Phân lập, định danh và xác định hiện trang kháng thuốc kháng sinh của một số chủng vi khuẩn gây bệnh trên cá rô đồng

Trang 1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ NĂM 2020 - 2021 Tên đề tài: PHÂN LẬP, ĐỊNH DANH VÀ XÁC ĐỊNH HIỆN TR

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH

Chủ nhiệm đề tài: TRẦN KIÊN CƯỜNG

Đơn vị công tác: Viện Kỹ thuật Công nghệ cao NTT

Thời gian thực hiện: 6 tháng

TP Hồ Chí Minh, ngày 1 tháng 10 năm 2021

NTTU-NCKH-04

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH

Chủ nhiệm đề tài: TRẦN KIÊN CƯỜNG

Đơn vị công tác: Viện Kỹ thuật Công nghệ cao NTT

Thời gian thực hiện: 6 tháng

Các thành viên phối hợp và cộng tác:

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC HÌNH ẢNH vi

DANH MỤC BẢNG BIỂU vii

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNHTÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU viii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1 Tổng quan về cá rô đồng 2

1.1.1 Phân loại 2

1.1.2 Đặc điểm hình thái 2

1.1.3 Đặc điểm sinh thái 2

1.1.4 Đặc điểm sinh trưởng 3

1.1.5 Đặc điểm sinh sản 3

1.1.6 Tình hình khai thác 3

1.2 Thực trạng kháng kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản 4

1.2.1 Tình trạng lạm dụng kháng sinh trong ngành nuôi trồng thủy sản trên thế giới 4

1.2.2 Hiện trạng lạm dụng kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản ở Việt Nam 6

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 9

2.1 Thu nhận và phân lập chủng vi khuẩn từ mẫu cá bệnh/có dấu hiệu lạ 9

2.2 Các phản ứng sinh hóa 9

2.3 Tách chiết DNA 11

2.4 Giải trình tự 11

2.5 Phương pháp khảo sát loại kháng sinh, sự nhạy cảm của vi khuẩn 12

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 12

3.1 Kết quả về tình trạng nhiễm khuẩn nội tạng của cá bệnh 13

3.2 Kết quả về đặc điểm hình thái các chủng vi khuẩn chiếm ưu thế phân lập và làm thuần 15

3.3 Kết quả định danh sinh hóa các chủng khuẩn phân lập 20

3.4 Kết quả về độ nhạy cảm/tính kháng của vi khuẩn với các kháng sinh 22

3.5 Kết quả về tỷ lệ khuẩn kháng kháng sinh 24

3.6 Kết quả định danh các chủng vi khuẩn đa kháng 26

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 26

TÀI LIỆU THAM KHẢO 29

PHỤ LỤC 3: MINH CHỨNG ĐI KÈM 33

PHỤ LỤC 4: (thuyết minh đề cương) 44

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Cá rô đồng (Anabas testidineus) 2

Hình 2.1 Sơ đồ thực hiện các phản ứng sinh hóa 10

Hình 3.1 Hình ảnh ngoại thể cá rô đồng có dấu hiệu bệnh 14

Hình 3.2 Hình ảnh giải phẫu nội tạng cá rô đồng bệnh 14

Hình 3.3 Hình thái khuẩn lạc phân lập ban đầu trên các mẫu bệnh phẩm thu nhận từ nội tạng của cá rô bệnh 14

DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 3.1 Số chủng vi khuẩn phân lập từ cá rô đồng bệnh thu nhận từ các trang trại cá

giống 20

Bảng 3.2 Các khuẩn lạc phân lập và làm thuần trên môi trường NA 15-19 Bảng 3.3 Danh sách các chủng vi sinh dự kiến từ các sinh hóa cơ bản 24 Bảng 3.4 Tính kháng kháng sinh của các chủng vi sinh phân lập từ cá rô với 10 loại

kháng sinh 26

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH TÓM TẮT KẾT QUẢ

NGHIÊN CỨU

1 Nôi dung 1: Thu mẫu và phân lập

mẫu bệnh phẩm cá có dấu hiệu

bệnh/biểu hiện lạ tại các trang trại

nuôi tại TP.HCM

110 mẫu cá có dấu hiệu lạ từ các trại nuôi, thu nhận được 65 khuẩn lạc khi cấy trên đĩa môi trường nuôi cấy

2 Nội dung 2: Quan sát hình thái,

nhuộm Gram, thực hiện các test

sinh lý sinh hóa gồm :KIA, blood

catalase, TCBS, Simmon citrate

Từ 65 khuẩn lạc ban đầu, cấy làm thuần chọn lọc ra được 14 khuẩn lạc đặc trưng thực hiện các phản ứng sinh hóa, định danh dựa vào hình thái

được 11 chủng vi sinh

3 Nội dung 3: Xác định tính nhạy

cảm với kháng sinh của các

chủng vi khuẩn phân lập

13 chủng vi sinh (trừ chủng XI) được kiểm tra tính kháng kháng sinh, các chủng vi sinh đều kháng lạ nhóm beta-lactam, 2 chủng đa kháng mạnh nhất lần lượt là IV (7/10) và VIII (6/10)

4 Nội dung 4: Giải trình tự 16S

rRNA của một số chủng vi khuẩn

1 1 Bài báo trong nước

Thời gian thực hiện: 6 tháng từ tháng 4/2021-10/2021 Thời gian nộp cuốn báo cáo : 10/2021

MỞ ĐẦU

Cá rô đồng (Anabas testudineus) đang được xem là đối tượng nuôi có giá trị kinh

tế cao, phân bố ở nhiều quốc gia châu Á và thế giới trong đó có Việt Nam Việc lạm dụng kháng sinh, hóa chất kháng khuẩn đã gây nhiều tác động tiêu cực, hệ quả là các thực phẩm thủy hải sản là nguồn chứa các vi khuẩn/gen kháng kháng sinh có thể lây lan từ động vật thủy sản sang người thông qua chuỗi thức ăn đe dọa nghiêm trọng đến sức khỏe

và môi trường Nghiên cứu này đã phân lập được mười bốn chủng vi sinh thuần nhất từ mẫu cá có dấu hiệu lạ thu thập từ các trại nuôi trên địa bàn TP.HCM Trong đó ở đề tài đã định danh ba chủng vi khuẩn là IV, VIII, XIV có mức độ tương đồng khi so sánh trình tự

gen 16S rRNA lần lượt là: Pseudomonas aeruginosa (99,77 %), Aeromonas caviae (99,93%) và Edwardsiella ictaluri (99,44%), có hình thái đặc trưng khi kiểm tra khuẩn

lạc trên các môi trường chọn lọc và các phản ứng sinh hóa Bốn chủng khuẩn định danh trên đều kháng lại nhóm beta-lactam, tetracyclin và một số nhóm kháng sinh khác đang được sử dụng phồ biến trong ngành nuôi trồng thủy sản, cùng với đó là việc đánh giá hành vi cá khi nhiễm bệnh gây ra bời từng loại bệnh khác nhau nhằm tạo ra một dữ liệu tham khảo bệnh tích dùng cho việc chẩn đoán sớm các tác nhân gây hại Kết quả này chỉ

ra được các chủng khuẩn trên cá rô đồng đang lưu hành tại các trại nuôi cũng như một số địa điểm bán ở khu vực TP.HCM và hiện trạng kháng kháng sinh của chúng, chỉ ra hướng giải pháp tiếp theo là tìm nguồn thay thế kháng sinh như là hợp chất thiên nhiên để khắc phục tình trạng kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh trên cá rô đồng

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.3 Đặc điểm sinh thái

Cá rô đồng (Anabas testudineus) sống ở nước ngọt, chúng thường sinh sống được

ở các loại hình mặt nước: ruộng lúa, ao mương, lung bào, đìa, sông rạch, Trên thế giới

cá rô đồng phân bố ở Nam Trung Quốc, Việt Nam, Lào, Campuchia, Thái Lan, Miến Điện, Ấn Độ, Philippines, Châu Phi và các quần đảo giữa Ấn Độ và Châu Úc (Trương Thủ Khoa và Trần Thị Thu Hương, 1993) Khả năng thích nghi với môi trường sống của

cá rô rất tốt, đặc biệt cá có thể hô hấp bằng khí trời nhờ có cơ quan hô hấp phụ (cơ quan

mê lộ), cá có thể tồn tại và phát triển trong điều kiện môi trường bất lợi ngoài tự nhiên

Hình 1.1 Cá rô đồng (Anabas

testudineus)

(Trương Thủ Khoa và Trần Thị Thu Hương, 1993) Điều kiện môi trường nước thích hợp cho cá phát triển có nhiệt độ từ 22ºC đến 36ºC, DO (nồng độ oxi hòa tan) 2 mg/L trở lên, độ mặn cao nhất 5 ppt và độ pH từ 5,5 đến 7,5

1.1.4 Đặc điểm sinh trưởng

Cá rô có tốc độ tăng trưởng chậm, cá cái lớn nhanh và có kích thước lớn hơn cá đực Cá nuôi thâm canh được cung cấp đầy đủ thức ăn, môi trường thuận lợi, sau 6 – 7 tháng nuôi cá đạt trọng lượng trung bình: con cái 80 – 120 g/con, con đực 50 – 80 g/con, con lớn nhất có thể đạt 300 – 400 g/con Cá tăng trưởng mạnh từ 3,5 – 6,5 tháng tuổi Giai đoạn trước và từ sau 6 – 7 tháng tuổi cá cái mang trứng nhưng vẫn tiếp tục tăng trọng chậm, cá đực tăng trọng rất chậm, có con hầu như ngừng tăng trọng (Trương Thủ Khoa và Trần Thị Thu Hương, 1993)

1.1.5 Đặc điểm sinh sản

Mùa sinh sản tự nhiên của cá rô đồng từ tháng 4 đến tháng 8 âm lịch ( tập trung vào mùa mưa tháng 6 – 7) (Ngô Trọng Lư và Thái Bá Hồ, 2003) Buồng trứng và tinh hoàn được nhìn thấy rõ rệt vào tháng giêng và phát triển cực đại vào tháng 4 – 10 ở nhiệt

độ 25 – 29oC Cá đẻ được từ 3 – 4 lần/năm, thời gian tái phát dục của cá là 20 – 30 ngày, sức sinh sản trung bình khoảng 300.000 – 700.000 trứng/kg cá cái Cá đẻ vào lúc mưa to

và thường đẻ vào ban đêm, làm tổ nơi nước cạn Trứng cá rô đồng hình bầu dục, có màu vàng hoặc hơi trắng Đường kính trứng khoảng 0,8 mm, trứng kết thành chùm nổi lơ lửng trên mặt nước (Nguyễn Thành Trung, 1998)

ương giống và nuôi thương phẩm Những dịch bệnh này thường xuyên xảy ra và gây thiệt hại kinh tế lớn cho người nuôi, cá trong ao có thể hao hụt lên đến 20 – 30% sau mỗi đợt

cá bị bệnh

1.2 Thực trạng kháng kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản

1.2.1 Tình trạng lạm dụng kháng sinh trong ngành nuôi trồng thủy sản trên thế giới

Thuốc kháng sinh đã và đang được sử dụng hơn 50 năm qua với mục tiêu khởi điểm bảo vệ và cải thiện sức khỏe con người và động vật (Flynn, 2012) Trong ngành nuôi trồng thủy sản, kháng sinh đóng vai trò phòng trị bệnh do vi sinh vật, cải thiện chuyển hóa thức ăn và thúc đẩy tăng trưởng vật nuôi (Cabello, 2004; Quesada và cs., 2013; Awad, 2017) Oxytetracycline, orfenicol, enrofloxacin và erythromycin là những thuốc kháng sinh đang được phép lưu hành và sử dụng trong nuôi trồng thủy sản trên toàn thế giới (FAO, 2005) Tuy nhiên, vì lợi nhuận trước mắt và nhằm hạn chế thiệt hại kinh tế, các nhà sản xuất/các chủ trang trại thường phớt lờ các nguyên tắc sử dụng kháng sinh với liều lượng thực dùng không chính xác, không đúng cách và không kiểm soát; lâu dần dẫn đến tình trạng kháng kháng sinh và sự tồn dư kháng sinh trong động vật thủy sản

và môi trường (Crumlish và cs., 2002; OIE, 2003; Van và cs., 2005) Thực tế, cá/động vật thủy sản và môi trường nước ao nuôi đang là nguồn chính yếu chứa vi khuẩn và các gen kháng kháng sinh (Heuer và cs., 2009) Năm 2005, Hatha và cộng sự đã công bố khả

năng kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn Aeromonas được phân lập từ cá nước ngọt

Kết quả cho thấy vi khuẩn này có khả năng kháng lại các loại kháng sinh như oxytetracycline, amoxycillin, ampicillin, novobiocin, và polymyxin- B (Hatha, 2005)

Năm 2013, nhóm tác giả gồm Lim và cộng sự đã nghiên cứu sự đa kháng kháng sinh của vi khuẩn phân lập từ các thủy sản nước ngọt Dựa trên kết quả giải trình tự 16S

rRNA, có tổng cộng 20 chủng vi khuẩn được phân lập và chủng Aeromonas sp chiếm ưu

thế hơn các chủng còn lại Ngoài ra, 58,3% các chủng vi khuẩn phân lập được là những chủng thể hiện khả năng đa kháng các loại kháng sinh (Lim et al., 2013)

Năm 2017, tại Bangladesh, Hossain và cộng sự đã nghiên cứu phân lập vi khuẩn

xuất hiện trên cá koi nuôi (cultured Anabas testudineus) Các chủng vi khuẩn sau khi

phân lập được tăng sinh trong môi trường lỏng Brain Heart Infusion (BHI) và sau đó cấy trên các môi trường MacConkey Agar và Blood Agar để kiểm tra Kết quả cho thấy các

chủng vi khuẩn Staphylococcus, S saprophyticus, Pseudomonas, Aeromonas hiện diện ở mang cá và da cá Ngoài ra, các chủng vi khuẩn sau Enterobacter, Escherichia, Shigella,

và Vibrio thì được tìm thấy ở ruột cá (Hossain et al., 2017)

Năm 2019, Chhanda và cộng sự nghiên cứu phân lập được một số chủng vi khuẩn

gây bệnh trên đối tượng cá koi Thái Anabas testudineus và định danh bằng một số test

sinh hóa như Methyl red (MR), Voges-proskaure test, Triple sugar iron test, Indole test, catalase, và simmon citrate Kết quả cho thấy nhóm tác giả đã phân lập được các chủng vi

khuẩn gồm Samonella spp., Shigella spp., Klebsiella spp., và Staphylococcus spp Ngoài

ra, hai chủng vi khuẩn Staphylococcus spp và Samonella spp được xác định là tác nhân

gây bệnh lở loét trên con cá (Chhanda và cs., 2019)

Năm 2019, John Thomas và cộng sự đã nghiên cứu về khả năng gây bệnh do

Pseudomonas aeruginosa gây ra trên cá rô phi Oreochromis mossambicus bằng cách gây cảm nhiễm theo phương pháp tiêm và ngâm Kết quả xác định được Pseudomonas auriginosa gây ra nhiễm trùng (Thomas et al., 2014)

Năm 2020, tại Ấn Độ, nhóm tác giả gồm Haque và cộng sự công bố khả năng gây

bệnh của chủng vi khuẩn Pseudomonas trên cá rô đồng Anasbas testudineus Vi khuẩn ở

các nồng độ 2,0 x 102 CFU/ml, 2,0 x 103 CFU/ml, 2,0 x 104 CFU/ml, 2,0 x 105 CFU/ml,

và 2,0 x 106 được tiêm vào cá Kết quả nghiên cứu cho thấy, cá bị tiêm vi khuẩn đều có những biểu hiện như suy giảm hồng cầu và haemoglobin, nhưng số lượng bạch cầu lại tang mạnh Ngoài ra, khối lượng cá và chiều dài của cá đều bị giảm Mang, gan, và thận

cá bị tiêm đều có chiệu trứng bị hoại tử và tăng sản mô (Haque và ca., 2020)

Ngoài ra, năm 2020, Zdanowicz và cộng sự đã phân lập được chủng vi khuẩn

Aeromonas từ các ao nuôi cá chép Những vi khuẩn thuộc chủng này được kiểm tra sự đa dạng và kháng kháng sinh Kết quả cho thấy các vi khuẩn thuộc chủng Aeromonas thể

hiện khả năng kháng nhiều nhất đối với các loại kháng sinh gồm amoxicillin, ampicillin, clindamycin, và penicillin (Zdanowicz và cs., 2020)

Việc lạm dụng kháng sinh, hóa chất kháng khuẩn đã gây nhiều tác động tiêu cực,

ức chế miễn dịch, kìm hãm tăng trưởng và tích lũy thuốc trong cơ thể cá và các loài động vật thủy sản (FAO, 2003; Harikrishnan và cs., 2011) Hệ quả, các thực phẩm thủy hải sản

là nguồn chứa các vi khuẩn/gen kháng kháng sinh có thể lây lan từ động vật thủy sản

sang người thông qua chuỗi thức ăn Các vi khuẩn gây bệnh này có thể chuyển trực tiếp hoặc gián tiếp các gen kháng kháng sinh sang vi khuẩn gây bệnh trên người, dẫn đến những thất bại liên tiếp của các phương pháp trị liệu truyền thống hoặc việc giảm hiệu quả điều trị tiếp theo (Miranda, 2001; Radu và cs., 2003), đe dọa nghiêm trọng sức khỏe con người và môi trường (Abutbul và cs., 2004; Cabello, 2006)

1.2.2 Hiện trạng lạm dụng kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản ở Việt Nam

Ngày nay, do quy mô thiếu quy hoạch, mật độ nuôi thả cao, các biện pháp nuôi trồng/sản xuất bất hợp lý và các biến động thời tiết khiến tình trạng dịch bệnh thường xuyên xảy ra, kéo dài và ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất, sản lượng và chất lượng cá/thủy hải sản ở Việt Nam Điển hình, bệnh gan thận mủ (Edwardsiellosis) do vi khuẩn

Edwarsiella ictaluri trên các loài cá da trơn, cá tra Pangasianodon hypophthalmus xảy ra

quanh năm, bùng phát vào mùa mưa hoặc mùa lạnh khi nhiệt độ thấp khiến tỷ lệ cá chết/hao hụt nhiều, chi phí điều trị cao và mức thiệt hại nghiêm trọng cho các hộ nuôi cá tra, basa vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long (Ferguson và cs., 2001; Dung và cs., 2004)

Tỷ lệ chết lên đến 100% với cá bột ương giống và khoảng 30 - 50% đối với cá thịt (Dung

và cs., 2010) Điều này khiến kháng sinh, hóa chất tiếp tục lạm dụng thiếu kiểm soát trong phòng trị bệnh nhiễm khuẩn trên cá/động vật thủy sản mặc cho những cảnh báo về tình trạng kháng thuốc trong nhiều năm qua

Theo báo cáo của Rico và cs (2013), 100% các trại nuôi cá tra ở Việt Nam có sử dụng kháng sinh, chiếm tỷ lệ cao hơn hẳn so với Trung Quốc (16%) và Thái Lan (9,7%) Đáng chú ý, dù mức giới hạn tối đa 2 loại kháng sinh cho một trang trại ở các quốc gia Châu Á nhưng các trang trại cá tra ở Việt Nam đã sử dụng hơn 17 hợp chất kháng sinh thuộc 10 nhóm khác nhau (penicillin, aminoglycoside, cephalosporin, quinolone, tetracycline, amphenicols, polymyxin, diaminopyrimidine, rifamycins và sulfonamide); trong đó, phổ biến nhất là enrofloxacin (tỷ lệ sử dụng 69%), florfenicol (63%), sulfamethoxazole tăng cường với trimethoprim (44%) và doxycycline (34%) Một số công thức kháng sinh đang được các trại cá sử dụng là hỗn hợp của 2 kháng sinh như sulfadimethoxine + ormetoprim, sulfamethoxazole + trimethoprim, apramycin + levofloxacin Kháng sinh được trộn vào từng bữa ăn trong mỗi ngày và liên tục từ 3 - 8 ngày Qua khảo sát thực tế tại Việt Nam, các hộ dân nuôi cá tra sử dụng trung bình 3 loại

kháng sinh khác nhau và 10% sử dụng trên 5 - 6 loại kháng sinh khác nhau Hầu hết các

hộ dân sử dụng kháng sinh để điều trị dịch bệnh và chỉ 5% trường cho mục đích phòng ngừa bệnh (Rico và cs., 2013) Tương tự như các trang trại trên thế giới, lượng kháng sinh luôn vượt ngưỡng với liều lượng không chính xác (Dung và cs., 1997; Crumlish và cs., 2002; Phuong và cs., 2005; Van, 2005)

Kết quả kháng gentemycin + streptomycin của hai chủng Streptococcus R17 và

R47 và kháng trimethorime + sulfamethoxazole của chủng R17 phân lập từ 62 mẫu cá rô bệnh đen thân và 4 mẫu cá khỏe mạnh tại 9 ao nuôi ở Cần Thơ và Hậu Giang (Nguyễn Duy Khương, 2011) cho thấy, hiện tượng kháng kháng sinh và sự lan truyền các gen kháng giữa các vi khuẩn gây bệnh thủy sản vào nước ao nuôi hoặc xung quanh khu vực nuôi khi lạm dụng kháng sinh, hóa chất Việc tích lũy tồn dư kháng sinh trong cá/động vật thủy sản và nguồn nước sẽ tác động tiêu cực đến môi trường và sức khỏe người tiêu dùng như đã nêu trên (O’Neill và cs., 2015)

Năm 2012, tác giả Đặng Thị Hoàng Oanh và cộng sự đã nghiên cứu phân lập được

chủng vi khuẩn Streptococcus agalactiae từ đối tượng cá rô đồng là tác nhân gây bệnh

xuất huyết ở cá cũng như cá bị nhiễm bệnh tự nhiên Mười hai mẫu cá rô đồng còn sống nhưng có những biểu hiện bất thường như lờ đờ và xuất huyết được thu thập tại các ao nuôi ở tỉnh Đồng Tháp Vi khuẩn được phân lập từ các mẫu cá rô này và sau đó được định danh dựa trên các chỉ tiêu về hình thái, sinh lý và sinh hóa (Oanh, Như, & Hiền, 2012)

Ngoài ra, trong năm 2012, tác giả Đặng Thụy Mai Thy và nhóm cộng sự sử dụng

hai chủng vi khuẩn A hydrophila và Streptococcus sp phân lập từ cá rô bị bệnh phù mắt

và xuất huyết để gây cảm nhiễm trên cá rô đồng Vi khuẩn được tiêm trực tiếp vào cá ở các nồng độ khác nhau và sau khi tiêm, cá được tiếp tục theo dõi trong 14 ngày Kết quả cho thấy, những nghiệm thức cá bị tiêm vi khuẩn đều có các triệu chứng như cá bơi lờ đờ mất thăng bằng, cá nỏi đầu, và chết (Thy, Cúc, & Lam, 2012)

Năm 2013, Từ Thanh Dung và cộng sự lần đầu tiên nghiên cứu phân lập được

chủng vi khuẩn Streptococcus iniae từ cá rô đồng Anabas testudineus nuôi thâm canh tại

các tỉnh thuộc đồng bằng sông Cửu Long Nhóm tác giả phân lập vi khuẩn từ các mẫu bệnh phẩm từ 114 mẫu cá rô Sau đó, nhóm tác giả tiến hành nhuộm Gram, thực hiện các

test sinh hóa, sinh lý, và giải trình tự gene 16S rRNA để xác định được vi khuẩn

Streptococcus iniae là tác nhân chính gây bệnh đen thân trên đối tượng cá rô đồng (Dung

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thu nhận và phân lập chủng vi khuẩn từ mẫu cá bệnh/có dấu hiệu lạ

Thu mẫu: Cá rô đồng A testudineus bệnh/có dấu hiệu lạ (trọng lượng ~ 5 g) được

thu nhận từ các trang trại cá (Quận 12, Quận 9, Quận 8, Thủ Đức, Cần Giờ, ) để phân lập vi khuẩn gây bệnh Mẫu cá bệnh được chọn dựa trên các biểu hiện ban đầu như: cá lờ

đờ, bơi lội kém linh hoạt, bị cô lập, có dấu hiệu bất thường (vảy bong tróc, đuôi mòn, đầu

và phần nắp mang trầy xước, mang cá nhạt màu ), biểu hiện của bệnh gan-thận-mủ trên đuôi, thân, mắt hoặc bệnh xuất huyết (xuất huyết ở vùng mắt, xung quanh miệng, hậu môn và ở các vây hoặc có dịch bên trong xoang bụng), hoặc cá vừa mới chết Mẫu cá có thể được giải phẫu, cấy vi khuẩn trực tiếp tại địa điểm thu mẫu hoặc được cho vào trong thùng đá (có sục khí) và mang về phòng thí nghiệm để tiến hành công tác phân lập vi khuẩn Thông tin về số mẫu cũng như địa điểm thu mẫu được ghi nhận

Phân lập vi khuẩn từ nội tạng của cá bệnh/có dấu hiệu lạ: Nguồn cá rô đồng

bệnh/dấu hiệu lạđược thu nhận từ các trang trại nuôi cá và địa điểm phân phối thuộc các quận (Quận 12, Quận 9, Quận 8, Thủ Đức, Cần Giờ…) trên địa bàn TP.HCM vào khoảng thời gian tháng 7 - 10 hàng năm Cá thu nhận dựa trên các dấu hiệu bệnh như cá ít ăn/bỏ

ăn, cá bơi lờ đờ; thân đen, xuất huyết; hoặc thân xuất hiện các vết lở loét; vẩy rụng; đuôi mòn/cụt… Các mẫu lách, thận, mang, da, và gan được thu nhận và cấy lên đĩa môi trường Trypton soy agar (TSA, Himedia) Đĩa cấy được ủ 24 giờ ở 28ºC, sau đó các khuẩn lạc rời được chọn làm thuần, tăng sinh và bảo quản trong môi trường Trypton soy broth (TSB, Himedia) bổ sung 15% glycerol ở -80ºC Các chủng vi khuẩn được tái nuôi cấy trên môi trường TSA, kiểm tra đặc điểm, hình thái, và sinh hóa trước khi sử dụng cho các phân tích tiếp theo

2.2 Các phản ứng sinh hóa

Sau khi phân lập được các chủng vi khuẩn từ cá bệnh thì tiến hành thực hiện các phản ứng sinh hóa để kiểm tra và định danh bước đầu Các phản ứng được thực hiện trên các môi trường chọn lọc hoặc thực hiện các phản ứng đặc trưng cho từng vi khuẩn

Hình 2.1 Sơ đồ thực hiện các phản ứng sinh hóa

Nhuộm Gram là phương pháp có thể phân biệt giữa nhóm vi khuẩn Gram dương

và Gram âm Vi khuẩn Gram dương khi nhuộm có màu tím do thành tế bào của chúng có một lớp peptidoglycan dày, do lớp này giữ lại hóa chất tím kết tinh trong dung dịch nhuộm trong thành tế bào Mặt khác, vi khuẩn Gram âm khi nhuộm sẽ màu đỏ, do lớp peptidoglycan trong thành mỏng hơn nên nó không giữ tím kết tinh lại trong quá trình nhuộm (Lương Ngọc Khuê và cs, 2017)

Môi trường MacConkey Agar có tính chọn lọc đối với các sinh vật Gram âm và giúp phân biệt thanh gram âm lên men lactose với thanh gram âm không lên men lactose (Melab Diagnostics, 2010)

Môi trường thạch máu hay Blood Agar, là môi trường dung để kiểm tra khả năng làm tan huyết của vi khuẩn Dựa vào enzyme tiêu huyết hemolysin, thường dùng để phân

biệt các thành viên Staphylococcus, Streptococcus và Enterococcus (Melab Diagnostics,

2010)

Môi trường KIA dùng phân biệt, dựa vào lên men glucose và lactose, sinh hơi và khử lưu huỳnh, thường dùng để phân biệt các thành viên lên men và không lên men lactose trong họ Enterobacteriaceae (Lương Ngọc Khuê và cs, 2017)

Thử nghiệm sinh oxidase là phản ứng dựa vào khả năng sinh enzyme cytochrome oxidase của vi khuẩn, thường dùng để phân biệt họ Enterobacteriaceae (Ox (+)) với họ Pseudomadaceae (Ox (-)) Khi vi sinh vật tiết cytochrome oxidase, enzyme này sẽ oxy hóa chất cho điện tử nhân tạo, chuyển điện tử sang chất nhận điện tử nhân tạo và làm xuất hiện màu tím thẫm trên giấy thử (Lương Ngọc Khuê và cs, 2017)

2.3 Tách chiết DNA

DNA vi khuẩn được tách chiết bằng bô kit tách chiết DNA TopPURE®DNA extraction kit (ABT, Việt Nam) (theo quy trình của nhà sản xuất)

Ly tâm dịch nuôi cấy ở tốc độ 13.000 rpm trong 5 phút, sau đó huyền phù trong

200 µl PBS (Phosphate-buffered saline), tiếp đó thêm 20 µl Proteinase K Thêm 200 µl

trộn đều và chuyển hỗn hợp sang cột silica đặt sẵn trong tube 2 mL Ly tâm ở tốc độ 13.000 rpm trong 60 giây Giữ lại cột và loại bỏ phần chất lỏng dưới đáy Đặt lại cột vào tube 2 ml cũ Thêm 500 µl WB1 (Washing buffer) buffer và ly tâm ở tốc độ 13.000 rpm trong 60 giây Giữ lại cột và loại bỏ phần chất lỏng dưới đây Đặt lại cột vào tube 2 ml

cũ Thêm 500 µl WB2 buffer và ly tâm ở tốc độ 13.000 rpm trong 60 giây Giữ lại cột và loại bỏ phần chất lỏng ngay bên dưới Đặt lại cột vào tube 2 ml cũ Làm khô cột bằng cách ly tâm ở tốc độ 13.000 rpm trong 60 giây Chuyển cột sang tube 5 ml mới Thêm 50

µl EB ( Elution Buffer) buffer và ủ 1 phút ở nhiệt độ phòng Ly tâm ở tốc độ 13.000 rpm trong 60 giây, thu phần dịch chứa DNA bên dưới DNA thu được sử dụng ngay hoặc bảo quản ở -20oC

2.4 Giải trình tự

Mẫu được gửi giải trình tự gene với mồi đặc hiệu bằng phương pháp Sanger sequencing (Nam Khoa, Việt Nam) Kết quả giải trình tự được kiểm tra lại bằng phần mềm DNASTAR 5.01 và công cụ BLAST của cơ sở dữ liệu NCBI

2.5 Phương pháp khảo sát loại kháng sinh, sự nhạy cảm của vi khuẩn

Tính nhạy cảm kháng sinh của vi khuẩn được xác định bằng phương pháp đĩa khuếch tán (disk diffusion assay) của Kirby-Bauer (Bauer và cs., 1966) trên môi trường thạch TSA/MHA dựa theo tiêu chuẩn của Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2011) Đĩa giấy kháng sinh được đặt lên đĩa vi khuẩn đã trải đều trên môi trường MHA (0.5 McFarland, theo hướng dẫn của CLSI 2011) Trong nghiên cứu này, 10 loại kháng sinh được chọn để thực hiện kháng sinh đồ với 13 chủng vi khuẩn phân lập và làm thuần được, gồm Am - Ampicillin; Ax - Amoxicillin; Cp - Cefalexin; Ci - Ciprofloxacin;

Of - Oxfloxacin; Te - Tetracilin; Dx - Doxycyclin; Cl - Clindamycin; CL - Chloramphenicol; Er - Erythromycin (Mekophar, Việt Nam) Sau đó, các đĩa thạch được

ủ 24 giờ ở 28oC và ghi nhận sự kháng theo CLSI (2011)

Chuẩn bị dịch huyền phù vi khuẩn: dùng que cấy tiệt trùng lấy khuẩn lạc cho

vào ống nghiệm chứa 5 ml nước muối sinh lý NaCl 0,85% đã tiệt trùng Trộn đều và so sánh độ đục với ống McFarland số 3 (9,7 ml H2SO4 1% và 0,3 ml 1% BaCl2) Nếu độ đục ngang bằng với ống chuẩn McFarland thì mật số vi khuẩn trong ống nghiệm khoảng 9×108 CFU/ml Dùng pipet tiệt trùng hút lần lượt 0,1 ml dung dịch vi khuẩn cho lên môi trường thạch TSA và trãi đều vi khuẩn đến vừa khô Để yên khoảng 1 phút rồi dùng pel tiệt trùng lấy đĩa kháng sinh đặt vào đĩa petri sao cho khoảng cách giữa 2 tâm của đĩa thuốc kháng sinh khoảng 24 mm và khoảng cách giữa tâm đĩa kháng sinh với mép đĩa petri khoảng 10 – 15 mm Mỗi đĩa thạch dán tối đa 5 đĩa kháng sinh Sau khi hoàn tất việc dán đĩa thuốc kháng sinh thì đặt đĩa vào tủ ấm ở 28 - 30oC

Đọc kết quả: sau 24 - 48 giờ, trên bề mặt đĩa thạch xuất hiện các vòng tròn không

có vi khuẩn phát triển (vòng vô khuẩn) Đo đường kính vòng vô khuẩn (mm) và dựa theo tiêu chuẩn của CLSI, 2011 để xác định tính kháng (resistant, R), nhạy trung bình (intermediate, I) và nhạy cảm (susceptible, S) của vi khuẩn đối với các loại kháng sinh

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Kết quả về tình trạng nhiễm khuẩn nội tạng của cá bệnh

Từ 110 mẫu cá rô đồng A testudineus bệnh/có dấu hiệu lạ thu nhận từ năm trang

trại cá giống thuộc các quận trên địa bàn TP.HCM (Quận 12, Quận 9, Quận 8, Thủ Đức, Cần Giờ, ), công việc lựa chọn ra số cá có dấu hiệu bất thường/biểu hiện bệnh rõ ràng, đặc trưng nhất để giải phẫu thu mẫu bệnh phẩm Từ đó, công việc thu nhận được 65 khuẩn lạc trên môi trường ban đầu TSA, cụ thể gồm 14 chủng ở Quận 8 (chiếm 21,54%),

14 chủng ở Quận 9 (chiếm 21,54%), 11 chủng ở Quận 12 (chiếm 16,92%), 14 chủng ở Thủ Đức (chiếm 21,54%), và 12 chủng ở Cần Giờ (18,46%) Nhìn chung, hầu hết các chủng vi khuẩn đều được phân lập từ các cơ quan như gan (30/65 chủng, chiếm 46,15%), thận (19/65 chủng, chiếm 29,23%) và tỳ tạng (18/65 chủng, chiếm 27,69%) của cá rô

đồng bệnh (Bảng 3.1)

Bảng 3.1 Số chủng vi khuẩn phân lập từ cá rô đồng bệnh thu nhận từ các trang trại cá

giống

*Các số trong dấu ngoặc là số chủng vi khuẩn phân lập từ cơ quan cá bệnh gan-thận-mủ

và cá nhiễm kép hai bệnh gan-thận-mủ và xuất huyết

Ngoài các dấu hiệu cảm quan ban đầu, cá rô bệnh khi thu nhận đều lờ đờ, bơi lội kém linh hoạt, cá bệnh bị những con cá khác cắn hoặc cô lập, vảy bong tróc, đuôi mòn, đầu và phần nắp mang trầy xước, mang cá nhạt màu, kèm theo biểu hiện đặc trưng bệnh gan-thận-mủ (cá bệnh có các đốm trắng nhỏ li ti trên da, gan, thận và tỳ tạng) hoặc bệnh xuất huyết (xuất huyết ở vùng mắt, xung quanh miệng, hậu môn và ở các vây hoặc có

dịch bên trong xoang bụng) hoặc có dấu hiệu nhiễm kép hai loại bệnh trên được thu ở các

ao nuôi (Hình 3.1 và Hình 3.2)

Hình 3.1 Hình ảnh ngoại thể của cá rô

đồng bệnh Cá bệnh được thu từ trại cá

giống với các dấu hiệu bệnh/có dấu hiệu

lạ bên ngoài, như (A) đầu và mang cá bị

tróc và xuất huyết; (B) da bị bong tróc

vảy và có dấu hiệu xuất huyết dưới da;

(C) đuôi bị ăn mòn, ngắn hơn so với bình

thường

Hình 3.2 Hình ảnh giải phẫu nội tạng cá

rô đồng bệnh Cá bệnh được giải phẫu

và ghi nhận tình trạnh nội tạng, như (A) gan bầm đỏ, xuất hiện một vài đốm trắng; (B) tỳ tạng sưng to bất thường; (C) thận có màu đỏ bầm, có dấu hiệu sưng to

Kết quả sau 24 - 48 giờ nuôi cấy vi khuẩn từ mẫu bệnh phẩm của của cá rô bệnh

trên môi trường TSA (Hình 3.3) thu nhận được một tổ hợp các chủng vi khuẩn dựa theo

nhận định về hình thái khuẩn lạc ban đầu Các chủng vi khuẩn này sẽ được làm thuần và bảo quản trong trong môi trường BHIB, glycerol 15% ở -80oC cho các phân tích tiếp theo

Hình 3.3 Hình thái khuẩn lạc phân lập ban đầu trên các mẫu bệnh phẩm thu nhận từ nội

tạng của cá rô bệnh (A) Khuẩn lạc thu được từ mẫu bệnh phẩm gan, thận, tỳ tạng (lách),

và mang; (B) khuẩn lạc thu được từ mẫu bệnh phẩm da thân, và đuôi

3.2 Kết quả về đặc điểm hình thái các chủng vi khuẩn chiếm ưu thế phân lập và làm

thuần

Từ 110 mẫu cá rô đồng A testudineus bệnh/có dấu hiệu lạ thu nhận từ năm trang

trại cá giống thuộc các quận trên địa bàn TP.HCM, 65 khuẩn lạc phát triển trên môi

trường chọn lọc ban đầu TSA Sau mỗi 24 giờ cấy chuyển nhiều lần để làm thuần các

khuẩn lạc nghi ngờ trên môi trường NA, nghiên cứu chọn lọc được 14 chủng thuần nhất

(I - XIV) dựa theo đặc điểm hình thái khuẩn lạc ban đầu (Bảng 3.2) Các chủng vi khuẩn

sau khi tách khuẩn lạc thuần sẽ được trữ trong trong môi trường BHIB chứa glycerol 15%

ở -80oC Các đặc điểm về hình thái, sinh lý và sinh hóa cơ bản của chủng khuẩn sẽ được

kiểm tra trước khi sử dụng cho các phân tích tiếp theo

Bảng 3.2 Các khuẩn lạc phân lập và làm thuần trên môi trường NA

I

- Khuẩn lạc tròn, trơn bóng Phần trung tâm nhô

lên

- Có quầng sáng bên ngoài Phần trung tâm

chuyển sang màu trắng đục Diện tích quầng sáng

lớn hơn diện tích phần trắng đục

- Lưu ý: tăng sinh trong 48 tiếng

II

- Khuẩn lạc hình răng cưa Bề mặt không bằng

phẳng Phần trung tâm không nhô lên

- Quầng sáng bên ngoài và phần trung tâm tạo

thành hai phần rõ rệt Phần trung tâm màu trắng đục

hơi ngả vàng Diện tích quầng sáng nhỏ hơn diện

tích phần trung tâm

III

- Khuẩn lạc to, hình thái không ổn định Bề mặt

không trơn nhẵn: lồi lên ở quầng sáng xung quanh

và lõm xuống ở phần trung tâm

- Vòng bên ngoài có màu trắng đục Phần trung

tâm có màu trắng trong

IV

- Khuẩn lạc tròn, trong suốt Viền ngoài hơi nhăn

Vùng trung tâm bóng và không lồi

- Khuẩn lạc làm môi trường chuyển màu xanh

xám (còn trong suốt) thành tối đen sau một tuần

nuôi cấy

- Màu trong suốt và đục dần về phía bên trong

V - Khuẩn lạc hình tròn Bề mặt trơn bóng, lồi

- Màu sắc trong suốt và đồng đều

VI

- Khuẩn lạc tròn; dạng lồi, trơn bóng

- Màu sắc đồng đều, trong suốt, ngả vàng

- Khuẩn lạc làm thay đổi môi trường sang màu

- Khuẩn lạc tròn, hơi nhăn

- Vòng ngoài trong suốt và đục dần vào bên trong

- Làm đổi màu môi trường ít

IX

- Khuẩn lạc tròn Bề mặt bóng, lồi lõm

- Phân thành 3 lớp rõ rệt: viền ngoài màu trắng

đục, phần kế tiếp màu trắng trong, lớp tiếp theo

màu trắng đục và phần trung tâm trong cùng có

màu trắng trong

X

- Khuẩn lạc tròn Bề mặt bóng, không bằng phẳng:

viền ngoài nhô ra và phần trung tâm lõm xuống

- Viền ngoài cùng màu trắng đục, phần giữa màu

trắng trong, và phần trung tâm nhô lên có màu trắng

đục

XI

- Khuẩn lạc tròn Bề mặt trơn bóng, không bằng

phẳng, phần trung tâm nhô lên

- Viền ngoài có màu trong suốt, phần trung tâm có

màu trắng đục

- Khuẩn lạc làm đổi màu môi trường thành màu

hơi ngả vàng

- Khuẩn lạc hình tròn Bề mặt trơn bóng và lồi

- Màu sắc trong suốt, vàng sậm Khuẩn lạc làm

môi trường đổi màu vàng nhạt

XIV - Khuẩn lạc tròn Bề mặt nhám, không lồi lõm

- Màu sắc hơi đục và đồng đều

3.3 Kết quả định danh sinh hóa các chủng khuẩn phân lập

14 chủng vi khuẩn sau khi phân lập từ cá bệnh được tiến hành sàng lọc trên ba môi trường chọn lọc MacConkey, thạch máu, và TCBS Loại bỏ mẫu XI (do khuẩn lạc không mọc/xuất hiện trên TSA) 2 mẫu (X và XII) chưa xác định được tên chủng do khuẩn lạc mọc rất yếu nên cũng sẽ bị loại bỏ trong nghiên cứu này Từ đó, một số nhận định ban

đầu được đưa ra: 11 vi khuẩn phân lập được dự đoán thuộc các chi Yersinia spp., Vibrio spp., Pseudomonas spp., Aeromonas spp., Shigella spp., Staphylococcus spp., Klebsiella

spp., Enterobacter spp., và E.coli (Bảng 3.3) Các kết quả định danh sơ bộ dựa trên đặc

điểm hình thái và sinh hóa này có sự trùng khớp với một số nghiên cứu trước đây về vi

sinh vật trên các loài thủy sản nước ngọt và ở cá rô đồng A testudineus Tuy nhiên, từ

trước đến nay, các công bố tại Việt Nam chưa tập trung khảo sát và đánh giá về bệnh

nhiễm khuẩn gây bệnh và gây chết cá rô đồng A testudineus Như vậy, việc đánh giá tình

trạng nhiễm khuẩn nội quan và phân lập các chủng vi khuẩn từ cá rô đồng bệnh trên địa bàn TP.HCM sẽ cung cấp thông tin cơ bản, chính xác ban đầu cho các nghiên cứu bệnh học thủy sản và cá nước ngọt tiếp theo

Các chủng vi khuẩn phân lập được đều đã được phát hiện ở các nghiên cứu trước đây Các yếu tố nêu trên sẽ gây mất cân bằng hệ vi sinh vật trong cơ thể vật chủ và tạo điều kiện cho các hại khuẩn bùng phát Hệ vi khuẩn gây bệnh trên cá/động vật thủy sản

rất đa dạng và phức tạp, phổ biến như Streptococcus agalactiae, Lactococcus garvieae, Enterococcus faecalis (Gram dương), Aeromonas hydrophila và Yersinia ruckeri (Gram âm)… (Waczak và cs, 2017) Trong đó, chi Aeromonas được biết đến với ít nhất 31 loài,

chuyên gây bệnh xuất huyết, lở loét trên hầu hết các loài động vật thủy sản, đặc biệt trên

cá da trơn (Từ Thanh Dung, 2010) Ngoài ra, Begum cùng nhóm nghiên cứu (2013) từ

257 mẫu vi khuẩn phân lập từ các cơ quan của cá rô bệnh, nước và bùn trong hồ nuôi

được xác định: Pseudomonas spp (21,40%), Aeromonas spp (33,46%), Vibrio spp (14,78%), Salmonella spp (21,40%) và E coli (8,94%) Việc xác định được các chủng vi khuẩn thuộc Pseudomonas spp, Shigella spp, Staphylococcus spp., Klebsiella spp., Enterobacter spp và E.coli trong nghiên cứu này cho thấy được hiện trạng nhiễm bệnh

trên cá rô tại một số khu vực TP.HCM, đồng thời những chủng vi khuẩn có nguy cơ lây nhiễm sang người khi sử dụng cá bị bệnh làm thực phẩm

Bảng 3.3 Danh sách chủng vi sinh vật dự kiến từ các phản ứng sinh hóa cơ bản

STT

Tên dự kiến Macconkey

TCBS (sau 48giờ)

Nhuộm Gram

Blood agar Catalase

Simmon citrate

KIA

Oxidase Reactions

Red: Alk Yellow: Acid

I - Khuẩn lạc nhỏ

II - Khuẩn lạc nhỏ, màu vàng nhạt, tâm màu đen + - β + + Alk-Acid - - + Vibrio spp

III - Khuẩn lạc rất lớn, không tròn đều viền trắng nhạt và đục

IV - Khuẩn lạc nhỏ vừa

viền trong và đục dần ở giữa - - β + + Alk-Alk - - + Pseudomonas spp

VI Khuẩn mọc yếu Khuẩn lạc tròn, trơn, có màu vàng nhạt - + α + - Alk-Acid - - - Staphylococcus spp

VII + Khuẩn lạc lớn, tròn đều, viền trong nhân trắng hơi ngả

E.coli

VIII - Khuẩn lạc to vừa tròn đều, trắng đục + - β + - Alk-Acid - - + Aeromonas spp

IX - Khuẩn lạc lớn, tròn đều, viền trong, nhân trắng đục - - γ + + Acid-Acid ++ - - Enterobacter spp

XIII Khuẩn mọc yếu Khuẩn lạc nhỏ, tròn, lồi, màu vàng chanh - + α + - Alk-Acid - - - Staphylococcus spp

XIV - Khuẩn lạc to, tròn đều, viền trong, nhân trắng đục - - β + + Alk-Acid + + - Edwardsiella spp

3.4 Kết quả về độ nhạy cảm/tính kháng của vi khuẩn với các kháng sinh

Đường kính vùng ức chế tính ra mm được so sánh với các giá trị dựa theo tiêu chuẩn do CLSI công bố (2011) để nhận định tính nhạy cảm (S), nhạy trung bình (I) hay

kháng (R) (Bảng 3.4)

Trong nghiên cứu này, 10 loại kháng sinh được chọn để thực hiện kháng sinh đồ với 13 chủng vi khuẩn chọn lọc được, gồm Am, Ax, Cp, Ci, Of, Te, Dx, Cl, CL, Er (Mekophar, Việt Nam) Sau đó, các đĩa thạch được ủ 24 giờ ở 37oC và ghi nhận sự kháng theo CLSI (2012) Môi trường sử dụng làm thử nghiệm kháng sinh đồ là môi trường thạch đĩa TSA/MHA có độ dày 4 mm (Bauer, 1966)

Chủng vi khuẩn thử nghiệm đã làm thuần và đang ở giai đoạn phát triển mạnh (nuôi cấy sau 18 - 24 giờ) và nên từ môi trường không có chất chọn lọc như cấy trên thạch thường, thạch máu… So sánh độ đục của huyền dịch vi khuẩn với độ đục của ống McFarland 0,5 và hiệu chỉnh nồng độ vi khuẩn tương đương McFarland 0,5 Sau 24 - 48 giờ, bề mặt đĩa thạch xuất hiện các vòng tròn không có vi khuẩn phát triển (vòng vô khuẩn) Đường kính vòng vô khuẩn (mm) được đo và dựa theo tiêu chuẩn của CLSI,

2011, để nhận định tính nhạy cảm (susceptible, S), nhạy trung bình (intermediate, I) hay kháng (resistant, R)