Tiểu luận phương pháp pcr và ứng dụng

Việc sửdụng kỹ thuật PCR trong lĩnh vực AND tái tổ hợp đã tạo ra một bước tiến mangtính cách mạng đối với di truyền học phân tử nói riêng cũng như với sinh học phântử nói chung, nhờ việc

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HA NỘI

KHOA SINH HỌC



BÀI TIỂU LUẬN PHƯƠNG PHÁP PCR VÀ ỨNG DỤNG

Chuyên ngành: Lý luận và phương pháp dạy học Sinh học

Người hướng dẫn: GS.TS Nguyễn Thành Đạt

Tiểu luận môn học

MỞ ĐẦU 1

1 SỰ RA ĐỜI CỦA PHƯƠNG PHÁP PCR 3

1.1 Khái niệm 3

1.2 Lịch sử của phương pháp PCR 3

1.3 Hai bước tiến quan trọng đã đưa PCR đến cuộc đại cách mạng sinh học phân tử 5

1.3.1 Sự phát hiện ra các men polymerase chịu nhiệt độ 5

1.3.2 Máy chu kỳ nhiệt 5

2 PHƯƠNG PHÁP PCR VÀ ỨNG DỤNG CỦA NÓ 7

2.1 Sự khác nhau giữa tái bản DNA trong tế bào và trong invitro 7

2.2 Nguyên tắc và các giai đoạn của phương pháp PCR 7

2.3 Phân tích sản phẩm PCR bằng điện di gel agarose 11

2.4 Các chỉ tiêu ảnh hưởng đến phản ứng PCR 12

2.4.1 DNA khuôn 13

2.4.2 Mồi và nhiệt độ lai 13

2.4.3 Enzyme 14

2.4.4 Một số yếu tố khác 15

2.5 Các ưu điểm và hạn chế của kỹ thuật PCR 16

2.5.1 Ưu điểm 16

2.5.2 Hạn chế 16

2.6 Một số ứng dụng của phương pháp PCR 17

2.6.1 Trong khoa học công nghệ 17

2.6.2 Trong đời sống xã hội 19

KẾT LUẬN 24

TÀI LIỆU THAM KHẢO 25

Tiểu luận môn học

MỞ ĐẦU

Phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction – PCR) do KaryMullis phát hiện ra năm 1985 Đây là phương pháp invitro để nhân bản nhanh mộtđoạn AND nào đó, có độ nhạy rất cao mà chỉ cần một khối lượng mẫu ban đầu hạnchế Bản thân kỹ thuật này chỉ là sự mở rộng trực tiếp các tính chất của quá trình táibản AND Nhưng nó đã được sử dụng theo nhiều cách khác nhau để làm cho việctách dòng và thao tác với AND dễ dàng và hiệu quả hơn

PCR là kỹ thuật cơ bản và rất quan trọng trong Sinh học phân tử Việc sửdụng kỹ thuật PCR trong lĩnh vực AND tái tổ hợp đã tạo ra một bước tiến mangtính cách mạng đối với di truyền học phân tử nói riêng cũng như với sinh học phân

tử nói chung, nhờ việc cho phép phân lập, xác định các gene và đi sâu nghiên cứuchức năng cũng như biểu hiện của gen trong quá trình phát triển, hoặc phản ứng củagen đối với các điều kiện môi trường Nó cho phép ta tiến hành những nghiên cứu

mà trước đây không có khả năng thực hiện Kỹ thuật này đã được ứng dụng trongnhiều lĩnh vực của sinh học phân tử, chẩn đoán các bệnh di truyền ở người, ditruyền quần thể, phân tích pháp y, …

Việc triển khai các ứng dụng của sinh học phân tử thường vấp phải trở ngại

về số lượng vật chất di truyền cần có Các phương pháp tạo dòng invitro đã biết tuygiải quyết được vấn đề về số lượng nhưng lại đòi hỏi thao tác phức tạp và thời giandài Sự ra đời của nhiều phương pháp khuếch đại invitro có chọn lọc, trong số đónổi tiếng nhất phải kể đến phương pháp PCR đã đảo lộn nguyên tắc của việc tạodòng cổ điển, mở ra những triển vọng ứng dụng to lớn

Chính vì vậy tôi đã quyết định nghiên cứu đề tài “Phương pháp PCR và ứng dụng”.

Đề tài được nghiên cứu nhằm mục đích tìm hiểu rõ hơn về các nguyên tắc,chỉ tiêu ảnh hưởng, ứng dụng và hạn chế của phương pháp PCR Từ đó có nhữngkiến thức cơ bản phục vụ cho việc nghiên cứu đề tài của luận văn cũng như việctiến hành các thí nghiệm trong phòng thí nghiệm sau này

Để đạt được điều đó, đề tài đã sử dụng các phương pháp nghiên cứu nhưphương pháp thu thập, xử lý thông tin, phương pháp phân tích, tổng hợp, hệ thốnghóa thông tin…

Ngoài phần Mở đầu, Kết luận, bài tiểu luận bao gồm những nội dung sau:

Tiểu luận môn học

1 Sự phát hiện ra phương pháp PCR.

2 Phương pháp PCR và ứng dụng

Tiểu luận môn học

1 SỰ RA ĐỜI CỦA PHƯƠNG PHÁP PCR 1.1 Khái niệm

PCRlà chữ viết tắt của cụm từ Polymerase Chain Reaction, được gọi là

“phản ứng chuỗi trùng hợp” hay “phản ứng khuếch đại gen” PCR là một kỹ thuậtphổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuếch đại (tạo ra nhiều bản sao) một đoạnDNA mà không cần sử dụng các sinh vật sống nhưE colihaynấm men [7]

Một đoạn DNA bất kỳ có thể được nhân lên nhanh chóng hàng tỷ lần màkhông cần đưa vào tế bào vi khuẩn [3] Điều đó xảy ra trong phản ứng tổng hợpinvitro sử dụng DNA polymerase và các oligonucleotide (các mồi – primers) Đóchính là kết quả tuyệt vời của phản ứng PCR Nhờ phản ứng này, một đoạn DNA ởmột vùng bất kỳ trong genome được khuếch đại lên rất nhiều lần khi trình tựnucleotide ở hai đầu đoạn mạch DNA đó đã biết Dựa vào trình tự đó, các cặpoligonucleotide được tổng hợp nhân tạo, mồi oligo tạo liên kết với từng sợi đơn.Chúng được sử dụng làm mồi để tổng hợp DNA invitro nhờ enzyme DNApolymerase Đặc biệt phản ứng PCR chỉ đòi hỏi một lượng DNA ban đầu làmkhuôn rất nhỏ (cỡ 10-3μg) [3]

Như vậy, PCR là phương pháp invitro để tổng hợp và khuếch đại một đoạnDNA đặc thù nhờ công hiệu của hai mồi oligonucleotide gắn vào hai sợi đôi củađoạn DNA đích với sự tham gia của DNA polymerase

1.2 Lịch sử của phương pháp PCR

Vào năm 1985, trong một đêm trăng sáng ở

tiểu bang California, trên đường lái xe dọc theo bờ

biển, một ý tưởng chợt xuất hiện trong đầu của một

nhà sinh hóa học rất bình thường, làm việc cũng tại

một phòng thí nghiệm rất bình thường Ý tưởng này

khi trở thành hiện thực, chính là thử nghiệm PCR, đã

làm một cuộc đại cách mạng trong sinh học phân tử

và đã đưa tác giả của nó, K.B Mullis, đến giải Nobel

năm khi ông đưa ra ý tưởng Ý kiến của Mullis là phát triển một quy trình mà DNA

có thể nhân lên nhiều lần một cách nhân tạo qua nhiều chu kỳ sao chépbởi enzyme DNA polymerase [7]

DNA polymerase có tự nhiên trong sinh vật sống, nơi mà nó thực hiện chứcnăng nhân DNA khi tế bào phân chia Nó làm việc bằng cách nối với sợi DNA vàtạo sợi bổ sung Theo quy trình PCR gốc của Mullis, enzyme phản ứng nhân bảnDNA được thực hiện trong ống nghiệm (invitro) Sợi DNA đôi bị tách thành 2 sợiđơn khi đun nóng ở 96 °C Tuy nhiên, ở nhiệt độ này DNA polymerase bị phá hủy

vì vậy cần bổ sung enzyme sau mỗi giai đoạn nung nóng của mỗi chu kỳ Quy trìnhPCR gốc của Mullis không có hiệu quả cao vì nó mất nhiều thời gian, cần mộtlượng lớn DNA polymerase, và phải liên tục lưu ý suốt trong quá trình PCR

Sau đó, quy trình gốc này được phát triển bằng cách dùng DNA-Polymeraselấy từ vi khuẩn thermophilic (ưa nhiệt) sống trong mạch nước phun ở nhiệt độ trên

110 °C DNA polymerase từ sinh vật này là thermostable (ổn định ở nhiệt độ cao)

và khi dùng trong PCR nó không bị phá vỡ khi hỗn hợp được nung nóng để tách sợiDNA [7] Từ đó, không cần phải thêm DNA-polymerase vào mỗi chu kỳ, quá trìnhsao chép DNA có thể đơn giản và tự động hơn

Một trong những DNA-polymerase chịu nhiệt đầu tiên được phân lập được

từ Thermus aquaticus và được gọi là Taq Taq polymerase được dùng rộng rãi trongthực nghiệm PCR (5/2004) Nhược điểm của Taq là thỉnh thoảng nó nhầm lẫn trongquá trình sao chép DNA, dẫn đến đột biến trong chuỗi DNA, vì nó thiếu tính sửa saiexonuclease 3’-5’ Các polymerase như Pwo hay Pfu, được phân lập từ Archaea có

cơ chế sửa sai (cơ chế kiểm tra lỗi sai) và có thể làm giảm một cách đáng kể số độtbiến xảy ra trong chuỗi DNA được sao chép Ngày nay, sự kết hợp giữa Taq và Pfu

có thể cung cấp cả độ tin cậy cao lẫn sự nhân bản chính xác của DNA

PCR được dùng để khuếch đại một đoạn DNA ngắn, đã xác định được mộtphần Đó có thể là một gen đơn Trái với sinh vật sống, quy trình PCR có thể copymột mảnh DNA ngắn, có thể lên đến 10kb (kb = kilo cặp base = 1000 cặp base).Một vài phương pháp có thể copy một mảnh kích thước lên đến 40kb, ít hơn nhiều

so với nhiễm sắc thể DNA trong tế bào Eukaryote (ví dụ như tế bào người chứa hơn

3 tỷ cặp base) [6].

Tiểu luận môn học

1.3 Hai bước tiến quan trọng đã đưa PCR đến cuộc đại cách mạng sinh học phân tử

1.3.1 Sự phát hiện ra các men polymerase chịu nhiệt độ

Chính việc phát hiện được các men polymerase chịu nhiệt là bước tiến đầutiên đã làm thử nghiệm PCR trở nên đơn giản hơn Nhờ sự sử dụng các menpolymerase chịu nhiệt mà giai đoạn bắt cặp của đoạn mồi vào nucleic acid đíchđược đặc hiệu hơn vì được thực hiện ở nhiệt độ cao hơn, do đó phản ứng PCR trởnên đặc hiệu hơn Cho đến nay đã có hàng chục loại polymerase chịu nhiệt đã đượcphát hiện và tổng hợp ra Có những men polymerase trích từ các vi khuẩn chịu nhiệtnhư Thermus aquaticus (Taq polymerase), Thermus thermophilus (rTth), Thermuslithoralis (Vent), Pyrococcus furiosus (Pfu) Có những men polymerase chịu nhiệtđược tổng hợp từ các vi khuẩn không chịu nhiệt nhưng mang gen tái tổ hợp từ các

vi khuẩn chịu nhiệt như Ampli Taq, Vaent (exo) Có những men polymerase chịunhiệt có hoạt tính sửa sai (proofreading) khi tổng hợp chuỗi nucleic acid bổ sung(3’-5’ exonuclease) như Ultima, Vent, Deep Vent, Pfu Nhờ vậy mà người dùng córất nhiều chọn lựa để sử dụng cho đúng mục đích của mình

Thermus aquaticus Pyrococcus furiosus

1.3.2 Máy chu kỳ nhiệt

Trước đây khi chưa có máy chu kỳ nhiệt, thử nghiệm PCR được thực hiệnbằng cách liên tục chuyển các ống nghiệm phản ứng PCR vào các máy cách thủy cónhiệt độ khác nhau để tạo ra được các chu kỳ nhiệt cho phản ứng Sau đó công việc

Tiểu luận môn học

bằng tay nhàm chán va nặng nhọc này được thay thế bằng các robot tương đối cồngkềnh và đắt tiền Ngày nay, thử nghiệm PCR

được thực hiện trong các buồng ủ PCR của

máy chu kỳ nhiệt, còn gọi là máy luân nhiệt

Một cách tổng quát, máy luân nhiệt bao gồm

các bộ phận chính như sau:

+ Một bàn phím đơn giản để lập các chương

trình chu kỳ nhiệt và ra các mệnh lệnh để máy

thực hiện

+ Một bộ vi xử lý để ghi nhớ các chương trình

đã nạp vào máy, thực hiện các mệnh lệnh đến

buồng ủ PCR, cũng như ghi nhận cách thay đổi nhiệt độ buồng ủ PCR trong các chu

kỳ nhiệt để điều chỉnh cho đúng với chương trình đang được thực hiện

+ Buồng ủ PCR là nơi mà các chu kỳ nhiệt được thực hiện qua sự điều khiển của bộ

vi xử lý Trong các chu kỳ nhiệt, nhiệt độ trong buồng ủ PCR có thể đưa lên cao hay

hạ xuống thấp trong một thời gian rất ngắn Để làm thay đổi được nhiệt độ trongbuồng ủ, có hai phương pháp:

(1) Liên tục thổi lên buồng ủ những luồng khí nóng sinh ra từ một đèn phátnhiệt, hay luồng khí lạnh sinh ra từ một dàn lạnh của máy làm lạnh Với phươngpháp này, máy luân nhiệt hãy còn tương đối cồng kềnh, khá đắt tiền và khi máyhoạt động âm thanh cũng khá ồn ào

(2) Phương pháp thứ hai hoạt động dựa theo hiệu quả Peltier ngược Hiệuquả Peltier là nguyên tắc của các máy đo nhiệt độ điện tử

Tiểu luận môn học

2 PHƯƠNG PHÁP PCR VÀ ỨNG DỤNG CỦA NÓ 2.1 Sự khác nhau giữa tái bản DNA trong tế bào và trong invitro

Trong tế bào, DNA được tái bản dựa theo nguyên tắc bảo tồn, tức là mỗiphân tử con được hình thành từ một mạch cũ và một mạch mới, ở mạch ra chậm5’→3’ theo nguyên tắc nửa gián đoạn là hình thành các đoạn okazaki, và theonguyên tắc bổ sung A-T, G-C Qúa trình nhân đôi mở đầu nhờ enzyme tháo xoắn

Sự tái bản bắt đầu bằng sự tổng hợp mồi RNA Qúa trình tái bản DNA trong tế bàodiễn ra trong điều kiện nhiệt độ thường, mang tính chất chính xác rất cao

Còn tái bản DNA trong invitro lại diễn ra

như sau: Phải đun nóng DNA khuôn đến gần

1000C và phải dùng DNA-polymerase ưa nhiệt

(chịu nhiệt) để tác động đến mạch 5’→3’ ở

32-800C, tốc độ 150Nu/s Hơn nữa cần có đoạn

mồi ngắn chặn hai đầu của đoạn nhân lên, cả

hai mạch đều có thể dùng làm khuôn nếu đoạn

mồi được cung cấp cho cả hai mạch Sau n phản

ứng, về lý thuyết sẽ được 2n bản sao DNA nằm

giữa hai đoạn mồi Tái bản xáy ra kém chính

xác hơn trong tế bào, sai sót khoảng 10-4 do Taq

polymerase

2.2 Nguyên tắc và các giai đoạn của phương pháp PCR

Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từmạch khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt Mồi là những đoạnDNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và DNApolymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới Phương pháp PCR đã đượchình thành dựa vào đặc tính đó của các DNA polymerase Thật vậy, nú ta cung cấphai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA, ta sẽ chỉtổng hợp đoạn DNA nằm giữa hai mồi Điều đó có nghĩa là để khuếch đại một trình

tự DNA xác định, ta phải có thông tin tối thiểu về trình tự đó đủ để tạo các mồi bổsung chuyên biệt; các mồi này gồm một mồi xuôi (sens primer) và một mồi ngược(antisens primer) Từ “xuôi” và “ngược” phải hiểu là so với chiều phiên mã của gen

Tiểu luận môn học

Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ (cycle) nối tiếp nhau, mỗi chu kỳgồm ba giai đoạn:

(1) Giai đoạn biến tính (denaturation): Nhiệt độ tăng lên 94-96°C để tách hai sợi

DNA ra Bước này gọi là biến tính, nó phá vỡ cầu nối hydrogen nối 2 sợi DNA.Trước chu kỳ 1, DNA thường được biến tính đến thời gian mở chuỗi để đảm bảomẫu DNA và mồi được phân tách hoàn toàn và chỉ còn dạng sợi đơn Thời gian: 1-2

phút [7].

Một số chú ý trong giai đoạn này:

+ Việc tăng nhiệt độ hoặc kéo dài thời gian biến tính có thẻ làm tăng tính đặc hiệucủa PCR nhưng làm giảm tuổi thọ của enzyme DNA polymerase

+ Đối với những enzyme DNA polymerase bền nhiệt thường nên sử dụng nhiệt độbiến tính 95-980C Bao gồm bước biến tính dài lúc khởi đầu và một bước biến tínhngắn trước từng chu kỳ nhiệt

+ Đối với các genome lớn như thực vật thường sử dụng bước biến tính dài đến 5phút Để làm giảm ảnh hưởng đối với enzyme thì có thể bổ sung enzyme DNApolymerase sau khi biến tính ban đầu

+ Khi đã tối ưu PCR thì cần giảm tối thểu thời gian biến tính mỗi chu kỳ để tănglượng sản phẩm, thông thường từ 10-30s

+ Tốc độ gia nhiệt và chế độ điều khiển nhiệt độ ở mỗi hệ thống luân nhiệt (PCRmachine, thermocylcer) là khác nhau, phụ thuộc hãng sản xuất

(2) Giai đoạn bắt cặp (anealation): Sau khi 2 sợi DNA tách ra, nhiệt độ được hạ

thấp xuống để mồi có thể gắn vào sợi DNA đơn Bước này gọi là gắn mồi Nhiệt độgiai đoạn này phụ thuộc vào đoạn mồi và thường thấp hơn nhiệt độ biến tính 50°C(45-60°C) Sử dụng sai nhiệt độ trong giai đoạn này dẫn đến việc đoạn mồi khônggắn hoàn toàn vào DNA mẫu, hay gắn một cách tùy tiện Thời gian: 1-2 phút

Một số chú ý trong giai đoạn này:

+ Đối với primer dài hơn 22 nucleotide, nhiệt độ bắt mồi thường hoạt động ở Tmthấp nhất +30C

Tiểu luận môn học

+ Đối với primer nhỏ hơn 22 nucleotide, nhiệt độ bắt mồi thường thấp hơn Tm thấpnhất, có thể dùng gradient nhiệt độ (touchdown PCR) để tìm nhiệt độ bắt mồi tối ưu(khoảng cách nhiệt ở mỗi chu kỳ thường là 0,50C).

+ Đối với các cặp Tm cao hoặc tự bắt cặp, có loop thì có thể khắc phục bằng PCRhai bước (950C và 680C)

(3) Giai đoạn kéo dài chuỗi (elongation): DNA polymerase gắn tiếp vào sợi trống.

Nó bắt đầu bám vào và hoạt động dọc theo sợi DNA Bước này gọi là kéo dài Nhiệt

độ kéo dài phụ thuộc DNA-polymerase Thời gian của giai đoạn này phụ thuộc vào

cả DNA-polymerase và chiều dài mảnh DNA cần khuếch đại, như một quy tắc1000bp/1 phút

Những chú ý trong giai đoạn kéo dài:

+ Nhiệt độ kéo dài thường ở 720C, tuy nhiên hoạt tính 5’-3’ DNA polymerase vẫnxảy ra ở nhiệt độ 680C

+ Thời gian kéo dài phụ thuộc hoạt độ enzyme DNA polymerase, chiều dài sảnphẩm và loại template Đối với DNA đồng chất (plamid, lambda hoặc BAC DNA)thì tốc độ có thể đạt tới 15 s/kb; đối với DNA genome lớn, phức tạp thì tốc độthường 30s-1min/kb

Cuối cùng sau một số chu kỳ, số lượng sợi DNA có kích thước duy nhấtchiếm ưu thế tuyệt đối trong phản ứng

N = (2n – 2n) x Trong đó: n: Số chu kỳ

2n: Số phân tử có chiều dài không xác định

x: Số phân tử khuôn ban đầu

N: Số sợi tổng hợp được trong phản ứng

2n: Số phân tử có chiều dài bằng khoảng cách giữa haimồi

Tiểu luận môn học

Hình 1: Chu trình PCR dưới dạng sơ đồ.

(1) Nóng chảy ở 96°C (2)Gắn mồi ở 68°C (3)Kéo dài ở 72°C (P=Polymerase) (4)Chu trình đầu tiên hoàn thành Hai sợi DNA kết quả thành DNA mẫu cho chu trình kế tiếp, mặc dù gấp đôi lượng DNA bản sao cho mỗi chu kỳ.

Tiểu luận môn học

2.3 Phân tích sản phẩm PCR bằng điện di gel agarose

Điện di agarose thường được sử dụng để xác định sản phẩm PCR dựa trênkhả năng phân tách các đoạn DNA có kích thước khác nhau khi sản phẩm PCR dichuyển qua mạng lưới các vi lỗ có trong gel agarose

Do phân tử DNA tích điện âm cao, khi phân tử DNA được đặt dưới một điệntrường xác định, những phân tử DNA tích đện âm này sẽ di chuyển về phía cựcdương của điện trường Trong trường hợp điện di agarose, chúng sẽ di chuyển quagel agarose được đặt trong dung dịch đệm điện di Các phân tử càng nhỏ có khảnăng di chuyển càng nhanh trong gel agarose về phía cực dương so với các phân tửDNA lớn hơn Nguyên tắc này cho phép kỹ thuật điện di phân tách các đoạn DNA

có kích thước khác nhau

Hình 3: Bộ sản phẩm điện di

Sản phẩm PCR được trộn với dung dịch đặt mẫu (loading gel) chuyển vàocác giếng trên gel agarose để thực hiện phân tách dưới tác động của điện trường.Gel agarose có chứa sẵn Ethidium bromid, vì thế khi DNA di chuyển trong gelagarose sẽ tạo liên kết với Ethidium bromide

Dung dịch đặt mẫu (loading gel) chứa chất có tỷ trọng nặng (như đườngsucrose hoặc glycerol) để lôi cuốn DNA xuống đáy giếng trên bản gel agarose vàngăn cản không cho DNA khuếch tán vào dung dịch đệm điện di Ngoài ra, trongdung dịch đặt mẫu còn chứa chất chỉ thị tích điện âm Chất chỉ thị di chuyển cùngvới DNA giúp cho dễ dàng ước lượng sự di chuyển của DNA trong bản gel Chất

Tiểu luận môn học