Nghiên cứu đa dạng và phát triển nguồn gen một số loài lan hài (paphiopedilum) đặc hữu khu vực miền núi phía bắc việt nam

Trang 1 NGUYỄN THỊ TÌNH NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG VÀ PHÁT TRIỂN NGUỒN GEN MỘT SỐ LOÀI LAN HÀI Paphiopedilum ĐẶC HỮU KHU VỰC MIỀN NÚI PHÍA BẮC VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ NƠNG NGHIỆP Trang 2 BỘ G

NGUYỄN THỊ TÌNH

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG VÀ PHÁT TRIỂN NGUỒN GEN

MỘT SỐ LOÀI LAN HÀI (Paphiopedilum) ĐẶC HỮU

KHU VỰC MIỀN NÚI PHÍA BẮC VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

HÀ NỘI – 2023

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

NGUYỄN THỊ TÌNH

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG VÀ PHÁT TRIỂN NGUỒN GEN

MỘT SỐ LOÀI LAN HÀI (Paphiopedilum) ĐẶC HỮU

KHU VỰC MIỀN NÚI PHÍA BẮC VIỆT NAM

Ngành: Di truyền và Chọn giống cây trồng

Mã số: 962.01.11

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

Người hướng dẫn khoa học:

1 GS.TS Ngô Xuân Bình

2 TS Trần Ngọc Hùng

HÀ NỘI – 2024

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan, đây là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận án này là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ một công trình nào khác

Tôi xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ, hợp tác cho việc thực hiện luận án này

đã được cám ơn và các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ dẫn rõ nguồn gốc

Tác giả luận án

Nguyễn Thị Tình

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận án này, tôi đã nhận được sự quan tâm giúp đỡ nhiệt tình của các Thầy, Cô giáo, các tập thể, cá nhân cùng bạn bè đồng nghiệp và gia đình

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới GS.TS Ngô Xuân Bình - Bộ khoa học

và Công nghệ, TS Trần Ngọc Hùng - Viện Nghiên cứu Rau Quả Hai Thầy đã tận tình

hướng dẫn, giúp đỡ, động viên và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài cũng như hoàn thành luận án

Tôi xin chân thành cảm ơn Viện Nghiên cứu Rau Quả, các bạn bè đồng nghiệp trong Viện Nghiên cứu Rau Quả đã tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong quá trình học tập và thực hiện nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy, Cô giáo, các anh, chị, em trong Ban Đào tạo sau đại học, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ và chỉ bảo tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn các tập thể, cá nhân, Khoa CNSH – CNTP trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã hợp tác giúp đỡ và chia sẻ thông tin, kinh nghiệm quý báu, cung cấp các mẫu giống lan hài trong quá trình thực hiện nghiên cứu Đặc biệt cảm ơn các tác giả có tên trong các bài báo khoa học đã công bố đã hỗ trợ và giúp

đỡ tôi trong quá trình tiến hành các thí nghiệm của luận án

Nghiên cứu được nhận tài trợ bởi Bộ khoa học và Công nghệ thông qua Đề tài cấp Nhà nước Mã số: NVQG.ĐT.04 Nghiên cứu sinh xin trân trọng cảm ơn Bộ khoa học và Công nghệ

Cuối cùng tôi vô cùng biết ơn các thành viên trong gia đình đã luôn bên cạnh, động viên khích lệ, tiếp thêm sức mạnh và nghị lực để tôi hoàn thiện công trình nghiên cứu này

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 02 tháng 02 năm 2024

Tác giả

Nguyễn Thị Tình

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Diễn giải

ABI Applied Biosystems Incorporated

AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism (Đa hình chiều dài

đoạn nhân bản)

BLAST Basic Local Alignment Search Tool (Công cụ tìm kiếm sắp gióng

cột từng phần cơ bản) CTAB Cetyltrimethylammonium bromide (Dung dịch đệm)

CV Coefficient of Variation (Hệ số biến động)

EDTA Ethylenediamine tetraacetate

EtBr Ethidium bromide

GA3 Gibberellin (Hormone sinh trưởng thực vật)

IAA Indole - 3 - acetic acid (Hormone sinh trưởng thực vật)

IBA Indole - 3 - butyric acid (Hormone sinh trưởng thực vật)

ISSR Inter - Simple Sequence Repeat (Đoạn lặp trình tự đơn)

ITS Internal transcribed spacer

LSD Least Significant Difference Test

matK Maturase K (Gen maturase K

NCBI National Center for Biotechnology Information (Trung tâm

Thông tin Công nghệ sinh học Quốc gia) PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi Polymerase) QTLs Quantitative trait locus

RAPD Random Amplified Polymorphic DNAs (DNA đa hình nhân ngẫu

nhiên rbcL Ribulose - bisphosphate carboxylase

RCB Randomized Completely Block (Khối Ngẫu nhiên đủ)

RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism (Đa hình về chiều

dài của các đoạn DNA) SSR Simple Sequence Repeats (Trình tự lặp lại đơn giản)

α NAA α - Naphthalene acetic acid (Hormone sinh trưởng thực vật)

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iii

MỤC LỤC iv

DANH MỤC BẢNG vii

DANH MỤC HÌNH ix

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu của luận án 2

3 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 2

3.1 Ý nghĩa khoa học 2

3.2 Ý nghĩa thực tiễn 3

4 Những đóng góp mới của đề tài luận án 3

5 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu đề tài 3

5.1 Đối tượng nghiên cứu 3

5.2 Phạm vi nghiên cứu 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 4

1.1 Khái quát chung về lan hài 4

1.1.1 Phân loại lan hài 4

1.1.2 Sự phân bố của lan hài 4

1.1.3 Sự đa dạng của các loài lan hài 6

1.2 Nghiên cứu đa dạng di truyền lan hài trên thế giới và Việt Nam 9

1.2.1 Nghiên cứu đa dạng di truyền lan hài trên thế giới 10

1.2.2 Nghiên cứu đa dạng di truyền của lan hài ở Việt Nam 12

1.3 Đặc điểm sinh học lan hài 16

1.3.1 Đặc điểm hình thái của lan hài 16

1.3.2 Đặc điểm sinh thái lan hài 18

1.4 Tình hình sản xuất và tiêu thụ lan hài trên thế giới và ở Việt Nam 19

1.4.1 Tình hình sản xuất và tiêu thụ lan hài trên thế giới 19

1.4.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ lan hài ở Việt Nam 20

1.5 Nghiên cứu hiện trạng và các giải pháp nhằm mục đích bảo tồn lan hài trên thế giới

và ở Việt Nam 22

1.5.1 Hiện trạng và các giải pháp bảo tồn lan hài trên thế giới 22

1.5.2 Hiện trạng và giải pháp bảo tồn lan hài ở Việt Nam 23

1.5.3 Nghiên cứu về khả năng nhân giống lan hài trên thế giới và ở Việt Nam 26

1.6 Các kết luận qua phân tích tổng quan 32

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33

2.1 Vật liệu nghiên cứu 33

2.1.1 Vật liệu thực vật 33

2.1.2 Phân bón, hoá chất, dụng cụ và thiết bị 34

2.2 Nội dung nghiên cứu 35

2.2.1 Đánh giá một số đặc điểm thực vật học của các loài lan hài thu thập ở khu vực miền núi phía Bắc 35

2.2.2 Đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen các loài hài của khu vực miền núi phía Bắc Việt Nam 35

2.2.3 Đánh giá khả năng lai tạo của một số tổ hợp có tiềm năng nhằm tạo ra dòng hài có triển vọng 36

2.2.4 Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống đối với một số loài hài có giá trị và đánh giá khả năng tái sinh của con lai 36

2.3 Phương pháp nghiên cứu 36

2.3.1 Thu thập nguồn gen các loài lan hài được trồng và phân bố tại các khu vực miền núi phía Bắc 36

2.3.2 Phương pháp mô tả, đánh giá đặc điểm hình thái của các loài lan hài 37

2.3.3 Phương pháp đánh giá đa dạng di truyền dựa vào kiểu hình- 38

2.3.4 Phương pháp và kỹ thuật đánh giá đa dạng di truyền dựa vào chỉ thị phân tử 38

2.3.5 Phương pháp lai tạo lan hài 42

Thành phần dinh dưỡng các loại phân bón như sau: 44

2.3.6 Phương pháp nghiên cứu nhân giống in vitro đối với lan hài Việt Nam và sản phẩm lai 45

2.3.7 Phương pháp nghiên cứu nhân giống tách chồi lan hài Điểm Ngọc 50

2.4 Điều kiện thí nghiệm và Các chỉ tiêu theo dõi 53

2.4.1 Điều kiện thí nghiệm 53

2.4.2 Các chỉ tiêu theo dõi 53

2.5 Phương pháp xử lý số liệu 55

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 56

3.1 Thu thập, đánh giá thực trạng và giá trị của các loài lan hài khu vực miền núi phía Bắc 56

3.1.1 Thu thập và đánh giá đặc điểm sinh thái nguồn gan các loài lan hài khu vực miền núi phía Bắc 57

3.1.2 Tình hình khai thác, sử dụng và nuôi trồng 58

3.1.3 Khả năng bảo tồn và phát triển 59

3.2 Đặc điểm hình thái và đa dạng di truyền của các loài lan hài đã thu thập 59

3.2.1 Đặc điểm hình thái của các loài lan hài phân bố và trồng khu vực miền núi phía Bắc 59

3.2.2 Đa dạng di truyền nguồn gen các loài lan hài phân bố và nuôi trồng tại khu vực miền núi phía Bắc Việt Nam 82

3.3 Đánh giá, xác định một số loài lan hài có triển vọng, tiềm năng phát triển và đề xuất hướng bảo tồn và phát triển 96

3.3.1 Xác định nguồn gen ưu tú để thiết lập các cặp bố mẹ phục vụ công tác lai tạo 97

3.3.2 Đánh giá khả năng lai tạo của 9 cặp bố mẹ lan hài 98

3.4 Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống đối với một số loài lan hài có giá trị và một số sản phẩm lai 104

3.4.1 Nghiên cứu khả năng nhân giống bằng phương pháp nhân giống in vitro đối với hài Việt Nam và sản phẩm lai 104

3.4.2 Nghiên cứu khả năng tái sinh chồi của các sản phẩm lai 119

3.4.3 Kết quả nghiên cứu nhân giống hài Điểm Ngọc bằng phương pháp tách chồi 123

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 131

1.Kết luận 131

2 Kiến nghị 132

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 133

TÀI LIỆU THAM KHẢO 134 PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG

1.1: Các nhóm lan hài Việt Nam theo thứ tự hạng bảo tồn của tổ chức bảo tồn thiên

nhiên quốc tế (IUCN) .24

2.1 Tập đoàn nguồn gen lan hài hài phân bố tự nhiên và được trồng ở khu vực miền núi phía Bắc được thu thập năm 2017 33

2.2 Trình tự các cặp mồi và nhiệt độ gắn mồi 35

2.3 Thành phần và thể tích các chất trong phản ứng PCR 41

2.4 Chu trình của phản ứng PCR-RAPD 41

2.5 Thành phần cho cây mẹ giai đoạn thụ phấn 44

2.6 Thành phần dinh dưỡng trong phân bón gốc lan hài Việt Nam 49

2.7 Dinh dưỡng chăm sóc lan hài Điểm Ngọc 51

2.8 Dinh dưỡng chăm sóc lan hài Điểm Ngọc sau tách nhánh 52

3.1: Một số tính trạng đặc trưng lá của nguồn gen lan hài tại khu vực miền núi phía Bắc 61

3.2 Đặc điểm tính trạng đặc trưng của thân, rễ và khả năng thích nghi của nguồn gen lan hài khu vực miền núi phía Bắc 67

3.3 Đặc điểm đặc trưng của hoa của nguồn gen lan hài khu vực miền núi phía Bắc 76

3.5 Hệ số tương đồng di truyền về trình tự nucleotide giữa 23 mẫu giống lan hài nghiên cứu 88

3.6 Một số vị trí sai khác về trình tự nucleotide của các mẫu giống nghiên cứu và mẫu tham chiếu 92

3.7 Ảnh hưởng của thời gian nở hoa đến sinh trưởng của hạt phấn ở một số loài lan hài 98

3.8 Ảnh hưởng của thời điểm lai trong ngày đến tỷ lệ đậu quả của các cặp lan hài 101 3.9 Ảnh hưởng của phân bón gốc đến tăng trưởng của quả lai sau 7 tháng năm 2019 tại Thái Nguyên 102

3.10 Ảnh hưởng của nồng độ, thời gian khử trùng của một số dung dịch khử trùng đến khả năng tạo vật liệu vô trùng của hài Việt Nam sau 7 ngày nuôi cấy 105

3.11 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy tới khả năng nảy mầm của hạt lan hài Việt Nam (sau 6 tháng nuôi cấy) 107

3.12 Ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân nhanh chồi của hài Việt Nam (sau 60

ngày nuôi cấy) 108 3.13 Ảnh hưởng của tổ hợp BAP (4 mg/l) và Kinetine đến khả năng nhân nhanh của

mẫu nuôi cấy sau (60 ngày nuôi cấy) 110 3.14 Ảnh hưởng của IAA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh hài Việt Nam 60

ngày nuôi cấy) 112 3.15 Ảnh hưởng của αNAA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh hài Việt Nam (sau

60 ngày nuôi cấy) 113 3.16 Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng đẻ nhánh, sinh trưởng và phát triển của

loài lan hài Điểm Ngọc 115 3.17 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hỗn hợp rêu chile và một số loại giá thể đến

sinh trưởng và phát triển của cây hài Việt Nam (sau 60 ngày) 116 3.18 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số loại phân bón gốc đến tỷ lệ sống và

hình thái hài Việt Nam giai đoạn vườn ươm 117 3.19 Ảnh hưởng của một số loại phân bón lá đến tỷ lệ sống và hình thái cây hài Việt

Nam giai đoạn vườn ươm 118 3.20 Ảnh hưởng của môi trường MS đến khả năng tái sinh chồi của hạt lai 119 3.21 Kết quả ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của các con lai trên môi trường MS có bổ sung

1,5 mg/l NAA (sau 60 ngày nuôi cấy) 120 3.22 So sánh đặc điểm hình thái lá của con lai so với bố mẹ 121 3.23 Ảnh hưởng của loại phân bón đến khả năng đẻ nhánh của hài Điểm Ngọc (sau 60

ngày) 123 3.24 Ảnh hưởng của hàm lượng nồng độ phân bón tốt nhất đến khả năng đẻ nhanh của

loài lan hài Điểm Ngọc 124 3.25 Ảnh hưởng của thời điểm tách chồi đến sinh trưởng và phát triển của cây con sau

khi tách chồi sau 2 tháng 125 3.26 Ảnh hưởng của giá thể đến khả năng đẻ nhánh, sinh trưởng và phát triển của loài

lan hài Điểm Ngọc (sau 90 ngày tách chồi) 126 3.27 Ảnh hưởng của giá thể và tỷ lệ phối trộn đến khả năng sinh trưởng và phát triển

của hài Điểm Ngọc năm 2021 tại Thái Nguyên 127 3.27 Ảnh hưởng của một số loại phân bón đến tỷ lệ sống và khả năng sinh trưởng của

cây con sau khi tách chồi ở hài Điểm Ngọc (sau 3 tháng) 129

DANH MỤC HÌNH

3.1 Điều tra thực địa và sinh cảnh của các loài Lan hài tại rừng Du Già – Yên Minh –

Hà Giang, năm 2017 56 3.2 Sơ đồ cây phân nhóm các loài lan hài dựa trên 5 tính trạng hình thái đặc trưng

bằng phần mềm NTSYS pc 2.10 83 3.3 Kết quả PCR 23 mẫu giống lan hài nghiên cứu với cặp mồi ITS1/ITS4 M: Marker

100bp ladder 85 3.4 Tỉ lệ phần trăm thành phần nucleotide của 23 mẫu giống lan hài nghiên cứu và các

mẫu tham chiếu 86 3.4 Sơ đồ hình cây của 23 mẫu giống lan hài và các mẫu giống tham chiếu 90 3.5 Ảnh hưởng của hàm lượng BAP đến khả năng nhân nhanh hài Việt Nam sau 60

ngày nuôi cấy A Đối chứng không bổ sung BAP; B: nồng độ BAP 2mg/l; C: nồng độ BAP 4 mg/l 109 3.6 Ảnh hưởng của BAP 4mg/l kết hợp với các nồng độ Kinetine đến khả năng nhân

nhanh hài Việt Nam sau 60 ngày nuôi cấy A Đối chứng không bổ sung Kinetine; B: nồng độ Kinetine 0,4 mg/l; C: nồng độ Kinetine 0,6 mg/l 111 3.7 Ảnh hưởng của hàm lượng IAA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh hài Việt

Nam sau 60 ngày nuôi cấy A Đối chứng không bổ sung BAP; B: nồng độ BAP 2mg/l; C: nồng độ BAP 4 mg/l 112 3.7: Ảnh lan hài Điểm Ngọc ở một số loại giá thể trồng sau giai đoạn tách chồi 127 3.8: Ảnh hưởng của phân bón đến khả năng sinh trưởng của lan hài Điểm Ngọc 129

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Khu vực miền núi phía Bắc gồm khu vực Đông Bắc và Tây Bắc Việt Nam bao gồm Quảng Ninh, Lạng Sơn, Thái Nguyên, Bắc Kạn, Cao Bằng, Hà Giang, Tuyên Quang, Lào Cai, Sơn La,…Đây là những tỉnh có diện tích rừng, vườn quốc gia và khu bảo tồn lớn ở Việt Nam Khu vực này là trung tâm đa dạng sinh học và hoạt động du lịch sinh thái cao do đó việc khai thác và tiêu thụ nguồn lan rừng với khối lượng lớn dẫn đến những loài thực vật quý hiếm có giá trị kinh tế trên địa bàn đang bị cạn kiệt và

có nguy cơ tuyệt chủng ngoài tự nhiên

Chi lan hài Việt Nam (Paphiopedium) có sự đa dạng về số lượng và chất lượng

với sự xuất hiện của 26 loài lan hài chiếm 37% số loài lan hài trên thế giới [Averyanov, 2008 [1] Lan hài hấp dẫn người yêu lan trong nước và trên thế giới bởi

sự đa dạng về màu sắc, hình dạng và kích thước của lá, hoa và cánh môi Sự đa dạng không chỉ được thể hiện ở cấp độ loài mà còn thể hiện ở các cá thể trong loài Bên cạnh đó chúng còn xuất hiện nhiều biến thể có lợi cho cây và hấp dẫn người chơi (hài Giáp biến thể là hài Jacki) hoặc hài Đuôi công biến thể (hài Tam Đảo, hài Trần Tuấn)

Sự khác biệt này chỉ có người đam mê hài mới đủ sự tinh tế để phân biệt chúng Một

số loài lan hài còn có hương thơm lôi cuốn người chơi (hài Hương, hài Hằng, hài Ân, hài Hồng) Lan hài đã hội tụ cho mình đủ hương, sắc và sự tinh tế của một loài hoa quý phái Điều đó càng gia tăng sự thú vị đối với các nhà sưu tầm, chọn giống, phân loại thực vật lan trên thế giới và ở Việt Nam Lan hài có nhiều giá trị trong làm cảnh, nghiên cứu và có thể mang lại tiềm lực kinh tế tạo công ăn việc làm cho hàng triệu người nếu như biết khai thác và phát triển bền vững

Tuy nhiên, các loài hài của Việt Nam bị khai thác trong tình trạng quá mức, môi trường sống của chúng bị hủy hoại, khả năng tự nhân giống phụ thuộc nhiều vào yếu

tố môi trường vì hạt lan hài không có chứa nội nhũ Các yếu tố đó đẩy chúng vào tình trạng từ nguy cấp đến tuyệt chủng ngoài tự nhiên Năm 2006 Sách đỏ Việt Nam đã đưa 13 loài lan hài vào tình trạng nguy cấp và lan hài Việt Nam (hài Bóng) trong tình trạng tuyệt chủng tự nhiên (EW) [Sách đỏ Việt Nam, 2006 [15] đến năm 2019 Nghị định 06/2019/NĐ-CP 2019 của chính phủ về quản lý thực vật rừng, động vật rừng nguy cấp thực thi công ước về buôn bán quốc tế các loài động, thực vật hoang dã nguy cấp, đã bổ sung thêm 9 loài hài vào nhóm IA nâng tổng số các loài lan hài rơi vào tình trạng nguy cấp 22 loài và 1 loài bị tuyệt chủng tự nhiên [Nghị định 06/2019/NĐ –CP, [6] Điều này cho thấy tốc độ cạn kiệt, tuyệt chủng nguồn gen của các loài hài rất nhanh

Việc đánh giá, nghiên cứu các loài lan hài hiện nay gặp nhiều khó khăn do một

số nguyên nhân như: số lượng cá thể đang bị thu hẹp, sức sống của cây và khả năng ra hoa không ổn định khi di thực từ rừng hoặc từ vùng này sang vùng khác Trong nhân giống và lai tạo lan hài, hạt phấn dễ mất sức nảy mầm, phôi hạt không có chứa nội nhũ

vì vậy hạt chỉ có thể nảy mầm trong điều kiện gặp môi trường giàu dinh dưỡng và tối

ưu Nuôi trồng lan hài cũng gặp không ít trở ngại do bộ rễ lan hài được bao phủ bởi một lớp vỏ lụa, đặc trưng là lớp biểu bì do vậy rất dễ thối, hỏng hoặc khó phát sinh rễ mới Vì vậy việc lựa chọn giá thể trồng, dinh dưỡng và chế độ tưới cho cây cần nghiên cứu kỹ lưỡng

Để định hướng được công tác bảo tồn, phát triển lan hài của Việt Nam bền vững cần phải giải quyết những vấn đề tồn tại trên do đó việc nghiên cứu các đặc điểm hình thái, đa dạng di truyền và nhân giống phục vụ công tác khôi phục nhanh nguồn gen hài đang trong tình trạng bị tuyệt chủng ngoài tự nhiên hoặc đang có nguy cơ cao và nghiên cứu lai tạo để tạo ra các tổ hợp lai có giá trị thương mại cao lan hài là cần thiết

Từ nhận thức trên đề tài luận án "Nghiên cứu đa dạng và Phát triển nguồn gen

một số loài lan hài (Paphiopedilum) đặc hữu khu vực miền núi phía Bắc Việt Nam"

đã được thực hiện

2 Mục tiêu của luận án

Đánh giá đa dạng di truyền các loài hài của khu vực miền núi phía Bắc bằng chỉ thị hình thái và chỉ thị phân tử để xác định mối quan hệ di truyền các loài lan hài thu thập được làm cơ sở cho việc chọn tạo nguồn vật liệu di truyền tốt phục vụ cho nhân giống, bảo tồn và lai tạo, tạo tiền đề phát triển một số loài lan hài có giá trị phục vụ sản xuất và nhu cầu chơi hoa

3 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn

3.1 Ý nghĩa khoa học

Các kết quả nghiên cứu của đề tài luận án đã cung cấp các dẫn liệu khoa học có giá trị về các đặc điểm hình thái và phân nhóm theo các tính trạng đặc trưng và mức độ đa dạng di truyền làm cơ sở bảo tồn, phát triển và khai thác chúng một cách phù hợp

Các kết quả nghiên cứu có hệ thống từ việc thu thập, đánh giá đặc điểm, nhân giống và chọn tạo giống và lai tạo lan hài, là tài liệu tham khảo cho công tác nghiên cứu, đào tạo, bảo tồn và phát triển nguồn gen hài Việt Nam

Tuyển chọn được hai loài lan hài có giá trị thẩm mỹ, dễ trồng, dễ chăm sóc, đã lai tạo được 9 tổ hợp lai và tái sinh được 03 dòng lai Nhân giống được 2 loài hài (hài Việt Nam, hài Điểm Ngọc) phục vụ bảo tồn và phát triển sản xuất

4 Những đóng góp mới của đề tài luận án

1 Là công trình nghiên cứu có hệ thống từ đặc điểm sinh thái học, đa dạng di truyền kiểu hình và kiểu gene tương đối đầy đủ cho các mẫu lan hài phân bố và trồng

ở khu vực miền núi phía Bắc

2 Đã chọn lọc và giới thiệu được 2 loài lan (hài Việt Nam, hài Điểm Ngọc) có giá trị thẩm mỹ (có hương, sắc) và đã bị và có nguy cơ tuyệt chủng ngoài tự nhiênđưa vào nhân giống bảo tồn, phát triển bền vững

3 Nhân giống in vitro thành công đối với lan hài Việt Nam (hài Bóng) bị tuyệt

chủng ngoài tự nhiên (phân hạng EW – sách đỏ Việt Nam, 2007) và tái sinh thành công 03 tổ hợp lai đưa vào theo dõi

4 Nhân giống tách chồi thành công đối với hài Điểm Ngọc (hài Hương Lan) trong tình trạng nguy cấp (mức CR – sách đỏ Việt Nam, 2007)

5 Đề xuất được 9 cặp bố mẹ có tiềm năng và lai tạo, tạo được 03 tổ hợp lai

5 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu đề tài

5.1 Đối tượng nghiên cứu

Cây lan hài thu thập ở khu vực miền núi phía Bắc

5.2 Phạm vi nghiên cứu

Thu thập, Đánh giá đặc điểm hình thái đặc trưng và đa dạng di truyền của các loài lan hài đã thu thập được trong khu vực Từ đó đề xuất các cặp bộ mẹ phục vụ công tác lai tạo

Đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố đến kết quả lai tạo lan hài

Đánh giá khả năng nhân giống hài Việt Nam, hài Điểm Ngọc và con lai có giá

trị bằng phương pháp nhân giống in vitro và phương pháp tách chồi

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1 Khái quát chung về lan hài

1.1.1 Phân loại lan hài

Theo hệ thống phân loại, chi lan hài (Paphiopedilum) là một nhánh của họ lan (Orchidaceae) thuộc bộ lan (Orchidales), phân lớp hành (Liliidae), lớp một lá mầm

(Monocotyledoneae), nghành hạt kín (Angiospermatophyta) Hoàng Thị Sản, 2002 [26] Lan hài là một nhóm đặc trưng dễ nhận biết so với các loài lan khác do hình thái cấu trúc hoa đặc biệt Hoa chỉ có một cánh hoa hình túi nhìn giống như chiếc hài, dựa vào hình thái đặc biệt giống chiếc hài nên loài lan này được đặt tên là lan hài Trên thế

giới hiện nay đã phát hiện được 5 chi lan hài đó là: Chi Cypripedium có khoảng 50

loài, thường được gọi là hài Vệ nữ, phân bố ở các vùng ôn đới và núi của bán cầu bắc;

chi Mexipedium, chi Phragmipedium, chi Selenipedium gồm khoảng 25 loài phân bố ở vùng nhiệt đới châu Mĩ và chi Paphiopedilum có khoảng 75 loài phân bố ở vùng nhiệt đới

châu Á từ Nam Ấn Độ và Đông Hymalaya đến Philippine, New Guinea và Quần đảo Solomon

Theo Nguyễn Tiến Bân (1990) ở Việt Nam các loài lan hài đều thuộc chi

Pa-phipedilum, thuộc tông Cypripedioideae, họ phụ Epidendroideae, họ Lan ceae), bộ lan (Orchidales), phân lớp hành (Liliidae), lớp một lá mầm (Monocotyledone-

(Orchida-ae), ngành hạt kín (Angiospermatophyta), giới thực vật (Plantae) [2]

1.1.2 Sự phân bố của lan hài

Theo Nguyễn Tiến Bân (1990) khu phân bố của Paphipeodilum kéo dài từ vùng

nhiệt đới ở chân núi Himalaya chạy ngang sang phía đông qua Trung Quốc đến Philippin, xuống đông nam đến hầu hết khắp vùng Đông Nam Á và quần đảo solomon

Paphiopedilum chắc chắn có nguồn gốc từ vùng lục địa Đông Nam Á Sự mở rộng khu

phân bố của nó về phía nam và phía đông đến vùng Malaixia và tây nam Thái Bình Dương là do kết quả di cư liên tục của các loài tổ tiên và sự phân ly tỏa tròn thành nhiều loài đặc hữu địa phương và thường có khu phân bố xa nhau [2] Những vùng có

mật độ quần thể Paphiopedilum cao nhất là ở miền nam Trung Quốc (Vân Nam,

Quảng Tây) và miền bắc Việt Nam, nơi có 18 - 20 loài

Trần Hợp (1998), tác giả cuốn: “Các loài lan Việt Nam”, đã đề cập tới 12 loài

thuộc chi Paphiopedilum và lần đầu tiên bổ sung đó là dựa trên các loài liệu đã xuất

bản và các loài được trồng [12]

Nguyễn Thiện Tịch (2001) trong tập đầu tiên của quyển sách “Các loài lan Việt

Nam“ đã đề cập tới 23 loài Paphiopedilum, bổ sung thêm P.hangianum cho hệ thực

vật Các thông tin đều dựa vào những loài đã được trồng [28]

Cuối cùng, dựa vào kết quả của quá trình nghiên cứu thực vật quy mô của Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh Vật thuộc Trung Tâm khoa học Tự Nhiên và Công Nghệ Quốc Gia, Việt Nam (Averyanov, và cs, 2004) [40] và nghiên cứu các mẫu thu để buôn bán 18 loài và 4 dạng lai tự nhiên đã được biết đến một cách chắc chắn ở Việt Nam Các loài lan hài ở Việt Nam có thể chia thành hai nhóm riêng Một nhóm phân

bố ở vùng núi đá vôi phía Bắc Việt Nam từ độ cao mặt nước biển lên đến 1600 m, nhóm còn lại phân bố ở khu vực có đá mẹ silicat, đá phiến và cát kết ở độ cao từ

700 - 2200 m

Nhóm lan hài phân bố trên vùng núi đá vôi: P.aspersum, P.barbigerum, P.concolor,

P.vietnamense được tìm thấy ở các vùng núi đá vôi bị bào mòn mạnh hoặc các sườn đá

khuất nắng và các vết nứt sâu trên vách đá dốc và các bờ đá vôi rắn dạng cẩm thạch hay các mỏm đá là nơi sống điển hình nhất cho các loài này Từ độ cao mặt biển lên

đến 400- 500m P concolor thường có ở các kiểu rừng thường xanh khô cây lá rộng

phát triển trên các vùng đá vôi của Bắc Việt Nam Hai loài đặc hữu hiếm của Việt

Nam như P.tranlienianum và P.vietnamense cùng phân bố ở các độ cao này Các loài lan hài sống ở độ cao từ 600 – 900 m bao gồm P helenae, P.herrmannii,

P.hirsutissimum var.esquirolei, P.emersonii và P.hangianum, đôi khi cả P.dianthum, P.henryanum và P.malipoense Ở độ cao 1500 – 1600m của các núi đá vôi cao nhất

miền Bắc Việt Nam đã ghi nhận các loài như P.dianthum P.micranthum,

P.henryanum, P.malipoense và P.micranthum là đồng ưu thế trong quần xã thực vật

bám đá

Nhóm sống ở các vùng có đá mẹ là silicat, đá phiến và cát kết Các loài thuộc nhóm lan hài thứ hai phân bố ở các vùng núi được tạo thành chủ yếu từ đá axit Kiểu núi cao ở khắp nơi tại Việt Nam, tuy nhiên phổ biến hơn ở miền Trung và miền Nam

Các loài P delenatii, P gratrixianum, P.appletonianum và P.callosum phân bố trên

loại đất giàu silicat Một vài cá thể của các loài này còn mọc bám ở các khe nứt hay rìa

của các vách dựng đứng đá granit hay gonai Ngoài ra, P gratrixianum còn hay được thấy ở các vùng đá riolit P villosum rất hiếm khi mọc trên đất nhưng các loài này vẫn

thường được tìm thấy ở các vùng núi hình thành từ đá axit Các loài của nhóm này

phân bố ở độ cao từ 700 - 2200m Nơi sống ưa thích cho các loài P delennatii, P

appletonianum, P.callosum và P.villosum thường là kiểu rừng hỗn giao và rừng lá

kim Còn hài P.concolor phân bố ở phía Bắc Việt Nam (Lào Cai, Yên Bái, Bắc Cạn,

Quảng Ninh, Hải Phòng, Tam Đảo (Vĩnh Phúc) và phân bố ở Lào, Campuchia, Thái Lan, Trung Quốc

1.1.3 Sự đa dạng của các loài lan hài

1.1.3.1 Sự đa dạng các loài lan hài trên thế giới

Theo mô tả của Averyanov và vs (2008) các loài lan Paphiopedilum là các loài

thân cỏ có kích thước trung bình với thân bị thu ngắn mang nhiều lá mọc thành hai hàng xếp hình quạt Tất cả các loài đều có thân rễ nhưng thường rất ngắn Tuy nhiên,

một số loài như P.malipoense và P.micranthum lại hình thành thân rễ kéo dài liên kết

rất nhiều gốc với nhau hình thành một mạng lưới ngầm dưới đất Đối với những loài này việc sinh sản vô tính cũng có thể bao phủ tới một vài m2 nếu như có điều kiện

sống thuận lợi như P.hirsutissimun hay P.dianthum, một số cây có thể từ một đến 20

gốc mọc chụm thành bó dày đặc [1]

Paphiopedilum bao gồm 50 loài lan sống trên cạn hoặc sống trên đá phân bố ở

Himalaya, Trung Quốc, Đông Nam Á, Indonesia và New Guinea Những loài lan này

là loài lan cộng sinh không thân, giả hành với những chiếc lá hình elip – hình mác phát triển tốt ôm lấy gốc Những bông hoa được sinh ra đơn lẻ hoặc trong một vài cụm hoa trên một cụm hoa ngắn đến dài Cụm hoa cao 60 cm và thường có màu nâu tía Các lá đài trên lưng đều khác biệt hai lá đài bên hợp nhất để tạo thành một lá đài thẳng đứng Các lá đài bên hẹp và dài với mép gợn sóng Các cánh hoa vuông góc với các lá đài và đôi khi cong về phía môi Ở các chi này, về tổng thể, hình dạng của lá, nhị và cánh hoa, chiều rộng cánh hoa và số lượng hoa trên mỗi chùm hoa cho thấy tính bảo thủ phát sinh gen mạnh mẽ và sự thay đổi tiến hóa rõ rệt [Zhang và cs, 2016] [98]

Paphiopedilum barbatum: Loài này có nguồn gốc từ bán đảo Malaya và Thái

Lan lá có màu xanh đậm, hoa có đường kính 10cm bao các lá đài hình tròn màu trắng hoặc xanh nhạt ở lưng, màu tím với các cánh hoa ở gốc màu xanh lục và môi màu nâu tím (De, 2019 [47]

Paphiopedilum callosum: Có nguồn gốc từ Thái Lan và Indonesia Có 4-5 lá,

màu hơi xanh với những đốm sẫm màu hơn Cụm hoa cao 35 cm, hoa đơn, đường kính

10 cm, đài hoa ở lưng hình tròn có vệt dọc màu tía Cánh hoa màu tía ở đỉnh và hơi xanh ở gốc và môi màu nâu tím [47]

Paphiopedilum fairreanum: Có nguồn gốc từ Himalayas và Assam Lá màu xanh

nhạt Cụm hoa đơn, mảnh, dài 25 cm hoa sặc sỡ với đài hoa ở lưng có sọc trắng và lưới với màu tím Cánh hoa trắng với sọc tím và mép lượn sóng, môi tím xanh có gân tím Ra hoa vào mùa hè và đầu thu [47]

Paphiopedilum hirsutissimum: Có nguồn gốc từ các bang Đông Bắc của Ấn Độ

Lá có màu xanh lục, thuôn dài Cụm hoa đơn, cao 30 cm, phủ đầy lông màu tím sẫm, hoa có đường kính 10cm với đài hoa ở lưng rộng hình dây có nhiều đốm màu tím đen Cánh hoa xòe theo chiều ngang, hơi xoắn, có đốm màu xanh và đốm tím Ra hoa vào cuối xuân, đầu hè [47]

Paphiopedilum insigne: Có nguồn gốc từ vùng Himalaya, lá hẹp, có 5 – 6 lá,

màu xanh nhạt, hoa bao gồm các lá đài màu xanh lá cây hình quả táo hình bầu dục

có đốm màu nâu tím Các cánh hoa xòe rộng, màu lục vàng nhạt với các gân dọc màu tía và mép lượn sóng Môi có màu xanh vàng với bóng nâu và hình mũ bảo hiểm Hoa ra trong mùa thu và mùa xuân [47]

Paphiopedilum rothschildianum: Loài này có nguồn gốc từ Sumatra, Borneo và

New Guinea Lá có màu xanh bóng, sần sùi và mọc đối Cụm hoa xim cao 75 cm, có 2 đến 5 hoa, màu hơi đỏ và có lông Lá đài lưng màu vàng có nhiều sọc màu tím đậm và viền đen trắng Cánh hoa có sọc xanh vàng hoặc xanh nhạt và có đốm tím đen Môi hình chiếc dép, màu nâu tía và hơi vàng ở đỉnh, hoa ra vào tháng 7 – tháng 9 [47]

Paphiopedilum Spicerianum: Có nguồn gốc từ Assam và Meghalaya Lá rộng,

hình thuôn dài, màu xanh đậm với mép lượn sóng và mặt dưới có màu tía Cụm hoa dài 30cm, màu tím, mảnh và mọc thẳng Những bông hoa có đường kính 7,5cm, bóng

và lâu tàn Lá đài lưng rộng, màu trắng tinh và hơi xanh ở gốc Các cánh hoa lệch, màu xanh vàng với các đốm và đường trung tâm màu đỏ Môi có hình chuông và màu đỏ thẫm Hoa ra từ tháng 11 đến tháng 1 năm sau [47]

Paphiopedilum venustum: Có nguồn gốc từ Assam và Sikkim của Ấn Độ Những

chiếc lá rộng, màu xanh đậm hơi xanh, có lốm đốm và lốm đốm với màu xanh xám và tím xỉn bên dưới Cụm hoa từ 1 đến 2 hoa, dài 30 cm Những bông hoa có đường kính 7,5cm với các lá đài trên lưng hình trứng đến hình dây cung có các đường gân màu xanh lá cây và các cánh hoa thuôn dài với các đốm đen màu xanh lá cây và tím Môi là một túi hình trụ, màu vàng lục, bóng hồng và có gân xanh Những bông hoa được sản xuất trong khoảng thời gian từ tháng 2 đến tháng 3 [47]

Paphiopedilum villosum: Có nguồn gốc từ Assam, Miến Điện và Thái Lan Các

lá dạng tuyến tính - có rãnh, mặt trên có màu xanh cỏ và nhạt hơn ở mặt dưới và có đốm màu tím ở gốc Cụm hoa từ 1 đến 2 hoa, có lông và dài 30cm Những bông hoa

có đường kính 15cm với lá đài trên lưng hình trứng thuôn dài, mép dưới quay và có hình thoi, màu tím lục ở gốc và tâm và màu trắng ở đỉnh Cánh hoa hình thìa, màu vàng nâu, cánh môi to, hình chiếc dép, màu vàng nhbô, hoa ra từ tháng 11 đến tháng 2 năm sau [47]

Paphiopedilum philippinensis: Là loài sống trên đá có nguồn gốc từ phía nam

đảo Mindanao Cánh hoa hẹp và xoắn [47]

Paphiopedilum fairieanum (Lindl.) Stein: Đây là loài sống trên cạn, mọc ở

độ cao từ 1200-200 m, ra hoa từ tháng 9 đến tháng 12 Được tìm thấy ở Arunachal Pradesh và Sikkim ở Ấn Độ và được phân phối tiếp đến Bhutan (Chen và Ji, 2000) [44]

Paphiopedilum armeniacum phân bố ở phía tây Vân Nam, Trung Quốc, cũng

như ở nước láng giềng Myanmar Loài này bị khai thác quá mức do giá trị trang trí cao (Chen và Ji, 2000) [44], Trong môi trường sống tự nhiên, loài này có tỷ lệ ra hoa là 7,39% ± 1,02% và tỷ lệ đậu trái là 32,23% ± 12,thể Cây sinh sản bằng chồi và thâgiống, hạt giống có thể nảy mầm tại chỗ và phát triển trong môi trường sống tự nhiên

1.1.3.2 Sự đa dạng các loài lan hài ở Việt Nam

Nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, Việt Nam là quốc gia được đánh giá có

sự đa dạng sinh học phong phú và là cái nôi của rất nhiều loại lan đặc trưng trong đó

có lan hài (Paphiopedilum) là một chi lan rất đẹp và quý hiếm Việt Nam là nước có

sự đa dạng về lan hài lớn nhất thế giới với 26 trên tổng số khoảng 80 loài, trong đó

có nhiều loài đặc hữu, trước tiên phải kể đến hài Việt Nam (P vietnamese), tiếp đó là các loài hài đỏ (P.delenatii); hài vàng (P.villosum); lan hài tía (P.purpurathum); hài trắng (P.emersonii); hài Vân (P.callosum); hài Vân duyên (P.amabile); hài Đốm (P.concolor), hài Lông (P.hirsutissimum); hài Râu (P.parishii)…(Nguyễn Tiến Bân,

1990) [2] Lan hài Việt Nam phân bố ở cả 2 miền Nam và Bắc, thời điểm nở hoa lại rải rác trong năm (Vũ Thị Huyền Trang và cs., 2019) [34]

Hài Hằng (P hangianum) là loài đặc hữu của Việt Nam, phân bố vô cùng hẹp ở

một số vùng núi thuộc tỉnh Bắc Kạn, Tuyên Quang, Hà Giang Đây là loài cho hoa đẹp

và rất được yêu thích, tuy nhiên về hình thái thân lá lại rất dễ nhầm lẫn với hài Hương

lan (P emersonii) do mức độ tương đồng cao về đặc điểm thân lá

Hài Việt Nam (P.vietnamense) là một loài đặc hữu có phạm vi phân bố hẹp nhất

Việt Nam Chỉ có ở một số tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam như Cao Bằng, Thái Nguyên, Hà Giang và khu vực vườn quốc gia Ba Bể Đa phần các quần thể lan hài Bóng sống ở nơi râm mát, chủ yếu ở các sườn bắc dốc và ở những vách cao 350-450 m của những dãy núi đá vôi Hài Việt Nam là một trong những loài lan hài đẹp kỳ lạ nhất với lá

có đốm khảm và hoa to, màu tím hay đỏ - hồng Đây là loài lan rất được ưa chuộng ở các thị trường trong nước và trên thế giới

Hài Gấm (P.concolor) là một trong những loài lan đăc̣ hữu quý hiếm của khu vực Đông co Nở hoa vào mùa Xuân và mùa Thu và có một hoa mỗi cụm Loài phân bố ở Myanma, Thái Lan, Việt Nam tại miền Bắc Việt Nam Là loài hài rất quý mới được phát hiện, có hoa to, màu sắc sặc sỡ, lạ mắt và rất đẹp, rất được ưa chuộng ở các thị trường

lan nước ngoài So với các loài lan hài khác, hài gấm có phân bố trên các núi, các đảo đá

vôi ở độ cao thấp và những nơi gần như sát mực nước biển Rất có thể đây là một trong những loài lan hài được tìm thấy sớm nhất ở Việt Nam và với cái tên “vạn điểm hài” cũng đã nói lên tất cả vẻ đẹp của loài Đây là một loài đặc hữu Việt Nam đang bị đánh giá là cạn kiệt ngoài tự nhiên (Trịnh Xuân Thành và cs, 2019) [31]

Mặc dù đã có những nghiên cứu về sự đa dạng của lan hài ở trong nước và trên thế giới, nhưng trên thực tế cho thấy những thông tin này chưa nhiều và có nhiều loài lan hài đặc hữu của khu vực miền núi phía Bắc chưa được nghiên cứu đánh giá một cách đồng bộ, do đó việc nghiên cứu đánh giá đặc điểm nông sinh học và sự đa dạng của các loài lan hài trong nội dung nghiên cứu của đề tài là cần thiết, góp phần xây dựng cơ sở dữ liệu về sự đa dạng của các loài lan hài, đồng thời làm cơ sở cho việc thực hiện các nghiên cứu cho loài lan quý hiếm và có giá trị ở Việt Nam cũng như trên thế giới

1.2 Nghiên cứu đa dạng di truyền lan hài trên thế giới và Việt Nam

Đa dạng di truyền của sinh vật là một đặc tính của sinh vật Sự đa dạng về kiểu hình do tính đa hình về kiểu gen quy định và có sự tương tác giữa kiểu gen với môi trường Biểu hiện của tính đa dạng di truyền ở sinh vật thể hiện ở các mức độ khác nhau: Đa dạng về kiểu hình biểu hiện ở các tính trạng hình thái và đa dạng về tính trạng số lượng

Sự đa dạng di truyền ở cây trồng, vật nuôi có giá trị đặc biệt trong chọn tạo

giống cây trồng, vật nuôi mới phục vụ cho lợi ích con người Chính vì vậy nghiên cứu

đa đạng di truyền có ý nghĩa đặc biệt trong công tác bảo tồn và chọn tạo giống (Trung tâm Tài nguyên thực vật, 2015)

Để sử đánh giá đa dạng di truyền cần dựa vào phương pháp mô tả các đặc điểm hình thái và phương pháp đánh giá đa hình di truyền ở mức độ ADN có thể bổ sung và

hỗ trợ lẫn nhau để công việc phân loại dưới loài trở nên chính xác hơn, phục vụ cho công tác bảo tồn, khai thác và sử dụng một cách có hiệu quả các nguồn gen lan hài bản địa của Việt Nam (Vũ Quốc Luận và cs, 2014) [9]

1.2.1 Nghiên cứu đa dạng di truyền lan hài trên thế giới

Trên thế giới, những nghiên cứu về lan hài chủ yếu chú trọng đến các lĩnh vực bảo tồn, phân loại thực vật học, đặc điểm hình thái, xác định loài lan hài Các kết quả nghiên cứu này được công bố nhiều trên tạp chí chuyên ngành của thế giới Những nghiên cứu này đã góp phần phân loại các loài lan hài, làm cơ sở xây dựng tập đoàn lan hài, khai thác và phát triển các loài lan hài có giá trị

Sự đa dạng trong cấu trúc gen là cơ sở để đánh giá tính đa dạng di truyền ở mức phân tử Sự đa dạng của các đối tượng nghiên cứu còn thể hiện trong trình tự nucleo-tide Bằng cách so sánh trình tự nucleotide của một gen nào đó có thể xác định được khoảng cách di truyền giữa các đối tượng nghiên cứu, thiết lập được sơ đồ hình cây thể hiện mối quan hệ giữa chúng Trong những thập niên gần đây, kết quả nghiên cứu đối

với các loài lan hài (Paphiopedilum), trước đây, chủ yếu phân loại dựa vào hình thái học Các loài thuộc chi Paphiopedilum lần đầu tiên được mô tả bởi E.Pfitzer vào năm

1886 [87], đánh giá sự tiến hóa của lan hài thuộc chi Paphiopedilum thông qua các

phân tích các đặc điểm hình thái Kết quả cho thấy các đặc điểm về hình dạng môi, hình dạng cuống, hình dạng cánh hoa, chiều rộng cánh hoa, màu sắc của hoa (bao gồm

cả màu sắc của lá đài sau, môi và cánh hoa) ít bị ảnh hưởng bởi phát sinh loài Do đó, tính chất này độc lập với quá trình tiến hóa và chịu ảnh hưởng chủ yếu của các yếu tố môi trường Tất cả các đặc điểm này là chìa khóa, chỉ số cổ điển khi phân biệt giữa các

loài trong chi Paphiopedilum

Trong số các chi lan hài, chi Paphiopedilum được nghiên cứu và truy tìm nhiều

nhất Điểm đặc biệt của chi này là rất nhiều loài có màu sắc lá, thân rất giống nhau, gây nhầm lẫn cho người sưu tầm do đó trong nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền cũng như xác định loài một cách chính xác thì việc sử dụng các phương pháp sinh học

phân tử và kỹ thuật di truyền đã được ứng dụng triệt để Khi sử dụng đặc điểm hình thái để phân loại họ lan nói chung và lan hài nói riêng thì cấu trúc hoa là tiêu chí xác định loài chính xác nhất (De và cs, 2019 447]); (Tsiftsis, 2016) 859]; (Zhang và cs, 2016) [98], bởi vì hoa có đặc điểm rất riêng biệt, đặc trưng từ màu sắc đến tạo hình, ngay cả các loài rất gần gũi trong chi (Cribb, 1987; Cribb, 1998) [42,43] Tuy nhiên, trong thực tế, hầu hết các loài lan nói chung và lan hài nói riêng thời gian ra hoa rất ngắn, chỉ khoảng 2 tuần/năm, vì vậy để nhận dạng nhanh và chính xác các loài lan khi còn nhỏ hoặc lúc không có hoa thì cần phải phát triển các phương pháp định loại hiệu quả hơn Do đó, cần có sự kết hợp giữa việc đánh giá thông qua hình thái học (De và

cs, 2019) [47] với việc phát triển các phương pháp định danh hiệu quả hơn cho lan Hài Sử dụng mã vạch DNA (DNA barcode) là một trong những phương pháp phục vụ định danh loài chính xác, nhanh chóng, tự động hóa bằng cách thông qua một vùng DNA đặc hiệu hay còn gọi là chỉ thị DNA mã vạch Ở thực vật, hệ gen lục lạp mang nhiều đặc điểm thích hợp đối với chỉ thị DNA Để nhận diện các loài thực vật hiệu quả, phụ thuộc rất nhiều vào việc lựa chọn và sử dụng trình tự phù hợp Chỉ thị rbcL

mã hóa ribulose-1, 5- ribuloza carboxylase oxygenase là trình tự gen lục lạp, cùng với chỉ thị MatK là hai locus được nhiều tác giả sử dụng và cho thấy có hiệu quả tốt khi sử dụng đơn lẻ trong các nghiên cứu (Hollingswort và cs, 2009) [56] Do vậy, chúng được đánh giá là các chỉ thị tiềm năng trong việc nhận dạng thực vật

Hơn 2 thập kỷ trở lại đây, lan hài ngày càng được chú ý nhiều hơn ở trên thế giới không chỉ trong việc nuôi trồng, lai tạo mà còn cả trong việc sưu tầm phát hiện những loài lan hài mới Chính vì vậy chỉ trong một thời gian ngắn, thế giới đã có một

loạt các loài lan hài mới được phát hiện và ghi nhận như P.armeniacum (Chen và cs, 2000; Liu, 2006) [44,68]; P.emersonii (Cribb (1987) [42]; P.malipoense var jackii (Huang (1988) [58]; P.helenae [Aver (1996)] Ở Trung Quốc một dự án lớn nghiên cứu về mức độ đa dạng di truyền ở một loài lan hài đẹp có tên là P.micranthum Trong

khuôn khổ dự án Ang Li và các cộng sự (2002) ở Viện Thực vật Bắc Kinh (Trung

Quốc) đã tiến hành nghiên cứu đánh giá sự đa dạng di truyền ở P.micranthum Trước

tình trạng ngày càng bị suy giảm trong tự nhiên thì loài lan này càng ngày càng được nuôi trồng nhiều trên môi trường nhân tạo Những nghiên cứu thực địa và sinh thái

sinh trưởng thân rễ chứng tỏ P.micranthum thường được tái sinh bằng sinh sản hữu

tính và vô tính, các tác giả cho rằng loài này có đầy đủ khả năng được nhân giống

thành công trong tự nhiên với điều kiện môi trường sống không bị phá hoại tiếp tục

và việc thu hái bị nghiêm cấm [38]

Nghiên cứu chuỗi trình tự vùng ITS của gần 100 loài lan hài (Cypripedioideae)

để phân tích mối quan hệ của chúng Những năm gần đây, có những nghiên cứu về phát sinh loài và định danh lan hài như Yao và cộng sự (2010) [94] dựa trên phân tích

trình tự vùng ITS2 của 85 loài Paphiopedilum và 76,6% trong số đó đã được phân

loại Xây dựng hệ thống DNA barcoding cho các loài lan hài Ấn Độ có nguy cơ tuyệt chủng dựa vào trình tự 5 vùng RNA polymerase-β tiểu đơn vị (rpoB), RNA polymerase-

β tiểu đơn vị (rpoC1), tiểu đơn vị lớn RuBisCO (rbcL), maturase K (matK) trong hệ gene của lục lạp và vùng ITS Kết quả của nghiên cứu cho thấy sử dụng gene matK là tốt nhất, có độ phân biệt loài đến 100%, các locus thành công tiếp theo là vùng ITS có

độ chính xác 50% Hơn nữa, gene matK đã có thể xác định chính xác cha mẹ của các giống lai giữa các loài Do đó, gene matK là một ứng viên đầy hứa hẹn cho việc xây

dựng mã vạch của các loài Paphiopedilum (Panveen, 2012) [81]

Đối với chi lan hài, nghiên cứu nhận dạng các loài dựa vào mã vạch lần đầu

được tiến hành bởi nhóm tác giả Parveen và cs (2012) Thí nghiệm trên tám loài

Pa-phiopedilum của Ấn Độ, sử dụng 5 mã vạch tiềm năng (rpoB, rpoC1, rbcL, matK, và

ITS) (Panveen và cs, 2012) [81]

Khi nghiên cứu về DNA barcode ở thực vật, Hollingsworth và cs, 2009 đã xác nhận rbcL và matK có hiệu quả phân biệt tốt khi sử dụng đơn lẻ RbcL có ưu điểm dễ dàng khuếch đại tuy nhiên lại khá bảo thủ trong khi đó MatK có sự biến đổi rộng nhưng khuếch đại kém

Sử dụng mã vạch DNA có vai trò quan trọng trong việc nhận diện các mẫu thực

vật Đối với họ lan (Orchidaceae), mã vạch DNA cũng đã được áp dụng để nhận diện nhiều loài trong các chi Dendrobium (De và cs, 2019); (Ludan và cs, 2019),

Phalaenopsis (Crib, 1987); (Tsiftsis, 2016), Cypripedium (Kim và cs, 2015), tophyllum, Cymbidium (Siripiyasing, 2012), Vanda (Khew & Chia, 2011) [47, 71, 42,

Gramma-89, 62, 87, 65]

1.2.2 Nghiên cứu đa dạng di truyền của lan hài ở Việt Nam

Việc phân biệt được các loài lan hài khi cây chưa ra hoa gặp nhiều hạn chế, nhất là đối với các loài có độ tương đồng cao về hình thái Trong số 22 loài lan hài của Việt Nam, có tới gần một nửa các loài mang các đặc điểm về thân lá tương đồng, rất

dễ nhầm lần Ví dụ như P.micranthum và P.armeniacum, P.concolor và P.delenatii,

P.callosum và P.purpuratum, P.tranlienianum và P.henryanum, P.helenae và P.hermannii; P hangianum và P.emersonii… (Huyen Trang Vu và cs, 2019) [34] Nếu

không phải là người có kinh nghiệm và từng được quan sát kĩ thì rất khó có thể phân biệt được chúng

Sử dụng mã vạch DNA (DNA barcode) là một phương pháp nhanh chóng và chính xác để xác định loài lan là điều cần thiết góp phần cho việc bảo tồn nguồn gen các loài lan có giá trị ở nước ta Khuất Hữu Trung và cs, 2009) [35] lần đầu phân tích trình tự nucleotide vùng gen nhân (ITS-rDNA) để xây dựng cơ sở dữ liệu DNA phân

tử và tìm ra mối quan hệ di truyền giữa các loài các loài lan trong chi lan hài

(Paphio-pedilum) ở Việt Nam Kết quả cho thấy vùng gen này rất hữu ích cho phân tích cây

phát sinh chủng loại Đặc biệt, tác giả cũng đã định hướng trong tương lai tiếp tục phát triển các chỉ thị phân tử khác để xác định các loài hay giống của chi lan hài ở Việt Nam khó xác định hình thái (nếu không có hoa)

Kết quả nghiên cứu đa dạng di truyền cho các loài lan hài ở Việt Nam chưa nhiều, phần lớn mới chỉ nghiên cứu về mặt hình thái, trong khi đó đây là đặc điểm rất khó để đánh giá chính xác được loài vì mức độ tương đồng về hình thái rất cao Do đó, việc thực hiện đề tài để đánh giá được đa dạng di truyền của các loài lan hài bằng chỉ thị phân tử là cần thiết, giúp cho việc xác định chính xác loài, làm cơ sở cho việc nghiên cứu chọn tạo giống, cũng như các biện pháp kỹ thuật trong phát triển lan hài cho khu vực miền núi phía bắc Phan Kế Long và cs, năm 2009 đã nhận diện một số loài lan Hài đặc hữu của Việt Nam và đã nghiên cứu mối liên hệ với các loài lan trên thế giới dựa trên vùng ITS để bảo tồn bền vững các loài lan có nguy cơ tuyệt chủng Kết quả phân tích cho thấy, vùng ITS-rDNA của 5 loài hài Việt Nam dao động 659-

700 bp Hai mẫu P.villosum lấy từ hai cây riêng biệt hoàn toàn không có sự khác

nhau Chiều dài ITS của các mẫu ở Việt Nam khá giống với trình tự đã được công bố

trên Genbank Khi nghiên cứu đa dạng di truyền loài lan hài Đốm (P.concolor) bản địa

của Việt Nam (2009), tác giả Khuất Hữu Trung và cộng sự đã nhậnxét: Loài lan hài

Đốm (P.concolor) bản địa của Việt Nam rất đa dạng và phong phú Các mẫu giống thu

thập tại các vùng sinh thái khác nhau đều có các đặc điểm đặc trưng riêng về hình thái Kết quả phân tích bằng kỹ thuật RAPD-PCR chỉ ra hệ số tương đồng di truyền của các mẫu hài Đốm dao động từ 0,56 đến 0,94; 16 mẫu lan hài Đốm nghiên cứu được phân

thành 6 nhóm khác nhau Năm 2010, Nguyễn Thị Mỹ Duyên và cs đã nghiên cứu phả

hệ các chi, loài lan (Orchidaceae) dựa trên phân tích các vùng trình tự ITS, kết quả

cho thấy 5 loài lan hài P.delenatii, P.concolor, P.paishii, P.hirsutissimum,

P.primulium có quan hệ họ hàng xa về phân tích kiểu gen, mặc dù về hình thái chúng

được xếp cùng một nhóm [8] Khuất Hữu Trung và cs cũng đã sử dụng trình tự vùng

ITS (gồm ITS1, 5.8 S, ITS2) để phân biệt 16 loài và 2 thứ dưới loài của chi

Paphiope-dilum Việt Nam Nghiên cứu kết luận rằng, các vùng có độ biến thiên cao ở vùng ITS

rất hữu ích cho việc phân tích phát sinh loài Như vậy có nhiều vùng trình tự được sử

dụng trên các đối tượng khác nhau của hoa lan [34]

Năm 2018 tác giả Trần Duy Dương và cộng sự đã sử dụng chỉ thị ITS để đánh gía đa dạng di truyền và đã xác định chính xác được 23/32 mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo Nghiên cứu giải trình tự vùng ITS cho nhóm lan Hoàng Thảo Phi điệp

(D.anosmum) này để định hướng xây dựng bộ chỉ thị phân tử nhận dạng chính xác các

loài phi điệp bản địa quí của Việt Nam

Huyen Trang Vu và cs, (2019) nghiên cứu đặc điểm di truyền trình tự loài lan

hài Hồng P.delenatii đặc hữu Việt Nam đã sử dụng 6 vùng trình tự rpoB, rpoC1,

trnH-psbA, ITS, matK và trnL để phân tích đặc điểm trình tự và nhận diện loài lan hài hồng đặc hữu Việt Nam cũng như một số các loài hài Việt Nam lân cận khác Phương pháp này đã nhận diện chính xác và bảo tồn hiệu quả những loài lan có giá trị trên [34] Các

tác giả đã thực hiện giải trình tự thế hệ tiếp theo của P.delenatii và lắp ráp bộ gen lục

lạp hoàn chỉnh của nó Bộ gen của lục lạp có thể được sử dụng như một siêu mã vạch hiệu quả để nhận dạng loài hoặc để phát triển các dấu hiệu nhận dạng khác, sau đó

phục vụ cho việc bảo tồn các loài Paphiopedilum Huyen Trang Vu và cộng sự, (2020)

trong nghiên cứu xác định các loài lan hài của Việt Nam đã sử dụng mã vạch DNA Với 8 locus ITS, LEAFY, ACO, matK, trnL, rpoB, rpoC1, và trnH-psbA, đã được

sàng lọc để tìm các trình tự mã vạch tiềm năng trên các loài Paphiopedilum ở Việt Nam Tổng cộng, 17 trong số 22 loài Paphiopedilum đã được xác định đúng Các tác

giả khẳng định sự kết hợp giữa ITS + matK là mã vạch nhận dạng hiệu quả nhất cho

các loài chi Paphiopedilum Việt Nam [93]

Nguyễn Thị Hải Yến và cs, (2020) [37] tách chiết DNA tổng số theo phương pháp dùng CTAB (Collins & Symons, 1992) có cải tiến cho phù hợp với điều kiện thí

nghiệm tại Việt Nam để nhận dạng lan hài Hằng (P.hangianum) của Việt Nam Kết

quả phân tích dựa vào trình tự gen rbcL đã chỉ ra sự sai khác giữa các loài lan Hài khác nhau Sơ đồ phân loại hình cây dựa trên kết quả so sánh trình tự nucleotide của

đoạn gen rbcL cho thấy 10 loài thuộc chi Paphiopedilum được chia thành 2 nhóm chính Nhóm thứ nhất gồm các loài P.haynaldianum; P.hirsutissimum và nhóm thứ 2

gồm 8 loài còn lại, trong đó có hài Hằng Cây phân loại di truyền cũng cho thấy trình

tự gen rbcL của hài Hằng có độ tương đồng cao với hài Việt (P.vietnamense), hài Hồng (P.delenatii) Điều này cho thấy vùng gen rbcL là trình tự DNA mã vạch có tiềm

năng lớn để nhận diện loài nhanh và chính xác loài hài Hằng Kết hợp giữa phân tích DNA mã vạch và đặc điểm hình thái sẽ cung cấp thông tin chính xác hơn trong định danh cũng như đánh giá đa dạng của các loài lan hài Kết quả nghiên cứu này đã đóng góp thêm vào cơ sở dữ liệu về trình tự DNA mã vạch trong nghiên cứu các loài lan hài của Việt Nam Trong sơ đồ phân loại hình cây thiết lập dựa trên trình tự gen rbcL, hài

Hằng (P hangianum) có quan hệ gần gũi với hài Việt Nam (P vietnamense) và hài Hồng (P delenatii)

Những dữ liệu về ITS (Internal Transcribed Spacer) đã được nghiên cứu trên

190 giống phong lan, bao gồm tất cả các loài và phần lớn được nghiên cứu ở

Orchidaceae, một số ở Habenariinae và một loài đơn trong hai chi Satyriinae và Disinae Gần đây, những nhà nghiên cứu thực vật đã tập trung vào các điều tra về sự

phát sinh giống loài từ cấp độ lớn nhất đến mức nhỏ nhất trong cây phân loại Nhóm

Orchidaceae là đại diện nổi bật trong nhóm nghiên cứu này và người ta có thể cho

rằng đây là họ thực vật lớn thứ 2 và là một trong những họ đa dạng nhất để tiến hành nghiên cứu

1.3 Đặc điểm sinh học lan hài

1.3.1 Đặc điểm hình thái của lan hài

Theo Trần Hợp (1990) [12], các loài lan hài (Paphiopedilum) ở Việt Nam có hình dạng bên ngoài rất đa dạng, chúng mang những đặc điểm hình thái chung sau:

- Dạng cây: Là các loài thân cỏ có kích thước trung bình với thân mang nhiều lá mọc thành hai hàng xếp thành hình quạt, đôi khi có dạng thân bò Tất cả các loài đều

có thân rễ nhưng đa số rất ngắn Thân chính là loại thân rễ nằm ngang, thông thường nằm ở dưới lớp đất, có nhiệm vụ đỡ cho các lá, từ đó các rễ phát triển theo nhiều ngang và dọc Thân thường mang trên nó một số lượng lá không đổi, sau khi đã đạt đến độ trưởng thành sẽ hình thành một chồi hoa

- Rễ: Rễ chùm, có một lớp mô xốp bọc xung quanh các rễ thật, lớp màng xốp này có vai trò trong việc giữ nước và ngăn ánh sáng mạnh Sau khi rễ trưởng thành thì

có dạng sợi mảnh với hệ floem phát triển mạnh Rễ xanh quanh năm được bao phụ bởi một lớp vỏ làm cho rễ có khả năng hấp thụ độ ẩm trong không khí Rễ lan hài cứng và dày, đường kính 2-5 mm, phân nhánh ít, dài từ 30-50 cm Đầu rễ non có màu từ hồng nhạt đến trắng ngà, rễ già màu sậm và nhiều lông hơn Rễ thường bắt đầu từ thân rễ, tức là ở phần gốc của lá trong một số loài, chúng bắt đầu từ cái trục của lá dưới thấp hơn

- Lá: Thường có dạng lá dài gấp đôi, hình trứng ngược hay bầu dục thuôn và

mở rộng Mỗi lá có đốt ở gốc, dưới đó là bẹ lá hình chữ V xếp lợp xít lên nhau trên thân Độ dài của lá có thể từ 3- 50 cm Mặt trên của lá có thể có màu xanh lá cây hoặc khảm bởi các mảng đậm nhạt không đều với các gân màu xanh lá nổi rõ Mặt dưới lá

có các đốm tím dày đặc hoặc vết tím xỉn chỉ thấy rõ ở gần gốc lá Lá của các loài điển hình cho điều kiện sống khô đều dày, mọng nước và cứng.Ở một số loài như

P.hirsutissimum, hay P.dianthum các lá có thể dài tới 50cm, nhưng ở một số loài khác

như P.helenae, cây trưởng thành đôi khi có lá không dài quá 3cm

- Cụm hoa: Thường thẳng đứng hay cong, cuống hoa nằm ngang hay chúc

xuống, P villosum phụ sinh thường có cuống hoa nằm ngang hoặc chúc xuống, nhưng ở loài P.malipoense, P.micranthum và P.appletonianum) cuống hoa thẳng đứng Phần lớn các loài chỉ có một hoa riêng lẻ Nhưng ở loài P.delenatii và

P.concolor, trong điều kiện thuận lợi lại phát triển thành cụm hoa có từ 2 hoa trở

lên Cuống hoa có thể lông tơ dầy, ngắn hoặc nhẵn Cụm hoa có hình dạng rất khác nhau tùy từng loài, từ hình múi giáo, hình trứng, chóp nhọn hoặc bầu dục tròn

- Hoa: Gồm hai lá đài ở vòng ngoài, một lá đài lưng, một lá đài hợp và ba cánh hoa ở vòng trong Lá đài lưng thường lớn, hướng thẳng lên trên và thường nổi bật với các vạch hay chấm ở mặt trong Lá đài lưng nằm đối diện với lá đài hợp ở vị trí thấp hơn và hướng xuống phía dưới Lá đài hợp nằm phía sau của cánh môi thường có một màu tối xỉn và kém nổi bật hơn so với lá đài lưng Cả hai lá đều có lông tơ dày ở mặt ngoài Hai cánh hoa bên thường hơi xoè xuống dưới theo chiều ngang Chúng có thể

có hình thìa, bầu dục, trứng rộng hay tròn Cánh hoa hình mũi giáo hẹp, xoắn ốc hẹp dần từ gốc lên đến đỉnh Cánh hoa giữa thứ ba biến dạng rõ rệt thành một môi giống như cái bao hoặc hình chiếc hài Môi dạng túi sâu và phồng lên, hình giầy, có lông

ở mặt trong và nhẵn ở mặt ngoài Nhị bất thụ của vòng ngoài và nhuỵ cái hợp thành cột nhị - nhuỵ Hai nhị đực hữu thụ của vòng trong có chỉ nhị ngắn dính liền ở phía sau núm nhuỵ và hai bên cuốn cột Bầu dưới, một ô, đỉnh noãn bên là điểm đặc trưng của chi này Hầu hết các loài lan hài, bầu có lông tơ, hình trụ, màu xanh lá cây hay đỏ tía xỉn

- Quả: Dạng quả nang, khô, dài, có một ô với ba van rộng và ba van hẹp Qủa

mở ở gần đỉnh bằng rãnh nứt Qủa thường chín trong điều kiên tự nhiên sau khi thụ phấn từ 6 đến 10 tháng

- Hạt: Có hình bầu dục, hình con suốt chỉ ngắn, dạng thuôn dài hay hẹp và thường có chiều dài từ 0,4 - 1,1 mm Phôi nhỏ, dài từ 0,3 - 0,4 mm Hạt không có nội nhũ do đó rất khó nảy mầm trong điều kiện tự nhiên Hạt lan chín rất nhẹ và dễ dàng phát tán nhờ gió do hạt không có nội nhũ, nên phải sống cộng sinh với một loài nấm

rễ Hạt chín trong vòng từ 6 đến 10 tháng sau khi được thụ phấn và phát tán qua khe

mở của quả nang chín đã chuyển thành màu nâu và khô đi Sự nảy mầm xảy ra trên đất, trên đá hay trên cây, ở chỗ tối ngay sau khi phát tán và khi cuống của phôi được nhiễm một loại nấm rễ phù hợp Mầm rễ phát triển ra các rễ giả dài cũng bị nhiễm các sợi nấm của nấm rễ Sau đó rễ thật xuất hiện ra từ phía sau của đỉnh chồi, tiếp theo các mầm rễ mọc dài ra và sinh ra các rễ con Sự sinh trưởng mới bắt đầu phát triển thường xảy ra trước khi kết thúc nở hoa Phần lớn các loài lan hài ra hoa vào đầu mùa xuân hay mùa hè Qua phân tích trên cho thấy những thông tin cơ bản về đặc điểm hình thái lan hài

đã được nghiên cứu đánh giá, nhưng trong thực tế mỗi loài lan hài khác nhau và sinh trưởng phát triển ở mỗi khu vực địa lý khác nhau đều có những đặc trưng riêng cho từng loài, do đó việc nghiên cứu đánh giá đặc điểm hình thái cho từng loài là cần thiết, làm

cơ sở cho việc đánh giá và định danh, cũng như đưa các biện pháp kỹ thuật phù hợp cho từng loài lan hài nhằm nâng cao hiệu quả trong nghiên cứu và phát triển những giống lan hài quý hiếm cho khu vực miền núi phía bắc Việt Nam

1.3.2 Đặc điểm sinh thái lan hài

Tại Việt Nam, lan hài thường phân bố ở vùng có lươṇg mưa lớn, ẩm độ cao Tuy nhiên do đặc trưng là vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nên chúng thường phải trải qua một giai đoạn khô hạn Sự xuất hiêṇ lá dày, dai và moṇg nước là hướng thích nghi tốt để cây có thể sống sót được qua đợt khô hạn định kỳ và chúng sẽ nhanh chóng phục hồi khi mùa mưa trở lại Độ ẩm xung quanh rễ, kiểu đất và đô ̣pH, sự có măṭ của các nấm rễ, tác nhân thụ phấn và cường độ ánh sáng là các nhân tố quan troṇg trong sự hình thành và phát triển của quần thể lan hài (Averyanov và cs, 2008) [1]

Nhiệt độ

Nhiệt độ là một nhân tố có tính chất quyết định đến sự phân bố, sinh trưởng, phát triển của các loài lan hài Nhiệt độ ảnh hưởng đến sự ra hoa của lan hài như loài

nếu nhiệt độ cao cây chỉ sinh trưởng dinh dưỡng Theo Powel và cs (1988) thì cây lan

hài (Paphiopedilum) sinh trưởng dinh dưỡng ở 21oC hoặc chênh lệch nhiệt độ ngày/đêm là 25oC/20oC là tốt nhất cho cây tích luỹ (Joseph và Arditti 1985) Lan hài đươc ̣ phân chia thành 2 nhóm chính, theo quy luật chung, những cây có lá màu xanh thường thích sống ở nơi có nhiêṭ đô laṇh đến trung bình, ban đêm là 13-16°C, ban ngày là 18-24°C Các loài hài có lá vằn thích hợp với điều kiện nhiệt từ trung bình đến

ấm, ban đêm là 16-18°C, ban ngày là 21-25°C

Ánh sáng

Lan hài thuộc nhóm cây sống không thể thiếu ánh sáng vì ánh sáng cung cấp năng lượng cho cây tạo lập thức ăn thông qua quá trình quang hợp, ánh sáng còn ảnh hưởng đến sự hình thành hoa và nở hoa Nếu thiếu ánh sáng cây không ra hoa, nhưng nhu cầu về ánh sáng lại khác nhau tùy thuộc vào từng loài

Nhóm ưa ánh sáng yếu: Khoảng 30 – 40%, điều kiện ánh sáng nhân tạo từ 11.000-22.000 lux (Liao và cs, 2011) [67] Koopowitz và Hasegawa (1991) đã xác định nếu lá bị vàng hoặc phát hoa ngắn là cây quá thừa ánh sáng, còn nếu lá mềm, màu xanh đậm hoặc phát hoa dài, yếu, là bởi do thiếu ánh sáng Lan hài từ rừng về không

ra hoa nguyên nhân chính là ánh sáng và nhiệt độ không phù hợp Ngoài ra, ánh sáng

có vai trò quan trọng trong sự nảy mầm của hạt giống, sự tiếp xúc với ánh sáng sẽ ức

chế sự nảy mầm và có thể dẫn dến hiện tượng ngủ của hạt gây khó khăn cho quá trình nhân giống

Độ ẩm không khí

Ẩm độ là yếu tố ảnh hưởng lớn đến toàn bộ quá trình sinh trưởng và phát triển của cây lan, đa số các loài lan thích hợp ở mức ẩm độ tương đối, tối thiểu 70% Độ ẩm quá cao có thể gây nhiễm nấm và vi khuẩn Trong điều kiện độ ẩm thấp, các chồi trưởng thành sẽ có biểu hiện vàng và khô (De, 2022) [48]

Yêu cầu về dinh dưỡng

Hầu hết các loài lan đều sống tự dưỡng, một số loài cộng sinh với nấm nên việc lấy dinh dưỡng từ môi trường ngoài khá thuận lợi, lan là loài cây không cần nhiều dinh đưỡng do đó bón phân cho lan cần bón thường xuyên với liều lượng thấp và đầy đủ các thành phần dinh dưỡng

Những thông tin về đặc điểm sinh thái lan hài chưa nhiều, trong khi đó việc đánh giá được đặc điểm sinh thái là yếu tố quan trọng, góp phần xây dựng cơ sở khoa học cho việc áp dụng các biện pháp kỹ thuật canh tác phù hợp cho lan hài sinh trưởng, phát triển tốt

1.4 Tình hình sản xuất và tiêu thụ lan hài trên thế giới và ở Việt Nam

1.4.1 Tình hình sản xuất và tiêu thụ lan hài trên thế giới

Hiện nay tình hình sản xuất hoa trên thế giới đang phát triển một cách mạnh mẽ

và đã trở thành một ngành thương mại có lợi cho nền kinh tế các nước trồng và xuất khẩu hoa Diện tích trồng hoa trên thế giới ngày được mở rộng và không ngừng tăng lên, nhiều tạp chí về hoa lan được xuất bản, nhiều cuộc hội thảo về lan đã được tổ chức Trước đây việc nuôi trồng và xuất khẩu chủ yếu là lan rừng nên nguy cơ khoảng

13 loài tuyệt chủng, ngày nay việc trồng lan dần theo quy mô công nghiệp, việc xuất khẩu lan đã đạt tới số lượng hàng trăm ngàn giò, hàng vạn cành lan trong một năm nhằm đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của thị trường

Vào những năm 1980 và đầu những năm 1990, một nhóm Paphiopedilum mới

đã được tìm thấy ở Trung Quốc và đã được thương mại bất hợp pháp

Vào năm 1998, P.rothschildianum được phát hiện tại núi Kinabalu, Sabah, Malaysia và là một trong những loài Paphiopedilum ngoạn mục nhất trong các chi đặc

điểm đặc trưng của chúng là hoa to, nhiều màu thời gian nở hoa kéo dài tới 60-90 ngày Được bán trên thị trường với giá trị cao và luôn được săn đón bởi các nhà sưu tầm (Cribb, 1998) [43]

Từ năm 1998 - 2002, các nhà xuất khẩu lan hài nhân tạo lớn nhất được ghi nhận

là Đài Loan, Indonesia và Trung Quốc Những nhà xuất khẩu này chiếm hơn một nửa tổng kim ngạch xuất khẩu quốc tế (54%) Các nước xuất khẩu lớn khác trong cùng thời kỳ là Thái Lan, Hàn Quốc, Nhật Bản, Hà Lan, Hoa Kỳ, New Zealand, và Bỉ (mỗi

nước xuất khẩu hơn 10.000 cây) Các chi quan trọng nhất của lan hài là Cypripedium,

Paphiopedilum và Phragmipedium Tất cả các chi này đều có nhu cầu thương mại

quốc tế (H Noel McGough và cs., 2006) [48]

Bên cạnh đó từ năm 1998 - 2002 các nước xuất khẩu lan hài lớn cũng đã nhập khẩu một lượng rất lớn lan hài như Nhật Bản là quốc gia nhập khẩu lan hài nhân tạo lớn nhất với hơn một nửa tổng lượng nhập khẩu (56%) Các quốc gia khác như Hàn Quốc, Canada, Hoa Kỳ, Đức, Ý và Thụy Sĩ cũng nhập khẩu hơn 10.000 cây/ năm (H Noel McGough và cs., 2006) [3]

Năm 2016 P.fairrieanum (Lindl.) Stein là một trong những loài sống trên cạn

được tìm thấy ở Bhutan, Ấn Độ và Nepal Loài được IUCN liệt kê là rất nguy cấp

trong tự nhiên (CR) do thu hái quá mức và suy thoái môi trường sống Paphiopedilum

sp là một trong những loài được thương mại hóa nhiều nhất dưới dạng cây trồng trong chậu và hoa cắt cành nhờ vẻ ngoài hấp dẫn của chúng (Zhang và cs., 2016) [98]

1.4.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ lan hài ở Việt Nam

Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm quanh năm rất thuận lợi cho việc trồng hoa, cây cảnh Tuy nhiên chưa được đầu tư thích đáng nên ngành trồng hoa nói chung và ngành trồng lan nói riêng vẫn chưa thực sự phát triển, sản xuất lan ở Việt Nam mới chỉ phát triển mạnh mẽ ở các tỉnh phía Nam, đặc biệt là

Đà Lạt và thành phố Hồ Chí Minh

Ngành sản xuất hoa lan ở các tỉnh, thành phố phía Nam phát triển mạnh hơn miền Bắc Nói chung vấn đề sản xuất – kinh doanh – xuất khẩu hoa lan ở Việt Nam từ trước đến nay vẫn còn ở mức tiềm tàng, trong khi đó sức cạnh tranh thị trường trên thế giới là rất lớn Những hoạt động, kinh doanh và xuất khẩu trong thời gian qua chỉ có ý nghĩa khởi động và hứa hẹn sự phát triển trong tương lai

Trước năm 1999 loài P.hangianum rất phong phú ở phía Bắc tỉnh Tuyên Quang

Nhưng đến năm 2000 – 2001 quần thể của loài này hầu như đã bị mất trong tự nhiên do người dân vào rừng thu hái xuất khẩu bất hợp pháp ra nước ngoài

Năm 1999 loài P.vietnamense và P.hangianum được phát hiện và mô tả ở Việt

Nam Rất nhanh sau đó cả hai đều được tìm kiếm nhiều nhất bởi vẻ đẹp lạ kỳ và chỉ

sau 3 năm cả hai loài đã bị coi là cực kỳ nguy cấp do phạm vi hẹp và mức độ khai thác lớn (H Noel McGough và cs., 2006) [73]

Tổ chức Bảo tồn Động thực vật Hoang dã Quốc Tế và Quĩ Khoa học Quốc gia Hoa Kỳ (USA, NSF), Averyanov và Phan Kế Lộc, năm 2001 đã tiến hành các cuộc điều tra dài ngày tại các tỉnh thuộc bắc Việt Nam nhằm phát hiện quần thể tự nhiên của lan hài Việt Nam cuối cùn tìm thấy với một số lượng vô cùng ít ở một khu vực rất nhỏ hẹp trên núi đá vôi thấp thuộc tỉnh Thái Nguyên Như vậy chỉ sau có 2 năm công bố phát hiện loài lan đặc hữu và vô cùng quý hiếm này đã rơi vào tình trạng nguy cấp trong môi trường tự nhiên Trong quá trình tìm hiểu người ta thấy rằng một lượng lớn hài Việt Nam (hài Bóng) được xuất khẩu cho mục đích thương mại

Năm 2004 nhà thực vật người Nga GS Liomid Averynov và cộng sự trong cuốn Lan hài Việt Nam đã đưa ra nhận xét: lan hài có giá trị thương mại cao, được sưu

tầm và tìm kiếm rất nhiều Với sự hiện hữu của hơn 20 loài thuộc chi Paphiopedilum,

Việt Nam là một trong các quốc gia có nguồn lan hài tự nhiên phong phú Không những phong phú về chủng loại, Việt Nam còn có nhiều loài lan đặc hữu có giá trị thẩm mỹ cao, được thế giới ưa chuộng Vì vậy tình trạng thu thập và xuất khẩu lan hài một cách ồ ạt, không kiểm soát dẫn đến việc lan hài ngày càng hiếm trong tự nhiên Đồng thời với tình trạng môi trường tự nhiên bị khai thác cạn kiệt như hiện nay, lan hài càng biến mất nhanh chóng [40]

Năm 2006, cuốn “Trồng Hoa Lan của tác giả Nguyễn Công Nghiệp” lại lần nữa khẳng định lan hài là một loài cây không những có giá trị thẩm mỹ, giá trị khoa học

mà còn có giá trị kinh tế rất cao Hoa lan hài có một nét đẹp kiêu sa, quyến rũ và mềm mại, mang dáng vẻ sang trọng và huyền bí Hiện nay cùng với sự phát triển của kinh tế

xã hội, đời sống con người ngày càng được nâng cao nhu cầu về thưởng thức cái đẹp càng gia tăng Nghề trồng hoa cây cảnh nói chung và đặc biệt chọn tạo giống hoa lan xuất khẩu nói riêng, đã và đang trở thành một ngành kinh tế thu nhiều lợi nhuận (Nguyễn Công Nghiệp (2006) [22]

Từ các nghiên cứu trên cho thấy, sản xuất, kinh doanh, lan hài ở Việt Nam từ trước đến nay vẫn ở dạng tiềm năng, có khả năng cạnh tranh trên thị trường quốc tế Những hoạt động kinh doanh và xuất khẩu lan hài trong thời gian qua chỉ mới có ý nghĩa khởi động, hứa hẹn một sự phát triển trong tương lai cũng như tạo thêm việc làm cho người dân trong khu vực Nâng kim ngạch xuất khẩu hoa lan ngang tầm với các quốc gia trong khu vực là khả thi

1.5 Nghiên cứu hiện trạng và các giải pháp nhằm mục đích bảo tồn lan hài trên thế giới và ở Việt Nam

Trên thế giới nhiều loài lan đang có nguy cơ tuyệt chủng, hiếm và được liệt kê trong phụ lục II của CITES, do nhiều nguyên nhân như biến đổi khí hậu, khai thác quá mức, buôn bán bất hợp pháp và lấn chiếm đất đai Hoa lan được biết đến như là cây cảnh quan trọng ở Việt Nam, đặc biệt là lan hài Các loài lan hài của Việt Nam nổi tiếng với vẻ đẹp và sự đa dạng đang có nhu cầu sử dụng làm cảnh cao trên toàn thế giới Do đó cần có các biện pháp kỹ thuật để nhân giống, bảo tồn và phát triển lan hài

có giá trị của Việt Nam

Hoa lan, có thể được duy trì trong tự nhiên (bảo tồn in situ – tại chỗ) và chuyển khỏi môi trường sống của chúng (bảo tồn ex situ) Bảo tồn in situ- chuyển chỗ là cách

tốt nhất để bảo tồn sự đa dạng di truyền các loài lan, nhưng nó rất khó khăn để duy trì

trong một thời gian dài và có nguy cơ bị mất do bị sâu bệnh, sinh học và stress phi

sinh học Ngoài ra, rất tốn kém do sử dụng lao động, giá thể nhân tạo và không gian

Để khắc phục vấn đề này, bảo tồn nguồn gen bằng nuôi cấy mô được sử dụng để lưu giữ nguồn gen lâu dài và có thể lưu giữ nhiều loài trong một không gian nhỏ và quản

lý, kiểm soát được môi trường dinh dưỡng

1.5.1 Hiện trạng và các giải pháp bảo tồn lan hài trên thế giới

Chi lan hài (Paphiopedilum) có khoảng 75 loài Tuy nhiên đây là loài mà công

tác điều tra, thu thập, bảo tồn nguồn gen lan hài trên thế giới đã được quan tâm nghiên cứu bởi nhiều tổ chức, cá nhân và chính phủ các nước Đầu tiên phải kể đến tổ chức

CITES đưa ra Công ước về buôn bán quốc tế các loài động, thực vật hoang dã nguy

cấp (CITES) là Hiệp định giữa các chính phủ, được thiết lập nhằm mục tiêu kiểm soát hoạt động buôn bán quốc tế mẫu vật của các loài động, thực vật hoang dã một cách bền vững, đảm bảo rằng hoạt động này không làm ảnh hưởng đến sự tồn vong của loài trong tự nhiên Công ước này ra đời đã góp phần giảm thiểu sự buôn bán các loài lan hài bất hợp pháp

Năm 2000 Trung Tâm Hoa lan Quốc gia Trung Quốc bảo tồn chuyển chỗ được

hỗ trợ bởi sự sinh sản thành công của P armeniacum 134 cá thể từ 8 quần thể bao

gồm sự đa dạng về kiểu hình để bảo tồn chuyển chỗ

Trung tâm nghiên cứu phong lan Quốc gia Ấn Độ cho rằng, biến đổi khí hậu hiện đang là một trong các nguyên nhân chính dẫn đến nguy cơ giảm số lượng và tuyệt

chủng của các loài lan hài quý hiếm Từ đó, tác giả cũng đưa ra một số biện pháp khắc phục: cần phục hồi và duy trì các hệ sinh thái bản địa, quản lý chặt sinh cảnh của các loài quý, hiếm, có nguy cơ tuyệt chủng, xếp hạng các mức độ dễ tổn thương của các loài

và theo dõi, nghiên cứu dài hạn các loài sinh vật giao phấn Nơi tốt nhất để bảo tồn nguồn gen thực vật và để thúc đẩy đa dạng sinh học là trong tự nhiên (Zeng và cs, 2013) [95]

Năm 2021 tác giả Wang và cs đã thành công trong việc bảo tồn loài lan hài P

armeniacum quý hiếm có nguy cơ tuyệt chủng ở Trung Quốc P armeniacum được

phân loại là cực kỳ nguy cấp (CR) trong sách đỏ của Trung Quốc và của IUCN Loài này cũng nằm trong danh mục các loài thực vật có quần thể cực nhỏ của Trung Quốc

và Phụ lục I của Công ước quốc tế các loài động thực vật hoang dã có nguy cơ tuyện chủng (CITES) [91]

1.5.2 Hiện trạng và giải pháp bảo tồn lan hài ở Việt Nam

Việt Nam nằm trong khu vực châu Á nhiệt đới - nơi phát sinh nhiều loài phong lan quý hiếm trên thế giới Việt Nam nằm trong số 25 quốc gia hàng đầu trên thế giới về đa dạng sinh học, trong đó có đa dạng các loài lan Theo đánh giá của Averyanov Việt Nam

có 158 chi và khoảng 900 loài Theo tác giả Trần Duy Quý và cs Việt Nam đã thống kê và phát hiện ở Việt Nam có 160 chi và 1004 loài lan Đây là quốc gia có nguồn tài nguyên thực vật và đặc biệt là họ lan phong phú bậc nhất trong khu vực Châu Á

Các kết quả nghiên cứu cho thấy, Việt Nam có 22 loài lan hài thuộc chi Paphiopedilum

và các dạng lai tự nhiên Giá trị lan hài ngày càng tăng, làm cho việc khai thác lan hài bất hợp tăng lên trong thời gian gần đây Theo đánh giá, một loài lan hài đã bị tuyệt chủng ở Việt Nam, một loài bị đe dọa ở mức độ cực kỳ nguy cấp, và 15 loài khác ở mức độ nguy cấp (trong đo hầu hết các loài đã rất gần với mức độ cực kỳ nguy cấp) Tất cả các loài

thuộc chi Paphiopedilum ở Việt Nam đang biến mất một cách nhanh chóng Dựa trên

các nghiên cứu thực địa gần đây, tình trạng bảo tồn các lan hài trong tự nhiên theo tiêu chuẩn các thứ hạng về mức độ đe dọa tuyệt chủng của tổ chức bảo tồn thiên nhiên Quốc Tế (IUCN) được tổng kết ở bảng 1.1

Bảng 1.1: Các nhóm lan hài Việt Nam theo thứ tự hạng bảo tồn của tổ chức bảo tồn

thiên nhiên quốc tế (IUCN)

Đã bị tuyệt chủng (EX) P.malipoense var.hiepii

Đã tuyệt chủng ngoài tự nhiên (EW) P vietnamenes

Đang có nguy cơ tuyệt chủng trầm

Đang có nguy cơ tuyệt chủng cao (EN)

P.aspersum, P.barbigerum var, P lokianum P.callosum, P.dianthum, P.emersonii,

P.hanryanum, P.x herrmannii, P.malipoense var

P.micranthum, P.purpuratum, P.tranlienianum

Sắp bị tuyệt chủng (VU)

P.appletoniaum, P.concolor, P.hirsutissmum var Chiwuawnum, P.hirsutissimum var P.esquirolai, P.villosun var annamens

Thiếu dẫn liệu (DD P x affine, P.x datalanse, P.illosum var.boxalli

(Nguồn: Averyanov và cộng sự, 2008) [1]

Theo Bộ Khoa học & Công nghệ (1996) trong Sách đỏ Việt Nam: lan hài và các loài thuộc bộ Lan là những loài thực vật bị đe dọa biến mất trước tiên khi môi trường sống tự nhiên bị suy thoái Nền kinh tế phát triển nhanh chóng dẫn đến ô nhiễm môi trường cùng với diện tích rừng nguyên sinh bị suy giảm nhanh chóng do hoạt động khai thác làm giảm đi nơi sống tự nhiên của lan hài gây ra nguy cơ tuyệt chủng nhiều loài lan hài ở Việt Nam hiện nay

Một mạng lưới rộng khắp các khu bảo tồn đã được thành lập ở Việt Nam Đặc biệt hàng loạt các khu bảo tồn đã đang bảo tồn các loài lan hài như:

Khu bảo tồn Ngọc Linh (Kon Tum), Chue Yang Sinh (Đắc Lắc), Núi Bà (Lâm

Đồng) bảo tồn loài P appletonianum (Trịnh Xuân Thành và cs) [31]

Khu bảo tồn Mom Ray (Kon tum), Thung Đa Nhim (Lâm Đồng) đang bảo tồn

loài P callosum (Trịnh Xuân Thành và cs) [31]

Vườn Quốc Gia Ba Bể, khu bảo tồn Cát Bà (Hải Phòng), Hữu Liên (Lạng Sơn),

Pà Cò (Hòa Bình), khu bảo tồn Thượng Đa Nhim (Lâm Đồng) đang bảo tồn

P.dalatensis (Trịnh Xuân Thành và cs) [31]

Vườn Quốc Gia Hoàng Liên Sơn (Lào Cai), Phong Quang (Hà Giang), Pà Cò (Hòa

Bình) đang bảo tồn loài P.dianthum, P.micranthum (Trịnh Xuân Thành và cs) [31]

Khu bảo tồn Na Hang (Tuyên Quang) đang bảo tồn loài P.emersoii,

P.hangianum, P.malipoense vari jackii (Trịnh Xuân Thành và cs) [31]

Vườn quốc gia Tam Đảo, Hoàng Liên Sơn đang bảo tồn loài P.gratrixianum

Trạm đa dạng sinh học Mê Linh, thuộc Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật với chức năng bảo tồn và phát triển rất nhiều loài động, thực vật quý hiếm Vườn lan của Trạm được xây dựng từ năm 2005 để lưu giữ và bảo tồn các loài lan của Việt Nam Vườn lan tại Trạm hiện có hàng trăm cá thể của nhiều loài lan khác nhau từ khắp các vùng

miền của Việt Nam Trong đó có bảo vệ các loài lan hài trong tình trạng: VU

A1c,d+A2d (SĐVN, 2007); IA (NĐ 32/2006) Như: (Tiên hài, hài lông, hài vân nam, hài xanh, hài malipô) (Trịnh Xuân Thành và cs) [31]

Khu BTTN Kim Hỷ, tỉnh Bắc Kạn (năm 2010) đã bảo tồn thành loài lan hài trong tình trạng EN A1a,c,d+2d (SĐVN, 2007); IA (NĐ 32/2006) (hài Điểm Ngọc (Trịnh Xuân Thành và cs) [31]

Khoa Nông Lâm Trường Đại học Đà Lạt đã nhân giống thành công nhiều loài

rất quý được nước ngoài đặt mua với số lượng lớn như Kim hài, Vân hài, lan P

concolor,

- Viện Sinh học Tây Nguyên công bố tháng 10/2008 thực hiện đề tài “Nghiên cứu chọn lọc và phát triển một số loài lan rừng có triển vọng phục vụ cho công tác nhân giống, lai tạo và bảo tồn nguồn gien đặc hữu, quý hiếm của Lâm Đồng” đã xác định và bảo tồn được 73 loài lan rừng có hoa to, lâu tàn, màu sắc đẹp, có giá trị kinh tế trong đó có hài Vân, hài Đà Lạt

- Trần Duy Quý và nhóm nghiên cứu Viện Khoa học nông nghiệp Việt Nam công bố năm 2009 thực hiện đề tài: “Thu thập đánh giá nguồn gen hoa lan Việt Nam

và lưu giữ chúng ở 2 vùng: miền núi phía Bắc và đồng bằng Bắc bộ” đã điều tra, thu thập, định danh và lưu giữ nguồn gen cho nhiều loài lan rừng thuộc 10 chi khác nhau (hài vệ nữ, Hồ điệp, lan Kiếm, Hoàng thảo, Quế lan hương, Vanđa, Catlan, Phượng vĩ, Hạc đính và Đai châu) và lưu giữ chúng ở 2 nơi: Vùng núi Tam đảo và vùng đồng bằng Hà nội với quy mô 2.000 dò (chậu)/ 1.500m2 vườn nuôi trồng

Phạm Anh Tám và nhóm nghiên cứu Ban quản lý Khu bảo tồn thiên nhiên Xuân Liên đã thực hiện nghiên cứu “Nghiên cứu bảo tồn, khai thác và phát triển

nguồn gen lan hài Vân Bắc (P.callosum (Rchb.f.) Pfitzer), lan hài lông (P.hirsutissimum (Lindl.ex Hook.) Stein.) và lan Thủy Tiên hường (Dendrobium

amabile O’Brien.) cho vùng Bắc Trung bộ” Kết quả đã bảo tồn thành công hài Vân

Bắc và hài Lông bằng phương pháp in vitro và phương pháp tách mầm từ thân mẹ

Mặc dù chính phủ Việt Nam ra nhiều chiến lược biện pháp như thành lập các mạng lưới bảo tồn các loài lan hài, nghiêm cấm khai thác và buôn bán lan hài nhưng hầu hết các loài lan hài của Việt Nam vẫn đang trong tình trạng nguy cấp và tuyệt

chủng ngoài tự nhiên như: hài Việt (P.vietnamense), hài mốc vàng (P.armeniacum), hài Mốc hồng (P.micranthum), hài Điểm Ngọc (P emersonii) (The IUCN, 2019 và

Phụ lục 1 của công ước CITES và Danh mục Thực vật rừng, Động vật rừng nguy cấp, quý hiếm (nhóm1) Nghị định số 06/2019/NĐ-CP, Nghị định của Chính phủ, ngày 22/01/2019) [91] Do đó việc bảo tồn các loài lan hài Việt Nam cần phải đồng bộ và thực hiện nhanh biện pháp nhân giống khẩn cấp đối với các loài lan hài có giá trị, loài đặc hữu của Việt Nam như hài Việt Nam (hài Bóng), hài Điểm Ngọc (hài Hương Lan)

1.5.3 Nghiên cứu về khả năng nhân giống lan hài trên thế giới và ở Việt Nam

1.5.3.1 Nghiên cứu nhân giống lan hài trên thế giới

Việc nhân giống lan hài cũng được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu từ rất sớm Cây lan hài được trồng từ nguồn giống được nhân theo các phương pháp nhân

giống như tách chồi, gieo hạt bằng phương pháp in vitro

Koopowitz và Hasegawa (1991) [64] đã xác định điều kiện ánh sáng nhân tạo cho hầu hết các loài lan hài là từ 11.000 - 22.000 lux Nếu lá bị vàng hoặc phát hoa ngắn là cây quá thừa ánh sáng, còn nếu lá mềm, màu xanh đậm hoặc phát hoa dài, yếu,

là bởi do thiếu ánh sáng Cây từ rừng về không ra hoa nguyên nhân chính là ánh sáng

và nhiệt độ không phù hợp Ngoài ra, ánh sáng có vai trò quan trọng trong sự nảy mầm của hạt giống, sự tiếp xúc với ánh sáng sẽ ức chế sự nảy mầm và có thể dẫn đến hiện tượng ngủ của hạt gây khó khăn cho quá trình nhân giống

Trong chương trình cải tiến giống của chi lan Hài (Paphiopedilum) ở đại học

Hawaii, Kamemoto (2000) đã nhận thấy phương pháp nuôi cấy vô trùng trong nhân giống lan hài khó thực hiện thành công vì mẫu nuôi cấy của loài này rất khó bảo quản Nhiều thử nghiệm về mẫu cấy như chồi đỉnh, chồi lấy từ cây con nẩy mầm trong ống nghiệm hoặc môi trường nuôi cấy mô sẹo từ protocorm, tái sinh lan hài thông qua sự hình thành chồi từ nuôi cấy lá… đã được thực hiện nhưng tỉ lệ hình thành mô sẹo và khả năng tái sinh còn rất thấp

Ở Ấn Độ Chyuam-Yih Ng và Norihan Mohd (2011), đã nghiên cứu nhân giống

Paphiopedilum trong in vitro thông qua phương pháp hình thành các thể protocorm

thứ cấp từ thể protocorm sơ cấp được phát triển từ callus có nguồn gốc từ thân Các thể protocorm được nuôi cấy trên môi trường ½ MS có bổ sung các nồng độ BA và

Kinetin khác nhau (1.0, 2.0, 3.0, và 4.0 μM) để cảm ứng các PLB thứ cấp Số lượng PLB thứ cấp được hình thành nhiều nhất trên môi trường ½ MS có bổ sung 4.0 μM Kinetin, trung bình có 4.1 PLB được hình thành trên mỗi mẫu sau 8 tuần nuôi cấy Các PLB thứ cấp được nhân lên từ 9,5-12,1 PLBs mới Mỗi PLB thứ cấp sau khi được cấy chuyển trên môi trường ½ MS không có chất điều hòa sinh trưởng và được bổ sung

60 g/l dịch chiết chuối Các PLB thành thục này sẽ được nuôi cấy trên môi trường có chứa các chất hữu cơ khác nhau như nước dừa, dịch chiết chuối, khoai tây, cà chua để tái sinh hình thành cây con Trong số các chất hữu cơ được thử nghiệm, việc bổ sung 20% CW trên môi trường ½ MS có kết quả tỷ lệ tái sinh trung bình là 67,9% PLBs, sau 8 tuần nuôi cấy

Vu Quoc Luan và cs, 2019, đã nghiên cứu quy trình vi nhân giống ba loài

Pa-phiopedilum nguy cấp (P.callosum, P.gratrixianum, và P.delenatii) bằng cách loại bỏ

đỉnh chồi và phương pháp gây vết thương được trình bày trong nghiên cứu này Kết

quả cho thấy khả năng tái sinh chồi của P.callosum, P gratrixianum và P delenatii có

tần suất cao (lần lượt là 5,61; 5,48; và 6,00 chồi/mẫu vật) khi đỉnh chồi bị chặt đầu được nuôi cấy trên môi trường Schenk và Hildebrandt (SH) lỏng được bổ sung thidi-

azuron (TDZ, 0,4–0,6 mg L−1) Đa chồi cũng được tạo chồi in vitro bằng phương

pháp tạo vết thương, khi nuôi cấy trên môi trường chứa TDZ (0,4–0,6 mg L−1) lần lượt là 4,48; 5,37; và 5,31 chồi/mẫu tương ứng ở mỗi loài chồi non tái sinh bằng cả phương pháp chặt ngọn và tạo vết thương đều phát triển tốt thành cây con trên SH môi trường bổ sung 1,0 mg/L Naphthaleneacetic acid (α - NAA) sau 90 ngày nuôi cấy cây

trồng chất lượng cao của P.callosum, P.gratrixianum và P.delenatii được quan sát thấy

khi cây con được chuyển lên giá thể than bùn với tỷ lệ sống 100% sau 24 tháng trong nhà kính

Ren, 2020 nghiên cứu nhân giống lan hài thông qua thụ phấn nhân tạo các cá thể ở đó ra hoa bình thường và đậu quả sau khi thụ phấn nhân tạo Kỹ thuật nuôi cấy

mô rất thành công trong việc tạo điều kiện cho hạt P.armeniacum nảy mầm và phát triển thành cây con Tổng cộng, 500 cây giống P.armeniacum đã được tạo ra tại Trung

tâm lan, điều này đã làm giảm bớt áp lực đối với việc khai thác tự nhiên Trung tâm Hoa lan cũng đã phát triển các quy trình canh tác thương mại hóa để thúc đẩy bảo tồn loài và sử dụng bền vững (Ren 2020) [85]

Paphiopedilum thường ưa đất mùn nhẹ, tơi xốp và các kẽ nứt, kẽ hở thoát nước

tốt Giá thể nên bao gồm vỏ dừa, đất sét đã sử dụng, than củi, than bùn hoặc rêu Sphagnum, đá trân châu, vermiculite, v.v Dừa Ở những vùng khí hậu ấm hơn, rêu

Sphagnum được sử dụng rộng rãi trong các thùng chứa đất sét cho phép hỗn hợp khô

đi mà không làm rễ bị bão hòa Than có thể được sử dụng như một chất phụ gia nhưng

nó thu hút lượng muối dư thừa có hại cho rễ mới mọc Hỗn hợp giá thể được sử dụng rộng rãi nhất chứa một phần bằng nhau than bùn và đá trân châu loại thô trộn với ba phần vỏ cây cỡ trung bình Một lượng nhỏ vôi đôlômit cũng được khuyến nghị làm

chất phụ gia trên phân trộn Paphiopedilums biểu sinh cũng được gắn trên phiến

dương xỉ hoặc bè bần (De, 2022) [48]

1.5.3.2 Nghiên cứu khả năng nhân giống lan hài ở Việt Nam

* Nghiên cứu nhân giống in vitro lan hài

Ngoài phương pháp gieo hạt trong tự nhiên, chi lan Paphiopedilum thường

được nhân giống qua sự phân chia chồi nách từ cây mẹ Năm 2006, Xuyến Như đã nghiên cứu tách mầm lan hài hằng, kết quả đã tạo ra những cây con có khả năng sinh

trưởng và phát triển tốt Lan hài P.concolor là loài đơn thân nên chỉ có thể tách chồi

non ra khỏi cây mẹ,̣ trồng vào chính giữa châụ mới Cần côṭ chăṭ cây vào châụ bằng môṭ cây sau đó phun môṭ dung dic̣h NAA 0,1 ppm và vitamin B1 và treo cây vào nơi thoáng mát Sau khi cây bén rễ thì bổ sung thêm chất trồng vào châụ sau đó đăṭ cây vào nơi có điều kiêṇ ánh sáng thích hơp ̣ cho sự phát triển lâu dài của cây

Nhut D.T và cộng sự (2005, 2007), đã nhân giống được loài hài đỏ - một loài

lan đặc hữu của Việt Nam (P delenatii) bằng kỹ thuật gây vết thương cơ giới, nuôi

cấy lỏng và kéo dài đốt thân có chứa mắt để tái sinh chồi từ việc sử dụng các hạt lan sáu tháng tuổi được nuôi cấy trên môi trường Knudson C kết hợp với việc gây vết thương và nuôi cấy trên môi trường lỏng đã thu được 5,2 chồi/mẫu ban đầu khi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 1,0mg/l TDZ Còn các cây sau khi được kéo dài đoạn thân bằng cách sử dụng ánh sang trắng của đèn huỳnh quang và ánh sáng đỏ của đèn LED, được cắt thành từng đốt rồi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung các chất diều tiết sinh trưởng khác nhau [75,76]

Nhut D.T và cộng sự (2007), đã nhân giống được loài lan hài Đỏ - một loài lan

đặc hữu của Việt Nam (P.delenatii) bằng kỹ thuật gây vết thương cơ giới, nuôi cấy

lỏng và kéo dài đốt thân có chứa mắt để tái sinh chồi từ việc sử dụng các hạt lan sáu tháng tuổi được nuôi cấy trên môi trường Knudson C kết hợp với việc gây vết thương

và nuôi cấy trên môi trường lỏng đã thu được 5,2 chồi/mẫu ban đầu khi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 1,0mg/l TDZ Còn các cây sau khi được kéo dài đoạn thân bằng cách sử dụng ánh sang trắng của đèn huỳnh quang và ánh sáng đỏ của đèn LED, được cắt thành từng đốt rồi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung các chất diều tiết

sinh trưởng khác nhau Kết quả cho thấy tỷ lệ tạo chồi cao nhất (75%) khi môi trường

có bổ xung 2,0mg/l BA, còn trên môi trường có bổ sung 1,5mg Zeatin hoặc 1,5mg/l TDZ thì cho chất lượng chồi tốt nhất [45,46]

Hoàng Thị Giang và cộng sự (2010) đã nghiên cứu nhân giống in vitro giống hài Hằng (P.hangganumperner gurss) từ nguồn nguyên liệu ban đầu là hạt lấy từ quả 6 - 10

tháng tuổi Môi trường nuôi cấy là RE cho tỷ lệ hạt nảy mầm cao nhất (58 - 67%) Môi trường nhân nhanh là môi trường RE có bổ sung 150ml/l nước dừa và 100mg/l chuối cho

hệ số nhân cao nhất đạt 4,3 lần và cùng trên nền môi trường RE có bổ sung 0,4 – 0,6 mg/l NAA cho khả năng ra rễ tốt nhất [10]

Viện Sinh học Nông Nghiệp – Học Viện Nông nghiệp Việt Nam đã nghiên cứu

quy trình nhân giống 2 loài lan hài là P.sp.laichau A2, P.hangianum Kết quả nghiên

cứu đã tìm ra môi trường thích hợp nhất để gieo hạt giống là môi trường RE, môi trường thích hợp để tạo chồi protocorm và nhân nhanh là RE + 100g/l dịch chiết chuối +150ml/l nước dừa Môi trường ra rễ cho hài hằng là RE + 100g/l dịch chiết chuối + 0,4ppm α-NAA, cho giống P.sp.laichau A2 và P.sp.720 là RE + 100g/l dịch chiết chuối + 0,6ppm α-NAA Ở giai đoạn vườn ươm, giá thể thích hợp là dớn cho tỷ lệ sống cao, cây sinh trưởng tốt (hài Hằng là 80%, P.sp.720 là 86.,67%) Phân bón thích hợp ở giai đoạn cây con là NPK (30:10:10) với lượng bón là 1g/l và phun 2 lần/tuần [Hoàng Thị Giang và cs (2010) [10]

Long và cộng sự, (2010) nghiên cứu các môi trường nuôi cấy cho lan bao gồm những viên gạch vỡ, đá núi lửa, rong rêu, than bùn, đá Zhijing (có tính chất giữ nước tốt hơn đá bình thường), vỏ cây và các môi trường hỗn hợp khác Trong môi trường

nhà kính có độ ẩm không khí cao, khoảng 60% cây con P villosum var

densissi-mum sống sót trên nền giá thể than bùn với rêu (Long và cs, 2010) [69]

Vũ Quốc Luận và cộng sự, (2014) nghiên cứu hài Hồng cho thấy các chồi non hài Hồng có 4 lá được cấy vào môi trường SH có bổ sung 0,5 mg/l BA, 0,5 mg/l NAA,

30 g/l đường sucrose, 9,0 g/l agar, 1 g/l than hoạt tính và được nuôi trong điều kiện che tối hoàn toàn trong 4 tháng nhằm kéo dài các đốt thân, sau đó được đưa ra điều kiện chiếu sáng thêm 2 tháng để lá tổng hợp diệp lục tố và các năng lượng cần thiết cho cây Kết quả cho thấy, các chồi non được kéo dài trung bình 10.5 cm, với số lá mới hình thành trung bình 5 lá/chồi, tương ứng với 5 đốt/chồi thu được sau 120 ngày nuôi trong điều kiện tối Sau đó, các chồi được đưa sang điều kiện chiếu sáng 60 ngày, các chồi non tiếp tục hình thành lá mới, tuy nhiên không nhận thấy có sự phân đốt Sau

180 ngày nuôi cấy, các chồi được cắt thành 5 đốt riêng biệt với 1 lá và 1 rễ, riêng phần