Đánh giá độ nhạy và đặc hiệu của quy trình kỹ thuật real-time PCR định lợng virút viêm gan B trong huyết thanh bệnh nhân.. Nhằm mục đích đa kỹ thuật này áp dụng một cách rộng rãi trong
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI TRẦN THỊ NGUYÊN DUNG ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ REAL-TIME PCR ĐỊNH LƯỢNG HBV DNA TRONG HUYẾT THANH BỆNH NHÂN NHIỄM VIÊM GAN B LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội, 2006 Tai ngay!!! Tai ngay!!! BanBan co the co the xoa dong xoa chu dong nay!!! chu 17062860450721000000 nay!!! 17061131526051000000 878be28d-d247-4738-9f77-58946549d0de BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI TRẦN THỊ NGUYÊN DUNG ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ REAL-TIME PCR ĐỊNH LƯỢNG HBV DNA TRONG HUYẾT THANH BỆNH NHÂN NHIỄM VIÊM GAN B LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN : TS.NGUYỄN XUÂN THÀNH Hà Nội, 2006 mục lục Trang Đặt vấn đề Chơng I: Tổng quan tài liệu I Bệnh viêm gan B virut I.1 Lịch sử nghiên cứu bệnh viêm gan virut viêm gan B I.2 Biểu lâm sàng bệnh viêm gan B virut II Tình hình nhiễm viêm gan virut B Việt Nam trªn thÕ giíi III Virut viªm gan B (HBV) III.1 Hình thể cấu trúc virút viêm gan B III.2 Sù m· ho¸ cđa c¸c gen cho kháng nguyên HBV phân typ HBV 10 III.3 Các dấu ấn virut viêm gan B 16 III.4 Sức đề kháng HBV 18 III.5 Khả chế gây bệnh HBV 19 IV Các kỹ thuật chẩn đoán HBV 21 IV.1 Các kü tht miƠn dÞch 22 IV.2 Kü tht PCR trun thống 26 IV.3 Kỹ thuật real time PCR định lợng HBV DNA 27 V Vai trò, ý nghĩa định lợng HBV DNA chẩn đoán điều trị 34 Chơng II: Đối tợng, vật liệu phơng pháp nghiên cứu 35 I Đối tợng nghiên cứu 35 II Vật liệu nghiên cứu 35 III Phơng pháp nghiên cứu 37 III.1.1 Kü thuËt t¸ch chiÕt DNA 37 III.1.2 Kü thuËt miễn dịch xác định dấu ấn virút viêm gan B 39 III.1.3 Kỹ thuật định lợng HBV DNA kỹ thuật real time PCR 42 Chơng III: Kết bàn luận 47 I Đánh giá độ nhạy đặc hiệu quy trình kỹ thuật real-time PCR định lợng virút viêm gan B huyết bệnh nhân 47 I.1 Đánh giá độ nhạy cặp mồi thiết kế 47 I.2 Đánh giá độ đặc hiệu cặp mồi thiết kế 49 II Tìm hiểu mối tơng quan nồng độ HBV DNA với dấu ấn khác HBV 50 Kết luận 61 kiến nghị 62 Tài liệu tham khảo 63 Đặt vấn đề Viêm gan virut bệnh truyền nhiễm phổ biến nguy hiểm Bệnh thờng gặp với tần xuất cao nớc phát triển mét vÊn ®Ị quan träng cđa y tÕ céng ®ång Mặc dù chương trình tiêm phịng vi rút viêm gan B (HBV) làm giảm đáng kể tỷ lệ bệnh viêm gan vi rút B, HBV l mt mối hiểm hoạ lớn loài ngời vỡ triệu chứng bệnh rât mơ hồ làm cho ta lầm tưởng với trường hợp rối loạn tiêu hóa hay gặp, đa số trường hợp khơng có triệu chứng lâm sàng trường hợp viêm gan vi rút B mãn tính mà có xét nghiệm máu chẩn đoán bệnh Do đó, vai trị xét nghiệm chẩn đốn viêm gan vi rút B giữ vai trò quan trọng Có nhiều loại xét nghiệm khác sử dụng chẩn đoán viêm gan vi rút B, loại có ý nghĩa khác tùy vào giai đoạn bệnh mà người bác sĩ lựa chọn xét nghiệm thích hợp Có xét nghiệm hay dùng chẩn đoán, đánh giá vi rút viêm gan siêu vi B trước HBsAg, AntiHBs, HBeAg, AntiHBe, AntiHBc IgM AntiHBc IgG Các xét nghiệm xét nghiệm bản, dùng phương pháp miễn dịch để phát có số hạn chế Vào năm cuối kỷ 20, kỹ thuật sinh học phân tử đời có tốc độ phát triển nhanh chóng mở kỷ nguyên chẩn đoán gen nên chẩn đốn vi rút viêm gan B mức độ phân tử (Đó xét nghiệm phân tích phân tử di truyền HBV DNA) Nhờ ứng dụng kỹ thuật phân tích DNA HBV mà giải hạn chế kỹ thuật miễn dịch cị phân tích DNA giúp có sở đánh giá tình trạng bệnh, khả diễn tiến bệnh, theo dõi điều trị bệnh lựa chọn phương thuốc điều trị thích hợp HiƯn thực số xét nghiệm sinh học phân tử ë HBV như: Xác định tình trạng tăng sinh vi rút trường hợp có đột biến vùng trước lõi (Pre Core) để từ có định điều trị đặc trị khơng Đó xét nghiệm HBV DNA, kỹ thuật thường dùng để xác định HBV DNA kỹ thuật PCR (Là kỹ thuật khuếch đại DNA đích, nhạy đặc hiệu, sử dụng phổ biến không Việt Nam mà trờn th gii); Kỹ thuật định lng vi rỳt B máu để theo dõi điều trị Nhờ xác định số lượng vi rút trước điều trị mà theo dõi số lượng vi rút trình điều trị: Tăng giảm để có thay đổi điều trị kịp thời hiệu Hai kỹ thuật thường dùng để định lượng vi rút viêm gan B Real Time PCR (Khuếch đại DNA đích với thời gian thật) bDNA (Khuếch đại tín hiệu) Trong ®ã, kü tht real time cho kết xác, độ nhạy độ đặc hiệu cao, thời gian thí nghiệm ngắn Đây kü tht míi ë ViƯt Nam, viƯc øng dơng kü thuật thực tế cha phổ biến Nhằm mục đích đa kỹ thuật áp dụng cách rộng rÃi nghiên cứu, chẩn đoán điều trị, tiến hành đề tài: ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử real time PCR định lợng Virut HBV DNA huyết bệnh nhân mắc viêm gan siêu vi B Mục đích: Đánh giá độ nhạy đặc hiệu quy trình kỹ thuật Real- time PCR định lợng virút viêm gan B huyết bệnh nhân Tìm hiểu mối tơng quan nồng ®é HBV DNA víi c¸c dÊu Ên kh¸c cđa HBV Chơng I Tổng quan tài liệu I bệnh viêm gan b virut I.1 Lịch sử nghiên cứu bệnh viªm gan virut viªm gan B Viªm gan virut thuật ngữ chung trờng hợp gan bị nhiễm loại virut gây viêm gan khác Bệnh đà đợc mô tả từ kỷ thứ năm trớc công nguyên Năm 1963, Baruch Blumberg cộng phát thấy mẫu huyết ngời xứ Australia có loại kháng nguyên phản ứng đặc hiệu với loại kháng thể bệnh nhân bị Hemophilia ngời Mỹ, gọi kháng nguyên Au Loại kháng nguyên gặp ngời Băc Mỹ Tây Âu nhng thấy lu hành vài nớc Châu Phi Châu gặp bệnh nhân bị bạch cầu cấp, bệnh nhân phong hội chứng Down Tuy nhiên mối liên quan kháng nguyên Au viêm gan huyết cha biết đến cách đầy đủ Năm 1968, Prince, Okochi Murakami đà chứng minh kháng nguyên Au (mà ngày gọi kháng nguyên bề mặt viêm gan B hay HBsAg) đợc tìm thấy đặc hiệu huyết bệnh nhân viêm gan B Năm 1970, Dane cộng đà xác định đợc hạt virut viêm gan B hoàn chỉnh (virion) gọi tiểu thể Dane Năm 1972, Magnuis Espmark tiếp tục nghiên cứu thành phần kháng nguyên virut viêm gan B: HBcAg, HBeAg kháng thể tơng ứng I.2 Biểu lâm sàng bệnh viêm gan B virut I.2.1 Viêm gan B cấp Khoảng 70% trờng hợp VGSV B cấp triệu chứng lâm sàng Tuy nhiên, 30% trờng hợp bệnh nhân có triệu chứng bệnh cảnh lâm sàng thờng diễn tiến qua giai đoạn sau: Giai đoạn ủ bệnh: Có thể thay đổi từ 1-4 tháng Trong giai đoạn này, khám lâm sàng kết xét nghiệm âm tính Giai đoạn khởi phát: kéo dài từ 1-2 tuần, 10-20% số bệnh nhân có biểu có ban hồng, mày đay, đau khớp, viêm khớp sốt vài ngày trớc xuất biểu lâm sàng: sốt nhẹ, mệt mỏi, tiểu vàng, chán ăn Giai đoạn toàn phát: kéo dài từ 2-6 tuần, mức độ nặng nhẹ thay đổi cá thể Các triệu chứng viêm gan B cấp nhẹ không vàng da nặng kết hợp với vàng da Trong trờng hợp điển hình, gồm đau đầu, mệt vmỏi, chán ăn, ngứa nhẹ, buồn nôn nôn, sốt nhẹ dÊu hiƯu sím xt hiƯn 2-7 ngµy tríc vµng da trờng hợp có vàng da, đầy bụng đau khu trú hạ sờn phải hay gặp Nớc tiểu trở nên sẫm màu phân nhạt màu Kháng nguyên HBs xuất vài tuần sau nhiễm virut viêm gan B Một thời gian ngắn sau xuất kháng nguyên HBe Kháng thể HBc xuất hiƯn sím kh¸ng thĨ kh¸ng HBs xt hiƯn muộn từ vài ngày đến vài tuần trớc HBsAg biến mất, bệnh khỏi, kháng thể antiPre S1 anti Pre S2 xt hiƯn tríc cã anti HBs vµ lµ dÊu hiƯu tiÕn triĨn tèt cđa bƯnh Sù tån dai dẳng kháng nguyên Pre S1 Pre S2 cho biết nhân lên virut tiếp tục Trong giai đoạn cấp, DNA virut phát kỹ thuật PCR kỹ thuật lai phân tử I.2.2 Viêm gan B mạn I.2.2.1 Viêm gan B mạn tồn Thờng triệu chứng, kèm với mệt mỏi, chán ăn, đau tức nhẹ vùng hạ sờn phải Thăm khám lâm sàng bình thờng thấy gan to nhẹ Những xét nghiệm chức gan bình thờng I.2.2.2 Viêm gan B mạn hoạt động Phần lớn bệnh nhân nhiễm viêm gan siêu vi B mạn triệu chứng lâm sàng, nhiên số có dấu hiệu lâm sàng gồm mệt mỏi, đau hạ sờn phải, vàng da ngứa có tắc mật Biểu tăng áp lực tĩnh mạch cửa Khám thấy gan to vừa đau, thấy lách to Viêm gan virut B mạn đợc xác định xét nghiệm sinh hoá men Transaminase cao kéo dài tháng sau giai đoạn cấp Các kháng nguyên tồn lâu máu nh HBsAg, HBeAg DNA virut cho thấy nhân lên virut tiếp tục Sau thời gian định (có thể từ vài tháng đến vài năm) DNA virut gắn vào genom tế bào gan, HBeAg mất, xuất kháng thể kháng HBe, men transaminase trở lại bình thờng II Tình hình nhiễm viêm gan virut B Việt Nam giới II.1 Tình hình nhiễm virút viêm gan B trªn thÕ giíi Nhiễm vi rút gây viêm gan siêu vi B (HBV) vấn đề sức khỏe lớn toàn cầu, đặc biệt nước phát triển Ngêi lµ ỉ chøa nhiễm tự nhiên động vật hoang dại, ngời ta đà gây bệnh thực nghiệm loài chimpanzee số loài linh trởng khác, nhiễm HBV đợc phát tất dân tộc nhng tần xuất bệnh tỷ lệ mang virut ngời lành thay đổi tuỳ theo vùng địa lý chủng tộc HiƯn nay, theo thèng kª cđa Tỉ chøc Y tÕ Thế giới, ớc tính có khoảng tỷ ngời đà bị nhiễm HBV, có khoảng 350 triệu ngời mang mầm bệnh mạn tính, 3/4 số Châu á, 25% ngời nhiễm virut mÃn thành viêm gan mÃn, xơ gan ung th gan nguyên phát Hng nm khong 1-2 triu ngi tử vong bệnh có liên quan đến HBV viêm gan cấp, tối cấp; lâu dài xơ gan ung thư gan Tû lƯ nhiƠm HBV thay đổi theo khu vực địa lý dân c nh quần thể dân c khác Các nhóm nguy cao (truyền máu, tiêm chích, quan hệ t×nh dơc, tiÕp xóc nghỊ nghiƯp) cã tØ lƯ mang trùng 10 lần cao so với quần thể dân c nói chung khả trở thành mang trùng sau tiếp xúc tăng lên đáp ứng miễn dịch suy giảm II.2 Tình hình nhiễm HBV Việt Nam Việt Nam quốc gia nằm vùng lưu hành viªm gan cao Theo TCYTTG số cơng trình nghiên cứu nước, có khoảng 515% dân số Việt Nam mang HBV hàng nǎm khoảng 35.000 người tử vong bệnh có liên quan đến HBV