Xây dựng mô hình toán họ để điều khiển kết thú quá trình thuỷ phân tinh bột sắn bằng enzym

Tạo ra được một sản phẩm mong muốn thông qua con đường sử dụng phản ứng thủy phân bằng enzym thường rất phức tạp, mất nhiều thời gian và tốn công do phải thí nghiệm quá nhiều cho đến lúc

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

Phần I MỞ ĐẦU

Từ xưa đến nay, thực phẩm luôn là mối quan tâm hàng đầu trong vấn đề duy trì và phát triển xã hội loài người Cùng với sự phát triển của tiến bộ khoa học và kĩ thuật, ngành khoa học về chế biến thực phẩm cũng phát triển tương xứng, tạo ra sản phẩm đa dạng, đáp ứng nhu cầu ngày càng khắt khe của người tiêu dùng

Phản ứng thủy phân bởi enzym là một mắt xích quan trọng trong chuỗi cung cấp thực phẩm Các sản phẩm được tạo ra thông qua con đường này thường có tính chất riêng biệt, đặc trưng và có giá trị dinh dưỡng cao như: sữa chua, phomat, dưa muối, kim chi, đồ uống lên men: rượu vang Sau khi qua quá trình phản ứng, sản phẩm được biến đổi mạnh mẽ từ các thành phần bên trong sản phẩm

Có được sự biến đổi có tính đột biến này là do sự tác động đồng thời của rất nhiều yếu tố lên cơ chất với những cơ chế phản ứng đặc biệt phức tạp mà cho đến nay các nhà khoa học vẫn đang tiếp tục tìm hiểu các cơ chế của chúng

Tạo ra được một sản phẩm mong muốn thông qua con đường sử dụng phản ứng thủy phân bằng enzym thường rất phức tạp, mất nhiều thời gian và tốn công do phải thí nghiệm quá nhiều (cho đến lúc tạo ra sản phẩm mong muốn) hoặc thí nghiệm lần lượt thay đổi các yếu tố tác động lên quá trình phản ứng Các phương pháp này thường không ổn định, dễ gây sai số, không đi đến bản chất của quá trình do không nắm rõ tác động tương hỗ giữa các yếu tố tham gia vào quá trình thủy phân, đồng thời không thấy được xu hướng của quá trình khi biến đổi đồng thời các yếu tố ảnh hưởng

Với mong muốn tạo ra các sản phẩm như ý thông qua quá trình thủy phân, luận văn này nghiên cứu xây dựng mô hình toán học điều khiển kết thúc quá

trình phản ứng thủy phân bằng enzym

Trong các loại enzym đã được biết tới, enzym thủy phân tinh bột đóng vai trò quan trọng và có nhiều ý nghĩa trong việc tạo ra các sản phẩm là nguyên liệu tạo ra rất nhiều sản phẩm thuộc nhiều ngành công nghiệp khác nhau như công nghiệp bánh kẹo, đồ uống, mỹ phẩm…

Trong luận văn này lựa chọn enzym thủy phân tinh bột sử dụng bột sắn làm đối tượng nghiên cứu

Luận văn giải quyết những vấn đề sau đây:

1 Lựa chọn phương pháp thuỷ phân bột sắn

2 Lựa chọn các nguyên liệu và loại enzym phù hợp cho thực hiện phản ứng thuỷ phân

3 Xây dựng phương pháp thực nghiệm

4 Tiến hành thực nghiệm lấy số liệu

5 Xây dựng đường hồi quy thực nghiệm dựa trên các số liệu có được

6 Đưa ra phương pháp để lựa chọn được các kết quả đầu ra theo mong mong muốn Đây được coi là điểm kết thúc quá trình phản ứng

7 Đưa ra các kết luận về phương pháp và các điểm cần được phát triển, đòi hỏi có thời gian nghiên cứu sâu hơn

Phần II TỔNG QUAN II.1 Cấu tạo và thành phần hóa học của sắn

–

Cây sắn khoai mỳ (Manihot esculenta Crantz) là một trong số những cây

có củ mọc ở hơn 80 quốc gia có khí hậu nhiệt đới ẩm trên thế giới Ở nước ta sắn được phân loại thành:

+ Sắn đắng: loại này lớp vỏ dày của củ có màu trắng, thân cây thấp, đốt ngắn, cuống lá màu tím, tán lá xum xuê Loại này cho lượng tinh bột cao, năng suất cao và tương đối ổn định

+ Sắn ngọt: chứa ít độc tố, có thể ăn tươi, cuống lá màu xanh, đốt dài, vỏ

củ dày màu trắng gọi là sắn xanh

+ Sắn đỏ: cuống lá màu tím, cây cao, vỏ củ màu đỏ, cuống củ dài đến

10 ÷ 12 cm Loại này trên 12 tháng mới cho tỷ lệ tinh bột cao

+ Sắn chuối: củ mập, cuống củ nhỏ, sắp xếp củ xung quanh như nải chuối, vỏ củ dày màu hồng

+ Sắn nghệ: đây là một loại sắn không trồng phổ biến Loại này có vỏ dày màu vàng

Trong cây sắn củ sắn là nơi có nhiều tinh bột nhất Cấu tạo của củ sắn gồm

ba phần chính: vỏ, thịt củ và lõi; ngoài ra còn có cuống và rễ củ

Vỏ gồm vỏ gỗ và vỏ cùi Vỏ gỗ có màu nâu xẫm, chủ yếu là cellulose Lớp vỏ này mỏng nhưng rất cứng, có nhiệm vụ bảo vệ phần bên trong không

bị tác động bên ngoài, đồng thời hạn chế mất nước của củ Vỏ gỗ liên kết không bền với vỏ cùi, do đó dễ mất khi thu hoạch và vận chuyển Tỷ lệ vỏ gỗ phụ thuộc giống sắn độ già và khối lượng củ, thường vào khoảng 1,5 ÷ 2%

Vỏ cùi dày khoảng 1 ÷ 3 mm và chiếm 8 ÷ 15% khối lượng củ Vỏ cùi gồm lớp tế bào mô cứng phủ ngoài Thành phần lớp này cũng chủ yếu là cellulose, hầu như không chứa tinh bột nhưng chứa nhiều dịch bào (mủ sắn) Trong

thành phần dịch bào có chứa các polyphenol Tiếp theo là lớp tế bào mô mềm, lớp này ngoài dịch còn có chứa khoảng 5% tinh bột Các polyphenol, enzym

và linamarin có tác dụng bảo vệ củ phát triển bình thường trước thu hoạch, nhưng lại gây trở ngại cho bảo quản và chế biến Tổng lượng các chất

polyphenol trong sắn khoảng 0,1 0,3%, trong đó đến 85 90% tập trung ở ÷ ÷

vỏ cùi

Sau vỏ cùi là khe mủ nơi lưu thông giữa vỏ cùi và thịt củ Do tác dụng - này nên liên kết giữa vỏ cùi với thịt sắn không bền, dễ tách vỏ khỏi thịt sắn Lớp nối tiếp là tầng sinh gỗ Tiếp sau tầng sinh gỗ là thịt sắn chứa nhiều tinh bột, protein và các chất dầu Hàm lượng tinh bột trong thịt sắn phân bố không đồng đều, lớp thịt gần vỏ cùi chứa nhiều tinh bột hơn cả và càng gần lõi củ lượng tinh bột càng giảm Các chất polyphenol, độc tố và enzym chứa ở thịt

củ tuy không nhiều, chỉ 10 15% so với chúng có trong củ nhưng vẫn gây trở ÷ngại khi chế biến như làm biến màu, sắn bị chảy mủ sẽ khó thoát nước khi sấy hoặc phơi khô

Lõi sắn nằm ở trung tâm củ, chạy suốt từ đầu đến cuối củ Thành phần lõi sắn chủ yếu là cellulose Lõi có chức năng dẫn nước và các chất dinh dưỡng giữa cây và củ, đồng thời giúp thoát nước khi sấy hoặc phơi khô

Thành phần hóa học của củ sắn tươi phụ thuộc vào giống loại, thời tiết, điều kiện canh tác và còn phụ thuộc thời gian đào dỡ sắn Thành phần hóa học của sắn tươi như sau:

Bảng II-1 Thành phần hóa học trung bình của sắn tươi

Chất khoáng trong sắn gồm có Ca, Mg, K, Na, P

Sắn còn chứa một lượng độc tố có tên là phaseolunatin Chất này không tan trong rượu, ete, nhưng hòa tan nhiều trong nước Dưới tác dụng của HCl hoặc enzym, phaseolunatin bị phân hủy và giải phóng ra HCN HCN sinh ra tác dụng với sắt tạo thành chất có màu xanh Vì vậy khi chế biến nếu không tách nhựa sớm thì tinh bột sắn sẽ có màu xanh xám

Tanin và các sắc tố trong sắn cũng làm cho bột sắn có màu xám Vì trong quá trình chế biến sắn, tannin dễ bị oxy hóa bởi O2 không khí và tác dụng với sắt (của thiết bị) tạo thành sắt tannate

Nước trong củ sắn rất cao (> 60%), thúc đẩy hoạt động sinh lý của sắn và sự phát triển vi sinh vật trên sắn, làm sắn dễ hư hỏng Đồng thời trong sắn còn có

nhiều loại enzym hoạt động Muốn bảo quản sắn lâu ngày, người ta thái sắn thành lát hoặc chế biến thành bột rồi phơi sấy đến độ ẩm thích hợp.

II.2 Đặc tính nguyên liệu tinh bột

Tinh bột là polysaccharide chủ yếu có trong các hạt hòa thảo, trong củ, thân cây và lá cây Lượng tinh bột ở hạt ngô và lúa mỳ vào khoảng 60 ÷ 75% Trong hạt lúa có thể đạt từ 75 ÷ 80% Tinh bột cũng có nhiều ở các loại củ như khoai tây, sắn, củ mài Một lượng tinh bột đáng kể cũng thấy ở các loại quả và cả ở nhiều loại rau Tinh bột có vai trò dinh dưỡng đặc biệt lớn vì trong quá trình tiêu hóa chúng bị thủy phân thành đường glucose là chất tạo nên nguồn calo chính của thực phẩm cho con người [16]

Trong hạt, tinh bột tồn tại dưới dạng các hạt có kích thước biến đổi từ 0,02 ÷ 0,12 mm Hạt tinh bột của các loại hạt khác nhau có hình dáng và kích thước khác nhau Hạt tinh bột khoai tây có kích thước lớn hơn cả, còn hạt tinh bột của lúa có kích thước nhỏ hơn Hạt tinh bột lúa mỳ, lúa mạch có cấu tạo đơn giản còn hạt tinh bột ngô lúa có cấu tạo phức tạp Khi tác dụng với iodine tinh bột cho màu rất đặc trưng Phản ứng này dùng để định tính tinh bột[3,17]

II.2.1 Cấu tạo của tinh bột

Tinh bột không phải là một chất riêng biệt Nó bao gồm hai cấu tử là

amylose (AM) và amylopectin (AP) AM thường chiếm 12 ÷ 25%, còn AP chiếm 75 ÷ 85% phân tử tinh bột [16]

-AM và AP đều là α polysaccharide và đều do các gốc α-D-glucose cấu tạo nên AM có trọng lượng phân tử từ 3,105 ÷ 1,106 được cấu tạo từ 200 ÷ 2000 gốc D glucose Các gốc glucose nối với nhau bằng liên kết - α-1,4 glucoside và tạo thành một mạch xoắn dài Cấu trúc xoắn được giữ vững nhờ liên kết

hydro được tạo thành giữa các nhóm OH tự do

Chiều dài cực đại của phân tử AM đạt tới 7000 Å Mỗi vòng xoắn của

của mạch AM gồm 3 gốc glucose và có chiều dài mạch là 10,6 Å Trong dung dịch mạch xoắn của AM co lại, vòng xoắn lớn lên và gồm 6 gốc glucose [17].

Hình II-1 Cấu trúc của Amylose

AP được cấu tạo từ 600 ÷ 37000 gốc D glucose Chúng gắn với nhau bằng các liên kết α-1,4 và -1,6 glucoside Chiều dài trung bình của mạch có nhánh α

-tự do gồm 21 ÷ 27 gốc glucose (có trường hợp chỉ 15 ÷ 18 gốc) AP có phân

tử lượng trong khoảng 107 ÷ 108 trong khi phân tử lượng của AM chỉ khoảng 5.105 ÷106 Người ta còn thấy một số liên kết 1,3 glucoside trong tinh bột α-Trong thành phần của AP còn có một ít phosphor (0,012 ÷ 0,111%) Phosphor được gắn vào nguyên tử carbon thứ 6 của gốc glucose

Hình -2 II Cấu trúc của Amylopectin

II.2.2 Tính chất của tinh bột

Hai cấu tử của tinh bột là AM và AP do cấu tạo hóa học khác nhau mà tính chất lý học cũng khác hẳn nhau AM tác dụng với iodine sẽ tạo thành phức

hợp màu xanh do iodine bị hấp phụ trên bề mặt phía trong của mạch xoắn Khi đun nóng liên kết hydro bị cắt đứt chuỗi AM duỗi thẳng do đó iodine bị tách ra khỏi AM, dung dịch mất màu xanh [3] AP cho màu tím với iodine do kết quả của sự hình thành các hợp chất hấp phụ.

AM và AP cũng khác nhau về tính hòa tan: AM dễ hòa tan trong nước ấm

và tạo nên dung dịch có độ nhớt không cao, còn AP chỉ hòa tan khi đun nóng

và tạo nên dung dịch có độ nhớt cao [16] Dung dịch của AM không bền, nhất

là khi nhiệt độ hạ thấp Các dung dịch đậm đặc của AM nhanh chóng tạo nên dạng gel vô định hình cứng rắn hoặc co dãn, ít lâu sẽ tạo nên dạng gel tinh thể

và các kết tủa không thuận nghịch Vận tốc thoái hóa phụ thuộc vào pH, vào

sự có mặt các ion, vào nồng độ AM cũng như khối lượng phân tử của AM Khi thêm các acid béo hoặc các monoglyceride sẽ hình thành với AM các phức hợp ít nhiều hòa tan, sẽ làm giảm sự trương phồng và độ nhớt trong khi nấu chín nhưng lại bảo vệ được một phần khỏi thoái hóa Còn AP có mức độ kết tinh thấp hơn nhiều so với AM [3,16]

AP hấp thụ nhiều nước khi nấu chín và là thành phần chủ yếu tạo nên sự trương phồng của hạt tinh bột Các hạt tinh bột giàu AP sẽ dễ hòa tan hơn trong nước ở 95oC hơn các hạt tinh bột giàu AM Do có sự cồng kềnh lập thể nên các phân tử AP không có xu hướng kết tinh và do đó chúng có khả năng giữ nước khác với các phân tử AM Các dung dịch AP thông thường không bị hiện tượng thoái hóa [3,16]

Tinh bột trong tự nhiên thường dưới dạng hạt Chúng khác nhau về kích thước, hình dạng và tỷ lệ AM/AP Tinh bột ở dạng hạt hoặc tinh bột chưa xử

lý khó bị tấn công bởi những enzym thủy phân [1] Khi hạt tinh bột được xử

lý đồng thời bằng nhiệt và ẩm thì sẽ xảy ra hiện tượng hồ hóa: trên 55 ÷ 70oC các hạt tinh bột trương phồng do hấp thụ nước vào các nhóm hydroxyl phân cực Khi đó độ nhớt của huyền phù tinh bột tăng mạnh vì các hạt trương

phồng kết dính vào nhau Nếu tiếp tục kéo dài việc xử lý thủy nhiệt có thể gây

ra nổ vỡ hạt tinh bột, thủy phân từng phần và hòa tan phần nào các phân tử cấu thành của tinh bột, kèm theo sự giảm độ nhớt của dung dịch Khi dung dịch rất đậm đặc thì tinh bột hình thành gel (độ nhớt lại tăng lên) và đôi khi lại tạo kết tủa Hiện tượng này cũng xảy ra đôi khi với dung dịch ít đậm đặc hơn nhưng được làm lạnh nhanh chóng hoặc để yên [16]

II.2.3 Đặc tính của bột sắn

Tinh bột sắn thu được từ quy trình xử lý ướt còn bột sắn thu được từ quá trình nghiền sắn lát khô, rồi được qua rây để loại phần lớn các chất xơ Thành phần chủ yếu của bột sắn là tinh bột, ngoài ra còn có lượng nhỏ các chất xơ, đường, protein, lipid…

Tinh bột sắn có hai thành phần cấu tạo: AM chiếm 18 ÷ 22% và AP chiếm

78 ÷ 80% Nhiệt độ bắt đầu hồ hóa của tinh bột sắn là 58oC, nhiệt độ

hồ hóa là 65oC và nhiệt độ hồ hóa hoàn toàn là 68oC Kích thước hạt tinh bột sắn là 15 ÷ 20 μm [19]

S.N Morthy và cộng sự khi nghiên cứu sự khác nhau của bột và tinh bột đến kết cấu của sản phẩm trên năm loại sắn khác nhau đã cho thấy hàm lượng tinh bột chiếm 98% chất khô trở lên trong các mẫu tinh bột sắn và chiếm 79,1

÷ 86,0% trong các mẫu bột sắn Hàm lượng chất xơ thô trong mẫu tinh bột nhỏ hơn 0,13%, trong khi từ 1,50 2,98 % trong mẫu bột sắn Hàm lượng ÷lipid dao động từ 0,11 0,22% trong các mẫu tinh bột và từ 0,25 ÷ ÷ 0,56% trong các mẫu bột (bảng II-2) Các chất chiết hòa tan trong cồn chiếm từ 2,5 ÷3,7% trong mẫu bột sắn và 0,9 1,3% trong mẫu tinh bột Sucrose là đường ÷chính trong bột sắn [23]

Bảng II 2 Các thành phần của bột và tinh bột từ - các loại sắn khác nhau

Sắn Sản phẩm Tinh bột

Đường tổng Lipid Xơ thô

Bột 86,0 2, 20 0,45 1,50 H-165 Tinh bột 98,0 - 0,22 0, 13

(Nguồn: Cassava flour and starch: Progress and development[23])

Bảng II Nhiệt độ hồ hóa của tinh bột và bột -3 từ các loại sắn khác nhau

Sắn Sản phẩm

Nhiệt độ hồ hóa, oC

kết thúc hồ hóa ta thấy các giá trị của mẫu bột cao hơn từ 2 – 3oC so với mẫu tinh bột tương ứng Các thành phần của bột sắn bằng cách hạn chế sự thâm nhập của nước vào các hạt tinh bột thì có thể đã làm chậm sự hồ hóa.

Trong sản xuất xi rô hạt tinh bột khi bị hồ hóa thì dễ dàng bị tác dụng của axit và các enzym thủy phân Ở đây ta sử dụng phương pháp enzym để điều khiển quá trình thủy phân Vì vậy ta cần xem xét đặc tính sinh hóa và cách tác dụng lên tinh bột của các enzym đường hóa và dịch hóa

-II.3 Đặc tính sinh hóa của enzym thủy phân tinh bột

II.3.1 Giới thiệu α-amylase và các nguồn sinh tổng hợp α-amylase

α-amylase (1,4 glucan 4 glucanhydrolase) (EC 3.2.1.1) từ các nguồn khác - nhau có nhiều điểm rất giống nhau α amylase có khả năng thủy phân liên kết -α-1,4 glucoside nằm ở phía bên trong phân tử cơ chất (tinh bột, glycogen và polyose đồng loại) một cách ngẫu nhiên không theo trật tự nào cả Vì thế người ta gọi nó enzym amylase nội phân (endoamylase) Khi tác dụng lên tinh bột enzym này giải phóng ra glucose ở dạng α mutamer nên năm 1924 Kuhn -gọi nó là α-amylase 17] [

-α amylase có trong nước bọt, hạt hòa thảo nảy mầm, đặc biệt có rất nhiều trong các chế phẩm nuôi cấy nấm mốc và vi khuẩn [3] Rất nhiều chủng vi sinh vật có khả năng tổng hợp α amylase nhưng phổ biến nhất vẫn là các -chủng vi khuẩn Bacillus, các chủng nấm mốc Aspergillus, Rhizopus Các chủng xạ khuẩn, các chủng giả nấm men Endomycopsis cũng có khả năng sinh tổng hợp α amylase Tuy nhiên hoạt độ enzym của xạ khuẩn và nấm men -không cao [6]

-α amylase được sản sinh bởi các chủng vi sinh vật khác nhau có nhiều tính chất giống nhau và nhiều tính chất khác nhau Chúng giống nhau chủ yếu về tính năng tác dụng đối với cơ chất nhưng lại rất khác nhau về khả năng bền

vững với nhiệt độ, pH, đồng thời các sản phẩm thủy phân cơ chất của chúng cũng rất khác nhau

Người ta tập trung nghiên cứu α amylase của nấm mốc và vi khuẩn vì đây

-là nguồn α-amylase nhiều nhất và được ứng dụng rộng rãi nhất Người ta phân biệt α-amylase của nấm mốc làm hai loại chủ yếu: α amylase chịu được -axit và α-amylase kém chịu axit Đối với α-amylase vi khuẩn người ta cũng phân biệt làm hai loại: α-amylase bền vững với nhiệt độ và α-amylase kém bền vững với nhiệt độ α-amylase bền nhiệt nhất được tách ra từ Bacillus stearothermophilus và Bacillus licheniformis α-amylase bền nhiệt hoạt động tốt nhất ở nhiệt độ trên 70oC Người ta đã đi đến nhận xét chung là α-amylase của vi khuẩn thì bền vững ở nhiệt độ cao hơn so với α-amylase của nấm mốc

Trong số các α amylase của vi khuẩn được nghiên cứu, người ta thấy chúng

-có rất nhiều tính chất khác nhau α-amylase của Bacillus subtilis được phân loại thành α amylase dịch hó- a và α-amylase đường hóa [28,33,37]

Trong công nghiệp người ta thường sử dụng α amylase dịch hóa nhiều hơn vì

-nó chịu được nhiệt độ cao từ 60 ÷ 90oC và bền vững ở pH từ 4,8 ÷ 10,6 trong

đó pHopt là 5,0 ÷ 6,2 và topt là 60 ÷ 70oC [35] α amylase dịch hóa l- à một loại protein có trọng lượng phân tử 48200 ÷ 48700 chứa 406 gốc acid amino Hàm lượng calcium trong phân tử enzym là 4 nguyên tử gam/mol enzym Thủy phân α amylase dịch hóa người ta không phát hiện cysteine, do đó mà nó -không có các nhóm SH cũng như các mối nối disulfur Trong khi đó α-amylase đường hóa lại chứa một gốc cysteine và bền vững với calcium [36] Nói chung α amylase đường hóa kém bền vững hơn α- -amylase dịch hóa Hai loại enzym trên khác nhau chủ yếu về khả năng phân giải tinh bột Sản phẩm thủy phân chủ yếu được tạo thành do α amylase dịch hóa là dextrin (5 6 đơn - –

vị glucose) và maltose, còn bởi α amylase đường hóa là maltose và glucose [2] α-amylase của Bacillus amiloliquefacien là enzym dịch hóa đầu tiên được

-sản xuất công nghiệp với số lượng lớn Sau đó người ta phát hiện ra chủng Bacillus licheniformis cũng sản sinh ra α amylase dịch hóa [29] Loại enzym -mới này được đưa vào sản xuất công nghiệp ngay vì nó có nhiều ưu điểm so với α-amylase dịch hóa của các vi khuẩn khác Đó là khả năng chịu được nhiệt độ cao (topt là 90 ÷ 95oC), thậm chí có thể chịu được đến 105 ÷ 110oC Sản phẩm thủy phân tinh bột cuối cùng của nó là maltose, maltotriose và maltopentose [26,27,29,31]

Trong các nghành công nghiệp, α amylase của vi khuẩn được sử dụng nhiều hơn α-amylase của nấm mốc, đó là do α-amylase của vi khuẩn thường không có độc tố lại có hoạt lực cao hơn hơn hẳn α-amylase của nấm mốc Mặt khác α-amylase của nấm mốc bị mất hoạt tính trước lúc đun nóng và ngay khi

-hồ hóa, bởi vậy áp dụng chúng không có hiệu quả, còn α-amylase của vi khuẩn chịu được nhiệt độ cao nên việc ứng dụng rất thuận lợi và có hiệu quả kinh tế cao hơn rất nhiều so với α-amylase của nấm mốc

II.3.2 Cấu tạo và đặc tính sinh hóa của α-amylase

-α amylase có bản chất protein dễ tan trong nước và không bị phân hủy bởi protease Nó có cấu trúc chuỗi đơn, xếp búi không theo thứ tự hoặc theo thứ

tự một nửa Những kết luận này dựa vào kết quả xoay cực ánh sáng của dung dịch enzym và khả năng bền vững của α amylase đối với các tác nhân gây -biến tính như urea [38,39]

-α amylase còn được gọi là enzym kim loại vì trong thành phần của nó có chứa ion calcium Tất cả các α amylase đều chứa từ 1 - ÷ 30 nguyên tử gam Ca/ mol enzym Trong đó Ca2+ có chức năng nối các phần tương ứng của cấu trúc bậc ba trong phân tử enzym, bởi vậy nó đóng một vai trò hết sức quan trọng trong việc duy trì cấu trúc phân tử cũng như khả năng hoạt động của enzym Khi tách Ca2+ khỏi enzym bằng EDTA thì enzym bị mất khả năng

thủy phân cơ chất, bị biến tính khi đun nóng và đặc biệt bị thủy phân bởi protease Số lượng ion Ca2+ trong phân tử enzym và mức độ liên kết của các ion Ca2+ này trong phân tử với protein cũng rất khác nhau [6,17]

Bằng phương pháp xác định các axit amino, người ta cũng đi đến kết luận

là α-amylase của các chủng vi sinh vật khác nhau có thành phần cấu tạo khác nhau Đa phần chúng đều chứa tyrosine và tryptophan với hàm lượng cao, điều đó giải thích tại sao đa phần các α amylase lại hấp thụ bước sóng 280nm -

-α amylase của Asp oryzae lại chỉ chứa một ít gốc axit amino kiềm tính, điều này giải thích tính axit của enzym α-amylase dịch hóa của Bac.subtilis không chứa gốc cystein và cystine, trong khi đó α-amylase đường hóa lại chứa một gốc cystein và 1 nhóm SH trong một phân tử enzym [28,33]

Về trọng lượng phân tử enzym α-amylase cũng có nhiều tác giả nghiên cứu Đa số α-amylase có trọng lượng phân tử gần 50.000

-α amylase có nguồn gốc khác nhau hoạt động thích hợp ở các điều kiện khác nhau Maning và Campbell (1961) đã xác định được nhiệt độ tối ưu của

α-amylase của Bac stearothermophilus 503-4 là 55 ÷ 70oC [39] Kixlukhina (1974) xác định nhiệt độ tối ưu của α-amylase của Bac.subtilis là 60oC, của Bac diastaticus là 80oC Trong khi đó α-amylase của Bac.licheniformis là 90

÷ 105oC[29,35]

-α amylase của nấm mốc có nhiệt độ tối ưu thấp hơn so với α amylase của

-vi khuẩn và pH của chúng nghiêng về phía axit Trong khi đó α-amylase của

vi khuẩn lại hoạt động ở pH trung tính hay kiềm nhẹ Tuy nhiên pH hoạt động của α amylase của các loại vi khuẩn chịu nhiệt thư- ờng dao động trong phạm

vi khá rộng và nghiêng về phía axit [12]

-α amylase của vi khuẩn chịu nhiệt thường bền vững với nhiệt độ hơn

α-amylase của các chủng vi sinh vật khác α-amylase của Bac.stearothermo- philus 503-4 nếu duy trì ở nhiệt độ 50 ÷ 70oC thì không bị mất hoạt tính sau

24 giờ [38] Ở nhiệt độ 90oC hoạt lực của α amylase của - Bac stearothermo-

philus 503 bị giảm 17% sau 6 phút, trong khi đó α-4 -amylase của Bac.subtilis

bị giảm hoạt lực hoàn toàn

Bảng II Một số tính chất của các amylase -4

Nguồn enzyme Isoform Phân tử

lượng (kDa)

pH tối

ưu Nhiệt độ tối ưu thuộc Phụ

Ca 2+

Hoạt tính (đv/ml) Hoạt tính đặc hiệu

( đv/mgP ) Termamyl

Sự thủy phân tinh bột của α-amylase trải qua nhiều giai đoạn:

Ở giai đoạn đầu (giai đoạn dextrin hóa) chỉ một số liên kết trong phân tử cơ chất bị thủy phân, tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp (α-dextrin),

độ nhớt hồ tinh bột giảm nhanh (cả AM và AP đều bị dịch hóa nhanh) Sang giai đoạn thứ hai (giai đoạn đường hóa) các dextrin phân tử thấp vừa được tạo thành bị thủy phân tiếp tục tạo ra các tetra, trimaltose không cho màu với I2

Các chất này bị thủy phân rất chậm bởi α-amylase cho tới di và monosaccharide

Dưới tác dụng của α amylase, AM bị phân cắt thành các oligosaccharide hay polyglucose (6-7 gốc glucose) , sau đó các oligosaccharide này tiếp tục bị phân cắt nên chuỗi bị ngắn dần và tạo thành maltotetrose, maltotriose, maltose Sau thời gian tác dụng dài, sản phẩm của quá trình thủy phân amylose là 13% glucose và 87% maltose [8]

Hoàng Kim Anh và cộng sự đã nghiên cứu khả năng thủy phân một số dạng cơ chất: tinh bột sắn đã hồ hóa, tinh bột sắn dạng hạt sống, AM & AP tách từ tinh bột sắn, được chuẩn bị với nồng độ 1%, thêm enzym với hàm lượng 15 đv/1g cơ chất (α-amylase từ B.oryzae, B.subtilis (viện sinh học nhiệt đới), B.licheniformis(Termamy 120L)) Thời gian phản ứng là 3 giờ Kết quả được thể hiện ở bảng sau:

Bảng II Sản phẩm chính khi thủy phân tinh bột bằng các loại amylase -5

Nguồn enzyme Sản phẩm thủy phân chính

α-amylase (B.subtilis) DP6, một lượng ít maltose, DP3, DP9

α-amylase (A.oryzae) Maltose, DP6

(DP3: maltotriose, DP5: maltopentaose, DP6: maltohexaose, DP9: dextrin chứa 9 gốc đường glucose (Nguồn: ) “Tính chất và khả năng thủy phân tinh bột sắn của một số amylase vi sinh vật” [2])

Qua bảng II 3 ta thấy maltose và một số dextrin là sản phẩm tạo ra khi thủy

-phân bằng amylase của A.oryzae Sản phẩm chính khi thủy -phân bằng Termamyl 120L là DP5, DP1, DP3 và một số dextrin như DP9 α-amylase của B.subtilis thủy phân tinh bột cho sản phẩm chính là DP6, một lượng không đáng kể maltose DP2, DP3 và DP9.[2]

Bảng II Kết quả thủy phân các dạng tinh bột sắn bằng α -6 -amylase

Cơ chất

Lượng đường khử tạo ra (% so với lượng cơ chất ban đầu) Termamyl 120L (B.subtilis) α-amylase (A.oryzae) α-amylase Tinh bột sắn đã

Do hàm lượng AP cao (≥ 80%) nên tinh bột sắn là một trong những loại tinh bột dễ bị amylase tấn công, hàm lượng đường khử tạo ra bằng ½ lượng đường

khử thu được khi cơ chất chỉ chứa AP Có thể thấy cơ chất mạch thẳng có ái lực kém đối với α-amylase vi khuẩn Tuy nhiên đối với α-amylase từ nấm mốc A.oryzae, độ phân nhánh của cơ chất lại không có ảnh hưởng gì Hàm lượng đường khử tạo ra ở ba trường hợp cơ chất tinh bột sắn đã hồ hóa, AM,

AP đều như nhau và đạt mức 4,0 mg/ml, cao hơn nhiều so với lượng tạo ra bởi α-amylase vi khuẩn α amylase từ nấm mốc là enzyme đường hóa với sản -phẩm chính của quá trình thủy phân là maltose nên lượng đường khử tạo ra không hoàn toàn phản ánh khả năng thủy phân nếu so sánh với các enzyme từ

vi khuẩn Kết quả trên cũng cho thấy 2 loại α-amylase này có cơ chế tấn công phân tử cơ chất khác nhau Termamyl thủy phân yếu tinh bột sắn dạng hạt sống, khả năng thủy phân dạng cơ chất này cao hơn đối với enzyme từ B.subtilis

II.4 Các yếu tố chính ảnh hưởng đến hoạt động của enzym

II.4.1 Ảnh hưởng của nồng độ enzym

Nói chung trong điều kiện thừa cơ chất vận tốc phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ enzym [8,17]:

v = k [E]

v là vận tốc phản ứng; [E] là nồng độ enzym

Cũng có trường hợp khi nồng độ enzym quá lớn vận tốc tăng chậm

II.4.2 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất

Năm 1913, Leonor Michaelis và Maud Menten đã đưa ra mô hình để giải thích tính chất động học của phản ứng enzym và đã lập được phương trình biểu diễn mối quan hệ giữa vận tốc phản ứng với nồng độ cơ chất của enzym Đặc điểm quan trọng của mô hình này là: ở đầu phản ứng cần thiết phải mtạo thành phức trung gian enzym-cơ chất (ES) Sau đó phức ES chuyển hóa

tiếp tạo thành sản phẩm cuối cùng của phản ứng và enzym tự do, enzym lại kết hợp với phân tử cơ chất khác bắt đầu vòng xúc tác mới[8,17].

Trường hợp đơn giản nhất, phản ứng chỉ có một cơ chất S, enzym E xúc tác cho sự chuyển hóa nó chỉ tạo thành một sản phẩm P, phản ứng xảy ra như sau:

v = k2[ES]

Khi nghiên cứu động học phản ứng enzym, người ta thường xác định vận tốc ban đầu của phản ứng khi:

- nồng độ cơ chất [S] rất lớn so với nồng độ tổng của enzym [Eo]

- lượng sản phẩm [P] tạo thành chưa đáng kể nên k -2 [E][P] ≈ 0

Trong những điều kiện trên phản ứng sẽ diễn ra:

k1 k2

E + S ES P + E

k -1

Vì [S] rất lớn so với [Eo], lượng S nằm trong phức có thể coi là không đáng

kể, nên nồng độ cơ chất ban đầu cũng được xem là nồng độ cơ chất lúc phảnứng đạt đến trạng thái dừng [ES] khi đó gần như không đổi và vận tốc ban đầu v = k2 [ES] cũng gần như không đổi Từ đây ta có:

1 -1 2

d[ES] k [E][S] - (k + k )[ES] = 0

-1 2

m 1

[E][S] k + k K

[ES] = k = (1.5)

Vì [S] chưa chuyển hóa thành [P] nên:

-1 p 1

[E][S] k K

[ES] = k = (1.6)

Kp: hằng số phân ly của phức enzym – cơ chất

Và k2 là không đáng kể so với k1 nên Km ≈ Kp Người ta nói Km là hằng số phân ly biểu kiến của phức enzym – cơ chất Km càng nhỏ thì ái lực của enzym đối với cơ chất càng lớn và ngược lại

v = [ES] = 1

K

v [E ] 1 + S

max m

- Nếu [S] >> Km thì v = vmax , vận tốc phản ứng đạt cực đại không phụ thuộc vào [S] Như vậy khi [S] đủ lớn đến một mức nào đó, nếu tiếp tục tăng [S] thì

sẽ không tăng theo

- Nếu [S] = Km thì v = vmax

2 , vận tốc phản ứng bằng một nửa vận tốc cực đại Như vậy Km bằng nồng độ cơ chất mà ở đó vận tốc ban đầu của phản ứng bằng một nửa vận tốc cực đại

II.4.3 Ảnh hưởng của các chất kìm hãm

Hoạt độ enzym có thể bị thay đổi dưới tác dụng của một số chất có bản chất hóa học khác nhau Các chất làm giảm hoạt độ của enzym nhưng không bị chuyển hóa bởi enzym được gọi là các chất kìm hãm hay là các chất ức chế,

thường ký hiệu là I Các chất này có thể là những ion, phân tử vô cơ, hữu cơ,

kể cả protein

Các chất gây biến tính protein là những chất kìm hãm không đặc hiệu của enzym Nhiều chất khác không làm biến tính protein enzym nhưng vẫn làm giảm hoạt động xúc tác của nó theo cơ chế khác [8,17]

Các chất này có thể kìm hãm thuận nghịch hoặc không thuận nghịch enzym Nếu là kiểu kìm hãm thuận nghịch, phản ứng kết hợp giữa enzym và chất kìm hãm I nhanh chóng đạt đến cân bằng:

k

i

E + I EI (1.12)

k -i Trong trường hợp kìm hãm không thuận nghịch k -i rất bé có thể xem như bằng 0, I kết hợp với E bằng liên kết đồng hóa trị hoặc kết hợp rất chặt chẽ đến mức khó có thể tách khỏi E, sự phân ly phức EI là rất chậm

II.4.4 Ảnh hưởng của các chất hoạt hóa

Các chất hoạt hóa làm tăng hoạt độ xúc tác của enzym Các chất hoạt hóa thường có bản chất khác nhau, có thể là các anion, các ion kim loại nằm từ ô thứ 1 đến ô thứ 55 của bảng tuần hoàn các nguyên tố hóa học hoặc các chất hữu cơ có cấu tạo phức tạp hơn làm nhiệm vụ chuyển nhóm chuyển hydro hoặc những chất có khả năng phá vỡ một số liên kết trong phân tử tiền enzym hoặc các chất có tác dụng phục hồi nhóm chức năng trong trung tâm hoạt động của enzym Tuy nhiên tác dụng hoạt hóa chỉ có giới hạn ở những nồng

độ xác định, vượt quá giới hạn này có thể làm giảm hoạt độ của enzym

Một số chất hoạt hóa có thể kết hợp trực tiếp với phân tử enzym, làm thay đổi cấu tạo không gian của nó theo hướng có lợi cho hoạt độ xúc tác của enzym Một số chất hoạt hóa khác có thể tác dụng theo cách gián tiếp như loại trừ các yếu tố gây kìm hàm khỏi môi trường phản ứng [8]

II.4.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ

50 60 70 40

II.4.6 Ảnh hưởng của pH môi trường

pH môi trường có ảnh hưởng rõ rệt đến phản ứng enzym vì nó ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, enzym và ảnh hưởng đến độ bền protein enzym

Đa số enzym bền trong giới hạn pH giữa 5 và 9 Đường biểu diễn ảnh

hưởng pH đến vận tốc phản ứng của nhiều enzym có dạng như ở hình II-5, pH

tối ưu cho hoạt động của nhiều enzym vào khoảng 7 Tuy nhiên cũng có một

số enzym có pHopt rất thấp (pepxin, proteinase axit của vi sinh vật, v.v…) hoặc khá cao (subtilisin, pHopt > 10), pHopt của một enzym cũng không cố định mà phụ thuộc nhiều vào các yếu tố khác như cơ chất, tính chất dung dịch đệm, nhiệt độ v.v…

-Xi rô maltose (mạch nha, đường nha) là sản phẩm có thể ăn trực tiếp, từ lâu

đã được nhân dân ưa thích Cơ thể người tiêu hóa được xi rô tinh bột dễ và nhanh hơn chất bột vì vậy xi rô maltose là một loại thức ăn bổ ích có giá trị -dinh dưỡng đối với người ốm, người già, trẻ em, người lao động nặng nhọc giống như đường sucrose

Rất nhiều loại xi rô maltose được sử dụng trong công nghiệp rượu bia, bánh nướng, đồ uống nhẹ, và bánh kẹo Các đặc trưng chức năng quan trọng của các xi-rô maltose nồng độ cao là có hàm ẩm thấp, độ nhớt thấp, chống lại

-sự kết tinh, độ ngọt thấp, giảm hiện tượng browning, và độ bền nhiệt cao Vì

vậy các xi-rô maltose được sử dụng như là tác nhân điều chỉnh độ ẩm, chất kìm hãm sự kết tinh, chất mang, chất làm bền và tác nhân làm dày.

Trong sản xuất thức ăn trẻ em: trẻ nhỏ nhất là trẻ sơ sinh tiêu hóa chất bột nhiều khi chưa tốt vì hệ men tiêu hóa trong cơ thể chưa đầy đủ nhất là để tiêu hóa tinh bột của các loại hạt Những loại đường nguyên chất như glucose, sucrose thường bị lên men nhanh trong ruột trẻ sơ sinh gây ra hiện tượng rối loạn đường ruột Vì vậy trong các sản phẩm sữa và bột dinh dưỡng người ta thường cho các loại xi rô tinh bột có trị số DE dưới 20 vào (maltodextrin) Đó -

là những saccharide trung gian giữa tinh bột và đường thích hợp với khả năng tiêu hóa của trẻ em Ngoài ra maltodextrin còn có tác dụng chống kết tinh đường, chống oxy hóa chất béo, cần thiết cho việc ổn định phẩm chất và bảo quản sản phẩm

Trong sản xuất kẹo: Trong sản xuất kẹo xi rô tinh bột có tác dụng:

-• Giảm bớt yêu cầu về đường sucrose làm nguyên liệu, có lợi về kinh tế nếu giá thành xi-rô tinh bột thấp hơn sucrose

• Làm cho viên kẹo dễ đông tụ, kết dính, không bị co méo, ổn định được hình dạng

• Chống sự kết tinh đường sucrose giữ cho viên kẹo được trong, khỏi bị

bở đục, làm cho bề mặt viên kẹo được nhẵn bóng, tăng khả năng nhũ hóa ổn định độ mềm của viên kẹo nhờ tác dụng của thành phần dextrin

• Tăng thêm mùi vị thơm ngon của kẹo, giữ lâu được mùi thơm của hương liệu

Khi sản xuất kẹo cứng và kẹo mềm không có nhân, người ta dùng các

loại xi rô có trị số DE = 31 ÷ 34% và DE = 38 ÷ 42% ,còn làm kẹo có nhân thì dùng các loại xi-rô có DE cao hơn

Trong sản xuất bánh mỳ, bánh ngọt, bánh bích qui: nếu thêm xi rô tinh bột

-có trị số DE cao (≥ 65%) như đường nha khi lên men bột mỳ thì khả năng giữ

khí CO2 sẽ tốt hơn, làm cho ruột bánh nở đều đàn hồi tốt, bánh xốp nhẹ lâu bị khô cứng Ngoài ra xi rô tinh bột còn có tác dụng làm cho màu sắc của vỏ -bánh sau khi nướng vàng nâu đẹp, mùi thơm ngon và bảo quản bánh do tác dụng chống oxy hóa các chất béo.

Sản xuất đồ uống rượu: người ta dùng xi ô có trị số DE cao để sản xuất -rnước uống lên men vì thành phần của xi rô có những loại đường dễ lên men -như glucose, maltose Còn làm rượu ngọt cũng cần xi rô có trị số DE cao để -chống kết tinh đường sucrose, ổn định độ trong của sản phẩm và giảm bớt vị ngọt gắt và tăng thêm mùi thơm của rượu

Làm mứt lỏng, đồ hộp… Trong công nghiệp làm mứt lỏng đồ hộp rau quả người ta dùng xi-rô có DE = 50 – 60% để chống kết tinh đường làm cho sản phẩm có vị dịu ngọt dịu dàng ưa thích hơn Ngày nay nhiều nước đang dùng nhiều xi-rô tinh bột để chế biến thịt cá, bơ, khoai lang, ngô đường… đóng thành hộp, làm nước quả, nước sốt, các thức ăn điểm tâm

II.6 Lý thuyết quy hoạch thực nghiệm điều khiển quá trình

Ở Việt Nam, quy hoạch thực nghiệm được bắt đầu ứng dụng từ những năm

70 Có thể nói, lý thuyết quy hoạch thực nghiệm từ khi ra đời đã thu hút sự quan tâm và nhận được nhiều đóng góp hoàn thiện của nhiều nhà khoa học Những ưu điểm rõ rệt của phương pháp này so với các thực nghiệm cổ điển là:

1 Giảm đáng kể số lượng thí nghiệm cần thiết Giảm thời gian tiến hành thí nghiệm và chi phí phương tiện vật chất

2 Hàm lượng thông tin nhiều hơn rõ rệt nhờ đánh giá được vai trò của tác động qua lại giữa các yếu tố và ảnh hưởng của chúng đến hàm mục tiêu Nhận được mô hình toán học thống kê thực nghiệm, đánh giá được sai số bức tranh thí nghiệm theo các tiêu chuẩn thống kê cho phép xét ảnh hưởng của các yếu tố với mức độ tin cậy cần thiết

Giai đoạn đầu tiên của quy hoạch thực nghiệm được hình thành cùng với sự phát triển của phân tích phương sai, cho phép ước lượng vai trò của từng yếu

tố ảnh hưởng trong tổng phương sai của hệ

Giai đoạn phát triển thứ 2 của quy hoạch thực nghiệm được đánh dấu bởi

sự xuất hiện của quy hoạch thực nghiệm cực trị, dựa trên cơ sở lý thuyết thực nghiệm cực trị toán học phát triển trong những năm 1950 Lý thuyết thực nghiệm mới cho phép lựa chọn chiến lược nghiên cứu tối ưu trong điều kiện chưa hiểu hết quá trình một cách toàn diện

Quy hoạch thực nghiệm là cơ sở phương pháp luận của nghiên cứu thực nghiệm hiện đại Đó là phương pháp nghiên cứu mới, trong đó công cụ toán học giữ vai trò tích cực Cơ sở toán học nền tảng của lý thuyết quy hoạch thực nghiệm là toán học xác suất thống kê với hai lĩnh vực quan trọng là phân tích phương sai và phân tích hồi quy

Một số thuật ngữ quy trong quy hoạch được dùng theo các nghĩa như sau:

• Quy hoạch thực nghiệm: là tập hợp các tác động nhằm đưa ra chiến

thuật làm thực nghiệm từ giai đoạn đầu đến giai đoạn kết thúc của quá trình nghiên cứu đối tượng (từ nhận thông tin mô phỏng đến việc tạo ra

mô hình toán, xác định các điều kiện tối ưu), trong điều kiện đã hoặc chưa hiểu biết đầy đủ về cơ chế của đối tượng

• Đối tượng nghiên cứu của quy hoạch thực nghiệm: thường là một

quá trình hoặc hiện tượng nào đó có những tính chất, đặc điểm chưa biết cần nghiên cứu Người nghiên cứu có thể chưa biết đầy đủ về đối tượng nhưng đã có một số thông tin tiên nghiệm dù chỉ là sự liệt kê khái lược những yếu tố biến đổi, ảnh hưởng đến tính chất đối tượng

Do đối tượng nghiên cứu của quy hoạch thực nghiệm thường là những hệ phức tạp, với cơ chế chưa được hiểu biết đầy đủ nhờ các mô hình lý thuyết, nên có thể hình dung chúng như một “hộp đen” trong hệ thống điều khiển

gồm các tín hiệu đầu vào và đầu ra, được thể hiện bằng hình II-6

Trong đó tín hiệu đầu vào được chia thành các nhóm:

1 Các biến kiểm tra được và điểu khiển được, mà người nghiên cứu có thể điều chỉnh theo dự định, biểu diễn bằng vắc tơ:

Các chỉ tiêu đầu ra dùng để đánh giá đối tượng là véc tơ Y=(y1, y2 ,…,yq) Chúng thường được gọi là các hàm mục tiêu Biểu diễn hình học của các hàm mục tiêu gọi là bề mặt đáp trị (bề mặt biểu diễn)

“HỘP ĐEN”

QUÁ TRÌNH LÀM VIỆC CỦA HỆ THỐNG

Phương pháp toán học trong xử lý số liệu từ kế hoạch thực nghiệm là phương pháp toán học thống kê Vì vậy các mô hình biểu diễn hàm mục tiêu chính là các mô hình thống kê thực nghiệm Các mô hình này nhận được khi

có cộng tính ngẫu nhiên Và vì vậy cấu trúc của hệ có dạng như ở hình II-7

ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Y Z

T

e

Hình 7 II- Sơ đồ đối tượng nghiên cứu với nhiễu e có tính cộng

Đặc tính cơ bản của mô hình thống kê thực nghiệm là ở chỗ chúng không thể mô tả được chính xác hành vi của đối tượng trong bất cứ thí nghiệm cụ thể nào Không thể chỉ ra giá trị chính xác của Y ngay cả khi hàm mục tiêu được xác định hoàn toàn chính xác và các véc tơ Z, T được ổn định Mô hình thống

kê mô tả hành vi của đối tượng theo giá trị trung bình, đặc trưng cho tính chất không ngẫu nhiên của đối tượng Các tính chất này có thể bộc lộ đầy đủ khi lặp lại nhiều lần thí nghiệm trong điều kiện không đổi Nhờ mô hình thống kê,

có thể chỉ ra giá trị tâm nào đó, mà mục tiêu Y sẽ dao động quanh nó, ứng với

bộ kết hợp các giá trị yếu tố ảnh hưởng Z, T Đồng thời có thể chỉ ra mức độ phân tán của Y Trong tập hợp các mô hình thống kê khác nhau, mô hình được quan tâm nhiều nhất trong thực tế là mô hình hồi quy(mô hình của phân tích hồi quy) Mô hình hồi quy được biểu diễn bằng quan hệ tổng quát:

Y=φ(Z1, Z 2, Z k; T1, T2,.Tk; β1, β 2, β k)+e = φ[(X,Z);β] + e

Trong đó β=( β0, β1, β 2,… β k) là véc tơ tham số của mô hình.

Để khỏi lẫn với các yếu tố ảnh hưởng Z, T, sẽ gọi β là véc tơ hệ số của mô hình Dạng hàm φ được ấn định trước, còn các hệ số β là chưa biết, cần xác định từ thực nghiệm

Các mô hình cụ thể được thể hiện như kết quả khai triển một hàm chưa biết thành dãy các hàm cơ sở theo một hệ thống nào đó Trong quy hoạch thực nghiệm người ta chọn hệ thống này ở dạng đa thức, có bậc khác nhau Mô hình bậc 1 còn gọi là tuyến tính được cho bở đa thức bậc 1 đối với các yếu tố vào Mô hình bậc 2 còn gọi là phi tuyến, được biểu diễn bằng đa thức bậc 2 đối với các yếu tố vào

Để xác định các tham số của mô tả thống kê thực nghiệm ta phải làm các thực nghiệm theo kế hoạch thực nghiệm

Đối tượng nghiên cứu chính của lý thuyết quy hoạch thực nghiệm là các thí nghiệm tích cực Đó là các thực nghiệm chỉ bao gồm các yếu tố vào thuộc nhóm Z, người thực nghiệm chủ động thay đổi chúng theo kế hoạch thực nghiệm đã vạch sẵn

Tùy theo mục đích và nhiệm vụ, các thực nghiệm tích cực có thể chia thành nhiều loại Liên quan trực tiếp đến phương pháp quy hoạch thực nghiệm có các loại sau:

• Thực nghiệm sàng lọc là thực nghiệm mà nhiệm vụ của nó là tách những yếu tố ảnh hưởng đáng kể ra khỏi tập hợp những yếu tố đầu vào

để tiếp tục nghiên cứu chúng trong các thực nghiệm cần thiết

• Thực nghiệm mô phỏng là thực nghiệm có liên quan tới việc mô phỏng hiện tượng cần nghiên cứu Có nhiều dạng mô phỏng, nhưng ở đây chỉ

đề cập đến dạng thực nghiệm, mà nhiệm vụ mô phỏng được hoàn tất bằng mô hình hồi quy đa thức

• Thực nghiệm cực trị được phát triển từ thực nghiệm mô phỏng Nhiệm

vụ của nó là xây dựng mô hình toán thực nghiệm, theo đó xác định giá trị tối ưu của hàm mục tiêu và tọa độ tối ưu của hàm Nói cách khác là xác định bộ kết hợp giá trị các yếu tố vào mà tại đó hàm mục tiêu có cực trị

Đối với các thực nghiệm tích cực, miền tác động là miền các giá trị có thể

có của các yếu tố Z trong thực nghiệm Trong miền tác động có miền quy hoạch- miền tác động của các yêu tố vào Z trong đó chứa vừa đủ các điểm thí - nghiệm của thực nghiệm Nói cách khác, đó là miền tạo bởi phạm vi thay đổi các yếu tố Z theo kế hoạch thực nghiệm xác định

Kế hoạch thực nghiệm bao gồm các điểm thí nghiệm, còn gọi là điểm của

kế hoạch Đó là một bộ kết hợp các giá trị cụ thể của các yếu tố vào Z, ứng với điều kiện tiến hành một thí nghiệm trong tập hợp các thí nghiệm của thực nghiệm Tại điểm thứ i của kế hoạch (điểm kế hoạch i), bộ kết hợp các giá trị

Zji bao gồm các giá trị cụ thể của k yếu tố vào:

Các nguyên tắc cơ bản của quy hoạch thực nghiệm:

1 Nguyên tắc không lấy toàn bộ trạng thái đầu vào

2 Nguyên tắc phức tạp dần mô hình toán học

3 Nguyên tắc đối chứng với nhiễu

4 Nguyên tắc ngẫu nhiên hóa (sử dụng tối ưu không gian các yếu tố)

5 Nguyên tắc tối ưu của quy hoạch thực nghiệm

Thuật toán của phương pháp quy hoạch thực nghiệm được trình bày ở hình II- 8

Lựa chọn thông số nghiên cứu

Xây dựng và kiểm tra

mô hình thực nghiệm

Tiến hành thí nghiệm nhận thông tin

Lập kế hoạch thực nghiệm

Áp dụng vào bài toán cụ thểTương thích

Không tương thích

Hình II-8 Các bước trong thuật toán xây dựng mô hình điều khiển

1 Chọn thông số nghiên cứu

Giai đoạn này bao gồm việc phân loại các yếu tố ảnh hưởng lên đối tượng thành các nhóm Z (kiểm tra được, điều khiển được), nhóm T (kiểm tra được, không điều khiển được) và nhóm E (không kiểm tra được, không điều khiển được)

Đưa ra những biện pháp tích cực để hạn chế tác động của các yếu tố T, E và

phân tích để chọn từ phân loại các yếu tố ảnh hưởng lên đối tượng thành các nhóm Z, nhóm T và nhóm E Chọn ra các yếu tố ảnh hưởng chính, loại bớt những yếu tố không cần thiết, đảm bảo tính khả thi và tính hiệu quả của thực nghiệm.

Quá trình thuỷ phân chịu ảnh hưởng của rất nhiều yếu tố được nêu ra trong bảng II 5 và được minh họa ở hình II- - 9

Bảng II-7 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thuỷ phân tinh bột

Cấu trúc hình thể không gian của hạt tinh bột ảnh hưởng rất nhiều đến khả năng tấn công của enzym vào cơ chất để phân cắt các liên kết Thông thường phải hồ hoá tinh bột trước để tạo điều kiện cho enzym dễ dàng tấn công Nếu tinh bột được hồ hoá ở nhiệt độ tối ưu tạo ra sự trương nở tinh bột là lớn nhất thì khả năng tấn công của các enzym để phân cắt các liên kết càng tăng Đó là

do khi hạt tinh bột đã trương nở thì cấu trúc không gian được mở rộng, do vậy việc enzym di chuyển tiếp xúc với liên kết để phân cắt được dễ dàng hơn

2 Hàm lượng amylose, amylopectin

Tinh bột được cấu tạo từ hai cấu tử amylose (AM), amylopectin (AP) Trong tinh bột sắn, AM thường chiếm từ 18 22%, AP chiếm 78 ÷ ÷ 80% Nghiên cứu của Hoàng Kim Anh và cộng sự [14] cho thấy đối với α-amylase, khả năng thủy phân AP là cao nhất và khả năng thủy phân hạt tinh bột sống là thấp nhất So với AM, α amylase vi khuẩn tấn công AP với tốc độ nhanh gấp -

10 lần (Termamyl 120L) và 15 lần (enzym của viện sinh học nhiệt đới) Tốc

độ thủy phân AM rất thấp, tương đương tốc độ thủy phân tinh bột sống dạng hạt Khả năng thủy phân tinh bột phụ thuộc vào tỷ lệ AM/AP trong thành phần Do hàm lượng AP cao nên tinh bột sắn là một trong những loại tinh bột

dễ bị amylase tấn công

3 Thời gian thủy phân

Tỷ lệ sản phẩm của quá trình thuỷ phân được quyết định chủ yếu bởi thời gian thuỷ phân Với quá trình thủy phân bằng enzym, thời gian dừng phản ứng là một thông số quan trọng

Các yếu tố khác như nồng độ cơ chất, nồng độ enzym, nhiệt độ, pH đã được phân tích ở II.4

Ngoài ra, cần lựa chọn chỉ tiêu đánh giá đối tượng sao cho chỉ tiêu này vừa đáp ứng các yêu cầu của phương pháp quy hoạch thực nghiệm, vừa đại diện

nhất cho các điều kiện của đối tượng nghiên cứu

Căn cứ vào số yếu tố ảnh hưởng chính, chỉ tiêu đánh giá, mục đích, nhiệm

vụ thực nghiệm, nhóm các yếu tố vào theo các kế hoạch thực nghiệm Tính hiệu quả và khả năng làm việc của các mô hình hồi quy phụ thuộc vào kết quả xác định yếu tố vào của chúng

Trong giai đoạn này, miền quy hoạch và số mức thay đổi của các yếu tố ảnh hưởng phải được xác định sơ bộ Ở giai đoạn sau, miền quy hoạch và mức thay đổi có thể được hiệu chỉnh cho phù hợp với loại kế hoạch được chọn

2 Lập kế hoạch thực nghiệm

Quan tâm đến điều kiện thí nghiệm và đặc điểm đo đạc, nhận giá trị của mục tiêu, nhằm chọn được dạng kế hoạch thực nghiệm phù hợp với điều kiện tiến hành thí nghiệm

3 Tiến hành thí nghiệm nhận thông tin

Ở đây sử dụng các phương pháp riêng, soạn thảo cho từng đối tượng nghiên cứu Liên quan đến quy hoạch thực nghiệm về mặt phương pháp là một số hướng dẫn và yêu cầu nhằm đảm bảo sự tiện lợi cho giai đoạn xử lý số liệu tiếp theo

4 Xây dựng và kiểm tra mô hình thực nghiệm

Sử dụng phương pháp bình phương nhỏ nhất và các nội dung phân tích hồi quy, phân tích phương sai để xác định các giá trị cụ thể của các hệ số trong

mô hình hồi quy đa thức, kiểm tra mô hình theo độ tương thích và khả năng làm việc Tùy theo loại thực nghiệm tuyến tính hay bậc 2 mà có mô hình tương ứng

Mô hình tuyến tính có dạng:

S = ∑ (yi – – a bxi)2 là tổng bình phương các sai số

Các hệ số của hệ phương trình này sẽ là tích, tổng của các giá trị biến số và hàm mục tiêu tại các điểm thực nghiệm mà ta phải tiến hành theo ma trận kế hoạch thực nghiệm

5 Kiểm chứng bằng thực nghiệm

Để khẳng định tính đúng đắn và độ tin cậy của các kết quả nghiên cứu vừa tìm được, người thực nghiệm cần đặt thực nghiệm vào điểm nhắm đến và kiểm định sự phù hợp của giá trị xác định bằng phương trình hồi quy so với kết quả thực nghiệm Để kết quả kiểm chứng là tin cậy về mặt thống kê, cần đánh giá mức độ trùng nhau đó theo các chuẩn thống kê, được thành lập dựa trên phân tích phương sai (chuẩn số Fisher, Student…)

Phần III NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

III.1 Nguyên liệu, thiết bị

- Bột sắn:

+ Cảm quan: bột trắng sáng, mùi thơm đặc trưng của sắn khô, không

mốc đắng

+ Độ ẩm: 12,7%

+ Hàm lượng tinh bột: 82,6%

- Các chế phẩm enzym của hãng Novo Đan Mạch: -

+ Termamyl 120L: là chế phẩm enzym α- amylase dạng lỏng, được sản xuất từ chủng Bac licheniformis

Termamyl rất bền nhiệt Nhiệt độ hoạt động tối ưu là 90 – 105oC, khối lượng riêng xấp xỉ 1,26 g/ml; pH tối ưu là 6,0- 6,5 [29]

+ Fungamyl 800L: là chế phẩm enzym amylase dạng lỏng màu nâu, α- khối lượng riêng xấp xỉ 1,25 g/ml; thu được từ chủng nấm mốc Asp oryzae

Fungamyl hoạt động tốt ở 55 – 60oC, pH từ 5,0 – 5, 5 [30]

- Máy và thiết bị thí nghiệm:

+ Cân phân tích: Scaltec

+ Máy đo mật độ quang: Genesys 20

+ Máy ly tâm: Rotofix 32, Hettich zentrifugen

+ Máy đo pH: micro processor pH metter, Hanna

+ Chiết quang kế ATAGO N-1α

+ Máy sấy: Binder

+ Máy khuấy từ

+ Bể ổn nhiệt, bếp điện

III.2 Phương pháp nghiên cứu

III.2.1 Phương pháp phân tích

III.2.2.1 Xác định độ ẩm [7]

Cân 5g bột sắn vào hộp nhôm sạch khô đã biết trước trọng lượng với độ chính xác 0,001g Sau đó đặt hộp vào tủ sấy đã đặt nhiệt độ 105 – 110oC, bắt đầu tính thời gian khi tủ sấy đạt nhiệt độ này Sau 3 giờ sấy, lấy hộp ra, làm nguội trong bình hút ẩm đến nhiệt độ phòng Cân lại hộp

m2- khối lượng mẫu sau khi sấy, g

Tiến hành đồng thời 3 mẫu để lấy giá trị trung bình

III.2.2.2 Xác định hàm lượng protein thô trong nguyên liệu bằng

Quá trình được tiến hành theo các bước như sau:

• Vô cơ hóa nguyên liệu:

R-CHNH2-COOH + H2SO4 → CO2 + H2O + (NH4)2SO4

Dung dịch hỗn hợp chỉ thị: 50 ml dung dịch xanh metylen (1g pha trong 800

ml etanol 96o) và 100 ml dung dịch đỏ metyl (1g pha trong 750 ml etanol 96o)

* Tiến hành:

- Vô cơ hóa mẫu: Cân 2 g bột sắn cho vào bình Kjeldahl Thêm vào bình 30

ml H2SO4 đặc Đậy bình bằng nút quả bông hay phễu thủy tinh nhỏ Đun bình Kjeldahl trên bếp, lúc đầu đun nhẹ, đến khi thấy SO2 bay ra có thể đun mạnh hơn, sau khi sôi 30 phút, nhấc bình ra khỏi bếp, để nguội, thêm 5 giọt H2O230% (chất xúc tác), tiếp tục đun 20 phút Nếu dịch trong bình trong bình chưa trắng cần thêm một lần xúc tác như trên cho đến khi dịch trắng hoàn toàn Quá trình vô cơ hóa kết thúc

- Cất đạm: Quá trình cất đạm được tiến hành trên máy cất Kjeldahl Chuyển toàn bộ dịch vô cơ hóa ở bình Kjeldahl sang bình cất của máy, tráng lại bình Kjeldahl bằng 10 ml nước cất và đổ chung vào bình cất Thêm vào vài giọt dung dịch chỉ thị hỗn hợp, dịch trong bình sẽ có màu tím (môi trường axit), sau đó cho vào một lượng kiềm 40% đến khi màu dịch trong bình cất chuyển

từ tím sang xanh lá mạ (môi trường kiềm)

Ở bình hứng có chứa sẵn một thể tích dư H2SO4 0,1N, thêm vào đó vài giọt chỉ thị hỗn hợp Đặt bình hứng ở đầu ra của hệ thống làm lạnh, đầu ra phải ngập trong dung dịch axit