Ứng dụng kỹ thuật sinh họ phân tử real time pcr định lượng hbv dna trong huyết thanh bệnh nhân nhiễm viêm gan b pdf

Đánh giá độ nhạy và đặc hiệu của quy trình kỹ thuật real-time PCR định lợng virút viêm gan B trong huyết thanh bệnh nhân.. Nhằm mục đích đa kỹ thuật này áp dụng một cách rộng rãi trong

B Ộ GIÁO DỤ C VÀ ĐÀO T Ạ O TRƯỜ NG Đ Ạ I H C BÁCH KHOA HÀ NỘI Ọ

Ứ NG D NG K THU T SINH H C PHÂN T Ụ Ỹ Ậ Ọ Ử REAL TIME PCR

-ĐỊ NH LƯ Ợ NG HBV DNA TRONG HUY T THANH Ế

B Ệ NH NHÂN NHIỄM VIÊM GAN B

LUẬ N VĂN TH C SĨ Ạ NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH H C Ọ

B Ộ GIÁO DỤ C VÀ ĐÀO T Ạ O TRƯỜ NG Đ Ạ I H C BÁCH KHOA HÀ NỘI Ọ

Ứ NG D NG K THU T SINH H C PHÂN T Ụ Ỹ Ậ Ọ Ử REAL TIME PCR Đ NH - Ị

LƯỢ NG HBV DNA TRONG HUY T THANH Ế

B Ệ NH NHÂN NHIỄM VIÊM GAN B

LUẬ N VĂN TH C SĨ Ạ NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH H C Ọ

NGƯỜ I HƯ Ớ NG D N Ẫ :

TS NGUYỄN XUÂN THÀNH

mục lục

Trang

I.1 Lịch sử nghiên cứu bệnh viêm gan do virut viêm gan B 3 I.2 Biểu hiện lâm sàng của bệnh viêm gan B virut 4

II Tình hình nhiễm viêm gan virut B ở Việt Nam và trên thế giới 5

III.1 Hình thể và cấu trúc của virút viêm gan B 7 III.2 Sự mã hoá của các gen cho kháng nguyên của HBV và các phân

III.3 Các dấu ấn của virut viêm gan B 16

III.5 Khả năng và cơ chế gây bệnh của HBV 19

IV.3 Kỹ thuật real time PCR định lợng HBV DNA 27

V Vai trò, ý nghĩa của định lợng HBV DNA trong chẩn đoán

Chơng II: Đối tợng, vật liệu và phơng pháp nghiên cứu 35

II Vật liệu nghiên cứu 35

III.1.2 Kỹ thuật miễn dịch xác định các dấu ấn virút viêm gan B 39 III.1.3 Kỹ thuật định lợng HBV DNA bằng kỹ thuật real time PCR 42

I Đánh giá độ nhạy và đặc hiệu của quy trình kỹ thuật real-time PCR định lợng virút viêm gan B trong huyết thanh bệnh nhân 47

II Tìm hiểu mối tơng quan của nồng độ HBV DNA với các dấu ấn

1

Đặt vấn đề

Viêm gan virut là một bệnh truyền nhiễm rất phổ biến và nguy hiểm Bệnh thờng gặp với các tần xuất cao ở các nớc đang phát triển và là một vấn đề quan trọng của y tế cộng đồng

Mặc dự chương trỡnh tiờm phũng vi rỳt viờm gan B (HBV) đó làm giảm đỏng

kể tỷ lệ bệnh viờm gan do vi rỳt B, nhưng HBV vẫn cũn là một mối hiểm hoạ lớn của loài ngời vỡ đụi khi triệu chứng của bệnh rõt mơ hồ làm cho ta lầm tưởng với một trường hợp rối loạn tiờu húa hay gặp, và đa số trường hợp khụng cú triệu chứng lõm sàng ở những trường hợp viờm gan vi rỳt B món tớnh mà chỉ cú xột nghiệm mỏu chỳng ta mới chẩn đoỏn được bệnh Do đú, vai trũ của xột nghiệm trong chẩn đoỏn viờm gan do vi rỳt B giữ một vai trũ cực kỳ quan trọng Cú nhiều loại xột nghiệm khỏc nhau được sử dụng trong chẩn đoỏn viờm gan vi rỳt B, mỗi loại cú một ý nghĩa khỏc nhau tựy vào từng giai đoạn của bệnh mà người bỏc sĩ sẽ lựa chọn xột nghiệm thớch hợp Cú 5 xột nghiệm hay được dựng trong chẩn đoỏn, đỏnh giỏ vi rỳt viờm gan siờu vi

B trước đõy là HBsAg, AntiHBs, HBeAg, AntiHBe, AntiHBc IgM và AntiHBc IgG Cỏc xột nghiệm này là những xột nghiệm cơ bản, dựng phương phỏp miễn dịch để phỏt hiện nhưng vẫn cú một số hạn chế

Vào những năm cuối thế kỷ 20, kỹ thuật sinh học phõn tử ra đời và cú tốc độ phỏt triển nhanh chúng đó mở ra một kỷ nguyờn mới về chẩn đoỏn gen nờn chỳng ta đó cú thể chẩn đoỏn được vi rỳt viờm gan B ở mức độ phõn tử (Đú là cỏc xột nghiệm phõn tớch trờn phõn tử di truyền của HBV là DNA) Nhờ ứng dụng cỏc kỹ thuật về phõn tớch DNA của HBV mà chỳng ta cú thể giải quyết được cỏc hạn chế của cỏc kỹ thuật miễn dịch c ũ cũng như phõn tớch DNA giỳp chỳng ta cú những cơ sở đỏnh giỏ tỡnh trạng bệnh, khả năng diễn tiến của

2

bệnh, theo dừi điều trị bệnh và lựa chọn phương thuốc điều trị thớch hợp Hiệnnay chỳng ta cú thể thực hiện được một số xột nghiệm sinh học phõn tử ở HBV như: Xỏc định được tỡnh trạng đang tăng sinh của vi rỳt trong những trường hợp cú đột biến ở vựng trước lừi (Pre Core) để từ đú cú quyết định điều trị đặc trị khụng Đú là xột nghiệm HBV DNA, và kỹ thuật thường dựng

để xỏc định HBV DNA là kỹ thuật PCR (Là một kỹ thuật khuếch đại DNA đớch, rất nhạy và đặc hiệu, được sử dụng phổ biến khụng chỉ ở Việt Nam mà

cả trờn thế giới); Kỹ thuật định lượng vi rỳt B trong mỏu để theo dừi trong điều trị Nhờ xỏc định được số lượng vi rỳt trước khi điều trị mà chỳng ta cú thể theo dừi số lượng vi rỳt trong quỏ trỡnh điều trị: Tăng giảm như thế nào để

cú sự thay đổi điều trị kịp thời và hiệu quả Hai kỹ thuật thường dựng để định lượng vi rỳt viờm gan B là Real Time PCR (Khuếch đại DNA đớch với thời gian thật) và bDNA (Khuếch đại tớn hiệu) Trong đó, kỹ thuật real time cho kết quả chính xác, độ nhạy và độ đặc hiệu cao, thời gian thí nghiệm ngắn Đây

là một kỹ thuật mới ở Việt Nam, việc ứng dụng kỹ thuật này trong thực tế còn cha phổ biến Nhằm mục đích đa kỹ thuật này áp dụng một cách rộng rãi trong nghiên cứu, chẩn đoán và điều trị, chúng tôi tiến hành đề tài:

ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử real time PCR định lợng Virut HBV DNA trong huyết thanh bệnh nhân mắc viêm gan siêu vi B

Mục đích:

định lợng virút viêm gan B trong huyết thanh bệnh nhân

2 Tìm hiểu mối tơng quan của nồng độ HBV DNA với các dấu ấn khác của HBV

3

Chơng I

T ổng quan tài liệu

I bệnh viêm gan b virut

I.1 Lịch sử nghiên cứu bệnh viêm gan do virut viêm gan B

Viêm gan virut là thuật ngữ chung chỉ những trờng hợp gan bị nhiễm ít nhất một trong các loại virut gây viêm gan khác nhau Bệnh đã đợc mô tả từ thế

kỷ thứ năm trớc công nguyên

Năm 1963, Baruch Blumberg và cộng sự phát hiện thấy trong mẫu huyết thanh ngời bản xứ Australia có một loại kháng nguyên phản ứng đặc hiệu với một loại kháng thể của bệnh nhân bị Hemophilia ngời Mỹ, gọi là kháng nguyên

Au Loại kháng nguyên này ít gặp ở ngời Băc Mỹ và Tây Âu nhng thấy lu hành ở vài nớc Châu Phi và Châu và còn gặp ở bệnh nhân bị bạch cầu cấp, á bệnh nhân phong và hội chứng Down Tuy nhiên mối liên quan giữa kháng nguyên Au và viêm gan huyết thanh vẫn cha biết đến một cách đầy đủ

Năm 1968, Prince, Okochi và Murakami đã chứng minh rằng kháng nguyên

Au (mà ngày nay gọi là kháng nguyên bề mặt viêm gan B hay HBsAg) đợc tìm thấy đặc hiệu ở huyết thanh bệnh nhân viêm gan B

Năm 1970, Dane và cộng sự đã xác định đợc hạt virut viêm gan B hoàn chỉnh (virion) gọi là tiểu thể Dane

Năm 1972, Magnuis và Espmark tiếp tục nghiên cứu các thành phần kháng nguyên của virut viêm gan B: HBcAg, HBeAg và các kháng thể tơng ứng

4

I.2 Biểu hiện lâm sàng của bệnh viêm gan B virut

I.2.1 Viêm gan B cấp

Khoảng 70% các trờng hợp VGSV B cấp không có triệu chứng lâm sàng Tuy nhiên, trong 30% trờng hợp bệnh nhân có triệu chứng thì bệnh cảnh lâm sàng thờng diễn tiến qua các giai đoạn sau:

lâm sàng và các kết quả xét nghiệm đều âm tính

-có ban hồng, mày đay, đau khớp, đôi khi viêm khớp và sốt vài ngày trớc khi xuất hiện các biểu hiện lâm sàng: sốt nhẹ, mệt mỏi, tiểu vàng, chán ăn

-cá thể Các triệu chứng của viêm gan B cấp có thể nhẹ và không vàng da hoặc nặng hơn kết hợp với vàng da Trong trờng hợp điển hình, gồm đau đầu, mệt vmỏi, chán ăn, ngứa nhẹ, buồn nôn và nôn, sốt nhẹ là những dấu hiệu sớm xuất hiện 2 7 ngày trớc khi vàng da trong các trờng hợp có vàng da, đầy -bụng hoặc đau khu trú ở hạ sờn phải hay gặp Nớc tiểu trở nên sẫm màu và phân nhạt màu hơn

Kháng nguyên HBs xuất hiện vài tuần sau khi nhiễm virut viêm gan B Một thời gian ngắn sau xuất hiện kháng nguyên HBe Kháng thể HBc cũng xuất hiện sớm trong khi kháng thể kháng HBs xuất hiện muộn từ vài ngày đến vài tuần trớc khi HBsAg biến mất, bệnh khỏi, kháng thể antiPre S1 và anti Pre S2 xuất hiện trớc khi có anti HBs và là dấu hiệu tiến triển tốt của bệnh Sự tồn tại dai dẳng của kháng nguyên Pre S1 hoặc Pre S2 cho biết sự nhân lên của

5

virut đang tiếp tục Trong giai đoạn cấp, DNA của virut có thể phát hiện bằng các kỹ thuật PCR hoặc kỹ thuật lai phân tử

I.2.2 Viêm gan B mạn

I.2.2.1 Viêm gan B mạn tồn tại

Thờng không có triệu chứng, có thể đi kèm với mệt mỏi, chán ăn, đau tức nhẹ vùng hạ sờn phải

Thăm khám lâm sàng bình thờng hoặc có vẻ thấy gan to nhẹ Những xét nghiệm chức năng gan bình thờng

Phần lớn bệnh nhân nhiễm viêm gan siêu vi B mạn không có triệu chứng lâm sàng, tuy nhiên một số ít có các dấu hiệu lâm sàng gồm mệt mỏi, đau hạ sờn phải, vàng da và ngứa khi có tắc mật Biểu hiện tăng áp lực tĩnh mạch cửa Khám thấy gan to vừa đôi khi đau, có thể thấy lách to

Viêm gan virut B mạn đợc xác định bằng xét nghiệm sinh hoá khi men Transaminase cao kéo dài trên 6 tháng sau giai đoạn cấp Các kháng nguyên tồn tại lâu trong máu nh H sAg, HBeAg và DNA virut cho thấy sự nhân lên Bcủa virut vẫn tiếp tục Sau một thời gian nhất định (có thể từ vài tháng đến vài năm) DNA virut gắn vào genom của tế bào gan, HBeAg có thể mất, xuất hiện kháng thể kháng HBe, men transaminase trở lại bình thờng

II Tình hình nhiễm viêm gan virut B ở Việt Nam và

trên thế giới

II.1 Tình hình nhiễm virút viêm gan B trên thế giới

6

Nhiễm vi rỳt gõy viờm gan siờu vi B (HBV) hiện nay là một vấn đề sức khỏe lớn của toàn cầu, đặc biệt tại cỏc nước đang phỏt triển Ngời là ổ chứa duy nhất và không có nhiễm tự nhiên trên các động vật hoang dại, mặc dầu ngời

ta đã gây bệnh thực nghiệm trên loài chimpanzee và một số loài linh trởng khác, và mặc dù nhiễm HBV đợc phát hiện ở tất cả các dân tộc nhng tần xuất của bệnh và tỷ lệ mang virut trên ngời lành thay đổi tuỳ theo vùng địa lý

và chủng tộc

Hiện nay, theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới, ớc tính có khoảng 2 tỷ ngời đã bị nhiễm HBV, trong đó có khoảng 350 triệu ngời đang mang mầm bệnh mạn tính, 3/4 trong số này là ở Châu á, 25% ngời nhiễm virut mãn có thể sẽ thành viêm gan mãn, xơ gan và ung th gan nguyên phát Hàng nǎm khoảng 1 2 triệu người tử vong do cỏc bệnh cú liờn quan đến HBV như viờm -gan cấp, tối cấp; lõu dài như xơ gan và ung thư gan Tỷ lệ nhiễm HBV thay

đổi theo từng khu vực địa lý dân c cũng nh ở các quần thể dân c khác nhau Các nhóm nguy cơ cao (truyền máu, tiêm chích, quan hệ tình dục, tiếp xúc trong nghề nghiệp) có tỉ lệ mang trùng 10 lần cao hơn so với quần thể dân c nói chung và khả năng trở thành mang trùng sau tiếp xúc tăng lên khi đáp ứng miễn dịch suy giảm

II 2 Tình hình nhiễm HBV ở Việt Nam.

Việt Nam là một quốc gia nằm trong vựng lưu hành viêm gan cao Theo TCYTTG cũng như một số cụng trỡnh nghiờn cứu trong nước, cú khoảng 5-15% dõn số Việt Nam đang mang HBV và hàng nǎm khoảng 35.000 người tử vong vỡ những bệnh cú liờn quan đến HBV

7

III Virut viêm gan B (HBV)

III.1 Hình thể và cấu trúc của virút viêm gan B

HBV là một thành viên của họ Hepadnaviridae (có axit nhân là DNA) HBV

có trọng lợng phân tử khoảng 2.000.000 dalton

Quan sát huyết thanh ngời bị nhiễm HBV bằng kính hiển vi điện tử, thấy có

3 loại hình thể:

- Những hạt to 42 45 nanomet

Những vi cầu đờng kính 20 22 nanomet

Những ống nhỏ đờng kính 20 22 nanomet dài 40 400 nanomet.-

-Các vi cầu và hình ống nhỏ là những bao ngoài rỗng của virut đứng lẻ hoặc nối với nhau chính là phần kháng nguyên bề mặt HBsAg của siêu vi đợc sản xuất thừa tại bào tơng của tế bào gan trong quá trình nhân lên của virut Các hạt này có rất nhiều trong huyết thanh, nồng độ vào khoảng 10 100- àg/ml, gấp

8

Hình 1: Ba kiểu cấu trúc của HBV trong huyết thanh

Bao ngoài của virut (envelope) đợc cấu tạo bởi 3 chuỗi polypeptide:

+ Chuỗi có kích thớc ngắn nhất (trọng lợng phân tử 25 kilo Dalton, kDa)

đợc gọi là polypeptide chính do có nhiều nhất trong thành phần bao ngoài

Đây chính là kháng nguyên HBsAg với 5 quyết định kháng nguyên khác nhau: a đặc hiệu chung cho nhóm, d/y và w/r đặc hiệu cho phụ typ (subtype) + Chuỗi polypeptide trung bình có cấu trúc gồm toàn bộ chuỗi ngắn (HBsAg) cộng thêm một đoạn có 55 axit amin (KN Pre S2), trọng lợng phân tử 29kDa.-

+ Chuỗi polypeptide lớn có cấu trúc gồm toàn bộ chuỗi trung bình cộng thêm một đoạn có từ 108-119 axit amin (KN Pre-S1 và Pre-S2), trọng lợng phân tử

33 kDa, có tính sinh miễn dịch cao hơn so với HBsAg Chuỗi lớn là thành phần quan trọng của hạt virut hoàn chỉnh

Vỏ capxit: đợc cấu thành bởi 2 loại chuỗi polypeptide, đợc gọi là

polypeptide lõi và tiền lõi Chuỗi polypeptide ngắn (polypeptide lõi), trọng lợng phân tử 22 kDa, chính là kháng nguyên lõi của virut, ký hiệu là HBcAg (Hepatitis B core antigen) Chuỗi polypeptide dài (polypeptide tiền lõi), trọng

9

lợng phân tử 25 kDa, có cấu trúc gồm toàn bộ chuỗi ngắn cộng thêm một peptide đơn có 29 axit amin Kháng nguyên e của HBV (Hepatitis B e antigen, HBeAg) chính là một sản phẩm chuyển hoá của lớp vỏ capxit

B ộ gen HBV :

HBV cú bộ gen là phõn tử DNA vòng, mạch kép không hoàn chỉnh và có chiều dài khoảng 3200 bases DNA này bao gồm hai chuỗi có chiều dài khác nhau: Chuỗi dài nằm ngoài, có cực tính âm ( ), tạo nên một vòng tròn liên tục -

có chiều dài cố định là 3,2 kb và mã hoá cho các thông tin di truyền của siêu

vi ARN thông tin và ARN tiền gen của virut đợc mã hoá từ mạch này Chuỗi ngắn nằm trong, có cực tính dơng (+), chiều dài thay đổi từ 50 80% chiều dài-mạch âm

Cấu trúc vòng của DNA đợc đảm bảo là sự ghép nối hai đầu 5’ của hai sợi DNA trên một đoạn có chiều dài 200 nucleotide, đợc gọi là vùng liên kết Vùng này nằm giữa hai trình tự DR1 và DR2 gồm có 10 11 nucleotide, trong -

đó DR1 nằm ở đầu 5’ của sợi DNA ( ) và cũng hiện diện ở đoạn d của đầu 3’, còn DR2 nằm ở đầu 5’ của sợi DNA (+) Hai trình tự này có vai trò chủ yếu trong việc khởi phát quá trình tổng hợp của các chuỗi DNA tơng ứng

-10

Thứ tự của các nucleotit đợc đánh số bắt đầu từ 1 tơng ứng ở vị trí EcoRI Chiều dài bộ gen thay đổi tuỳ theo từng phân týp khác nhau

Hình 3: Cấu tạo bộ gen HBV

III.2 Sự mã hoá của các gen cho kháng nguyên của HBV và các phân typ của HBV

Chỉ có sợi DNA (-) mới đợc mã hoá Trên sợi DNA này có bốn đoạn gen tơng ứng với bốn khung đọc mở là các vùng mã hoá để tổng hợp các protein của siêu vi Quá trình đọc mã đợc bắt đầu từ bộ ba nucleotit AUG đợc gọi

là codon khởi đầu và chấm dứt bằng codon kết thúc TAG

KN bề mặt (HBsAg) Vùng S và pre-S2 có chiều dài cố định trong khi đó vùng pre-S1 có chiều dài thay đổi tuỳ theo từng phân týp khác nhau

11

Đoạn gen S tổng hợp nên protein S (Small) có chiều dài 24kd gồm 226 axitamin (aa) Protein này gồm hai thành phần là p24 và gp27 (gp: glycoprotein) Đây là protein chủ yếu vì nó chiếm đa số

Đoạn gen S và pre S2 tổng hợp nên protein M (Medium) có chiều dài 33kd gồm 281 aa Protein này gồm hai loại glycoprotein gp33 và gp36 Vùng pre-S2 có vai trò giúp cho siêu vi bám dính và xâm nhập vào trong tế bào gan nhờ

-nó liên kết với một loại albumin đợc trùng hợp trong huyết thanh ngời đồng thời trên tế bào gan cũng có các thụ thể để gắn với pHSA Nếu trên tế bào gan thiếu các thụ thể này thì có thể làm cho các tế bào gan có khả năng đề kháng với sự nhiễm HBV

Đoạn gen S, pre-S1 và pre S2 tổng hợp nên Protein L, có chiều dài 39 kd gồm hai loại p39 và gp42 Chuỗi protein pre S1 có chiều dài thay đổi tuỳ theo từng -phân týp khác nhau Đây là vùng chủ yếu mà các thụ thể trên bề mặt của tế bào gan sẽ liên kết với siêu vi, giúp siêu vi xâm nhập vào trong tế bào Kháng thể antipre-S1 có thể trung hoà và ức chế siêu vi kết dính vào tế bào gan

-Cả ba loại protein này hiện diện với số lợng khác nhau trên bề mặt của virion, trong đó protein S chiếm đa số, protein M chiếm khoảng 5-10% trong các virion và các hạt có kích thớc 22nm Protein L chiếm 20% trong vỏ bọc của virion và các cấu trúc dạng ống nhng chỉ chiếm 1-2% trong các protein của hạt 22nm

12

5’ của gen C có hai codon khởi đầu cho quá trình đọc mã Trình tự nucleotide nằm giữa hai codon này đợc gọi là vùng pre-C Nếu quá trình đọc mã đợc bắt đầu từ codon AUG thứ nhất ở vị trí 1814 và dọc suốt chiều dài của đoạn gen pre C và C sẽ tổng hợp nên HBeAg Các nucleotide đầu tiên của vùng pre- -

C sẽ mã hoá cho việc tạo nên một đoạn peptide gồm 19 aa gọi là peptide tín hiệu Peptide này giúp cho HBeAg đợc bài tiết qua hệ thống lới nội bào tơng của tế bào gan, đồng thời cũng giúp cho kháng nguyên này hoà tan

đợc trong huyết thanh Vì vậy, HBeAg đợc gọi là kháng nguyên hoà tan

Đây là một loại protein không tham dự vào cấu trúc của virion và chức năng của nó cha đợc biết rõ Tuy nhiên, sự hiện diện của HBeAg có liên quan

đến tính lây nhiễm và phản ánh tình trạng đang nhân đôi của siêu vi

Nếu quá trình đọc mã bắt đầu từ codon AUG thứ nhì ở vị trí 1901 và đi suốt

đoạn gen C sẽ tổng hợp nên KN lõi hay HBcAg Đây là KN cấu trúc của phần

13

nucleocapid Vì HBcAg không có đoạn peptide tín hiệu cho nên nó không

đợc bài tiết ra khỏi tế bào gan Vì vậy, HBcAg không bao giờ hiện diện trong huyết thanh

Một số trờng hợp xảy ra đột biến ở đoạn pre C tại vị trí 1896, guanosine

-đợc thay thế bằng adenine, tạo nên một trình tự TAG là một codon kết thúc Chính codon kết thúc này đã chấm dứt quá trình giải mã của vùng pre-C, cho nên sự tổng hợp của HBeAg không thực hiện đợc mặc dù quá trình nhân đôi của siêu vi vẫn tiếp diễn

bộ gen Sản phẩm của gen P không chỉ liên quan đến cơ chế sao chép ngợc

mà còn tham gia vào việc tạo ra phần capsid bao bọc bên ngoài cầu trúc RNA tiền genome

14

Hoạt động nhõn đụi của HBV nhờ hoạt tớnh của men DNA polymerase (P protein) nội sinh trong các viên kết siêu li tâm từ huyết thanh ngời chứa HBV Gen P (Polymerase) được chia làm 4 vựng, mỗi vựng cú một chức năng riờng: Terminal protein, Spacer, RT domains và RNAase H (Xem hỡnh) Trong đú, vựng sao mó ngược (RT domains: Reverse Transcription) chịu trỏch nhiệm cho việc tổng hợp men RNA-dependent DNA và DNA-dependent DNA được chia ra thành 7 vựng đặt tờn từ A – G (Xem hỡnh cấu tạo RT) HBV DNA có tỉ lệ đột biến rất cao vì men này hay bị sai sót trong khâu sao chép

Hình 6: Cấu tạo gen P và vùng RT

cho một polypeptide có khoảng 145 154 aa tuỳ theo tong phân týp Chức năng của gen này vẫn cha đợc biết chính xác nhng có lẽ nó giữ vai trò chuyển hoạt hoá trong quá trình nhân đôi của siêu vi Protein X còn có liên quan đến

-sự điều hoà quá trình tăng trởng của tế bào, cho nên có thể nó có vai trò trong cơ chế sin hung th của tế bào gan bị nhiễm

Các phân týp của HBV:

15

Trước đõy, HBV được phõn ra làm 4 kiểu huyết thanh (Serotypes) dựa trờn việc xỏc định cỏc kiểu khỏng nguyờn của khỏng nguyờn bề mặt vi rỳt B, mỗi phân týp đều có chung phần quyết định kháng nguyên “a” và khác nhau tuỳ theo sự ghép cặp của các quyết định kháng nguyên “d” hoặc “y” ghép với “w” hoặc “r” để tạo nên các phân týp nh adw, ayw, adr, ayr Cỏc kiểu huyết thanh này cú thể phõn loại thờm ra 9 kiểu (Subtypes) là ayw1, ayw2, ayw3, ayw4, ayr, adw2, adw4, adrq+, và adrq- Nghiờn cứu dịch tể cho thấy sự phõn bố của cỏc serotypes khỏc nhau trờn cỏc vựng khỏc nhau trờn thế giới Tuy nhiờn, cho

đến nay cú rất ớt dữ liệu về vai trũ của HBV Serotypes

Những tiến bộ của kỹ thuật sinh học phõn tử vào những năm cuối thế kỷ 20

đó giỳp khỏm phỏ ra sự đa dạng trong trỡnh tự chuỗi của vi rỳt viờm gan B, và

từ đú một dấu ấn (marker) mới của HBV ra đời là HBV genotype Tỏm kiểu gen của HBV đó được xỏc định (Từ A đến H) dựa vào sự khỏc nhau trờn 8% của toàn bộ trỡnh tự chuỗi của bộ gen HBV, và sự phõn bố của cỏc kiểu gen khỏc nhau ở cỏc chõu lục, cỏc nước khỏc nhau

Tuy nhiờn sự phõn loại cỏc HBV genotypes cú thể chỉ cần dựa trờn trỡnh tự chuỗi (sequence) của một đoạn gen nào đú của HBV như trờn một phần trỡnh

tự chuỗi của gen pre-S; S Cú nhiều phương phỏp đó được nghiờn cứu và dựng trong việc xỏc định HBV genotypes như giải trỡnh tự chuỗi (sequencing), RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), LiPA (Line Probe Assay), phản ứng miễn dịch men (Enzyme-linked Immunoassay) Mỗi phương phỏp cú những ưu và nhược điểm khỏc nhau, tuy nhiờn phương phỏp giải trỡnh tự chuỗi cú thể xem như cú nhiều ưu điểm nổi bật vỡ bờn cạnh việc xỏc định được trỡnh tự chuỗi cỏc Nucleotids trong bộ gen của HBV để từ

đú so sỏnh với thư viện gen và xỏc định được HBV genotypes mà cũn dựa

16

vào kết quả giải trỡnh tự này chỳng ta cú thể xỏc định được một số dạng đột biến khỏng thuốc của HBV để từ đú cú phỏt đồ điều trị tối ưu

III.3 Các dấu ấn của virut viêm gan B

Virut viêm gan B có cấu tạo phức tạp, có nhiều kháng nguyên, các dấu ấn sau

đây đáng đợc chú ý ví nó có ý nghĩa trong chẩn đoán bệnh và trong nghiên

cứu dịch tễ:

III.3.1 Kháng nguyên bề mặt virut viêm gan B (HBsAg):

Kháng nguyên bề mặt của virut viêm gan B (HBsAg), đây là maker (dấu ấn) xuất hiện trớc tiên sau khi bị lây nhiễm, có thể thấy trong huyết thanh ở giai

đoạn cuối của thời kỳ ủ bệnh thờng nhiều ngày hoặc nhiều tuần trớc khi có triệu chứng lâm sàng rồi giảm dần và biến mất thờng từ 4-8 tuần tiếp theo Nếu HBsAg tồn tại sau 6 tháng sau khi khỏi bệnh đợc gọi là nhiễm trùng mạn tính (hay là mang HBsAg mạn tính) rất nguy hiểm cho ngời khác Trong viêm gan mạn HBsAg có thể tồn tại nhiều năm hoặc hết đời

Định lợng HBsAg có giá trị tiên lợng cao: Nếu HBsAg không giảm xuống

đến mức 1/4 hiệu giá ban đầu trong 4 6 tuần đầu của bệnh thì bệnh nhân có khả năng chuyển sang mạn tính Khi thấy có HBsAg trong máu chứng tỏ có ADN của virut trong gan, phản ánh tình trạng cấp hoặc mạn của bệnh viêm gan và tất cả các trờng hợp HBsAg dơng tính đều đợc coi là có khả năng truyền bệnh Tuy nhiên vẫn có khoảng 5 10% bệnh nhân viêm gan xét nghiệm -không có HBsAg (có thể hàm lợng quá thấp hoặc bị kháng thể trung hoà)

-III.3.2 Kháng thể Anti HBs:

Là dấu ấn phản ánh tình trạng viêm gan B đã khỏi bệnh và/hoặc đã đợc miễn nhiễm đối với HBV

17 Xuất hiện muộn 2-16 tuần sau khi không phát hiện đợc HBsAg.

Kháng thể IgM anti HBs xuất hiện trong giai đoạn cấp, còn kháng thể IgG anti HBs xuất hiện muộn hơn và tồn tại lâu hơn

Xuất hiện kháng thể anti HBs là dấu hiệu bệnh đã đợc cải thiện, nó có tác dụng chống tái nhiễm HBV Kháng thể anti HBs còn phát hiện đợc trong máu ở những ngời có tiêm phòng vacxin viêm gan B

III.3.3 Kháng nguyên HBeAg:

Kháng nguyên E (HBeAg) là kháng nguyên hoà tan, xuất hiện sớm sau HBsAg nhng tồn tại lâu trong các thể nhiễm trùng mãn (đặc biệt là viêm gan mãn hoạt động) có liên quan đến sự có mặt của virut HBV nên nó phản ánh mức độ lây nhiễm của ngời bệnh, đặc biệt ở phụ nữ mang thai có HBsAg dơng tính Xét nghiệm phát hiện HBeAg và kháng thể kháng lại HBeAg (anti HBe) thờng chỉ nên chỉ định ở những bệnh nhân đã có xét nghiệm HBsAg dơng tính

Sự biến mất của HBeAg và xuất hiện kháng thể anti HBe là dấu hiệu của bệnh

đang lui dần Ngợc lại, trong viêm gan mãn tấn công thờng thấy HBeAg (+)

III.3.4 Kháng thể anti HBe:

Sự chuyển huyết thanh antiHBe xảy ra khi antiHBe từ (-) chuyển sang (+) và HBeAg từ (+) chuyển sang ( ) Hiện tợng này phản ánh sự nhân đôi của siêu -

vi đã giảm hoặc chấm dứt Sự chuyển huyết thanh antiHBe có thể xảy ra một cách tự nhiên hoặc đợc thúc đẩy nhanh chóng nhờ các phơng pháp trị liệu kháng siêu vi

18

Tuy nhiên, trong viêm gan B mãn tính, sự hiện diện của antiHBe chứng tỏ bệnh đã diễn tiến tơng đối lâu, nhất là có thể đã chuyển sang giai đoạn xơ gan hoặc ung th gan nguyên phát

IgM anti HBe xuất hiện sớm còn IgG anti HBe xuất hiện muộn hơn

III.3.5 Kháng nguyên lõi HBcAg:

Kháng nguyên lõi (HBcAg) là thành phần bên trong lõi virut, đợc bao bọc bởi bao ngoài nên không có trong máu dới dạng tự do, nó chỉ xuất hiện ở trong tế bào gan, vì vậy các kỹ thuật miễn dịch học thờng không phát hiện

đợc Bằng các kỹ thuật đặc biệt nh miễn dịch huỳnh quang hoặc miễn dịch enzyme có thể phát hiện chúng trong nhân tế bào gan trên các tiêu bản sinh thiết hoặc tử thiết

Khi trong một tế bào gan có HBcAg bao giờ cũng có HBsAg trên màng tế bào

và nồng độ DNA polymerase luôn luôn tăng cao

III.3.6 Kháng thể anti HBc:

Là dấu ấn huyết thanh quan trọng nhất chứng minh bệnh nhân đã từng bị nhiễm HBV; là dấu ấn quý giá giúp phân biệt VGSV B trong giai đoạn cấp tính hay mãn tính

Kháng thể IgM anti HBc xuất hiện sớm trong những tuần đầu của bệnh, còn kháng thể IgG anti HBc xuất hiện muộn nhng tồn tại lâu hơn

Sự có mặt của kháng thể anti HBc không có tác dụng bảo vệ chống tái nhiễm HBV

III .4 Sức đề kháng của HBV.

19

HBV có sức đễ kháng cao và cao hơn cả HAV, virut có thể tồn tại ở nhiệt độ buồng trong 6 tháng, ở 100oC trong 20 phút, ở 58oC trong 24 giờ; không bị huỷ bởi ete HBsAg rất bền vững, vẫn tồn tại sau 20 năm ở 20oC, dới tác -dụng nhiều enzyme và dung môi hữu cơ HBV bị bất hoạt bởi formalin 5%/12 giờ, Cloramin 3%/ 2 giờ

Muốn huỷ virut hoặc HBsAg phải khử trùng rất kỹ (đun sôi 30 phút hoặc sấy khô, hấp ớt)

III.5 Khả năng và cơ chế gây bệnh của HBV

HBV có tính lây nhiễm cao, 0,01 0,001 ml huyết thanh nhiễm HBV đã có thể lây đợc bệnh

-Virut lây bệnh chủ yếu qua đờng máu: tiêm truyền, truyền máu, tiêm chủng, châm, tiếp xúc với máu có virut (mổ, chữa răng, lấy máu xét nghiệm máu, làm việc ở các trung tâm máu, thận nhân tạo ) Virut có thể lây qua đờng sinh …dục và mẹ truyền sang con

HBV là tác nhân gây viêm gan virut quan trọng nhất trong các virut viêm gan

Bà mẹ nhiễm HBV trong những tháng đầu mang thai không làm cho thai nhi

bị dị tật, nếu bà mẹ nhiễm HBV ở 3 tháng cuối thời kỳ mang thai thì có 60%

có nguy cơ lây bệnh cho con Mức độ lây bệnh cho con càng cao nếu ngời

mẹ mang đồng thời HBsAg và HBeAg (có thể lây tới 100%) Nhiễm virut ở lứa tuổi nhỏ thờng dễ tiến triển thành các dạng mãn tính nghiêm trọng Tần suất tiến triển thành dạng mãn tính ở trẻ em nhiễm virut từ mẹ rất cao 40-80% trong khi đó tỷ lệ này ở ngời trởng thành là 5 10%.-

Virut có thể thải ra ngoài theo dịch tiết của các niêm mạc và sữa nhng không thải theo phân Thực tế cho thấy HBsAg có ở hầu hết các dịch sinh học: nớc

20

bọt, dịch mật, dịch não tuỷ, dịch màng phổi, tinh dịch, dịch âm đạo, nớc ối,

mồ hôi và nớc tiểu

Quá trình nhân lên của virut viêm gan B:

HBV có ái lực đặc biệt với tế bào gan Sau khi bám vào tế bào gan, virut cởi

vỏ, chỉ có DNA xâm nhập vào nhân tế bào gan ở dạng siêu xoắn polymerase phụ thuộc DNA của tế bào chủ sẽ phiên mã sợi DNA ( ) thành các -bản sao RNA hoàn chỉnh, trong đó có RNA tiền genome, để ra bào tơng tế bào gan tổng hợp các protein cho virut Dới tác dụng của DNA-polymerase, RNA tiền genome thực hiện phiên mã ngợc tổng hợp DNA sơi âm Khi DNA của virut đợc tổng hợp xong, RNA tiền genome bị giáng hoá trừ một đoạn nhỏ khoảng 20 đôi baze từ đầu 5’ sẽ hoạt động nh một primer để tổng hợp DNA sợi dơng từ sợi âm mẫu, tuỳ thuộc vào mức độ hoạt động của DNA polymerase mà DNA sợi dơng có độ dài thay đổi, các thành phần khác đợc tổng hợp từ các RNA thông tin cùng lúc với sự tổng hợp DNA sợi dơng Các

RNA-21

thành phần vừa đợc tổng hợp lắp ghép lại với nhau tạo hạt virut và giải phóng khỏi tế bào gan Trong quá trình nhân lên của virut luôn có sự tổng hợp thừa thành phần vỏ virut vì vậy trong huyết thanh ngời nhiễm HBV có cả 3 loại hạt: hạt vi rut hoàn chỉnh, hạt hình cầu và hạt hình ống

Iv Một số thử nghiệm cần thiết đối với bệnh nhân mắc viêm gan siêu vi B:

Để tầm soát xem một bệnh nhân có bị nhiễm HBV hay không, ngời ta không cần phải làm tất cả các dấu ấn huyết thanh gồm HBsAg, antiHBs, HBeAg, antiHBe và antiHBc mà chúng ta chỉ cần tìm HBsAg và antiHBc

HBsAg (+) là tiêu chuẩn chính yếu để chẩn đoán nhng nếu HBsAg (-) thì antiHBc (+) cũng đủ chứng minh bệnh nhân đã tong nhiễm HBV Do đó, khi cả HBsAg và antiHBc đều (-), chúng ta có thể ít nghĩ đến VGSV B

Sau khi đã xác định bị nhiễm HBV, nếu muốn biết bệnh nhân đang ở giai

đoạn nào của bệnh thì mới cần kết hợp thêm các dấu ấn còn lại

HBsAg (+)

Viêm gan (cấp hoặc mãn) IgM antiHBc

âm tính dơng tính Viêm gan mãn Viêm gan cấp

HBeAg và anti HBe

HBeAg (+) antiHBe (+)

Lây nhiễm cao Lây nhiễm thấp

22 HBsAg ( )-

Hình 8: Các hớng dẫn chẩn đoán dựa trên kết quả tầm soát ban đầu:

Đối với những người mang HBV và có dấu hiệu gan đang bị suy nhược do hoạt động của HBV cú thể được điều trị để giảm bớt những nguy cơ thiệt hại lõu dài mà cú thể dẩn đến xơ gan và ung thư gan, một số thử nghiệm để quyết

định có nên điều trị hay không đó là: xét nghiệm men gan ALT; dấu ấn HBeAg và nồng độ HBV DNA Trong đ ềi u trị cho bệnh nhân viờm gan B mạn, những thử nghiệm trên cũng được ỏp dụng để kiểm tra sự phản ứng đối với điều trị Phản ứng tốt với cỏch điều trị khi chỉ số ALT trở lại bình thường, giảm số HBV DNA và HBeAg, tăng khỏng thể anti-HBe trong huyết thanh

IV.1 Các kỹ thuật miễn dịch phát hiện dấu ấn virut viêm gan B

Các kỹ thuật miễn dịch có thể xếp vào hai nhóm chính:

xạ:

• Kỹ thuật miễn dịch enzyme (enzyme immunoassay, EIA): Kỹ thuật miễn dịch enzyme dùng chất đánh dấu là một enzyme,

enzyme có thể đợc gắn vào hoặc kháng thể hoặc kháng nguyên

Các kỹ thuật EIA có thể chia lam 2 nhóm dựa trên bản chất của

hệ thống phản ứng:

 Nhóm các kỹ thuật EIA cạnh tranh: dựa trên nguyên lý cạnh tranh giữa kháng nguyên trong mẫu huyết thanh với kháng nguyên đánh dấu enzyme để kết hợp với một lợng kháng thể có hạn đợc gắn vào một pha rắn (nh thành ống nghiệm, giếng phiến dẻo, viên bi ) Trong thực hiện

kỹ thuật cạnh tranh không cần tới nhiều bớc

 Nhóm các kỹ thuật EIA bánh kẹp: trong kỹ thuật miễn dịch gắn enzyme pha rắn (ELISA), kháng nguyên muốn tìm bị kẹp giữa một bên là kháng thể bắt giữ gắn cố định trên bề mặt đáy giếng phiến nhựa và một bên là kháng thể

đánh dấu gắn POD

• Kỹ thuật miễn dịch phóng xạ (RIA): là kỹ thuật có độ nhạy cao

để phát hiện các dấu ấn viêm gan Kỹ thuật này có độ nhạy gấp

10 lần hơn so với kỹ thuật ngng kết và 100 lần so với các kỹ thuật thuộc thế hệ thứ hai Phản ứng dựa trên nguyên lý cạnh

tranh hoặc bánh kẹp

24

IV.1.1 Kỹ thuật xác định HBsAg

Kỹ thuật xác định HBsAg dựa trên nguyên lý của kỹ thuật bánh kẹp Sandwich (Kháng nguyên Kháng thể Kháng nguyên ):- -

Anti-HBs đợc phủ lên trên bề mặt các giếng của plate, nhỏ lên trên cộng hợp anti-HBs*HRPO, sau đó nhỏ tiếp mẫu có chứa HBsAg, sẽ tạo phức kháng thể

IV.1.2 Kỹ thuật xác định HBeAg

Kỹ thuật xác định HBeAg dựa trên nguyên lý của kỹ thuật bánh kẹp Sandwich (Kháng nguyên Kháng thể Kháng nguyên ):- -

Kháng thể Anti-HBe đã đợc phủ trên các giếng ở bản nhựa

Rỏ tiếp mẫu xét nghiệm có chứa dịch kháng nguyên HBeAg Kháng nguyên HBeAg có trong mẫu sẽ gắn với kháng thể anti HBe tạo thành phức hợp Anti- -HBe-HBeAg

Thêm cộng hợp kháng thể gắn enzyme Anti HBe*HRPO vào giếng để kháng thể của cộng hợp này gắn với kháng nguyên HBsAg mà trớc đó đã gắn với kháng thể anti-HBe, tạo nên một phức hợp: Anti-HBe*HBeAg*Anti-HBe*HRPO

-25

Cuối cùng bổ sung cơ chất của enzyme là dung dịch TMB không màu, enzyme sẽ thuỷ phân cơ chất làm màu dung dịch chuyển dần sang màu xanh Sau đó nhỏ tiếp 2N HR 2 RSOR 4 R, dung dịch chuyển dần sang màu vàng Đo OD ở bớc sóng 450nm

IV.1.3 Kỹ thuật xác định anti HBe

Kỹ thuật xác định Anti HBe dựa trên nguyên lý của kỹ thuật trung hoà Anti- HBe trong mẫu nghiên cứu bị ức chế bằng cách ủ với huyết thanh có chứa HBeAg nhng không bị ức chế khi ủ với mẫu chứa anti-HBe, đặc tính của kháng nguyên đợc thừa nhận Quy trình phản ứng gồm các bớc sau:

-Plate có gắn Anti-HBe + mẫu chứa Anti-HBe + dung dịch trung hoà (HBeAg), tạo ra phức hợp Plate (Anti-HBe) và HBeAg*Anti-HBe Nếu mẫu không chứa Anti-HBe, HBeAg trong dung dịch trung hoà sẽ phản ứng với Anti HBe phủ -trên plate và tiếp tục thực hiện các phản ứng sau

Plate (Anti-HBe*HBeAg) + Anti HBe*HRPO, Tạo ra phức hợp Plate (Anti- HBe*HBeAg*Anti HBe*HRPO) Phức hợp này cộng với dung dịch TMB -không màu sẽ chuyển dần thành mầu xanh

-Sau đó nhỏ thêm 2N HR 2 RSOR 4 R, dung dịch sẽ chuyển dần thành màu vàng, đo OD

ở bớc sóng 450nm

I V.2 Kỹ thuật PCR

PCR là chữ viết tắt của cụm từ Polymerase Chain Reaction, được dịch là Phản ứng chuỗi trựng hợp Phản ứng PCR là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phõn tử nhằm khuyếch đại (tạo ra nhiều bản sao) một đoạn DNA nhờ enzyme polymerasse mà khụng cần sử dụng cỏc sinh vật sống như E coli hay nấm men

26

Quá trình tổng hợp chuỗi DNA dựa trên nguyên tắc bổ sung của các base nitơ, bắt đầu từ đầu 3, của sợi DNA khuôn mẫu Việc gắn các nucleotide nhờ Taq Polymerase có khả năng chịu đợc nhiệt độ cao Giai đoạn tháo xoắn, tách và gắn mồi đợc thực hiện nhờ thay đổi đột ngột nhiệt độ

Để thực hiện phản ứng PCR cần r t nhi u thành ph n Nhữấ ề ầ ng thành ph n ó ầ đbao gồm:

- DNA mẫu chứa mảnh DNA cần khuếch đại

- Cặp Primer xuôi và ngợc

- Enzyme Taq DNA-polymerase để copy vựng cần khuếch đại

- dNTP mỗi loại để xõy dựng DNA mới

- Dung dịch đệm, cung cấp mụi trường húa học cho DNA-polymerase Phản ứng PCR được thực hiện trong chu kỳ nhiệt

Đoạn mồi

Là một chuỗi oligonucleotide dài khoảng 20 30 nucleotide- (khụng quỏ 50 nucleotides) có trình tự sắp xếp bổ sung đặc hiệu với trình tự các nucleotide trên đoạn DNA cần nhân lên Một cặp mồi xuôi và ngợc sẽ giới hạn một

đoạn DNA đặc hiệu cần nhân lên, chúng xỏc định điểm bắt đầu và kết thỳc vựng cần khuếch đại

Nhiệt độ núng chảy của mồi được định nghĩa là nhiệt độ dưới lỳc mồi bỏm vào DNA mẫu và nhiệt độ trờn lỳc mồi tỏch ra khỏi DNA mẫu Nhiệt độ núng chảy tỉ lệ thuận với chiều dài đoạn mồi Mồi quỏ ngắn sẽ bỏm nhiều vị trớ trờn DNA mẫu dài và sẽ cho kết quả khụng rừ ràng Mặt khỏc chiều dài DNA bị giới hạn bởi nhiệt độ cần núng chảy Nhiệt độ núng chảy quỏ cao, vớ dụ như trờn 80oC sẽ gõy ra nhiều vấn đề vỡ DNA-polymerase hoạt động kộm ở nhiệt

độ đú Chiều dài tốt nhất của đoạn mồi là từ 20 40 nucleotide với nhiệt độ núng chảy khoảng từ 60 – 75oC

-Quy trỡnh

27 Quy trỡnh PCR gồm 20 đến 30 chu kỳ Mỗi chu kỳ gồm 3 bước:

(1) Giai đoạn tháo xoắn: Nhiệt độ tăng lờn 94-960C để tỏch hai sợi DNA ra Thời gian: 1-2 phỳt

(2) Gắn primer: Sau khi 2 sợi DNA tỏch ra, nhiệt độ được hạ thấp xuống để mồi cú thể gắn vào sợi DNA đơn Nhiệt độ giai đoạn này phụ thuộc vào đoạn mồi và thường thấp hơn nhiệt núng chảy (45-60oC) Thời gian: 1 2 phỳt.-

(3) Tổng hợp sợi DNA mới ới tác dụng của enzyme Taq DNA polymerase, Dsợi DNA mới đợc tổng hợp có trình tự bổ sung với sợi DNA đích Nhiệt độ kộo dài phụ thuộc DNA-polymerase Thời gian của bước này phụ thuộc vào

cả DNA-polymerase và chiếu dài mảnh DNA cần khuếch đại

IV.3 Kỹ thuật real time PCR định lợng HBV DNA

Kỹ thuật real time PCR định lợng hay còn gọi là PCR động đã cho phép hiển thị và theo dõi trực tiếp quá trình nhân bản DNA đang diễn ra theo từng chu

kỳ nhiệt qua sử dụng kỹ thuật phát huỳnh quang Dựa vào cờng độ phát huỳnh quang mà có thể định lợng các đoạn DNA hình thành

Ưu điểm nữa của phơng pháp này là do mồi có tính phát quang nên có thể

đánh dấu chúng với các chất nhuộm khác nhau, nhờ thế có thể tiến hành nhân các đoạn khác nhau trong cùng một phản ứng PCR Tuy nhiên phơng pháp này có hạn chế là phải tổng hợp các mẫu dò khác nhau cho các trình tự nhận biết khác nhau

Phơng pháp này khắc phục đợc một số hạn chế của phơng pháp PCR thông thờng nh:

- Không cần chạy điện di kiểm tra sản phẩm PCR

28

- Có thể định lợng chính xác đợc sản phẩm PCR trong khi sử dụng PCR thông thờng việc phân biệt đợc dựa vào độ lớn của vạch thu

đợc sau điện di

- Độ đặc hiệu và độ nhay cao hơn Thời gian phát hiện kết quả phản ứng ngắn

- Có thể tiến hành với nhiều đoạn DNA cùng một lúc trong cùng một ống nghiệm nên giảm khả năng nhiễm mẫu

Có 3 cách thông thờng trong kỹ thuật real time PCR định lợng đó là:

1 Sử dụng đầu dò thuỷ phân (TaqMan, Beacons, Scorpions)

2 Sử dụng cực dò lai (Light Cycler)

3 Sử dụng tác nhân gắn lên DNA (SYBR Green)

Nguyên lý của kỹ thuật định lợng Realtime PCR:

đợc gắn với rãnh nhỏ của chuỗi DNA kép, khi đợc gắn với DNA sợi kép thì cờng độ phát huỳnh quang tăng lên, khi bản sao đợc tạo ra càng nhiều thì tín hiệu phát ra của chất màu sẽ tăng lên theo tỷ lệ thuận u điểm của phơng pháp này là SYBR sẽ đính vào bất kỳ chuỗi phân tử DNA kép nào có mặt

mẫu dò có thể phát huỳnh quang, các mẫu dò là một oligonulceotit trong đó một đầu đợc gắn với chất nhuộm phát huỳnh quang, đầu kia đợc gắn với chất nhuộm có vai trò làm tắt sự phát huỳnh quang Khi có mặt đoạn DNA cần nhân, mẫu dò sẽ gắn vào DNA khuôn ở vùng dới của mồi theo hớng 5”

ở trạng thái này, không có hiện tợng phát huỳnh quang Khi bắt đầu tiến hành quy trình PCR với sự hoạt động của enzyme taq polymerase mồi đợc -

29

kéo dai cho tới khi gặp mẫu dò thì mẫu dò sẽ bị phân giải bởi hoạt tính 5” nuclease của taq-DNA polymerase Sự phân giải mẫu dò sẽ giải phóng chất nhuộm mầu có khả năng phát huỳnh quang khỏi ảnh hởng kìm hãm của chất nhuộm có vai trò làm tắt sự phát huỳnh quang Sự phát huỳnh quang này có thể nhận biết đợc Sự phân giải mẫu dò khỏi đoạn mục tiêu cho phép sự kéo dài mồi cho đến tận cùng của đoạn cần nhân Nh vậy mẫu dò không ngăn cản quá trình PCR Các phân tử chất màu đợc bổ sung vào sẽ đợc giải phóng khỏi mẫu dò ở từng chu kỳ PCR Nh vậy hàm lợng chất phát huỳnh quang sẽ tăng dần theo chu kỳ PCR và tỷ lệ thuận với sản phẩm đợc nhân bản Cờng độ phát huỳnh quang cũng phụ thuộc vào hàm lợng chất màu Qua đó hoàn toàn có thể theo dõi đợc quá trình PCR và định lợng đợc sản phẩm

Phơng pháp sử dụng đầu dò lai:

Trong kỹ thuật này, một đầu dò đợc gắn với một chất cho huỳnh quang ở đầu

3 ’ và một đầu dò thứ hai đợc gắn với một chất nhận huỳnh quang Khi hai

đầu dò này tiến lại gần nhau, cách nhau khoảng 1 5 nucleotide, chất phát quang phát ra từ chất cho huỳnh quang sẽ kích thích chất nhận huỳnh quang

-và kết quả là phát ra tín hiệu huỳnh quang tín hiệu này có thể đợc xác định , trong suốt các giai đoạn của phản ứng PCR Sau mỗi chu kỳ phản ứng PCR nhiều đầu dò lai đợc tạo ra, kết quả là tín hiệu phát quang ngày càng tăng

30

Hình 9: Sơ đồ một số phơng pháp của kỹ thuật real time PCR

Động học của phản ứng real- time PCR.

Delta Rn: Là cờng độ của tín hiệu huỳnh quang, biểu hiện độ sáng.

+Rn là giá trị Rn của một phản ứng bao gồm tất cả các thành phần (các mẫu quan tâm); -Rn là giá trị Rn của chứng âm NTC (baseline)

Delta Rn là giá trị chênh lệch giữa Rn+ và Rn- Đây là giá trị biểu thị độ lớn của tín hiệu huỳnh quang phát ra của phản ứng PCR

Ngoài ra, để thu đợc kết quả trong kỹ thuật real-time PCR, cần phải xây dựng đờng chuẩn dựa trên các nồng độ pha loãng của dung dịch chuẩn đa vào

32

Hình 10: Đồ thị biểu diễn mối tơng quan giữa số chu kỳ phản ứng real-time

và cờng độ tín hiệu phát quang

Nguyên tắc xây dựng đờng chuẩn:

Để xây dựng đờng chuẩn, mỗi lần chạy real-time PCR cần phải xác định 5

điểm chuẩn của 5 nồng độ pha loãng dung dịch chuẩn khác nhau Đờng chuẩn phụ thuộc vào thể tích và nồng độ template đa vào, Nếu nồng độ template đa vào càng cao thì đồ thị lên càng sớm, chu kỳ ngỡng càng nhỏ,

và ngợc lại Nếu thể tích đa vào không bằng nhau thì sai số càng lớn và khó hay không xác định đợc đờng chuẩn

Mỗi một điểm chuẩn, một nồng độ gồm ba giếng, sau đó lấy giá trị trung bình vì mỗi một lần hút pipet do thao tác kĩ thuật có thể không chuẩn nên sẽ dẫn

đến sai số Mỗi một mẫu kiểm tra cũng làm ba giếng, mỗi mẫu chứng âm (non template control) cũng làm ba giếng

33

IV.3 Nguyên tắc thiết kế primer và probe trong kỹ thuật real-time PCR:

Chúng tôi sử dụng phần mềm thiết kế mồi dựa trên cơ sở trình tự gen HBV DNA đã biết, các đoạn gen bảo thủ, các đoạn gen đột biến

Thiết kế probe trớc tiên sau đó thiết kế các primer phù hợp với probe, không trùng lên nhau (Các amplicon của 50 150 cặp base đợc liên kết chặt chẽ với -nhau )

- Kích thớc của amplicon là -50 150 bp (max 400)

- span exon-exon junctions in cDNA

Thiết kế TaqMan Probes

- Tm cao hơn Tm của primer 10P