số lồi lan hài có giá trị số sản phẩm lai 104 3.4.1 Nghiên cứu khả nhân giống phương pháp nhân giống in vitro hài Việt Nam sản phẩm lai 104 3.4.2 Nghiên cứu khả tái sinh chồi sản phẩm lai 119 3.4.3 Kết nghiên cứu nhân giống hài Điểm Ngọc phương pháp tách chồi 123 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 131 1.Kết luận .131 Kiến nghị 132 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CĨ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 133 TÀI LIỆU THAM KHẢO 134 PHỤ LỤC vii DANH MỤC BẢNG TT bảng Nội dung bảng Trang 1.1: Các nhóm lan hài Việt Nam theo thứ tự hạng bảo tồn tổ chức bảo tồn thiên nhiên quốc tế (IUCN) 24 2.1 Tập đoàn nguồn gen lan hài hài phân bố tự nhiên trồng khu vực miền núi phía Bắc thu thập năm 2017 33 2.2 Trình tự cặp mồi nhiệt độ gắn mồi 35 2.3 Thành phần thể tích chất phản ứng PCR 41 2.4 Chu trình phản ứng PCR-RAPD 41 2.5 Thành phần cho mẹ giai đoạn thụ phấn 44 2.6 Thành phần dinh dưỡng phân bón gốc lan hài Việt Nam .49 2.7 Dinh dưỡng chăm sóc lan hài Điểm Ngọc .51 2.8 Dinh dưỡng chăm sóc lan hài Điểm Ngọc sau tách nhánh 52 3.1: Một số tính trạng đặc trưng nguồn gen lan hài khu vực miền núi phía Bắc 61 3.2 Đặc điểm tính trạng đặc trưng thân, rễ khả thích nghi nguồn gen lan hài khu vực miền núi phía Bắc .67 3.3 Đặc điểm đặc trưng hoa nguồn gen lan hài khu vực miền núi phía Bắc 76 3.5 Hệ số tương đồng di truyền trình tự nucleotide 23 mẫu giống lan hài nghiên cứu 88 3.6 Một số vị trí sai khác trình tự nucleotide mẫu giống nghiên cứu mẫu tham chiếu 92 3.7 Ảnh hưởng thời gian nở hoa đến sinh trưởng hạt phấn số loài lan hài 98 3.8 Ảnh hưởng thời điểm lai ngày đến tỷ lệ đậu cặp lan hài 101 3.9 Ảnh hưởng phân bón gốc đến tăng trưởng lai sau tháng năm 2019 Thái Nguyên 102 3.10 Ảnh hưởng nồng độ, thời gian khử trùng số dung dịch khử trùng đến khả tạo vật liệu vô trùng hài Việt Nam sau ngày nuôi cấy 105 3.11 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy tới khả nảy mầm hạt lan hài Việt Nam (sau tháng nuôi cấy) 107 viii 3.12 Ảnh hưởng BAP đến khả nhân nhanh chồi hài Việt Nam (sau 60 ngày nuôi cấy) 108 3.13 Ảnh hưởng tổ hợp BAP (4 mg/l) Kinetine đến khả nhân nhanh mẫu nuôi cấy sau (60 ngày nuôi cấy) 110 3.14 Ảnh hưởng IAA đến khả rễ tạo hoàn chỉnh hài Việt Nam 60 ngày nuôi cấy) 112 3.15 Ảnh hưởng αNAA đến khả rễ tạo hoàn chỉnh hài Việt Nam (sau 60 ngày nuôi cấy) 113 3.16 Ảnh hưởng thời gian đến khả đẻ nhánh, sinh trưởng phát triển loài lan hài Điểm Ngọc 115 3.17 Kết nghiên cứu ảnh hưởng hỗn hợp rêu chile số loại giá thể đến sinh trưởng phát triển hài Việt Nam (sau 60 ngày) 116 3.18 Kết nghiên cứu ảnh hưởng số loại phân bón gốc đến tỷ lệ sống hình thái hài Việt Nam giai đoạn vườn ươm 117 3.19 Ảnh hưởng số loại phân bón đến tỷ lệ sống hình thái hài Việt Nam giai đoạn vườn ươm 118 3.20 Ảnh hưởng môi trường MS đến khả tái sinh chồi hạt lai 119 3.21 Kết rễ tạo hoàn chỉnh lai mơi trường MS có bổ sung 1,5 mg/l NAA (sau 60 ngày nuôi cấy) 120 3.22 So sánh đặc điểm hình thái lai so với bố mẹ 121 3.23 Ảnh hưởng loại phân bón đến khả đẻ nhánh hài Điểm Ngọc (sau 60 ngày) 123 3.24 Ảnh hưởng hàm lượng nồng độ phân bón tốt đến khả đẻ nhanh loài lan hài Điểm Ngọc 124 3.25 Ảnh hưởng thời điểm tách chồi đến sinh trưởng phát triển sau tách chồi sau tháng 125 3.26 Ảnh hưởng giá thể đến khả đẻ nhánh, sinh trưởng phát triển loài lan hài Điểm Ngọc (sau 90 ngày tách chồi) 126 3.27 Ảnh hưởng giá thể tỷ lệ phối trộn đến khả sinh trưởng phát triển hài Điểm Ngọc năm 2021 Thái Nguyên 127 3.27 Ảnh hưởng số loại phân bón đến tỷ lệ sống khả sinh trưởng sau tách chồi hài Điểm Ngọc (sau tháng) 129